Summary
体外应用退行性肌腱细胞是必要的, 当调查的效果, 新的治疗肌腱。然而, 大多数研究研究只使用动物模型或健康的 tenocyte。我们提出了以下的协议, 以隔离人类退行性肌腱细胞在手术期间。
Abstract
肌腱, 一种因肌腱变性而发展起来的痛苦状态, 由于体力活动的增加和预期寿命的延长, 在发达世界中的上升。尽管患病率不断上升, 但潜在的发病机制仍不清楚, 治疗一般是有症状的。最近, 研究了多种治疗方法, 包括生长因子、干细胞和基因治疗, 以期提高退行性肌腱的愈合效力。然而, 这些研究中的大多数只对动物模型或健康的人类肌腱细胞进行。尽管一些研究使用病理学肌腱细胞, 我们最好的知识目前还没有描述如何获得人类退行性肌腱细胞的协议。本研究的目的是描述获取人类退行性肌腱细胞的标准协议。最初, 肌腱组织是在手术期间从侧髁的病人身上收获的。然后从腕桡肌肌腱中取出活检标本, 并与手术时观察到的结构变化有关。所有收获的肌腱看起来都是钝的、灰色的、易碎的和水肿的, 这使得它们在视觉上与健康的不同。肌腱细胞被培养并用于实验。同时, 在组织学上分析了一半的收获组织, 并表明它们具有相同的肌腱 (angiofibroblastic 发育不良或增生) 的主要特征。免疫细胞化学的二次分析证实, 培养的干细胞是肌腱细胞与大多数细胞有阳性染色的莫霍克和 tenomodulin 蛋白。用增殖试验或 qRT PCR 方法对细胞与健康对照进行比较, 确定肌腱细胞退行性的质量。退行性 tenocyte 显示出较高的增殖率和类似基因表达模式的肌腱, 匹配以前的报告。总的来说, 这一新的议定书可能为今后研究肌腱提供了有用的工具。
Introduction
肌腱是一种慢性退行性肌肉骨骼的情况, 发展在身体的各个部分。最近, 由于越来越多地参与娱乐运动和提高预期寿命1、2, 发达世界的肌腱病例数量大大增加。肌腱的病因被认为是多因素的, 这些原因包括缺血、氧自由基损伤、收缩与血管扩张 innervations 的不平衡、内微泪和神经调节的变化3 ,4,5,6,7,8。大多数治疗肌腱只会缓解症状。此外, 没有组织再生的治疗需要很长的时间来恢复和获得有限的反应肌腱, 这给医生9的临床挑战。
目前治疗方案的无能以及缺乏退行性肌腱的自愈能力, 使研究人员对探索替代治疗策略感兴趣。最近, 新的研究报告了许多有希望的结果, 以提高肌腱肌腱的愈合效果, 使用生长因子, 干细胞为主的治疗, 和基因治疗10,11,12。
通过文献综述, 我们发现, 所涉及的研究可分为两类, 根据其分析材料: 动物模型, 如鼠, 一只老鼠, 或兔子;和人类模型。关于动物模型, 目前有两种常用的技术来产生肌腱: 化学诱导损伤或机械超载的模型。然而, 每个动物模型是有限的复制复杂的人类肌腱病理13,14。
大多数使用人体标本的论文都是在组织学上分析的, 或者是以健康的人类 tenocyte 为基础进行体外实验, 而不是变性 tenocyte15、16、17、18,19,20,21. 只有少数论文报告说, 他们使用了人类退化 tenocyte, 但他们没有详细描述用于从人类22、23获得变性 tenocyte 的协议。在这方面, 应该指出, 动物模型或健康组织/tenocyte 的成功结果不一定能预测人的疗效或有效剂量, 因为肌腱变性是一个复杂的过程, 而发病机制是仍未完全理解。
总的来说, 有必要描述从人体组织获得退行性 tenocyte 的标准协议, 而不会对捐献者造成不良影响。本文介绍了如何获得人类退行性 tenocyte 的协议。为验证该协议, 对所采集的组织进行组织学分析。然后, 采用免疫细胞化学 (ICC)、定量的实时聚合酶链反应 (qRT PCR) 和活性测定方法, 证实了 tenocyte 的退化性。
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Protocol
该议定书是根据《赫尔辛基宣言》进行的, 《议定书》是在茶 Bundang 医疗中心的机构审查委员会批准的。
1. 退行性肌腱组织从患者中收获
- 诊断侧髁的病史和使用体检结果: 压痛在腱的起源接近侧髁;疼痛通过腕关节的伸展而诱发。
- 使用以下纳入标准:18 岁以上;侧髁的历史至少六月;非手术治疗顽固;自注射皮质类固醇、富含血小板血浆或肉毒杆菌毒素以来, 至少有三月的时间过去了。
- 排除下列情况: 孕妇;有颈椎病病史、肘关节关节炎、rheumatologic 病、肘关节手术及神经卡压综合征的患者;患者拒绝捐献组织。
-
外科技术
注: 见图 124。- 经异氟醚和气管插管全麻后, 将手臂放在桌子上, 应用止血带。然后在整个手臂上应用 betadine 剂, 用无菌手术片进行悬垂。
- 将侧肘暴露在3–5厘米切口上, 用15号手术手术刀刀片内侧侧向髁和近端到关节的水平。
- 视觉识别伸腕桡肌 (ECRL) 和伸腱界面, 并作出分裂切口2–3毫米深度之间 ECRL 和伸腱与15号手术刀刀片在确定的界面。
- 提取 ECRL 前方, 使病理伸腕桡短肌 (ECRB) 的起源直接的看法。
- 以暗灰色和通常水肿、易碎的组织为特征, 以视觉识别病理退行性组织。
- 鉴定后, 用15号手术手术刀和迷你刀片仔细切除所有退行性组织。
- 将切除的组织 (约1厘米3) 立即嵌入磷酸盐缓冲盐水 (pbs), 并尽快将肌腱组织以外的所有周围组织移除到大约10毫升的 pbs 中。
- 在侧髁骨遗传性的情况下, 用钳将遗传性移除, 并抚平锉。在前外侧髁上制造多个钻孔 (直径1.6 毫米, 约6–8孔), 以增强血管供应。这是可选的。
- 用不可吸收的缝合材料将伤口层层闭合。
-
健康控制 tenocyte
- 在前交叉韧带重建过程中, 从自腿筋或自髌肌腱的剩余肌腱中获得健康肌腱细胞, 并以此为对照试验25。
注: 本研究中使用的样本数为每组三。
- 在前交叉韧带重建过程中, 从自腿筋或自髌肌腱的剩余肌腱中获得健康肌腱细胞, 并以此为对照试验25。
2. 组织学
- 储存大约一半的收获组织在中性缓冲10% 福尔马林在化学油烟机或同等。
- 将组织嵌入石蜡块 (第4-5 毫升), 并在第4-5 µm 节封闭。
-
染色部分从控制和退化肌腱与苏木精和伊红染色 (H & E) 和阿利新蓝染色的 pH 值为2.5。在自动染色机上进行 H & E 染色, 如下所示。
- Deparaffinize 使用二甲苯 (分别为3次, 5 分钟)。
- 从分级醇到水的水合物 (100% 酒精, 4 分钟; 100% 酒精, 3 分钟; 95% 酒精, 2 分钟; 70% 酒精, 1 分钟; 水, 2 分钟)。
- 在苏木精染色5分钟, 在水中洗好2分钟。
- 区分在1% 酸酒精 (1% HCl 在70% 酒精) 为 3 s. 洗涤井在水中为3分钟。
- 用0.5% 氨浸泡十年代, 然后用3分钟的水洗法中和 HCl。
- 在 Eosion 染色5分钟。
- 脱水通过酒精 (80% 酒精, 三十年代; 95% 酒精, 1 分钟; 100% 酒精1分钟, 100% 酒精2分钟)。
- 在二甲苯中清除 (分别为3次、2分钟、2分钟和3分钟)。
- 装上封面幻灯片。
-
immunohistochemitry (IHC) 使用粘结聚合物精制检测试剂盒, 根据制造商的指示, 稍加修改。
- deparaffinization 使用二甲苯后, 用键表位检索溶液进行抗原检索, 30 分钟100摄氏度。键表位检索解决方案含有柠檬酸盐基缓冲剂和表面活性剂 (1 升, pH 5.9–6.1)。
- 用过氧化氢孵化组织内源性过氧化物5分钟。
- 在室温下 (21-22 °c) 孵化出15分钟的切片, 主要抗体为血管内皮生长因子 (VEGF) (1:200), tenomodulin (1:200), 或莫霍克 (1:200)。
- 用无生物素的高分子辣根过氧化物酶-链接器抗体共轭系统进行二次抗体标记。
- 在 10% (v/v) 动物血清中使用二次兔抗小鼠 IgG, 在三缓冲盐水/0.09% 2-甲基 4-异噻唑啉 3-一溶液中定位小鼠抗体。
- 在三缓冲盐水/0.09% 中使用含有 10% (v/v) 动物血清的高分子抗兔多酶 IgG (< 25 µg/毫升) 对兔抗体进行局部定位。
- 使用 33 '-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 水合物在稳定剂的解决方案, 以可视化的复杂通过褐色沉淀。
- Counterstain < 0.1% 苏木精 (蓝色), 以可视化细胞核。
- 观察在光镜下用 H & E、阿利新蓝污渍和 IHC 为 VEGF、tenomodulin 和莫霍克染色的幻灯片, 并获得在一个高功率场 (400X) 下每张幻灯片的代表性显微图像。
3. Tenocyte 文化
-
组织准备
- 用微剪刀和镊子彻底去除周围组织, 准备肌腱标本。
- 用 PBS 和碎肉清洗成小块 (大约1毫米3或更少)。
- 1小时的消化组织在30毫升的 Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM) 补充30毫克/毫升胶原酶 II 在37°c。
- 通过100µm 细胞过滤器传递细胞。
- 添加1毫升胎牛血清 (血清), 停用胶原酶 II。
- 离心机在 196 x g 5 分钟。
-
细胞培养
- 种子 3 x 105细胞成100毫米菜和文化与 DMEM 补充与10% 个血清和1% 个抗生素-防霉解答在37摄氏度在5% 个 CO2个孵化器为1星期。
- 每三天更改一次培养基, 直到80% 汇合发生。培养健康的控制和退化细胞样本直到四, 并用于实验。
4. 免疫细胞化学 (ICC)
- 将培养细胞的200µL (2 x 105细胞) 转移到腔室的八口井中, 并将细胞生长, 使其与新鲜培养基的添加融合在一起1天。
- 用 PBS 冲洗细胞, 用500µL 4% 甲醛。
- 在 PBS 中孵化0.5% 海卫 X-100, 通透膜的10分钟。
- 以1% 牛血清白蛋白和 0.05% TWEEN-20 为莫霍克和 tenomodulin 的 PBS 块。
- 在黑暗中孵育鼠抗莫霍克的单克隆抗体 (1:100 稀释) 和山羊抗 tenomodulin 抗体 (1:100 稀释) 在4°c 过夜。
- 孵化二级抗体 (Alexa 555-抗山羊 (1:200) 为 tenomodulin;Alexa 488-反老鼠 (1:200) 为莫霍克) 在黑暗中为1小时的室温。
- 安装0.5 µL 的荧光安装介质。
- 使用荧光显微镜 (400X) 进行分析。
5. 扩散试验
-
用水溶性四氮唑 (WST)-1 测定细胞可行性。
- 将健康和退化的细胞种子分为96个井板, 密度为 2 x 103细胞, 每井为24、72和 120 h。
- 孵化后, 添加10µL 的 10% WST-1 解决方案, 每个井。
- 孵化板材为3小时在37°c 在 5% CO2。
- 使用微板块读取器测量 450 nm 的光学密度。在每个样品的时间点上至少取三次读数。
-
用 BrdU 法测定细胞 DNA 量。
- 将健康和退化的细胞种子分为96井板, 密度为 2 x 103细胞, 每井为24、72和 120 h。
- 孵化后, 添加10µL 10% BrdU 溶液的每一个井。
- 孵化板材为3小时在37°c 在 5% CO2。
- 添加100µL/变性溶液 (60–70% 乙醇, 0.1–0.5% 氢氧化钠), 并保持在室温下的板材30分钟。
- 添加100µL/良好的1x 检测抗体溶液, 并保持在室温下的板材1小时。
- 用1x 洗涤缓冲器去除溶液和洗涤板三次。
- 添加100µL/精心制备的1x 酶共轭二次抗体溶液, 并保持在室温下的板30分钟。
- 用1x 洗涤缓冲器去除溶液, 洗盘子三次。
- 添加100µL 50% TMB 基板。
- 室温下孵育30分钟。
- 添加100µL 的停止解决方案。
- 使用微板块读取器测量 450 nm 的光学密度。
注: 每样样品在所有时间点至少取三次读数。
6. 统计分析
- 使用 SPSS 收集和分析数据。
- 用平均标准误差描述数据。
- 使用曼尼特. U 测试。
- 当p值小于 0.05 (p < 0.05) 时, 请考虑统计学意义上的差异。
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Representative Results
组织学分析表明, 从侧髁的收获组织具有 tendinopathic 肌腱的特征。肌腱退行性肌腱的 H & E 段揭示了一种无条理的胶原束, 极性和细直、强包装的平行纤维结构。在样品中常见的组织学征象如高细胞构成、大核无典型纺锤形等。此外, 退化肌腱的胶原束是由 H & E 染色的相对较弱的阿利新, 但呈阳性染色, 表明软骨和多糖物质增加。
在所有的病例中, 血管数量都在增加, 在纤维间嵌入的聚集空间与正常的狭缝状血管相比较。在 IHC 染色中, 退化肌腱细胞与对照的阴性反应相比, 对 VEGF 的胞质颗粒呈阳性反应。总的来说, 这些发现证实, 从侧髁的收获组织是退化组织, 适合于退行性 tenocyte 培养 (见图 2)。
经 ICC 确认培养细胞为肌腱细胞, IHC 作为肌腱组织证实了所收获的组织。大多数培养的细胞和肌腱组织的细胞显示了一个积极的污点, 代表 tenocyte 标志物 (绿色) 蛋白和 tenomodulin (红色) 蛋白与拉长的外观在显微镜下 (见图 3)。此外, 收获的组织有阳性染色的莫霍克蛋白和 tenomodulin 蛋白免疫组化 (见补充图 1)。这表明所收获的组织是由肌腱组织组成的。
从侧髁收获组织中培养的肌腱细胞具有与肌腱相对应的特征特征。在相同的条件下, 4 天的退变性和健康肌腱细胞培养。在每一个时间点, 通过 BrdU 测定和 WST-1 测定, 测定其增殖率。结果表明, 与先前报告的对照组相比, 退变性细胞的增殖率显著提高 (p < 0.05) (见图 4)。
采用 qRT PCR 方法分析了五例退行性肌腱中已知的调节基因。从退行性肌腱培养的细胞中, 基因、 COL3A1、ACTA2、TAC1 (SP)、TAC 受体 1和PTGS2 (COX2)的表达比健康的细胞明显增加。所有基因的相对表达式如图 4B和补充图 2所示。
图 1:手术照片的退行性肌腱收获.(A)皮肤切开和解剖后, 常见的伸肌原体的病理退行性组织暴露, 呈浅灰色, 有水肿变化 (红线)。反之, 正常肌腱组织的一般外观是发亮的, 有轻微的灰色色调 (黑线)。(B) 所有已确定的退行性组织均被迅速切除, 然后暴露出桡骨头骨。(C) 所有切除的组织立即嵌入磷酸盐缓冲盐水中, 并尽快仔细解剖周围的非腱组织。ECRB: 伸腕桡。伸趾。ECU: 伸腕腕。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 组织学证实退行性肌腱.(A)在 H & E 染色中, 外侧髁的退行性样品有无条理的胶原束, 极性丧失, 细胞数目增加, 与健康对照比较。(B). 阿利新蓝染色表明, 退变肌腱增加了由软骨和多糖组成的地面物质, 其中有几个粘液斑块和纤维间的空泡 (箭头)。(C). 此外, VEGF 免疫组化显示, 与对照样品相比, 退行性肌腱样品中血管形成的染色增加。VEGF: 血管内皮生长因子。刻度条 = 50 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.
图 3: 由 ICC 鉴定 tenocyte.在肌腱组织中培养的细胞和细胞经 ICC 证实为 tenocyte。大多数细胞显示阳性染色的代表性 tenocyte 标记, 包括莫霍克 (绿色) 和 tenomodulin (红色) 与拉长的外观在显微镜下。软骨细胞被用作阴性对照。免疫细胞化学。刻度条 = 50 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.
图 4:退化 tenocyte 的特征.(A、B)变性肌腱细胞 (红色) 的增殖率较高, 细胞构成显著增加。(C) 已知与肌腱发育相关的五种基因在退行性肌腱细胞中明显升高。基因表达水平被规范化对GAPDH。*: 平均 < 0.05, **: 平均 < 0.01, 分别。SP: 物质 P.请点击这里查看这个数字的大版本.
补充图 1: 组织学确认的收获组织作为肌腱组织.用 IHC 对莫霍克和 tenomodulin 的收获组织进行了分析, 以确定所收获的组织是否具有足够的肌腱组织特征。IHC: 免疫组化。刻度条 = 50 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.
补充图 2: 肌腱相关基因在 tenocyte 中的表达.在退行性肌腱细胞中, 肌动蛋白表达正常化的五个基因的转录显著升高, 与图 4有相似的趋势。基因表达水平被规范化对肌动蛋白以平均 < 0.05 和 < 0.01, 分别。SP: 物质 P.请点击这里查看这个数字的大版本.
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Discussion
以前的一些研究报告了如何使用不同的程序, 如胶原酶或 kartogenin 注射, 跑步机跑步, 以及更多的26,27建立慢性 tendinopathic 动物模型。虽然许多研究显示有希望的治疗效果的基础上这些动物模型, 使用人类退行性 tenocyte 的实验将是至关重要的肌腱领域, 以重现疗效的治疗。在这篇文章中, 我们建立了一个成功地收获和文化的人类退化肌腱细胞一致的协议。收获肌腱组织和培养的 tenocyte 显示退行性肌腱和 tenocyte7,28的共同特征。
根据我们的经验, 为了成功的组织收获, 必须了解经常与退行性肌腱相关的形态学变化, 并在手术中准确地划定该区域。变性组织通常呈灰色或褐色, 组织薄, 易碎, 结构松散。应严格遵守《议定书》的列入和排除标准, 并在收获前仔细评估以前的处理办法。
组织大小对于成功的细胞培养也很重要。我们建议收获超过1厘米3。通常, 只要移除所有退化区域, 所收集的组织量就足够用于细胞培养。最后, 我们没有在所有实验中使用肌腱细胞超过六通道。直到六, 我们相信培养的细胞仍然有退化的特征。
我们的协议有几个优点。这些优点包括对病人没有伤害, 因为变性组织应该在手术中被切除, 效率, 因为需要的组织数量足够的实验, 高度道德的, 因为没有违反健康的组织,在手术过程中可以很容易地获得人体病理组织的重现性, 最后, 一旦手术技术变得熟悉, 就易于应用。
然而, 我们承认我们的实验有几个局限性。首先, 我们不能完全排除以前的皮质类固醇或富含血小板的血浆注入的残余效应, 尽管我们只包括至少通过了三月的病人接受以前的治疗。此外, 在本议定书中, 我们只收获了 ECRB 肌腱, 并利用它来培养退行性肌腱细胞, 因为 ECRB 肌腱是一个常见的肌腱部位, 手术连同阿基里斯和肩袖肌腱。进一步的研究应该以更大的样本大小为重点, 在不同的肌腱站点之间的任何差异。
总之, 这种获得人类退行性肌腱细胞的验证性的协议将是未来肌腱生物学研究和测试新的治疗干预的有用工具。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了韩国卫生技术研发 & 发展研究所 (KHIDI) 的资助, 该项目由大韩民国卫生部 & 福利部提供资金 (赠款号: HI16C1559)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
| Mini-blade | Beaver | 374769 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| 50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
| 4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
| BSA | Rdtech | C0082 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
| Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
| Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
| ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
| TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
| TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
| PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
| ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
| Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
| 100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
| 8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
| Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
| VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
| Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
| Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
| Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
| Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
| Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
| Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
| Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
| Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
| VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
| SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
| Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |
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