Summary
サンプル準備プロセス中に改革の結晶構造により MALDI 質量分析法における炭水化物イオン信号を強化するためのプロトコルが示されています。
Abstract
試料は、質量分析法 (MS) における炭水化物の重要なプロセスです。マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI) MS は炭水化物分析に最適な方法が、糖質の貧しいイオン信号とデータの再現性は深刻な問題であり続けます。炭水化物の定量分析、優れたデータ品質を提供する効果的な分析プロトコルが必要です。このビデオは、信号強度を改善し、炭水化物 MALDI MS のデータ変動を最小限に抑えるためのサンプル準備のプロトコルを示します。乾燥とサンプル滴の結晶化の後結晶形態は質量分析の前にメタノールによって改良されます。MALDI イメージング質量分析法 (IMS) と炭水化物信号の強化を調べた実験を行い結晶改革が結晶構造を調整し、炭水化物の検体を再配布します。従来の MALDI MS、メタノール ショーより信号強度、イオン イメージ分布データの安定性と改革の炭水化物結晶の形態で乾燥されたしぶき製法との比較ここに示したプロトコルがサンプル組成の変化を伴わないので彼らは一般的に様々 な炭水化物およびマトリックスに適用されます。
Introduction
炭水化物分析重要かつ困難な課題であります。炭水化物及びその誘導体を果たす重要な役割生物1,2,3の生活します。これらの分子は複雑な構造があるし、分解する傾向があります。それらの多くは、明確に分離と検出の難しさによる特徴付けられることはできません。マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI) 質量分析 (MS) は、その感度とわかりやすい結果4のための生体分子の広い範囲の分析に適用されている続けて MALDI MS による糖の分析このような分子5の低イオン化効率のため主要な挑戦になります。化学誘導体化は炭水化物6、7のイオン化効率を向上させる一般的な方法がそのようなプロシージャは時間と消費するサンプルです。また、炭水化物の誘導体のイオン化効率はまだ蛋白質のより低いです。したがって、複雑な手続きなし MALDI MS で炭水化物の信号を改善する方法の開発が必要です。
MALDI MS の定量分析への応用は、もう一つの挑戦的な件名です。MALDI MS の主要な問題は、その感度とデータの再現性がサンプル準備のプロトコルおよび実験的パラメーターに批判的に依存していることです。多くの場合、MALDI 質量分析法による定量分析は異種サンプル形態と試料配布のため信頼できません。有名な例は、2, 5-ジヒドロキシ安息香酸 (DHB) MALDI マトリックスを使用したサンプルです。DHB を周囲の環境の下でゆっくりと結晶化させたとき、試料マトリックス結晶混入の程度は予測、結果サンプルは不規則な形態を示すため。そのようなサンプルは通常、大きな針形と細かい結晶で構成されます。DHB は、揮発性溶剤や加熱サンプル プレートを使用して準備ができたら、高速乾燥処理はより均一な微細な結晶とより量的な結果8,9,10の結果します。この手法は、MALDI のサンプルの「結晶」と呼ばれます。改善、良い混入検体の微細なマトリックス結晶高速結晶化プロセス中に起因します。我々 はまた、サンプル調製環境の調整減少炭水化物信号および改善された定量的な結果11,12の不均一性であることを実証しました。これらの作品のサンプル形態が炭水化物の信号の品質を決定する重要な要因であることが示唆します。毎日の分析の一般的な戦略の開発、改良された炭水化物感度を提供する効率的なサンプル改革メソッドが必要です。
最近レポート13MALDI MS のサンプルの形態と炭水化物感度の相関関係を体系的に検討する.いくつかの重要な炭水化物を使った結果、最高の信号強調が再結晶によって満たされるマトリックス ショー乾燥 MALDI のサンプル。従来乾燥されたしぶき (DD) 法による試料の形態はメタノール (メタノール) と高速再結晶によって改良されます。ここで詳細なサンプル準備のプロトコルを示します。プロトコルは、サンプル プレートの前処理、サンプル成膜および再結晶、質量分析など、3 つの主な手順で構成されています。利用の炭水化物には、シアリル ルイス (SLeA) と maltoheptaose (MH) が含まれます。DHB は、モデル行列として使用されます。炭水化物信号強度と空間分布を再結晶した後著しく改善することを示した。このようなメソッドは、他の人気のあるマトリックス、2,4,6 trihydroxyacetophenone (タップ) とα- シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸を含む試料に適用できます。このメソッドは、炭水化物分析研究室のルーチンに簡単に統合することができます一般的なアプローチとして機能します。
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Protocol
1. サンプル プレートの前処理
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サンプル板のクリーニング
- サンプル プレートの洗浄時の汚染を避けるためにニトリル手袋を着用します。
- 手洗い洗剤 (1.0 mg/mL) の 100.0 ml サンプル プレート。
- 手洗い蒸留脱イオン水 (DDW) でサンプル プレート。
- 30.0 ml の MeOH のサンプル プレートの表面を洗い流してください。
- サンプル プレートは完全に水に浸漬されるまで 600 mL ビーカー、DDW でいっぱいサンプル プレートを置きます。
- 超音波でビーカーを置いて (表の資料を参照してください) お風呂し、15 分 (200 W、40 kHz) のサンプル プレートを超音波照射します。
- サンプル プレートを取り出し、加圧窒素を使用して水滴を吹き飛ばします。
- メタノール メタノールが他のスポットに広がるかどうかを確認するサンプル プレートを 0.2 μ を入金します。
注:メタノールは、他のスポットと合併、繰り返します手順 1.1.3-1.1.5;ない場合は、次の手順に進みます。
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乾燥室内温度の調節
- 11,12,13を前述のように、水滴を乾燥して安定した条件の下で乾燥室を使用します。特に、Ou、Y. M の手順 2.1 2.5 で説明する詳細な手順を使用します。ら201612。簡潔に。
- 乾燥室を低湿度環境を維持するために一定の流量で常温窒素パージします。
- サンプル プレート温度を一定に保つ正 (25 ° C) または高速乾燥条件 (50 ° C) で乾燥室の温度制御の銅ブロックによって規制されています。
- 11,12,13を前述のように、水滴を乾燥して安定した条件の下で乾燥室を使用します。特に、Ou、Y. M の手順 2.1 2.5 で説明する詳細な手順を使用します。ら201612。簡潔に。
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行列と試料溶液の調製
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溶液の調製
- 50% アセトニ トリル (ACN) に DHB の溶解: 50% DDW 0.1 M の溶液を調製します。
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炭水化物検体の調製
- 10-4 M 溶液を調製する DDW ではSLe を溶解します。
- 10-4 M 溶液を調製する DDW で MH を溶解します。
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溶液の調製
2. サンプル ・析出・再結晶
注:小さくて正規量試料の分析に最適化された手順は以下のとおりです。ソリューションを堆積させる前に所望の温度に試料皿温度を安定化していることを確認します。サンプルは結晶中に他のサンプルのスポットをカバーする広いエリアに広がる、新しいサンプルを準備または 1.1 の手順を繰り返します。
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サンプルの少量 (0.1 μ L) の分析のため
注:次の手順は、サンプルおよび時間消費を最小化するため開発されています。限られた量と定量分析のための迅速な IMS 実際試料の定量分析に適しています。- DHB ソリューションと 0.25 の sleA μ L または微量遠心チューブに MH ソリューションの 0.25 μ L をプレミックスします。
- 渦 3 渦のミキサーを使用して混合液 s。
- 2 ミニ遠心分離機で混合液をスピン s (2000 x g)。
- ピペットを使用して予混合液の 0.1 μ L を引き出すし、すぐにサンプル プレートに入金します。
注:10 人以上でピペットの先端で予混合ソリューションをしないで保持時に少量の試料を入金、s。 - サンプルを乾燥するを待ちます。典型的な乾燥時間は表 1のとおりです。
- 乾燥サンプル スポットを右にメタノールの 0.2 μ L を入金するのにピペットを使用します。サンプルを得るが濡れているし、すぐに乾きます。
注:3 堆積工程が終了したことを確認 s MeOH の大きな蒸発損失を避けるために。 - 顕微鏡を使用してサンプルを確認します。結晶の形態は期待どおりに (例えば望ましい結果の図 1を参照) は、新しいサンプルを準備する 2.1.1-2.1.6 が手順繰り返します。
- ニトリル手袋を着用し、乾燥室からサンプル プレートを慎重に取り出します。
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サンプルの正規の金額 (1 μ L) の分析のため
注:次の手順は、通常利用した MALDI サンプル量と炭水化物サンプルの均質性を最大化するために開発されています。プロセスは、ルーチンおよび定量分析に適しています。再結晶化プロセスは、サンプルおよびより大きい区域に均等にマトリックスに再分配します。- DHB ソリューションと 2.5 μA SLe または微量遠心チューブに MH のソリューションの 2.5 μ L をプレミックスします。
- 渦 5 渦のミキサーと予混合ソリューション s。
- 2 ミニ遠心分離機で混合液をスピン s (2000 x g)。
- ピペットを使用して予混合溶液 1.0 μ L を引き出すし、すぐにサンプル プレートに入金します。
注: しない残りの使用サンプルを入金後に再度ソリューションを予混合します。 - サンプルを乾燥するを待ちます。典型的な乾燥時間は表 1のとおりです。
- 乾燥サンプル スポットを右にメタノールの 1.5 μ L を入金するのにピペットを使用します。サンプルを得るが濡れているし、すぐに乾きます。
注:5 内高いサンプル プレート温度 (50 ° C) の場合、再結晶のステップを行う必要があります s ピペット チップでメタノールの蒸発を最小限に抑える。 - 顕微鏡を使用してサンプルを確認します。結晶の形態は期待どおりに (例えば望ましい結果の図 1を参照) は、新しいサンプルを準備する 2.2.1-2.2.6 が手順繰り返します。
- ニトリル手袋を着用し、乾燥室からサンプル プレートを慎重に取り出します。
3. 質量分析データ集録および解析
注:商業飛行時間質量分析計 (材料表) MALDI イオン源を装備を使用して解析が実行されます。特定のコントロール ソフトウェア (材料表) 事前に最適化抽出遅延とレーザー エネルギーと楽器が運営しています。スペクトル m/z 質量範囲で線形モードで記録されます = 0-1500。潜在的なサンプル プレートは ± 25 keV とあらゆるスペクトル平均 10 レーザー ショット。ユーザーは、楽器最適化および互換性のあるソフトウェアを使用してのサンプル分析を実施する必要があり、楽器の製造元の指示に従ってください。
- 計測器制御ソフトウェアを開く (材料の表を参照してください)。
- サンプル プレートを質量分析計に挿入します。
- ソフトウェアで事前に最適化されたデータ取得方法を選択します。
- IMS のイメージング ソフトウェアを使用しての全体のサンプル領域を登録 (材料の表を参照してください)。
注:IMS をやっていない場合、この手順をスキップします。 - コントロール ソフトのバッチ モードでデータ集録を開始します。
- データ集録が完了した後に、イメージング ソフトウェアを使用してイオンのイメージをプロットします。
- 解析ソフトウェアを使用して質量スペクトルの解析 (材料の表を参照してください) イオン イメージなしのデータが記録される場合。
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Representative Results
再結晶法は、図 1に示すが、SLeAの代表的な SEM 画像混合 DHB DD を使用して準備します。典型的な DHB 形態 DD 法により作製した縁でサンプル スポットの中心部に微細な結晶の大きな針状結晶です。このような針状結晶の典型的な長さは、〜 100 μ m です。メタノールによって再結晶後、サンプルに均等に細かいフレーク状の結晶で覆われて大きなエリアがあります。「フレーク」結晶の長さがおよそ 20-50 μ m. 再結晶サンプル提供従来の DD サンプルで作り出されるそれらより大きい区域の有効な表面。
IMS が示唆されたフレーク状の結晶は、通常より高い炭水化物信号強度およびより均一な分布になります。従来の DD サンプル サンプル スポットの周辺ではほとんど炭水化物イオン信号が分散されます。図 2は、SLe の IMS 結果を示していますAと MH とメタノール再結晶なし。後、再結晶化試料スポット SLeAの分布との明視野像とも MH 信号一致。また、再結晶化糖のすべてのサンプルは DD 標本から得られるそれらの結果を信号強度で大幅に強化を表示します。高い信号強度と均一性のため再結晶は著しく定量分析におけるデータ品質を向上させます。
再結晶による炭水化物の信号強度を高めることは、両方の正と負のイオンのモードに有効です。図 3は、sodiated (ポジティブ イオン モード) の信号強度と DD のサンプルに対して再結晶試料のラジカルアニオン (マイナス イオン モード) 炭水化物を比較します。平均では、SLeAおよび MH サンプルの再結晶により sodiated 信号 3.9 と 3.3 の要因それぞれ。ラジカルアニオン SLeAのイオン信号は通常再結晶後約 4.7 倍に強化されます。
図 1。SLeAの SEM 像は、DHB 行列の準備。サンプルは乾燥の液滴と再結晶の方法を使用して。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。画像はMH を使用した SLe の質量分析法の代表的な結果乾燥液滴と再結晶の方法。イオンのイメージは、sodiated またはラジカルアニオンの analytes の分布を表します。すべての明視野とイオンのイメージは、同じスケールで表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。異なる試料作製法で得られた炭水化物信号強度。黒いバー: sodiated SLeA (m/z: 843);赤いバー: ラジカルアニオン SLeA (m/z: 819);ブルー ・ バー: sodiated MH (1175 m/z:)。エラーバーは標準偏差を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| サンプル | サンプル プレート 温度 (° C) |
サンプル量 (Μ L) |
サンプルの乾燥 時間 (秒) |
乾燥メタノール 時間 (秒) |
適切なサンプル エリア 後の拡張 再結晶 (%) |
| SLeA | 25 | 0.1 | 100-150 | < 5 | 0-200 |
| 1 | 300-350 | < 10 | |||
| MH | 0.1 | 100-150 | < 5 | ||
| 1 | 200-350 | < 10 | |||
| SLeA | 50 | 0.1 | < 5 | < 5 | |
| 1 | < 10 | < 10 | |||
| MH | 0.1 | < 5 | < 5 | ||
| 1 | < 10 | < 10 |
表 1.実験パラメーターおよび乾燥条件別のサンプル プレート temperatures.x
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Discussion
試料の不均質は MALDI さん DD の重要な問題は最も一般的に使用されるサンプルの準備方法、得られた結晶は非常に異種。そのようなサンプルは、劣悪なショット-ショットとサンプル-サンプル信号の再現性を示します。したがって、データ集録時にサンプル エリアの「甘いスポット」の検索は、MALDI 実験の一般的な手順です。このような異種のサンプル、ルーチンな分析の定量化のため適していません。
現在の研究では、MALDI サンプル形態は、再結晶によって最適化されます。炭水化物信号強度と再結晶によりデータの安定性の改善は、炭水化物とマトリックス間の改善された定款に起因します。ほとんどの炭水化物とマトリックスの親水性の特性のため、効率的にメタノールはできます MALDI 結晶と炭水化物に崩壊します。観測は、蒸着とメタノールの速い蒸発が小さなフレークのような結晶構造に大きな針状 DHB 結晶を改革を示しています。このプロセスはまたサンプル分離を最小化し、表面積を高めます。IMS データによると改革の結晶は炭水化物のイオン化のためのより良い微小環境を提供します。特に、乾燥室の利用は、精密に制御された実験的パラメーターと参照条件を提供するためにです。ルーチン分析の一般的な MS のユーザーことができますと同様の強化の結果を達成するために周囲の環境の下でプロトコルに従います。
MALDI は表面化学反応14,15によって支配されるので、有効表面積の増加により再結晶により信号強調にはあります。信号強度と MALDI 結晶の実効面積との相関は、異なるサンプル プレート温度11,12の下のサンプルを準備することによって研究されています。再結晶法による結晶の大きさに大きな変化と比較して結晶サイズの微調整は、液滴の乾燥過程中にサンプル板の温度を調整することによって実現できます。ドンタップの針状結晶の平均サイズ削減 10 倍サンプル プレート温度が 40 ° c 低下する場合行列としてタップを使用する場合観測は、炭水化物信号強度増加結晶サイズが13減少することを示します。ただし、サンプル プレート温度を減らすことはルーチン分析に適した DHB の形態を効率的に変わることはないし、長い準備時間が必要です。
再結晶の最高の結果を確保するため、準備プロセスを実行して注意してください。まず、新鮮なサンプルの混合物は、再結晶法による最高の信号強調を提供します。予混合ソリューションは、周囲の環境にさらされている、一度前の結晶化に最終的な結晶サイズおよび形態変更ソリューションで発生します。このような形態の変化はおそらくマトリックス/試料比を変更したためです。観測表示その再結晶化などのサンプルは、最高の信号強調を提供できません。したがって、ピペッティングのプロシージャは、ピペット チップ内で前の結晶からサンプル液滴を保護するために高効率で操作されるべきです。第二に、MeOH の適切な量は完全に改革サンプルに適用する必要があります。再結晶化プロセス中に、試料表面にかなり蒸発損失を避けるためにできるだけ早く MeOH を廃棄ください。堆積したメタノールの量が十分ではない場合は、MALDI サンプル結晶は完全に溶解しません。対照的に、大量のメタノールは広がって、サンプルの密度を低減します。MS 分析前に結晶の形態を正しく改質して顕微鏡下でサンプルの形態を観察することをお勧めします。結晶の形態が完全に (参照の図 1と表 1を参照) を変更していない場合と同じ手順で新しいサンプルを準備する必要は。
MALDI MS に最適な定量分析アプローチ IMS と改良されたサンプルを分析します。改革では、試料の不均質を最小限に抑えられますがさまざまな分野での信号強度はまだ (図 2) を異なる場合があります。選択したサンプル位置の手動検査と比較する IMS とサンプル全体領域の分析の不確実性とデータの変化を平均します。観測表示その再結晶、通常の試料量 (1.0 μ L 試料溶液) は、定量的解析 (ステップ 2.2) で優れた炭水化物サンプルの均質性を提供しています。ただし、このような試料の IMS 分析手動試験方法より分析時間を消費します。IMS の迅速な分析を達成するために 0.1 μ L 試料溶液 (ステップ 2.1) を使用してサンプルを準備する小さなサンプル エリアを生成でき、解析時間を短縮します。
MALDI のサンプルの再結晶は、敏感と MALDI MS で定量分析の優れたサンプル形態を提供します。このメソッドの背後にある基本的な原則は明確に示されています。この研究で開発された実験のプロセスは一般的な実験条件、便利かつ効果的なです。これらの実験プロセスは余分なしルーチンな分析に容易に適用できるコストです。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者の謝辞があります。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Detergent powder | Alconox | 242985 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Acetonitrile | Merck | 100003 | |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) | Alfa Aesar | A11459 | |
| sialyl-lewis A (SLeA) | Sigma-Aldrich | S1782 | |
| Maltoheptaose | Sigma-Aldrich | M7753 | |
| Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| Equipment | |||
| Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
| Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
| 600 mL beaker | Duran | 2110648 | |
| Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
| Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
| Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
| K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Mini centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
| Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Temperature controllable drying chamber | This lab | ||
| Ultraflex II TOF/TOF mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| MTP 384 target plate polished steel BC | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Flexcontrol Version 3.4 | Bruker Daltonics | Control software | |
| Fleximaging Version 2.1 | Bruker Daltonics | Imaging software | |
| Flexanalysis Version 3.4 | Bruker Daltonics | Analysis software |
References
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