Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الكشف عن الأجسام المضادة التي تحييد استيعاب الخلوية لأنزيم استبدال العلاجات مع تحليل يستند إلى الخلية

Published: September 10, 2018 doi: 10.3791/57777
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1BioMarin Pharmaceutical Inc

Summary

نقدم هنا أسلوب يستند إلى الخلية تدفق الخلوي للكشف عن الأجسام المضادة لتحييد أو غيرها من العوامل التي تتداخل مع امتصاص الخلوية لأنزيم استبدال العلاجات في مصفوفة بشرية، مثل السائل الدماغي النخاعي (CSF) أو مصل الدم البشري.

Abstract

إدارة العلاج البديلة إنزيم (أفرقة خبراء الاستعراض)، والعلاجات البيولوجية الأخرى للمرضى الذين قد تثير استجابة مناعية لمكافحة المخدرات. توصيف هذه الأجسام المضادة لمكافحة المخدرات (ADA)، لا سيما تلك التي يمكن تحييد النشاط البيولوجي للمخدرات، ووصف تحييد الأجسام المضادة (رعايتها)، أمر حاسم في فهم آثار هذه الأجسام المضادة على الدواء الشخصية الدوائي. هذا البروتوكول وصف أسلوب يستند إلى الخلية تدفق الخلوي للكشف عن العوامل التي تحييد استيعاب الخلوية لفريق خبراء الاستعراض الليزوزومية ممثلة في مصفوفة البشرية. البروتوكول يتكون من ثلاثة إجراءات: الفرز، خطوة توكيدي، وعيار فحوصات للكشف عن، تحديد، وإنشاء المستوى النسبي لتحييد عيار الأجسام المضادة في موضوع العينات.

في هذا الأسلوب، عينات أولاً مختلطة مع المنتج الحلقات مترافق فلوروفوري، ثم المحتضنة مع خلايا [مثلاً، الإنسان تي اللمفاويات (الخلايا جوركات)] التي تعبر عن مستقبلات سطح الخلية المستقلة الموجبة يطلق 6-فوسفات (CI-M6PR)، و وأخيراً، حلل مع سيتوميتير تدفق. سيؤدي إلى عينة دون رعايتها على الإقبال مترافق fluorophore المكون من المنتج عن طريق CI-M6PR، في حين وجود رعايتها سوف ربط إلى المخدرات وتتداخل مع ربط CI-M6PR وامتصاص. مقدار استيعاب خلايا جوركات فريق خبراء الاستعراض مترافق fluorophore يقاس بالتدفق الخلوي وتقييمها كاستجابة الحصول على حضور مصفوفة السذاجة المخدرات ممثل بالمقارنة مع تثبيط إشارة النسبة المئوية (%). في الخطوة المؤكدة، العينات المحتضنة مسبقاً مع الخرز المغناطيسي مترافق فريق خبراء الاستعراض أن تستنفد العوامل الخاصة بالمخدرات التي تربط بالمخدرات (مثل ريسوليوت) قبل حضانة مع الخلايا. ثم هي تضعف عينات الشاشة وتأكيد الإيجابية لرعايتها الخاصة بالمخدرات في المقايسة متسلسل لتوليد عيار الأجسام المضادة. قد يرتبط التتر جسم شبه كمي بقياسات للمخدرات سلامة وفعالية.

Introduction

الاستمناع التقييم جزء مهم من سلامة وفعالية رصد البرنامج لأي منتج بيولوجي العلاجية، بما في ذلك أفرقة خبراء الاستعراض. وقد وضع المرضى استجابة مناعية يمكن أن تؤثر تأثيراً مباشرا المخدرات سلامة وفعالية، وملامح الحرائك الدوائية/ميكروبيولوجية. مجموعة فرعية من هذه أدا، يسمى ريسوليوت، قد تحد من فعالية فريق خبراء الاستعراض بطريقتين: عن طريق تثبيط امتصاص الحلقات إلى الخلية المستهدفة، أو عن طريق تثبيط نشاط الحفاز الحلقات. الطريقة المعروضة هنا يهدف إلى قياس رعايتها التي تتداخل مع امتصاص الحلقات في الخلايا. للرصد الكامل لسلامة وكفاءة الفريق العلاجي، الرصد المستمر لرعايتها أمرا حاسما في توضيح أي الارتباطات المحتملة مع النتائج السريرية أو تأثيرات ميكروبيولوجية1.

وتشمل مناهج تقييم رعايتها ضد البروتين المداواة النشاط الأنزيمي، يستند إلى الخلية وفحوصات ملزم يجند1. تحديد منصة الفحص الأمثل استناداً إلى مجموعة متنوعة من المعايير: إليه العمل المنتج العلاجي، وحساسية منصة الفحص، والانتقائية والدقة، والأهم من ذلك، قدرته على تقليد عمل المثبطة يعتقل في فيفو . فحوصات ملزم يجند قد يكون مناسباً في حالات معينة (مثلاً، عندما لا يمكن تحديد خط خلية ذات صلة أو إذا كانت حساسية مناسبة لا يمكن تحقيقه تحليل يستند إلى الخلية). ومع ذلك، تعكس قبض يستند إلى الخلية فحوصات ينصح نظراً لأنها ربما أفضل في 2016 مشروع "توجيهات إدارة الأغذية والعقاقير" للوثيقة الصناعة وأخرى قبلت صناعة أوراق بيضاء، الآلية البيولوجية من المخدرات في فيفو1،2 , 3.

وتشمل المكونات الحاسمة لوضع مقايسة قبض يستند إلى الخلية تدفق الخلوي خط خلية ملائمة التي تستجيب لتحفيز المخدرات، إيجابية-تحكم مركب قبض تحييد فريق خبراء الاستعراض، وفريق خبراء الاستعراض مترافق فلوروفوري، واختبار الأنواع البيولوجية مصفوفة4،،من56. تحديد خط الخلية يعتمد على إليه عمل فريق خبراء الاستعراض وينبغي تقييم خطوط الخلايا متعددة خلال التنمية المقايسة3. في الأسلوب الموصوفة هنا، اختير الخلايا T جوركات البشرية للتعبير عنها CI-M6PR الذاتية على سطح الخلية وعدم وجود جسم يفتت مستقبلات (فكرس) التي تربط دون تمييز منطقة Fc لمعظم الأجسام المضادة7،8 . أثناء تطوير التحليل، من المهم إنشاء عنصر تحكم سلبية لدراسات التحقق من الصحة والمريض عينة الاختبار، مثل المصل التجميعي من الأفراد التي لم تعالج باختبار المادة1. يجب أن نقبل خطوط الخلايا أيضا المصفوفات ذات الصلة من مختلف الأنواع للاستمرارية عبر مراحل التنمية المخدرات1nonclinical والسريرية، ومرحلة ما بعد التسويق. عنصر آخر هو تحديد عنصر تحكم الإيجابية للفحص. تم اختيار عنصر التحكم الإيجابي مقايسة الامتصاص خلية الحلقات استناداً إلى قدرتها على الربط العلاج وتحييد امتصاص عن طريق CI-M6PR9،1. غالباً ما يصعب الحصول على كميات مفيدة أو المستدامة لتحييد أنتيسيرا من البشر لاستخدامه كعنصر تحكم مقايسة، ولا سيما في الأمراض النادرة السكان المريض2. وتشمل البدائل أنتيسيرا من فرط تحصين الحيوانات، أو أجسام [بولكلونل] أو [مونوكلونل] تنقية تقارب ارتفعت إلى المصفوفة ذات الصلة المقايسة1. أثناء استخدام مصفوفة إبلاغها، فمن الممكن أن العوامل المثبطة خلاف الأجسام المضادة الموجودة في المصفوفة قد تحول دون استيعاب فريق خبراء الاستعراض. هو عنصر حاسم آخر في الفحص فريق خبراء الاستعراض مترافق فلوروفوري. وينبغي تقييم اختيار فلوروفوري لتصريف فريق خبراء الاستعراض لكل فريق خبراء الاستعراض، على أساس الحاجة للفحص للسطوع واستقرار الأس الهيدروجيني والتداخل الطيفي المحتملة إلى قنوات أخرى في سيتوميتير تدفق.

الفحص الموصوفة هنا هو مثال لقياس قبض لبروتين علاجي، مثل الحلقات، أن يدخل الخلية عبر كاريتاس الدولية-M6PR. عدة أفرقة خبراء الاستعراض، تهدف إلى علاج أمراض التخزين الليزوزومية (النساء)، واستخدام هذا المسار لامتصاص الخلية واستهداف الليزوزومية، بما في ذلك ألفا الوسولفاسي لمتلازمة A موركويو، ألفا سيرليبوناسي لمرض باتن CLN2، ألفا أجالسيداسي لمرض فابري، و ألفا الجلوكوسيداسي لمرض بومبي10،11. والغرض من هذا الأسلوب هو لقياس المستويات النسبية لرعايتها التي تتداخل مع المخدرات ملزمة واستيعاب عبر كاريتاس الدولية-M6PR. وهذا يتم في الفرز، توكيدي المتدرجة، وعيار الخطوات3. عينات الفحص الأولى لقبض الإيجابية وثم أكدت إيجابية في الخطوة المؤكدة. أخيرا، قد تضعف عينات الشاشة وتأكيد إيجابية متسلسل لتوليد عيار الأجسام المضادة1. ويوفر هذا يستند إلى الخلية التدفق الخلوي المخدرات امتصاص المقايسة طريقة حساسة وذات الصلة ميتشانيستيكالي في المختبر لقياس رعايتها الخاصة بالمخدرات التي قد تؤثر على الشخصية العقاقير الدوائية. نحن قبل التحقق من صحة الأسلوب واختبار العينات السريرية باستخدام هذه المنصة للمخدرات الوسولفاسي ألفا8. هنا يمكننا وصف البروتوكول مفصلة خطوة بخطوة التي يمكن تطبيقها على البروتينات العلاجية الأخرى أو أفرقة خبراء الاستعراض.

Protocol

مصفوفات البشرية تم شراؤها من مصادر تجارية بموافقة من بهم المؤسسية استعراض المجلس (IRB) ولكن ينبغي أن يعامل كما يحتمل أن تكون معدية. ضمان احتفاظ مختبر البيئة المستخدمة على ثقافة السلامة12.

1-قبل البدء التحليل

  1. إعداد الحلقات مترافق streptavidin الخرز المغناطيسي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة13.
  2. إعداد عينات مراقبة الجودة (جمعية قطر الخيرية): سبايك جسم السيطرة إيجابية (PC) (مثلاً، قبض) في المصفوفة إبلاغها (مثلاً، المجمعة الخدمات القطرية أو المصل).
    ملاحظة: توصي توجيهات إدارة الأغذية والعقاقير وأيما إعداد عالية ومراقبة الجودة منخفضة للتحقق من صحة المقايسة وروتين الاختبار1،14.
    1. على سبيل المثال، الحصول مراقبة الجودة في 10 ميكروغرام/مل، إضافة 10 ميليلتر لمراقبة إيجابية المخزون 1 ملغ/مل إلى 990 ميليلتر من المصفوفة ذات الصلة (مثلاً، CSF) لإجمالي حجم 1,000 ميليلتر.
    2. الكوة عينات مراقبة الجودة في وحدة تخزين مناسبة لواحد استخدام (مثلاً، 50 ميليلتر) وتجميد مختبرين في-60-80 درجة مئوية1.
    3. استخدم (مثلاً، 50 ميليلتر) قاسمة قص-نقطة-تحكم (CC)، مصفوفة إبلاغها لا تعامل مع اختبار المقالة (مثلاً، المجمعة الخدمات القطرية أو المصل) لفترة واحدة وتجميد مختبرين في-60-80 درجة مئوية1.
  3. القيام برد فعل على اقتران بين فلوروفوري وفريق خبراء الاستعراض باستخدام مجموعة البروتين-وضع العلامات وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة15. الكوة العينة في حجم مناسب لواحد استخدام (مثلاً، 50 ميليلتر) وتجميد مختبرين في-60 إلى-80 درجة مئوية.

2-يوم 1: الخلية والطلاء وإعداد نموذج

  1. إعداد لوحة الخلية
    1. استخدام غطاء زراعة الأنسجة والحفاظ على بيئة معقمة للخطوات التالية. رش كل الكائنات التي سيتم وضعها في غطاء محرك السيارة مع الإيثانول 70% والاحتفاظ بيئة نظيفة16،،من1718.
    2. الحارة متوسط نمو الخلية (مثلاً، ربمي-1640 مع 10% الجنين البقري 1% ومصل البنسلين-ستربتوميسين) في حمام ماء أو حبة في19من 37 درجة مئوية.
    3. حساب تي البشرية لمفاوية جوركات الخلايا ولوحة 100 ميليلتر في البئر في 7.5 × 105 خلايا/مل في جولة 96-جيدا-قاع الخلية لوحة الثقافة المناسبة للاستخدام في سيتوميتير تدفق مجهزة محمل لوحة.
      1. على سبيل المثال، استخدام هيموسيتوميتير أو عداد الآلي خلية لعد الخلايا20،21.
      2. ضمان حصول الخلايا على الأقل 70% الجدوى قبل الشروع في هذه التجربة (مثلاً، تقييم الجدوى مع تلطيخ تريبان الأزرق)17.
    4. احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO2 و 95% رطوبة بين عشية وضحاها على ح 14-20.
  2. إعداد نموذج الفحص
    1. تمييع هذا الموضوع أو الاعتداء عينات مراقبة استخدام وسائل الإعلام الحرة المصل (مثلاً، ربمي-1640). في أسلوب المثال هنا، تمييع 1: 2.5 عينات في RPMI 1640 بإضافة 60 ميليلتر من العينة إلى 90 ميليلتر لوسائل الإعلام الحرة المصل. (مثلاً، 8-قطاع أنابيب). تابع إلى الخطوة 3.1 لإجراء التحليل بإعداد فريق خبراء الاستعراض المسمى فلوروفوري.
      ملاحظة: التخفيف من 1: 2.5 مصممة تجريبيا، وهو الأمثل لأسلوب المقدمة هنا. وينبغي تحديد تخفيف العينة المثلى لكل أسلوب التي تم تطويرها.
  3. توكيدي إعداد حبة وعينه
    1. حساب عدد حبات مترافق الحلقات اللازمة للعينات المؤكدة.
      1. لاستخدام المثال، لعينات 10، 10 عينات x 100 ميليلتر من حبات مترافق المكون من كل عينة + 30% إضافية للتعويض عن أي خسائر خلال الخطوة الغسيل = ميليلتر 1,300 من حبات مترافق الحلقات.
    2. دوامة الخرز جيدا. إضافة عدد حبات المحسوبة لأنبوب مخروطي 15 مل للغسيل.
    3. أغسل الخرز المغناطيسي مترافق فريق خبراء الاستعراض بإضافة 1,300 ميليلتر من المخزن المؤقت لاقتران أو كما اقترحت الشركة المصنعة (مثل، مع الفوسفات مخزنة المالحة مع 0.1% بوليسوربيت 20) اتباع الخطوات أدناه13.
    4. دوامة الأنبوب دقيق. ضع الأنبوبة في حامل أنبوب المغنطيسي لمدة 2 دقيقة. دون الإخلال بالخرز، بعناية نضح وتجاهل المادة طافية.
      ملاحظة: سوف تتحول الحل من البنى الداكن واضحة عندما يتم سحبها الخرز للمغناطيس.
    5. ريسوسبيند الخرز مع 1,300 ميليلتر من اقتران المخزن المؤقت. كرر الخطوات المياه والصرف الصحي لما مجموعة أربع يغسل.
    6. بعد الغسيل النهائي، تعليق الخرز في 1,300 ميليلتر من اقتران المخزن المؤقت (محسوبة مسبقاً في الخطوة 2.3.1.1). إضافة 100 ميليلتر كل جيدا إلى 96، حسنا، أبيض، جولة السفلي، ولوحة البولي بروبلين غير ملزم وفقا للخريطة لوحة (مثلاً، واحد توكيدي جيدا لكل نموذج أو مراقبة الجودة؛ إرادة نموذج تقسيم التكرارات عند المحتضنة مع فريق خبراء الاستعراض المسمى fluorophore).
    7. وضع اللوحة على مغناطيس الفساتين الجانب 96-جيدا وتسمح الخرز لتشكيل بيليه. نضح المادة طافية واضحة وتخلص منه بعناية.
      ملاحظة: الحل سوف تتحول من الظلام براون إلى واضحة بعد حوالي 1 – 2 دقيقة على المغناطيس الفساتين الجانب. وتسمى الخرز المتحصل عليها الخرز "الجافة".
    8. إذا كانت العينات فحص إيجابية وهي التي أكدت، إضافة 100 ميليلتر من كل عينة مع أو بدون الخرز مترافق الحلقات في المناسبة/تعيين جيدا. ختم اللوحة مع فيلم بلاستيك واهتز لمدة 60 دقيقة على الأقل في شاكر روتاري في حوالي 800 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
      ملاحظة: أعد سابقا وجمدت الإيجابية والسلبية ينبغي إدراج جمعية قطر الخيرية، ولجنة التنسيق على كل لوحة.
    9. بعد الحضانة، وضع لوحة توكيدي على المغناطيس الفساتين الجانب 96-جيدا وتسمح الخرز لتشكيل بيليه.
  4. عيار تمييع إعداد سلسلة
    1. لإعداد سلسلة عيار، وتمييع متسلسل العينة في مصفوفة تجميع عدد كاف من أوقات عبور عيار محدد سلفا قص النقطة1.
    2. على سبيل المثال، مزيج 30 ميليلتر من العينة إلى 60 ميليلتر من مصفوفة المجمعة في سلسلة 1:3 إضعاف لما مجموعة 8 تخفيف (مثلاً، 8-قطاع أنابيب). تابع إلى الخطوة 3.1 لإجراء الفحص لإعداد المكون المسمى فلوروفوري.

3-يوم 1: الفحص الداخلي

  1. إعداد المكون المسمى فلوروفوري في المتوسط خالية من المصل (مثلاً، 60 ميليلتر لكل بئر، أو حوالي 6 مل/لوحة).
    1. على سبيل المثال، لإعداد 10 مل من 1 ميكروغرام/مل المكون المسمى فلوروفوري، أضف 10 ميليلتر من الأسهم 1 ملغ/مل المكون المسمى فلوروفوري لمل 9.99 لوسائل الإعلام الحرة المصل (مثلاً، ربمي-1640).
  2. في حضانة جديدة إضافة لوحة (مثل، لوحة البوليبروبيلين 96، حسنا، أبيض، أسفل المائدة المستديرة، غير ملزم)، إعداد العينات من الخطوة 2.2، 2.3، أو 2.4 وفريق خبراء الاستعراض المسمى فلوروفوري في خليط 1:1 في الآبار المكررة (مثل، نقل 60 ميليلتر من كل إعداد نموذج وإضافة 60 ميليلتر من فريق خبراء الاستعراض كل بئر المسمى fluorophore).
    ملاحظة: يتم توفير مخطط لوحة تجربة مثال في الشكل 1.

Figure 1
رقم 1: مثال على تخطيط لوحة التجربة. عينات وفريق خبراء الاستعراض المسمى fluorophore كانت المحتضنة بين عشية وضحاها في 2-8 درجة مئوية. فحص عناصر التحكم مثل مراقبة جودة عالية (هقك)، مراقبة الجودة المنخفضة (لقك)، ومراقبة الجودة السلبية (نقك) وأكدت على زوايا المعاكس للوحة لتقييم لوحة التوحيد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

  1. خلط العينات والحلقات المسمى فلوروفوري من بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات مع ماصة متعددة القنوات. التفاف اللوحات في إحباط واحتضانها لهم بين عشية وضحاها في 2 – 8 درجة مئوية ح 14-20.

4-يوم 2: إضافة العينات المعدة للخلايا

  1. إزالة plate(s) حضانة عينة من الحضانة في 2 – 8 درجة مئوية والحارة اللوحات بوضعها في حمام حبة في 37 درجة مئوية لمدة 10 – 15 دقيقة.
  2. إزالة الخلايا من حاضنة2 CO. إجراء فحص مرئي للخلايا مطلي باستخدام مجهر مقلوب ضمان أن تظهر الخلايا سليمة وموزعة بالتساوي عبر17،الآبار19.
  3. إضافة 100 ميليلتر عينات مختلطة سابقا والمسمى فلوروفوري ERT إلى لوحة الخلية وفقا للخريطة لوحة تجريبية.
  4. ضع لوحة الخلية مع العينات المضافة إلى حاضنة2 CO في 37 درجة مئوية. احتضان لوحة ح 3 و ± 15 دقيقة.
    ملاحظة: أنشئ هذا الوقت في المختبر الأمثل للاستجابة إشارة إلى الضوضاء في المقايسة.
  5. الطرد المركزي لوحة الخلية لمدة 6 دقائق في 320 x ز في أجهزة الطرد مركزي منضدية في 14 – 18 درجة مئوية. تأكيد وجود بيليه خلية في الجزء السفلي من لوحة الآبار.
  6. عقد اللوحة بزاوية 30-45 درجة مئوية. بعناية إزالة المادة طافية من كل بئر دون إزعاج بيليه الخلية. إضافة 200 ميليلتر من x DPBS 1 على بيليه خلية في كل بئر ريسوسبيند الخلايا.
  7. كرر الخلية الغسيل الخطوات لما مجموعة 3 يغسل. الشروع فورا في الخطوة 5 لتلطيخ بقاء الخلية.

5-يوم 2: الخلية تلطيخ البقاء

  1. استخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 100 ميليلتر من إيجاد حل عملي من 1 × لايف/الميت وصمة عار لكل بئر، المحدد للطول موجي انبعاثات يختلف من فريق خبراء الاستعراض المسمى فلوروفوري والمعدة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة22.
  2. احتضان اللوحة لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام. الطرد المركزي لوحة لدقيقة 6 في 320 x ز في أجهزة الطرد مركزي منضدية في 14 – 18 درجة مئوية.
  3. بعناية إزالة المادة طافية من كل بئر دون إزعاج بيليه الخلية. تغسل الخلايا 1 x مع 1 x DPBS.

6-يوم 2: تحديد الخلايا مع بارافورمالدهيد 1%

  1. استخدام ماصة متعددة القنوات، الاستغناء عن 100 ميليلتر من بارافورمالدهيد 1% مبردة (في 2 – 8 درجة مئوية) (منهاج عمل بيجين) في كل بئر.
  2. ختم بلوحات ودوامه النبض لخلط بلطف. التفاف اللوحة في إحباط ووضعه في 2 – 8 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل للسماح بالتثبيت.
    ملاحظة: كن حذراً لتجنب الرش على ختم اللوحة.
  3. إضافة 50 ميليلتر من 1 x DPBS في كل بئر استخدام ماصة الأقنية صعودا وهبوطاً قبل التحليل.

7-التدفق الخلوي

  1. وضع اللوحات على cytometer التدفق مع محمل لوحة وتشغيلها.
  2. حيازة وتسجيل الأسفار متوسط قياس الكثافة (MFI) باستخدام البرمجيات التدفق الخلوي (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: انظر الشكل 2 كمثال لإعدادات لودر. معدل تدفق العينة، حجم العينة، والخلط بين حجم وسرعة خلط وعدد يمزج هي الأمثل لهذا التحليل. ويمكن تعديل هذه المعايير باستخدام الأزرار "الأسهم أعلى" أو "أسفل" بجوار الأرقام لكل معيار، اعتماداً على أن التدفق الخلوي اقتناء برمجيات23.

Figure 2
الشكل 2: مثال لإعدادات محمل cytometer التدفق. ينبغي أن يكون الأمثل إعدادات لودر لكل التحليل التي يتم تطويرها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

  1. قم بإنشاء cytometer تحليل/غيتس/قطع كما هو مبين في الشكل 3.
    ملاحظة: قد تختلف إنشاء بوابة وتطبيقها لكل برامج التدفق الخلوي23.

Figure 3
الشكل 3: التدفق الخلوي النابضة استراتيجية- خلايا جوركات فصل من مجموع الأحداث وجمعها التآمر (FSC) مبعثر الأمام مقابل القنوات (SSC) الجانب مبعثر ورسم بوابة حول السكان المستهدفين. تم فصل نوع (الخلايا المفردة) من دوبليتس أو خلية أكبر المجاميع باستخدام منطقة منتدى التعاون الأمني (منتدى التعاون الأمني-أ) وقنوات الطول (منتدى التعاون الأمني-H) منتدى التعاون الأمني. قد اختارت الخلايا الحية النابضة في الخلايا القميص السلبية لبقاء وصمة عار. تم قياس في الخلايا جوركات واحد، ويعيش fluorescence متوسط الكثافة (MFI) والمرسومة كرسم بياني. حظر مؤسسة مونتانيار قيم الخلايا بامتصاص العقاقير (مثلاً، هقك)، والخلايا التي تحتوي على عنصر التحكم وترد المبالغ لامتصاص (الأحمر والأزرق، على التوالي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

  1. استبعاد الخلايا الميتة من التحليل وتسجيل نحو أحداث 10,00023.

8-بيانات التحليل

  1. تصدير البيانات (مؤسسة مونتانيار الخام) إلى برنامج التحليل (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: اعتماداً على التحليل اللازم، تحليل البيانات التالية قد يتم تنفيذ باستخدام برمجيات التحليل.
  2. حساب متوسط مؤسسة مونتانيار الآبار مكررة (جمعية قطر الخيرية وعينات) ومعامل اختلاف (% السيرة الذاتية) لتقييم مدى انتشار تغير التكرارات من الوسط.
    Equation 1
    Equation 2
    Equation 3
  3. للعينات وجمعية قطر الخيرية التي تم فحصها في المقايسة، حساب النسبة المئوية إشارة تثبيط (% SI) بالنسبة لمؤسسة مونتانيار يعني للمصفوفة المجمعة جمعية قطر الخيرية CC.
    Equation 4
  4. إذا لزم الأمر، حساب معدلات الاسترداد (Rr) لجمعية قطر الخيرية مؤكدة والعينات بالنسبة للقيم المناظرة في الشاشة.
    Equation 5

Representative Results

في اليوم الأول من الأسلوب، مذاب قاسمة مجمدة من الخلايا جوركات ومطلي، وتم إعداد عينات الاختبار. ويبين الشكل 1 مخطط لوحة مثال. اليوم الثاني، كانت مختلطة مع الخلايا جوركات العينات والمحتضنة في 37 درجة مئوية لحوالي 3 ساعات و 15 دقيقة. الخلايا ثم غسلها، والثابتة مع منهاج عمل بيجين، وحلل في سيتوميتير تدفق. ويبين الشكل 2 مثالاً تدفق إعدادات سيتوميتير.

التدفق الخلوي النابضة استراتيجية صممت لقياس كمية المخدرات مترافق fluorophore في العيش وحيد جوركات الخلايا24 (الشكل 3). تم فصل الخلايا من بين الأنقاض عن طريق رسم بوابة التي تستثني الحطام الخلوية [منخفضة عادة، إلى الأمام مبعثر (FSC)] والخلايا الميتة [عادة، الجانب عالية مبعثر (SSC)]، ترك الخلايا الحية فقط لتحليل25. ثم تم فصل الخلايا المفردة من مجموعات الخلايا عن طريق رسم بوابة التي تستثني منطقة منتدى التعاون الأمني عالية ومنخفضة الارتفاع، منتدى التعاون الأمني26. الخلايا تعامل مع وصمة عار جدوى التي وصفت أي خلايا ميتة أو غير صحية دون غشاء سليمة، وتم إنشاء بوابة إضافية لاستبعاد الخلايا الميتة22. مؤسسة مونتانيار للخلايا الحية واحدة استخدمت للتحليل لاستيعاب الحلقات مترافق فلوروفوري. كمثال على إمكانية فحص نتائج الفحص، أعاق المصفوفة ارتفعت بنسبة عالية من مركب الأجسام المضادة لمكافحة المخدرات إيجابية تحكم [مثلمراقبة جودة عالية (هقك)] امتصاص الحلقات مترافق فلوروفوري، أدى مؤسسة مونتانيار منخفضة من حوالي 300 (الشكل 3). على النقيض من ذلك، ينبغي أن يكون للخلايا المحتضنة مع المصفوفة في غياب جسم التحكم الإيجابي مؤسسة مونتانيار أعلى (مؤسسة مونتانيار = 37,830 في الشكل 3)، مما يدل على الإقبال على فريق خبراء الاستعراض مترافق فلوروفوري.

تحييد جسم السيطرة الإيجابية على سبيل المثال هنا اختيرت استناداً إليه العمل من المخدرات (أي، استيعاب فريق خبراء الاستعراض من خلال كاريتاس الدولية-M6PR). كان فريق فلوروفوريس أيضا اختبار ومقارنة لحساسية الفحص الأمثل والنطاق الديناميكي1. تم اختبار 5e سايفر سبب به الأسفار زيادة في درجة حموضة حمضية، التي قد تكون ذات صلة ببعض أفرقة خبراء الاستعراض كتدبير إضافي لاستهداف الليزوزومية من المخدرات27. ودرست أيضا صبغة فلورسنت خضراء (مثل أليكسا فلور 488)، وصبغة فلورسنت استعملنا (مثلاً، أليكسا فلور 647). مثال على فلوروفوريس كيف مختلفة قد تؤدي ويرد في الشكل 4a و 4b. في المثال، كان "الفريق 647 فلور أليكسا" أداء أفضل نظراً لحساسية فائقة (مثلاً، % أعلى SI في أدنى تركيز PC) ودينامية واسعة النطاق (~ 3 من حيث الحجم).

Figure 4
الشكل 4: مثال ينتج من يصرف الحلقات فلوروفوري مختلفة- (أ) أثناء تطوير التحليل، ينبغي تقييم منحنى تخفيف الرقابة إيجابية (PC) باستخدام مختلف أفرقة خبراء الاستعراض مترافق fluorophore. في المثال الموضح هنا، أفرقة مترافق fluorophore اثنين (5e أليكسا فلور 488 وسايفر) في 6.25 ميكروغرام/مل وأكثر إشراقا الحلقات fluorophore مترافق (أليكسا فلور 647) في 1.56 ميكروغرام/مل تم اختبار حضور التركيزات المتزايدة لرعايتها مراقبة إيجابية. (ب) هذا الفريق يظهر المنحنيات من الفريق رسوم بيانية، استخدام مؤسسة مونتانيار لإظهار الزيادة الكبيرة في النطاق الديناميكي باستخدام فريق خبراء الاستعراض مترافق 647 فلور أليكسا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الأسلوب الموصوفة نهج متسلسل لاكتشاف وتأكيد، والتحريف على مستوى شبه كمي لقبض عيار3. إنشاء المقايسة على استعداد للتحقق من المعلمات بما في ذلك تحليل الحساسية، الدقة، الانتقائية، وخصوصية، التسامح المخدرات، ومتانة، وينبغي أن تقيم نقاط قطع وفقا للمنشأة البصرية1،3 .

واعتبرت عينات إيجابية محتملة في هذا التحليل عندما تم الحصول على قيم % SI أكبر من العرض قطع نقطة (SCP). حددت اللجنة الدائمة كان إحصائيا باختبار عينات المخدرات-ساذجة من سكان تمثيلاً وقياس انخفاض نسبي في إشارة كثافة (SI)3. التوجيه (على سبيل المثال من إدارة الأغذية والعقاقير) توصي بأن يتم تأسيس اللجنة الدائمة المئويال 95 لمجموعة البيانات الموزعة عادة، وأساليب لحساب اللجنة الدائمة منذ1ووصف بالتفصيل في مكان آخر. أي عينة أن تناقص إشارة المقايسة (تقاس كزيادة في النسبة المئوية SI) عند أو فوق اللجنة الدائمة أنها عاقدة العزم على أن تكون إيجابية محتملة، وعينات مع نتائج أعلى من اللجنة الدائمة (بدون تغيير أو نقصان في % SI) تعتبر سلبية.

تم اختبار العينات التي فحصها إيجابية (% SI أعلاه اللجنة الدائمة) في مقايسة المؤكدة لتحديد الطابع الخاص لرعايتها لفريق خبراء الاستعراض. وكان يؤديها المقايسة توكيدي قبل حضانة العينات مع الحلقات مترافق الخرز المغناطيسي لإزالة الأجسام المضادة الخاصة بالمخدرات أو العوامل المثبطة. تم تقييم الاختطار النسبي (نسبة لمؤسسة مونتانيار المؤكدة لفحص مؤسسة مونتانيار) لتحديد عدد ريسوليوت إزالة من العينة. RR أعلى من عتبة المحسوبة الإيجابية [أينقطة قطع توكيدي (CCP)] يدل على وجود رعايتها لمكافحة المخدرات. كما هو الحال في الفحص الفحص، ينبغي إنشاء الحزب الشيوعي الصيني أولاً بتقييم المعاملة السذاجة عينات من سكان ممثلة في مقايسة توكيدي. الحزب الشيوعي الصيني كان استناداً إلى معدل إيجابية كاذبة 1% تصميماً إحصائيا وتم تعيين العتبة مؤكدة إيجابية عينة (الشكل 5)3.

عينات فحص وأكد إيجابية متسلسل المخفف واختبارها في مقايسة عيار لتحديد المستوى النسبي أو عيار لرعايتها في كل عينة. هو إضعاف أعلى الذي عينة اختبارات إيجابية عندما اجتازت عتبة معينة [مثلاً عيار قطع نقطة (TCP)]1،عيار (الشكل 5) عينة3.

Figure 5
الشكل 5: مثال على نموذج اختبار النتائج. هذه اللوحات إظهار أمثلة العينات التي اختبرت إيجابية أو سلبية بالفرز أما أعلى أو أسفل الاستهلاك والإنتاج المستدامين من 17.51% SI. ثم اختبار عينات في مقايسة توكيدي استخدام المخدرات مترافق الخرز المغناطيسي إلى استنزاف الأضداد الخاصة بالمخدرات من العينات قبل الاختبار في مقايسة إيجابية. عينات بمعدل استرداد (RR) أكبر من نقطة قطع توكيدي (أي، اختطار نسبي = 1.315) اعتبرت أن يتم تأكيد إيجابية. كانت تضعف العينات التي أكدت إيجابية حتى الإشارة عبرت عيار قطع نقطة (TCP) لإنشاء قطع عيار (عامل إضعاف) الذي يساوي نتيجة عينة عيار نقطة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

تم اختبار التكرار المقايسة وتقلبه على مدى عدة أيام، ومع محلل واحد أو أكثر. وكانت جمعية قطر الخيرية استعداد في دفعة واحدة في البداية والكوتيد في لاستخدام 1 x. على مدى 3 (د)، يقوم المحللون اثنين المقايسة مع عدة مجموعات من جمعية قطر الخيرية لإثبات دقة التحليل. في المثال البيانات المبينة، % السيرة الذاتية لدقة المقايسة بين وداخل جمعية قطر الخيرية أقل من التوصية بتوجيه إدارة الأغذية والعقاقير % السيرة الذاتية < 20% (الشكل 6)1.

Figure 6
رقم 6: مثال لمراقبة الجودة دقة البيانات التي تم إنشاؤها على مدى ثلاثة أيام مع اثنين من محللي. حسبت دقة البيانات بتحليل تباين (ANOVA) باستخدام الصيغة المعروضة في ديسيلفا et al. 28-ترد دفعة داخل (داخل يعمل) وإحصاءات دفعة بين الوكالات (بين تشغيلات) ك % عام الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تحييد الأجسام المضادة أو غيرها من العوامل التي تحول دون استيعاب فريق خبراء الاستعراض من خلال CI M6PR لديها القدرة على التأثير على السلامة أو فعالية الحلقات1. ولذلك، من المهم تقييم ريسوليوت في موضوع العينات باستخدام نموذج قوية ذات صلة بالمخدرات إليه العمل. نحن وآخرون وجدوا أن أداء بعض تنسيقات الحشري (مثلاً، ثنائي مستقبلات، التعبير لوسيفراس، إلخ) لا تتماشى مع توصيات السلطة الصحية لدقة الفحص وإمكانية تكرار نتائج حساسية 29-في أسلوب العينة الموضحة هنا، يعمل خلايا جوركات التي تعبر عن M6PR CI الذاتية لرصد رعايتها محددة لاستيعاب الحلقات الليزوزومية. جنبا إلى جنب مع قراءات تدفق الخلوي، هذا التحليل يستخدم نموذج خلية فيزيولوجية مع دقة التحليل مناسبة وحساسية وإمكانية تكرار نتائج وعينه عالية الإنتاجية. احصل على كشف مع تدفق طبق قراءات الخلوي أيضا إلى دلائل أخرى. على سبيل المثال، قد وضعت أساليب للكشف عن الأجسام المضادة موجودة مسبقاً ضد التهاب الكبد الوبائي ه والفيروسات المرتبطة بالغدة (إف)30،31.

وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول تحديد فلوروفوري مناسبة، تتضمن لقك أن مراقبي الاعتداء حساسية، ضمان مستوى كاف من بقاء الخلية، والحفاظ على الالتزام الصارم بأوقات الاحتضان. في المثال المعروض هنا، مترافق fluorophores (مثلأليكسا فلور 488، 647 فلور أليكسا و 5e سايفر)، إلى فريق خبراء الاستعراض الليزوزومية، تباينا في أدائها. واختير أليكسا فلور 647، الذي كان أيضا fluorophore اختبار ألمع32، لمزيد من التحليل في التنمية. نوصي بأن تقييم عدة فلوروفوريس في وقت مبكر في تطوير التحليل لتوفير أفضل حساسية والنطاق الديناميكي. ينبغي رصد حساسية الفحص أثناء اختبار عينة من بينهم لقك التي قريبة من الحد الأقصى حساسية التي ستفشل في % 1 ل تشغيل اختبار1. جنبا إلى جنب مع هقك، لقك أيضا بمثابة ملاءمة نظام مراقبة الجودة لرصد الانجراف المقايسة مع مرور الوقت3. ويتحقق بقاء الخلية الأمثل والأداء بإعداد بنك خلية مختبرين تستخدم مرة واحدة والمؤهلة في المصارف الخلية الجديدة استناداً إلى نتائج مراقبة الجودة قابلة للمقارنة3،18. الخلية وأوقات الاحتضان مترافق fluorophore المخدرات أيضا المركزية لأداء تحليل يتفق نظراً للإقبال على المخدرات يزيد بمقدار الوقت المحتضنة المخدرات مع الخلايا. لتقليل التقلبات اليومية في الإقبال على المخدرات، قد طبعت نموذج البيانات لعينات مراقبة مصفوفة المجمعة في كل لوحة (مثلاً، نقطة قطع عينات التحكم في الأسلوب أعلاه). عامل مهم آخر في إنتاج بيانات متسقة مع هذا الأسلوب هو رصد لوحة التوحيد والتقليل إلى أدنى حد ممكن تأثيرات الحافة. تجربة أولية قد تشمل إجراء الفحص استخدام QC واحدة عبر لوحة كاملة، في حين يجوز إجراء تجارب أكثر قوة خلال فحص التحقق من الصحة (مثلاً، والضبط والدقة)1. وهذا يوضح أهمية تخطيط خريطة لوحة33. كما هو موضح في المثال خريطة لوحة، وضعت عينات مراقبة الجودة على جانبي الشاشة لوحة تماثل التي يمكن تتبعها على مر الزمن مع ليفي--جينينغز المخططات34.

بينما ترصد هذه المقايسة رعايتها وغيرها من العوامل التي قد تعوق امتصاص ERT الليزوزومية، يمكن إجراء المزيد من التجارب لتأكيد تثبيط امتصاص بسبب الأجسام المضادة. خيار واحد هو التعامل مع عينات مع البروتين A/غرام/لتر، الذي يربط الغلوبولين المناعي35غير على وجه التحديد. إذا تواصل عينات اختبار إيجابية بعد البروتين استنفاد A/G/L، قد تكون عوامل مثبطة جسم غير مسؤولة عن إعاقة امتصاص المخدرات. الأسلوب الموصوفة هنا صمم لقياس تثبيط امتصاص جسم بوساطة، ومراقبة إيجابية ومقايسة أخرى المعلمات ينبغي أن يعاد النظر في حالة العثور على نسبة مئوية عالية من عينات هذا الموضوع مع العوامل المثبطة غير جسم.

كما يمكن وصف المقايسة كذلك تثبت يهرب المخدرات المسمى فلوروفوري إلى حجرة الخلوية المناسبة استناداً إلى إليه عمل هذا الدواء. في المثال المعروض هنا، يتوقع فريق خبراء الاستعراض ربط CI-M6PR على سطح الخلية والحركة إلى يحلول. أننا سبق الإبلاغ عن نتائج تجارب عديدة تشير إلى أن ما يقرب من كل إشارة الفلورسنت لوحظت في النتائج الأسلوب من الحلقات المسمى فلوروفوري في يحلول8. ووجدنا أن إشارة المكون المسمى fluorophore ألغى بعد علاج للخلايا مع سيتوتشالاسين ب، الذي يعطل الاستيعاب الداخلي عن طريق تثبيط إعادة التنظيم أكتين. أيضا، التجارب أن تطفئ fluorophore الخارجية مع تريبان الأزرق، أو استيعاب تباطأ بوضع الخلايا في 4 درجات مئوية، تشير إلى أن المكون المسمى fluorophore متغللة بسرعة، والأسفار القليل جداً يرجع إلى فريق خبراء الاستعراض الالتزام على سطح الخلية. وأكد استهداف الليزوزومية تصور التعريب المشارك لصبغ ليسوتراكير حساسة لدرجة الحموضة مع المخدرات مترافق fluorophore استخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. تحديد للامتصاص من خلال CI M6PR أيضا من الممكن التحقق من استخدام M6P خارجية للتنافس مع العقاقير المسماة لربط مستقبلات. ينبغي القيام بتجارب مماثلة التحقق من حركية امتصاص والتعريب الخلوية مترافق fluorophore المخدرات في فحوصات أخرى.

وقد استخدمت منصة هذا التحليل يستند إلى الخلية لدراسة رعايتها للعقاقير العلاجية التي تستخدم الالتقام بوساطة مستقبلات CI-M6PR. ونحن مؤخرا أفادت النتائج باستخدام هذه المنصة المقايسة التي أظهرت أي ارتباط بين تنمية كفاءة المخدرات وقبض على الوسولفاسي ألفا36،37. للتحقق من صحة الفحص السريري عينة الاختبار، والمعلمات، بما في ذلك تحليل الحساسية، الدقة، الانتقائية، وخصوصية، التسامح المخدرات، ومتانة، وخفض نقطة، ينبغي تقييم وفقا البصرية الثابتة3، 4-كما تجدر، لتعويض أفرقة خبراء الاستعراض، أنه قد وضع رعايتها التي يمكن أن تتداخل مع نشاط المخدرات من خلال الربط قرب موقع حفاز إنزيم. بشكل عام، ونحن نعتبر رصد هذا النوع من قبض تكون ذات أولوية أدنى نظراً للبيئة الحمضية و proteolytic القاسية يحلول ليست مواتية للمكون من جسم التفاعلات2،،من3940. ومع ذلك، من الممكن أن ريسوليوت proteolytic مقاومة موجودة، وقد تحول دون الجزء الحفاز ل المخدرات40. هذه المقايسة شاشات المسمى فلوروفوري المكون من امتصاص يحلول، ووجود قيود التحليل هو عدم القدرة على رصد proteolytic مقاومة لرعايتها. في حالة الاشتباه في هذا النوع من قبض على أساس السلامة أو فعالية البيانات، ينبغي وضع مقايسة التي تراقب نشاط فريق خبراء الاستعراض والمستخدمة لاختبار عينات.

من المهم تقييم الاستمناع في فهم آثار ريسوليوت على المخدرات سلامة وفعالية. تحديد ريسوليوت قادرة على إعاقة في المختبر المخدرات امتصاص عن طريق CI M6PR يوفر فرصة لفهم النشاط قبض في فيفو. الطريقة المعروضة هنا يستخدم خط خلية بشرية التي تعرب عن CI-M6PR لقياس تدخل مترافق fluorophore الليزوزومية ERT الخلوية الإقبال. وقد استخدمت هذا الأسلوب فعلا لرصد رعايتها لأفرقة خبراء الاستعراض عدة تهدف إلى علاج أمراض التخزين الليزوزومية. قد تنطبق هذه منصة الفحص إلى أساليب أخرى لدراسة آثار رعايتها على العلاجات البيولوجية التي تتطلب من استيعاب خلوية لوظيفتها الصحيحة.

Disclosures

الكتاب هي الموظفين والمساهمين في شركة الأدوية بيومارين

Acknowledgments

المؤلفين قد لا إعلامات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter unit, 500 mL vacuum filter flasks Corning CLS430769
Round Bottom 96-well culture plates Thermo-Nunclon 163320
Sterile reagent reservoirs VistaLab 3054-1004
96 well white round bottom polystyrene microplate plate Corning 3605
96-well Polypropylene Tubes, 8-Tube Strips Corning 4408
Magnetic bead separator tube rack V&P Scientific, Inc VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3
DynaMag -2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
DynaMag -96 Side Skirted Magnet Thermo Fisher Scientific 12027
BD FACSCanto II Flow Cytometer BD Biosciences
BD High Throughput Sampler (HTS) BD Biosciences
BioRad TC20 Automated Cell Counter BioRad 1450103
Microplate Shaker VWR 12620-928
Galaxy MiniStar Microcentrifuge VWR C1413
tissue culture CO2 incubator Nuaire NU-4750
Biosafety cabinet Labcono Purifier Cell Logic +
Jurkat Cell Line ATCC TIB152™
Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit Thermo Fisher Scientific A20173
Dynabeads M270 Streptavidin Thermo Fisher Scientific 65306
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin Thermo Fisher Scientific 21343
RPMI-1640 1x Medium Life Technologies A10491-01-500mL
Fetal Bovine Serum (FBS) ATCC 30-2020
Pen-Strep (100x) liquid formulation Corning 30-002-CI
1x DPBS without calcium and magnesium Corning 21-031-CV
4% Para-formaldehyde Electron Microscopy Science 15735-85
LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Life Technologies L34955
Tween 20 Sigma P1379-100mL
Bovine Serum Albumin Sigma 3059
Pooled human matrix (e.g. human serum or cerebrospinal fluid) Bioreclamation IVT request a quote from website
VWR Polyester Plate Film VWR 60941
Seal & Sample Aluminum Foil Beckman Coulter 538619

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. CDER. Assay Development and Validation for Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products (Draft). , FDA Guidance for Industry. (2016).
  2. Gupta, S., et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. Journal of Immunological Methods. 321, 1-18 (2007).
  3. Gupta, S., et al. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55, 878-888 (2011).
  4. Pedras, A. NAb me well- FDA Regulatory Perspectives on Neutralizing Antibody Assays. BEBPA Forum. , (2015).
  5. Stovold, C. NAB Assay Development and Validation Immunogencity Workflow. Annual BEBPA Bioassay Meeting. , (2013).
  6. Kromminga, A. Neutralizing anti-drug antibodies Emerging Trends and Clinical Impact. Symposium. , IPM Biotech. (2013).
  7. Davis, R. S., Wang, Y. H., Kubagawa, H., Cooper, M. D. Identification of a family of Fc receptor homologs with preferential B cell expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 9772-9777 (2001).
  8. Melton, A. C., et al. Antibodies that neutralize cellular uptake of elosulfase alfa are not associated with reduced efficacy or pharmacodynamic effect in individuals with Morquio A syndrome. Journal of Immunological Methods. 440, 41-51 (2017).
  9. U.S. Department of Health and Human Services. Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Guidance for Industry. S6 Addendum to Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals. , ICH. (2012).
  10. Lee, K., et al. A biochemical and pharmacological comparison of enzyme replacement therapies for the glycolipid storage disorder Fabry disease. Glycobiology. 13, 305-313 (2003).
  11. Kirkegaard, T. Emerging therapies and therapeutic concepts for lysosomal storage diseases. Expert Opinion on Orphan Drugs. 1, 385-404 (2013).
  12. Miller, J. M., et al. Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. Morbidity and Mortality Weekly Report. , Available from: https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su6101a1.htm 1-101 (2012).
  13. Invitrogen by ThermoFisher Scientific. Dynabeads M-270 Streptavidin. , (2015).
  14. European Medicines Agency. Guideline on Immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins. , European Medicines Agency. (2017).
  15. ThermoFisher Scientific. Molecular Probes Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit (A20173). , (2004).
  16. JoVE Science Education Database. An Introduction to Working in the Hood. Journal of Visualized Experiments. , General Laboratory Techniques (2018).
  17. Invitrogen and Gibco. Cell Culture Basics Handbook. , ThermoFisher Scientific Inc. (2010).
  18. Coecke, S., et al. Guidance on Good Cell Culture Practice. Alternatives to Laboratory Animals. 33, 261-287 (2005).
  19. ThermoFisher Scientific. Introduction to Cell Culture. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/introduction-to-cell-culture.html (2018).
  20. JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Journal of Visualized Experiments. , Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  21. Bio-Rad Laboratories. Counting Cells with Bio-Rad's TC20(TM) Automated Cell Counter. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=sDHOL7UEL1M (2012).
  22. ThermoFisher Scientific. User Guide LIVE / DEAD Fixable Dead Cell Stain Kits. , (2016).
  23. Biosciences. Getting Started with BD FACSDiva Software. , BD Biosciences. (2007).
  24. Biosciences. BD FACS Canto II Instructions For Use. , (2007).
  25. Quirke, P. Introduction to Flow Cytometry: A Learning Guide. Journal of Clinical Pathology. 45 (3), (2002).
  26. Bio-Rad Laboratoratories. A guide to gating in flow cytometry. , Available from: https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html (2016).
  27. Minor, L. K. Handbook of Assay Development in Drug Discovery. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2006).
  28. Desilva, B., et al. Recommendations for the Bioanalytical Method Validation of Ligand-binding Assays to Support Pharmacokinetic Assessments of Macromolecules. Pharmaceutical Research. 20, (2003).
  29. Hu, J., et al. Comparison of cell-based and non-cell-based assay platforms for the detection of clinically relevant anti-drug neutralizing antibodies for immunogenicity assessment of therapeutic proteins. Journal of Immunological Methods. 419, 1-8 (2015).
  30. Cai, W., et al. A high-throughput neutralizing assay for antibodies and sera against hepatitis E virus. Scientific Reports. 6, (2016).
  31. Charles River. A Flow Cytometric Method to Assess Neutralizing Antibodies to AAV Gene-Therapy Vectors. Charles River Researcher. , (2015).
  32. Biosciences. BD Biosciences Relative Fluorochrome Brightness. BD Biosciences. , Available from: http://www.bdbiosciences.com/us/applications/research/multicolor-flow/m/745795/overview 16181 (2014).
  33. Waritani, T., Chang, J., McKinney, B., Terato, K. An ELISA protocol to improve the accuracy and reliability of serological antibody assays. MethodsX. 4, 153-165 (2017).
  34. Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , 1-30 (2004).
  35. Thermo Fisher Scientific. Tech Tip #34. Binding characteristics of antibody-binding proteins: Protein A, Protein G, Protein A/G and Protein L. , (2013).
  36. Long, B., et al. Long-term Immunogenicity of Elosulfase Alfa in the Treatment of Morquio A Syndrome: Results From MOR-005, a Phase III Extension Study. Clinical Therapeutics. 39, (2017).
  37. Schweighardt, B., et al. Immunogenicity of Elosulfase Alfa, an Enzyme Replacement Therapy in Patients with Morquio A Syndrome: Results from MOR-004, a Phase III Trial. Clinical Therapeutics. 37, (2015).
  38. Schneider, Z. Importance of isoelectric point (pI) of antibodies. Antibody Society. , Available from: http://www.antibodysociety.org/importance-isoelectric-point-pi-antibodies/ (2017).
  39. Mellman, I. R. A., Plutner, H. Internalization and Degradation of Macrophage Fc Receptors Bound to Polyvalent Immune Complexes. The Journal of Cell Biology. 98, 1170-1177 (1984).
  40. Wang, J., et al. Neutralizing antibodies to the therapeutic enzymes: considerations for testing, prevention and treatment. Nature Biotechnology. 26, 901-908 (2008).

Tags

أمراض التخزين الليزوزومية علم المناعة والعدوى، العدد 139، Neutralizing جسم المقايسة، والعلاج استبدال إنزيم، التدفق الخلوي، فحوصات يستند إلى الخلية، التنمية المقايسة والتحقق من الصحة
الكشف عن الأجسام المضادة التي تحييد استيعاب الخلوية لأنزيم استبدال العلاجات مع تحليل يستند إلى الخلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheung, R., deHart, G. W., Jesaitis, … More

Cheung, R., deHart, G. W., Jesaitis, L., Zoog, S. J., Melton, A. C. Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay. J. Vis. Exp. (139), e57777, doi:10.3791/57777 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter