Rilevazione degli anticorpi che neutralizzano l'assorbimento cellulare di terapie di sostituzione enzimatica con un'analisi Cell-based

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunogenicità e della bioanalisi sull'impatto degli anticorpi neutralizzanti sulla sicurezza, l'efficacia e i profili farmacocinetici e farmacodinamici dei farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un metodo cellulare sensibile e biologicamente rilevante per misurare gli anticorpi neutralizzanti specifici del farmaco in modo semiquantitativo. In questa tecnica, gli enzimi marcati con fluorofori entrano nelle cellule Jurkat attraverso il legame di un residuo di mannosio-6-fosfato al recettore del mannosio-6-fosfato cationico-indipendente o CI-M6PR.

Gli anticorpi neutralizzanti che impediscono l'interazione tra il recettore enzimatico inducono una diminuzione della fluorescenza, misurata mediante citometria a flusso. Per iniziare, seminare 7,5 volte 10 al quarto Jurkat in 100 microlitri di terreno di crescita cellulare per pozzetto in una piastra di coltura cellulare rotonda a fondo rotondo da 96 pozzetti per un'incubazione da 14 a 20 ore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica con il 95% di umidità. Diluire prima i campioni di saggio in un terreno privo di siero con un rapporto da uno a 2,5.

Quindi aggiungere 60 microlitri di ciascun campione ai pozzetti appropriati di una piastra in polipropilene bianco a fondo tondo a 96 pozzetti non vincolante. Questa sarà la piastra di incubazione del campione. Per i campioni che sono risultati positivi allo screening e devono essere confermati, vorticare una fiala di terapia enzimatica sostitutiva o perline ERT e aggiungere il numero appropriato di perle a una provetta conica da 15 millilitri per un altro vortice.

Quindi posizionare la provetta in una rastrelliera magnetica per due minuti e rimuovere con cautela il surnatante. Dopo il quarto lavaggio, aggiungere 100 microlitri di perle negli appositi pozzetti di una nuova piastra in polipropilene bianco a fondo tondo a 96 pozzetti non vincolante. Quando tutte le perle sono state placcate, posizionare la piastra su un magnete a 96 pozzetti con gonna laterale e lasciare che le perline formino un pellet prima di rimuovere con cura il surnatante trasparente.

Successivamente, aggiungere 140 microlitri di ciascun campione negli appositi pozzetti e sigillare la piastra con pellicola di plastica per agitare per almeno 60 minuti su un agitatore rotante a circa 800 giri/min a temperatura ambiente. Quindi posizionare la piastra di conferma sul magnete a 96 pozzetti con gonna laterale per consentire alle perle di formare un altro pellet e aggiungere 60 microlitri di campione ai pozzetti appropriati di una piastra di incubazione del campione in polipropilene bianco non vincolante a fondo rotondo a 96 pozzetti. Per i campioni che sono stati sottoposti a screening e sono confermati positivi, può essere eseguita una serie di titoli.

Per preparare una serie di titoli, diluire in serie il campione nella matrice aggregata un numero sufficiente di volte per superare il punto di taglio del titolo predeterminato e aggiungere 60 microlitri di ciascun campione diluito ai pozzetti appropriati della piastra di incubazione del campione e 60 microlitri delle concentrazioni appropriate di ERT marcato con fluoroforo ai pozzetti appropriati di una nuova piastra in polipropilene non vincolante a fondo tondo bianco a 96 pozzetti secondo il protocollo di testo. Quindi pipettare più volte la soluzione del campione di fluoroforo ERT per miscelare e avvolgere le piastre in un foglio di alluminio per un'incubazione di 14-20 ore a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius. La mattina successiva, riscaldare le piastre dei campioni in un bagno di perle a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti e controllare le cellule piastrate su un microscopio invertito per confermare che le cellule siano sane e distribuite uniformemente nei pozzetti.

Quando le piastre si sono riscaldate, aggiungere 100 microlitri di campione e miscela ERT marcata con fluoroforo alla piastra cellulare secondo la mappa sperimentale della piastra e rimettere le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per altre tre ore e 15 minuti. Al termine dell'incubazione, pellettare le celle mediante centrifugazione e confermare la presenza di un pellet sul fondo di ogni pozzetto. Tenendo la piastra ad un angolo di 30-45 gradi, rimuovere con cura il surnatante in ciascun pozzetto senza disturbare i pellet e lavare le celle tre volte in 200 microlitri di DPBS per pozzetto per centrifugazione.

Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 100 microlitri di macchia morta viva in ogni pozzetto per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Al termine dell'incubazione, pellettare le cellule mediante centrifugazione e lavare le cellule con 200 microlitri di DPBS per pozzetto. Risospendere i pellet lavati in 100 microlitri di paraformaldeide da due a otto gradi Celsius per pozzetto e sigillare la piastra per un delicato vortice a impulsi.

Quindi avvolgere la piastra in un foglio per un fissaggio di 10 minuti a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius. Per analizzare la vitalità cellulare mediante citometria a flusso, mescolare le cellule con 50 microlitri di DPBS per pozzetto per ottenere una sospensione di una singola cellula e leggere le cellule su un citometro a flusso secondo i protocolli standard di citometria a flusso. L'assorbimento di ERT coniugato con fluorofori può quindi essere valutato in base all'intensità di fluorescenza mediana o MFI delle singole cellule vive.

Prima di essere testato nel saggio, viene calcolato un punto di taglio di screening sperimentale come soglia per determinare i campioni positivi e negativi. In questo esempio, vengono mostrati i controlli di qualità con quantità alte o basse di anticorpi neutralizzanti. I campioni positivi vengono quindi testati in un test di conferma utilizzando biglie magnetiche coniugate con farmaci per esaurire l'anticorpo specifico del farmaco dai campioni.

I campioni con un rapporto di recupero superiore al punto di taglio di conferma sono considerati positivi. I campioni che sono stati sottoposti a screening e confermati positivi vengono diluiti in serie e testati nel test del titolo per determinare il titolo relativo di anticorpi neutralizzanti in ciascun campione. Il titolo è il valore interpolato tra due diluizioni che attraversano il punto di taglio del titolo.

Qui mostrato, le MFI a cellula singola vive hanno valutato l'assorbimento di ERT coniugato con fluorofori. Ad esempio, in questo esperimento, la matrice addizionata con l'anticorpo di controllo positivo ha inibito l'assorbimento di ERT coniugato con fluoroforo con conseguente bassa intensità di fluorescenza mediana. Al contrario, le cellule incubate con la matrice in assenza dell'anticorpo di controllo positivo hanno mostrato un'intensità di fluorescenza mediana più elevata, dimostrando l'assorbimento dell'ERT coniugato con fluoroforo.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere finestre di incubazione rigorose per ottenere risultati affidabili e coerenti. È anche importante ottimizzare il test per ogni terapia enzimatica sostitutiva. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada all'immunogenicità e agli scienziati bioanalitici nello sviluppo di farmaci per esplorare l'impatto degli anticorpi neutralizzanti dell'assorbimento cellulare sulla sicurezza e l'efficacia dell'ERT.

Non dimenticare che lavorare con campioni umani può essere estremamente pericoloso e che tutti i campioni devono essere trattati come se fossero potenzialmente infettivi durante l'esecuzione di questa procedura.