Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung und der stereotaktischen Verwaltung der allogenen menschlichen Lymphozyten in immungeschwächte Mäuse tragen orthotopen menschlichen primären Hirntumoren. Diese Studie liefert eine Machbarkeitsstudie für die Machbarkeit und die Antitumor-Wirksamkeit von zellulären Immuntherapien Intrabrain geliefert.
Abstract
Glioblastoma Multiforme (GBM), der häufigsten und aggressive primäre Hirntumoren bei Erwachsenen, ist in der Regel verbunden mit einer schlechten Prognose und knappen effiziente Therapien wurden in den letzten zehn Jahren vorgeschlagen. Unter den vielversprechenden Kandidaten für neue therapeutische Strategien zu entwerfen zelluläre Immuntherapien haben sehr invasive Beseitigung gezielt und Chemo-radioresistenten Tumorzellen, wahrscheinlich in eine schnelle und tödliche Rückfall dieses Krebses beteiligt. So Zwecke der allogenen GBM-reaktive Immunzelle Effektoren, wie menschliche Vϒ9Vδ2 T-Lymphozyten, in der Nähe des Tumors würde stellt eine einzigartige Gelegenheit, effizient zu liefern und hochkonzentrierten therapeutischer Wirkstoffe direkt in die Website des Gehirns Malignome. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung und der stereotaktischen Verwaltung der allogenen menschlichen Lymphozyten in immungeschwächte Mäuse tragen orthotopen menschlichen primären Hirntumoren. Diese Studie liefert eine präklinischen Proof-of-Concept für die Machbarkeit und die Antitumor-Wirksamkeit von diesen zellulären Immuntherapien, die Stereotaktische Injektion von allogenen menschlichen Lymphozyten innerhalb Intrabrain Tumor Betten abhängen.
Introduction
Glioblastom (WHO Grad IV Astrozytom), ist die häufigste und aggressive primäre Hirntumoren bei Erwachsenen. Trotz der aggressiven Behandlungen, die Operation und Radio-Chemotherapie zu kombinieren, bleibt GBM eine extrem schlechte Prognose (mediane Überlebenszeit von 14,6 Monate und eine 2-Jahres-Mortalität > 73 %)1zugeordnet. Dies beweist, dass einige effiziente therapeutische Fortschritte in den letzten zehn Jahren2validiert worden sind. Unter den Kandidaten für die Gestaltung effektiver Therapiestrategien3,4,5werden Immuntherapien6 derzeit untersucht, um zu verfolgen und zu beseitigen sehr invasiv und Radio/Chemotherapie-resistenten tumor Zellen, für ihren wichtigen Beitrag zur schnellen und tödlichen Tumor Rezidiv7vermutet. Verschiedene mögliche immunologische Ziele wurden identifiziert und vorgeschlagenen für Immuntherapien, mit natürlichen oder modifizierten αβ oder ϒδ T-Lymphozyten wie GBM-spezifischen Tumorantigenen oder Stress-induzierte Moleküle8,9, 10. Die Möglichkeit, ausgewählte GBM-reaktive Immunzelle Effektoren verwalten stellt eine einzigartige Gelegenheit, erhöhte Mengen von Effektor Lymphozyten direkt in die Website der verbleibenden Bösartigkeit zu liefern. Um diese Strategie zu unterstützen, haben wir vor kurzem gezeigt, dass Modelle basierend auf immungeschwächte Mäuse orthotopen primären menschlichen GBM Xenotransplantate treu tragen die Entwicklung von Hirntumoren in GBM Patienten9,11rekapitulieren. Darüber hinaus wurden diese Modelle verwendet, um die starke Antitumor-Effizienz der adoptively übertragenen allogene menschlichen Vϒ9Vδ2T Lymphozyten zeigen.
Dieses Protokoll beschreibt die kritische experimentellen Schritte zur Erreichung Stereotaktische Immuntherapien von Hirntumoren, wie GBM, basierend auf die Adoptiveltern Übertragung der allogenen T-Lymphozyten. Der Artikel zeigt: (i) die Verstärkung der therapeutischen allogene immun Effektor T-Lymphozyten, wie menschliche Vϒ9Vδ2T Lymphozyten; (Ii) die Vorbereitung dieser Effektor T-Lymphozyten zur Injektion; (Iii) das Verfahren für die Stereotaktische Verwaltung innerhalb des Gehirns, in der Nähe des Tumors. Dieser Artikel enthält auch einen Einblick in das Verhalten von diese zellulären Effektoren nach Stereotaktische Injektion.
Der hier vorgestellte Therapieansatz basiert auf die Injektion von 20 x 106 Effektor Zellen pro Dosis für jedes Gehirn Tumor-tragenden immungeschwächte Maus. Ein erste in-vitro- Erweiterung Schritt ist erforderlich, große Mengen von Immunzellen produzieren. Daher unspezifische Zelle Erweiterungen werden mit Phytohemagglutinin (PHA-L) durchgeführt und allogene Feeder-Zellen bestrahlt: Blut-peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) von gesunden Spendern und Epstein-Barr-Virus EBV-transformierten B-Lymphoblastoid Zelle Linien (BLCLs), abgeleitet von PBMCs durch in-vitro- Infektion mit EBV-haltigen Kultur überstand von der Marmoset B95-8-Zell-Linie, im Beisein von 1 µg/mL Cyclosporin-A.
GBM-reaktive Effektor Immunzellen verglichen und von in-vitro- Assays9ausgewählt. Diese Effektorzellen werden aktiviert und verstärkt mit standard-Protokolle, nach ihrer Natur (z.B., menschliche Vγ9Vδ2 T-Lymphozyten-9 oder menschliche Anti-Herpes-Virus αβ T-Lymphozyten12) mit einer Mindestreinheit von > 80 %, wie routinemäßig von durchflusszytometrischen Analyse überprüft. Die Zelle Erweiterung Verfahren unten gilt für verschiedene menschliche Lymphozyten-Teilmengen.
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Protocol
Die folgenden Verfahren mit tierischen Themen erfolgte nach institutionellen Richtlinien (Vereinbarung #00186.02; regionalen Ethik-Kommission der Pays De La Loire [Frankreich]). Menschlichen PBMCs wurden isoliert aus dem Blut von informierten gesunden Spendern (Etablissement Français du Sang Nantes, Frankreich) gesammelt. Alle Schritte werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
1. nicht-spezifische Erweiterung der zytotoxischen Effektor T-Lymphozyten
- Bereiten und Feeder-Zellen bei 35 Gy zu bestrahlen. Die Stimulation von 2 x 105 - 4 x 105 Effektorzellen, Vorbereitung 10 x 106 PBMCs und 1 x 106 BLCLs von drei unterschiedliche, gesunden Spendern.
- Aufschwemmen Sie Feeder-Zellen und Effektorzellen in 15 mL RPMI ergänzt mit 10 % Hitze-inaktivierten FCS, 2 mM L-Glutamin, (100 IE/mL), Penicillin und Streptomycin (0,1 µg/mL) und 300 IU/mL rekombinantes Il-2.
- PHA-L auf eine Endkonzentration von 1 µg/mL hinzufügen, vorsichtig mischen und 150 µL Zellsuspension pro Bohrloch in 96-Well U-Boden Platten zu verteilen.
- Inkubation bei 37 ° C und mit 5 % CO2 in eine feuchte Atmosphäre.
- Täglich prüfen die Platte bis großzellige Form in den Kultur-Brunnen Klumpen (~ 7 Tage).
- Übertragen Sie die Zellen in einer Kultur Kolben 1 x 106 Zellen/ml in frischem Nährmedium.
- Bestimmen Sie die Anzahl der gesamten Zelle durch zählen (2 x pro Woche) und pflegen sie auf 1 x 106 Zellen/mL in frischem Nährmedium.
Hinweis: Effektor Immunzellen soll für die therapeutische Verwaltung in einen Ruhezustand (in der Regel 3 Wochen nach anfänglichen Verstärkung Reiz) vorliegen. Die Reinheit und die Reaktivität dieser Effektor-Zellen sollten vor dem in-Vivo -Injektionen (z. B. in-vitro- Tests) überprüft werden.
2. präoperative Effektor Zellen Vorbereitung
- Nach der Überprüfung der Effektor-Zellzahl, sammeln Sie die Effektorzellen in ein 50-mL-Tube durch Zentrifugieren (300 X g für 5 min).
Hinweis: Um den Verlust auszugleichen, bereiten Sie ein Übermaß an Zellen (z.B. 50 x 10-6). - Sorgfältig entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zellen in 15 mL sterile PBS und Zentrifuge für 5 min bei 300 X g Wash durchzuführen.
- Sorgfältig und vollständig entfernen des Überstands und dann die Zelle Pellet in 1 mL sterile PBS aufzuwirbeln.
- Die resuspendierte Zellen in einem 1,5 mL reaktionscup für Zentrifugation bei 300 X g für 5 min zu übertragen.
- Sorgfältig und vollständig entfernen des Überstands durch pipettieren langsam.
- Aufschwemmen der Zelle Pellet in 8 µL steriler PBS per Mausklick.
Hinweis: Dies ist ein entscheidender Schritt. - Messen Sie das Volumen der Zellsuspension mithilfe einer Mikropipette. Ggf. sterile PBS (20 x 106 Zellen in 15 µL PBS pro Dosis) hinzufügen und vorsichtig umrühren.
- Überprüfen Sie, mit einer Mikropipette, das ist das Endvolumen per Mausklick zwischen 15 und 20 μl (Imperativ < 20 µL).
- Bewahren Sie die Zellen auf Eis bis Stereotaktische Injektion.
Hinweis: mehr als 3 h Zeitpunkte wurden nicht getestet.
(3) Stereotaktische Injektion
-
Geräte-Setup
- Montieren und einen kleinen Tieren stereotaktischen Rahmen entsprechend den Anweisungen des Herstellers für die Richtigkeit der intrakraniellen Injektionen (z.B., Spritze Größe, gewünschte Lautstärke und Geschwindigkeit der Injektion) zu kalibrieren.
Hinweis: Eine langsame Infusionsrate wird (d.h.2-3 µL/min) empfohlen. - Installieren Sie das Material unter einer mikrobiellen Sicherheitsschrank (MSC), um die Sterilität der Instrumente zu erhalten und die Mäusen zu schützen vor Infektionen.
Hinweis: statt "Isothermen Blöcke" in einem Wasserbad bei 37 ° C. Dieses System schränkt die Unterkühlung von Mäusen während der Operation. Heizkissen, die für die Post-prozessualen Pflege notwendig sind, muss während die kontinuierliche Temperaturüberwachung verwendet werden.
- Montieren und einen kleinen Tieren stereotaktischen Rahmen entsprechend den Anweisungen des Herstellers für die Richtigkeit der intrakraniellen Injektionen (z.B., Spritze Größe, gewünschte Lautstärke und Geschwindigkeit der Injektion) zu kalibrieren.
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Präoperative Vorbereitung der Tiere
- Eine Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (10 mg/mL) und Xylazin (0,1 mg/mL) 10 µL/g Körpergewicht von der Maus zu betäuben.
- Führen Sie eine Zehe kneiftest um die komplette Anästhesie und Analgesie des Tieres sicherzustellen.
Hinweis: Jede Bewegung ist ein Hinweis auf nicht-tief Analgesie und in diesem Fall ein paar Minuten sind erforderlich, bevor der Vorgang zu wiederholen. - Sobald die Maus richtig betäubt ist, mit einer Schere um das Fell aus der Operationsstelle (zwischen den beiden Ohren, bis die Nase) zu entfernen.
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Präoperative Handy Vorbereitung
- Aufschwemmen Sie die Zellen mit einer Pipette sorgfältig (mehrmals) vor jeder Injektion einer beliebigen Zelle Verklumpen zu verhindern.
- Zeichnen Sie sorgfältig die erforderlichen Zellvolumen der Aufhängung (15-20 µL) in der 22-G-Microsyringe, die Aspiration von Luftblasen zu vermeiden.
Hinweis: Dieser Zelle be-Schritt in der Microsyringe ist wichtig, Abweichungen in der injizierten Volumina zu minimieren. Laden Sie Zellen für jede einzelne Injektion zwischen Verfahren, jede Zelle Verklumpen zu verhindern und eine gerade Anzahl von Effektor Zellen Verwaltung in der Kohorte zu gewährleisten. - Legen Sie die Spritze in die angepasste Spritzenpumpe.
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Verfahrenstechnische Betreuung
- Desinfizieren der Operationsstelle mit Tupfer getränkt in 5 % Povidon-Jod-Lösung mindestens 3 X.
- Legen Sie eine Schmier ophthalmologische Salbe in der Maus Augen zu verhindern jede Austrocknen der Hornhaut.
- Position der narkotisierten Maus auf der Stereotaktische Rahmen auf einem warmen Isothermen Block bedeckt mit einer sterilen Plastikfolie zu halten die Maus Temperatur während der Operation und die Sterblichkeit zu begrenzen.
Hinweis: Der Maus Nase und Zähne sollten angemessen über die Zahn-Bar, um angemessene Atemfluss während des Verfahrens zu gewährleisten positioniert werden. - Sobald die Maus über den Zahn Bar befindet, ziehen Sie das Ohr Bars fest unter der Maus Ohren um den Kopf zu immobilisieren.
Hinweis: Seien Sie vorsichtig, nicht das Trommelfell beschädigen oder die Atmung beeinträchtigen. - Machen Sie einen 1-2 cm Mittellinie sagittaler Hautschnitt mit einer sterilen Schere entlang der obere Teil des Schädels von Anterior Posterior des Schädels aussetzen.
- Identifizieren Sie den Schnittpunkt der sagittale und koronale Nähte (Bregma) als Wahrzeichen für die Stereotaktische Lokalisierung vor der Injektion (siehe Abbildung 1) zu dienen.
- Legen Sie die Microsyringe über diesen Punkt.
- Verschieben Sie die Microsyringe 2 mm rechts seitlichen und vorderen von der Bregma 0,5 mm.
- Mit einem Microdrill, machen Sie ein kleines Loch in den Schädel mit einem sterilen Bohrer an den vorgegebenen Koordinaten. Achten Sie darauf, um traumatische Verletzungen des Gehirns zu vermeiden oberflächlich bleiben.
Hinweis: In diesem Protokoll wurden Immunzellen innerhalb einer etablierten Tumor (eine Woche nach Tumor Zelle Injektion) injiziert. Die Haut soll wiedereröffnet (Narbe) und die Injektion erfolgt an den gleichen Koordinaten verwendet für die Tumor-Zellen-Implantation (das Loch ist in der Regel bis zu 2 Wochen nach der Injektion noch vorhanden). Koordinaten wurden ausgewählt, für die Injektion Tumor und Effektor Zellen in das Gehirn Parenchym13,14.
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Injektion von immun Effektorzellen
- Sorgfältig legen Sie die Microsyringe in das gebohrte Loch und bewegte sich langsam, die Nadel 3 mm nach unten in die Dura und dann rückwärts 0,5 mm bis zu einer endgültigen Tiefe von 2,5 mm vor der Injektion der Effektorzellen zu übermitteln.
- Führen Sie die Effektor-Zelle-Injektion bei 2-3 µL/min und überwachen Sie die Mäuse entlang der Einspritzzeit.
- Nach die Injektion abgeschlossen ist, ziehen Sie die Nadel heraus für nur 1 mm und bewahren Sie die Microsyringe für eine weitere Minute, bevor langsam zurückziehen vollständig Microsyringe, um eine Leckage aus der Infusionsstelle zu verhindern.
Hinweis: Nach dem Entfernen des Tieres aus dem stereotaktischen Gerät, sofort reinigen Sie die einspritzausrüstung für zukünftige Experimente.
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Nachbetreuung und Follow-up von Maus
- Entfernen Sie das Tier aus der Stereotaktische Rahmen und sofort übernehmen Sie Povidon-Jod 5 % Lösung auf die Schnitt-Website und schließen Sie die Haut mit einer geeigneten chirurgischen Naht.
- 2 % Lidocain Gel direkt auf die Wunde auftragen und 0,15 µg/g von Buprenorphin durch eine subkutane Injektion für Post-prozedurale Analgesie zu verwalten.
- Platz zurück gesetzt die narkotisierten Maus zu seinem Käfig oben ein Heizkissen auf 37 ° C, eine geeignete Maus Körpertemperatur aufrechtzuerhalten und eine Unterkühlung zu vermeiden.
Hinweis: Separates Gehäuse ist nicht erforderlich. - Überwachen Sie die Maus, bis es vollständig aus der Narkose erholt ist und in einem Gehäuse Raum übertragen.
Hinweis: Bisher ist dieses Protokoll gut unterstützt, wie einige unvorhersehbare Komplikationen (< 5 % der injizierten Mäusen) aufgetreten sind. - Täglich überwachen Sie die Mäuse zu und einschläfern sie, wenn Anzeichen für abnehmende Gesundheit eingehalten werden (z.B., Buckliger Haltung, eingeschränkter Mobilität, Erschöpfung oder bedeutenden Gewichtsabnahme [≥ 15 %]).
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Representative Results
Diese Studie beschreibt die Strategie der Adoptiveltern Übertragungen von zellulären immun Effektorzellen in das Gehirn von Tumor-tragenden Mäusen, basierend auf Stereotaktische Injektionen direkt in das tumorbett durchgeführt.
Um jedes Risiko von Hirn-Trauma, verbunden mit einem großen Injektionsvolumen zu minimieren, muss die Zellsuspension Effektor (20 x 106 Zellen in 15-20 µL PBS) konzentriert werden. Um zu überprüfen, ob dieser Zelle Konzentration Schritt die Lebensfähigkeit der Effektorzellen beeinflussen könnten, wurden diese Zellen nach dem beschriebenen Protokoll vorbereitet und in die Microsyringe geladen. Die Effektorzellen wurden sofort oder 10 min nach dem Laden sie in der Microsyringe gesammelt. Die Zellen waren voller Flecken mit Propidium Jodid (PI), einen fluoreszierenden DNA intercalating Agenten, die nicht permeationsfähigen Zellen Leben und analysierten durch Durchflusszytometrie an verschiedenen Zeitpunkten (0, 24 und 72 Stunden). Die Ergebnisse zeigen, dass die Vorbereitung und das Laden in der Microsyringe nicht deutlich die Lebensfähigkeit der Effektorzellen für mindestens 24 Stunden (Abbildung 2A und 2 b) beeinträchtigen. 72 Stunden wurde eine leichte, aber nicht signifikante Erhöhung der PIpositive Zellen (14 % im Vergleich zu 11 % entladenen Zellen) beobachtet. In ähnlicher Weise wurde die Antitumor-Reaktivität der Effektorzellen, die vorbereitet und gepflegt auf Eis für 3 Stunden wurden analysiert. Effektorzellen wurden mit Gehirn-Tumor-Zellen für 4 Stunden in Anwesenheit einer Anti-CD107a-MAB cocultured. Die Hochregulation der Aktivierung Markierung CD107a, ähnlich wie der Wert, der bei der Kontrolle zeigt, dass die Reaktivität der Effektorzellen nicht die Vorbereitung und das Laden in den Microsyringe (Abbildung 2 betroffen ist).
Um festzustellen, ob Effektorzellen überleben und bewegen sich in der Anwesenheit von nach ihrer Implantation Intra-Tumor, 20 x 106 Effektor wurden Zellen in der Tumor-Website von Mäusen mit einem Gehirntumor (Glioblastom-111) injiziert. Eine Woche später wurden die Gehirne, feste, geschnitten und gefärbt für Safran Hämatoxylin und Eosin Färbung (HES) und Anti-Human-CD3-mAb (IHC) gesammelt. HES Färbung identifiziert die Struktur von Hirntumoren (Abbildung 3, Links). Die CD3 Färbung identifiziert und lokalisiert die Effektor-immun-T-Lymphozyten (hier menschliche Vϒ9Vδ2 T-Zellen) (Abbildung 3, Rechts). Interessanterweise wurden Effektor-T-Lymphozyten rund um den Tumor (Abbildung 3, rechten oberen Bereich), in der Tumor-Kern (Abbildung 3, mittleren rechten Bereich), sondern auch in der kontralateralen Hemisphäre (Abbildung 3, erkannt unteren rechten Bereich). Darüber hinaus wurde die Funktion des menschlichen T-Lymphozyten isoliert aus dem Gehirn der Maus 48 Stunden nach der Injektion (4 x 106 αβ-T-Zellen), die 2 % der Gehirnzellen darstellen, analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass gesammelte Gehirn injiziert Effektor allogenen αβ T Zellen erweitern und vermehren sich auf eine unspezifische PHA-Feeder Zellen Aktivierung durchgeführt in Anwesenheit von IL-2 (Abbildung 4).
Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass Effektorzellen T vorbereitet und nach diesen Verfahren verwaltet stundenlang im Gehirn überleben und können innerhalb des Tumors und gesunden Hirngewebe patrouillieren. Diese Verfahren wurden für die Beurteilung der Antitumor-Effizienz der therapeutischen Stereotaktische Verwaltungen der allogenen menschliche ruhenden Vϒ9Vδ2 T-Zellen steuern die Entwicklung der menschlichen GBM Gehirn Tumoren9,11verwendet. Diese Studien belegen, dass Injektionen von allogenen menschlichen Effektor T-Lymphozyten in das tumorbett verbessert das Überleben von Mäusen mit Hirntumoren Interessanterweise überleben Mäuse nicht nachweisbare Tumorzellen, was darauf hindeutet, eine komplette Tumor Ablehnung führen.
Abbildung 1 : Überblick über die wichtigsten anatomischen Landmarken auf den Maus-Schädel. Dazu zählen sagittale (rote Linie) und koronalen (blaue Linie) Nähte und deren Schnittmenge (Bregma) verwendet, der Injektionsstelle zu orientieren. Die Maßstabsleiste wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Überleben und Aktivierung der Effektor T-Lymphozyten vorbereitet. Effektorzellen (hier ruhenden menschlichen peripheren Vϒ9Vδ2 T-Zellen) wurden verstärkt und nach dem beschriebenen Verfahren vorbereitet. Färbung von Lymphozyten mit Propidium Jodid (PI), eine DNA verschuppen fluoreszierende Substanz, die nicht permeationsfähigen Leben Zellen und funktionelle Aktivierung ist wurden durchgeführt. (A) dieses Panel zeigt ein repräsentatives Grundstück nach vorne (FSC-H) im Vergleich zu Seite (SSC-H) streuen Anspritzung von Effektor Lymphozyten (Panel Links). Das Histogramm zeigt die PI Färbung des gated Kontrolle Lymphozyten (Rechts). Der Anteil derpositiven Lymphozyten PI wird angezeigt. (B) dieses Panel zeigt den prozentualen Anteil der Toten Lymphozyten (PIpositiv) sofort gesammelt (hellblaue Linie) oder nach 10 min (dunkelblaue Linie) in der Microsyringe, gemessen an den angegebenen Zeitpunkten. Als Kontrolle dienten entladene bereite Zellen (graue Linie). (n = 3; mittlere ± SD; ns = nicht signifikante.) (C) CD107a Oberfläche Mobilisierung, indem Durchflusszytometrie auf beiden Vδ2positive Kontrollzellen (unvorbereitet gemessen wurde) oder Lymphozyten gepflegt auf Eis (vorbereitete + 3 h) nach einer Coculture mit Zielzellen primäre Gehirn Tumor vorbereitet. Der Anteil der Lymphozyten wird in jedem Quadranten durchflusszytometrischen angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Erkennung und Lokalisierung von Effektor T-Lymphozyten in das Gehirn des Tumor-tragenden Mäusen. Eine Woche nach Glioblastom brain Tumor Implantation, Effektor Immunzellen (hier ruhenden menschlichen peripheren Vϒ9Vδ2 T-Zellen) wurden in den Gehirnen der Mäuse injiziert. Eine Woche nach der Immuntherapie Behandlung wurden die Gehirne gesammelt, fixiert und geschnitten. Gehirn-Abschnitte wurden für immunhistochemische Analyse (Hämatoxylin Eosin und Safran [HES] Färbung) gefärbt (linken) oder gebeizt mit Anti-Human-CD3-Antikörper (Rechts). Die dargestellten Ergebnisse sind repräsentativ für drei unabhängigen Experimenten. Die Maßstabsleiste wird angezeigt.
Abbildung 4 : Aktivierung von Effektor T-Lymphozyten gesammelt aus dem Gehirn der behandelten Mäuse. Ruhende menschlichen T-Lymphozyten (hier: 4 x 106 menschlichen αβ T-Lymphozyten) wurden in den Gehirnen der NSG Mäuse injiziert. Nach 48 Stunden wurden die Gehirne gesammelt und getrennt. Der Anteil des menschlichen Gehirns infiltrieren T-Lymphozyten wurde mittels Durchflusszytometrie mit einem Anti-Human-CD3-Antikörper (Bodenplatte) gemessen. Die gesammelten Zellen wurden (10 Zellen/na) in 96-Well U-Boden Platten und stimuliert (PHA-Feeder-Zellen und Il-2) für 20 Tage (16 Zyklen zu verdoppeln) ausgesät. Hinweis an Tag 10, 13,3 x 106 von menschlichen T-Lymphozyten stammen (Rechts).
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Discussion
Eine adoptive Übertragung von ausgewählten einheimischen oder veränderter immun Effektorzellen stellt einen vielversprechenden Ansatz zur Behandlung von Tumoren, wie z. B. infiltrative Gehirntumoren, kümmert sich der Begrenzung der Reaktivität gegen nicht-transformierten Zellen15effizient, 16,17,18. Das zentrale Nervensystem, das Gehirn umfasst, hat jedoch eine besondere Immunstatus, insbesondere auf Grund der Existenz der Blut - Hirn-Schranke und das Fehlen eines klassischen Lymphdrainage System19,20. Diese physiologischen Funktionen beeinflussen Gewebe Handel und systemischen Injektionen von Immunzellen beeinträchtigen könnte. Um diese Hindernisse zu überwinden, wurden Intraparenchymal Injektionen auf dem Prinzip untersucht, die Antitumor-Zellen eher lokal geliefert werden, eng auf die Tumor-Website für Mikrosphären, die pharmakologischen Verbindungen21, enthalten 22. auf der einen Seite könnte die begrenzte Verdünnung von Lymphozyten innerhalb der Orgel ihre Antitumor-Effizienz zu verbessern, aber es kann auch mechanisch oder Tumor Anpassung schädlich, wie tissular-Komprimierung, die sich entlang Gehirn entwickelt verstärken Tumorwachstum. Dies bedeutet, dass dieses Verfahren kleine Mengen an immuntherapeutischen Injektionen erfordert. Dieses Problem ist noch kritischer in experimentellen Tiermodellen in welche, die Gehirn Tumoren chirurgisch herausgeschnitten werden können nicht. Dieser Artikel beschreibt einen therapeutischen Ansatz für die Vorbereitung und die lokale Übermittlung von Gehirn Tumor-spezifische zelluläre Effektoren, basierend auf Stereotaktische Injection(s) von allogenen menschlichen T-Lymphozyten.
Diese Studie zeigt die Vorbereitung und der stereotaktischen Lieferung von allogenen menschlichen Vϒ9Vδ2 T-Lymphozyten in immungeschwächte NSG Mäuse mit menschlichen GBM Xenotransplantate. Die erste Phase dieses Protokolls beschreibt ein einfaches Verfahren zur Verstärkung der allogenen T-Lymphozyten von PBMCs von gesunden Spendern, unter Verwendung einer standard unspezifischen PHA-Feeder-IL2-Stimulation, die große Mengen von reinem Effektor T-Lymphozyten produziert, so dass Ihre therapeutische Nutzung23,24. Der zweite Teil dieser Artikel konzentriert sich auf die Vorbereitung der T-Lymphozyten Suspensionen auf den Tag der stereotaktischen Verwaltung ruht. Ein besonderes Augenmerk wurde auf diesen wichtigen Schritt, die eine hohe zellulare Dichte erfordert, die die Lebensfähigkeit und die Funktion der ausgewählten Effektor T-Lymphozyten nicht beeinflussen sollte. Schließlich zur in-Vivo -Experimente, die Vorbereitung der Effektor T-Lymphozyten und ihre Injektion in den Tumor-Kern ist mit ihrer Verbreitung, nicht nur innerhalb der Tumor aber auch in den umliegenden Hirngewebe, Hervorhebung ihrer besondere Fähigkeit zu patrouillieren und invasive Tumorzellen zu verfolgen. Wichtig ist, bleibt diese Vorbereitung und Injektion Methoden die Möglichkeit diese T-Lymphozyten innerhalb des Gehirns auf eine besondere Anerkennung der Gehirn-Tumor-Zellen aktiviert werden. Insgesamt diese überzeugendsten Eigenschaften speziell die Fähigkeit der T-Lymphozyten zu gewährleisten und effizient gezielt zu beseitigen tief infiltrative Gehirn-Tumor-Zellen sind ein Markenzeichen der GBM25. Der Hinweis eine besondere Vorsicht ist während der Injektion und die Entfernung von der Microsyringe getroffen werden, um jede Läsion des Gehirns zu minimieren oder Effektor Zellen leckt.
Dieser Artikel beschreibt zusammenfassend ein effizientes Verfahren für die Bereitstellung von großen Mengen von allogenen menschlichen Anti-Tumor-Lymphozyten, z. B. ruhenden menschliche Vϒ9Vδ2T Lymphozyten in der Nähe von Hirntumoren. Wichtig ist, wird dieses therapeutische Verfahren nicht mit negativen Auswirkungen auf die übertragenen T-Lymphozyten (z.B., Rentabilität, Reaktivität) oder auf das Hirngewebe begleitet. Neuere Studien, basierend auf murinen orthotopen Modelle der primären menschlichen GBM haben gezeigt, dass Vϒ9Vδ2T Lymphozyten Ziel effizient GBM-Zellen, einschließlich Tumorzellen, die tief das Gehirn Parenchym9,11infiltriert haben. Diese Elemente eröffnen Chancen für die Entwicklung neuartiger Adoptiv T-Lymphozyten Beförderungsverfahren, die angewendet werden könnten in erster Linie bei Mäusen mit orthotopen Hirntumoren und dann in klinischen Studien bei GBM-Patienten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken die Mitarbeitern der der Universitätsklinik Tierhaus (UTE) von Nantes für Tierhaltung und Pflege, die zelluläre und tissular imaging-zentrale Einrichtung der Universität Nantes (MicroPICell) für die Bildgebung und Zytometrie Anlage (Cytocell) von Nantes für ihre kompetente technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von INSERM, CNRS Université de Nantes, Institut National du Cancer (Inka #PLBio2014-155), Ligue Nationale Contre le Cancer (AO interregionale 2017) und das Europäische Konsortium ERA-Net Transcan2 finanziert (Immunoglio). Das Team wird von der Fondation Pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118) finanziert. Diese Arbeit wurde im Rahmen des LabEX IGO realisiert und die IHU-Cesti-Programme, unterstützt von der nationalen Forschung Agentur Investissements Avenir über die Programme ANR-11-LABX-0016-01 und ANR-10-IBHU-005, bzw.. IHU-Cesti-Projekt wird auch von Nantes Metropole und der Region Pays De La Loire unterstützt. Die Autoren danken für seine Hilfe bei der Korrektur des Manuskripts Chirine Rafia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
References
- Stupp, R., Roila, F. Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet? Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).
- Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).
- Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme. Cureus. 10 (3), e2305 (2018).
- Zhu, L., et al. Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells. Frontiers in Immunology. 9, 824 (2018).
- Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy. Journal of Immunology Research. 2014, 326545 (2014).
- Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma. Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).
- Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
- Jarry, U., et al. Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors. Oncoimmunology. 5 (6), e1168554 (2016).
- Dutoit, V., et al. Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy. Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).
- Joalland, N., et al. IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors. Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).
- Clemenceau, B., et al. Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Jarry, U., et al. Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection. Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).
- June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities. Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).
- Bryant, N. L., et al. Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma. Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).
- Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).
- Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. Innate and adaptive immune responses of the central nervous system. Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Menei, P., et al. Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study. Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).
- Menei, P., et al. Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma. Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).
- Salot, S., et al. Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product. Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).
- Bennouna, J., et al. Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
