Summary
وهنا يصف لنا إجراء أمثل، على أساس لانجيندورف لعزل cardiomyocytes أذينية خلية واحدة من نموذج الفئران من فشل القلب المتصلة بالمتلازمة الأيضية مع كسر قذفي الحفاظ على. دليل تنظيم الضغط إينترالومينال تجاويف القلب ينفذ تؤتي myocytes وظيفيا سليمة مناسبة للدراسات الإثارة-الانكماش-اقتران.
Abstract
في هذه المقالة، يصف لنا إجراء أمثل، على أساس لانجيندورف لعزل خلية واحدة أذينية cardiomyocytes (تابع) من نموذج الفئران من المتلازمة الأيضية (ميتس)-المتعلقة بفشل القلب مع كسر قذفي الحفاظ عليها (هفبيف). يتزايد انتشار ميتس المتصلة هفبيف، والقلب الرجفان المرتبطة بإعادة عرض الرجفان والرجفان الاذيني ذات الصلة سريرياً عاليا كما يعيد البناء الرجفان توقع مستقلة من الوفيات. كثيرا ما تستخدم الدراسات مع عزل الخلايا المفردة كارديوميوسيتيس التثبت وتكمل في فيفو النتائج التي توصل إليها. راريفيكيشن سفينة الدورة الدموية والتليف الخلالي الأنسجة تشكل عاملاً يحد يحتمل أن عزل الخلايا المفردة الناجحة تابع من نماذج حيوانية لهذا المرض.
ونحن قد تناول هذه المسألة باستخدام جهاز قادرة على تنظيم ضغط إينترالومينال تجاويف القلب يدوياً أثناء إجراء العزل، زيادة عائد تابع سليمة شكلياً ووظيفيا. يمكن استخدام خلايا المكتسبة في مجموعة متنوعة من تجارب مختلفة، مثل زراعة الخلايا وتصوير الكالسيوم وظيفية (أي، الإثارة-الانكماش-اقتران).
نحن تزويد الباحث ببروتوكول خطوة بخطوة، قائمة بالحلول الأمثل، وتعليمات شاملة لإعداد المعدات اللازمة، ودليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها شامل. حين التنفيذ الأولى للإجراء الذي قد يكون من الصعب بدلاً من ذلك، تسمح تكيف ناجح القارئ لأداء الدولة للفنون ACM العزلة في نموذج الفئران من هفبيف المتصلة ميتس لمجموعة واسعة من التجارب.
Introduction
ميتس يصف مجموعة من عوامل خطر الإصابة بأمراض القلب والشرايين والسكري نوع-2 ويشمل ارتفاع ضغط الدم الشرياني، دسليبيدميا (آثار الشحوم وتخفيض الكوليسترول الكثافة lipoprotein)، زاد الصيام السكر، والسمنة المركزية1. انتشار ميتس في العالم يقدر بنسبة 25-30 في المائة، واستمرار ارتفاع2. هفبيف متلازمة سريرية ايربان غالباً ما ترتبط مع ميتس. إعادة عرض القلب أثناء هفبيف ومراحلها السابقة (أي، أمراض القلب ارتفاع ضغط الدم) أيضا يرافق إعادة عرض اتريا3. انخفاض وظيفة الهوس والتغيرات الهيكلية الاذين الأيسر ارتبطت بزيادة معدل الوفيات والرجفان الاذيني وقصور القلب بداية جديدة4. إعادة عرض الرجفان يتسم بالتغيرات في وظيفة قناة أيون، Ca2 + التوازن، وهيكل أذينية والتنشيط تنتجها الخلايا الليفية، وأنسجة التليف5. غادر يعيد البناء الرجفان في ميتس المتصلة هفبيف والكامنة في الآليات المرضية التي لا تزال غير مفهومة وتحتاج إلى مزيد من التحقيقات متعمقة. وأثبتت نماذج حيوانية يكون أداة قيمة ويؤدي إلى العديد من التطورات في مجال القلب الرجفان6،7،،من89.
كثيرا ما تستخدم الدراسات مع عزل الخلايا المفردة كارديوميوسيتيس التثبت وتكمل في فيفو النتائج التي توصل إليها. عزلة، وثقافة الخلية اللاحقة المحتملة، تسمح للتحقيق مما يشير إلى مسارات والتيارات القناة الأيونية، والإثارة-الانكماش-اقتران. في ظل الظروف الفسيولوجية، لا تتكاثر كارديوميوسيتيس. الانصهار بين تسلسلات التنظيمية النسخي عامل atrial natriuretic وفيروس القردي 40 كبيرة تي مستضد في الفئران المعدلة وراثيا أدى إلى إنشاء تابع مخلدة الأولى، المسماة في-110. المزيد من تطوير خلايا تي-1 يثير الخلايا HL-1، التي لا يمكن إلا أن يكون باساجيد متسلسل ولكن أيضا العقد تلقائياً11. بيد أنهم، إظهار الاختلافات الهيكلية والوظيفية مقارنة مع الخلايا المعزولة حديثا، مثل أولتراستروكتوري أقل تنظيماً، حدوث ارتفاع النامية ميوفيبريلس11، و الحالية إلى الداخل12المنشط فرط الاستقطاب. يتم عزل cardiomyocytes البطين (VCM) في الجرذان والفئران من مجموعة متنوعة من نماذج راسخة13،،من1415،16،،من1718 , 19-عموما، هو قلب قصت المركبة بجهاز لانجيندورف وريتروجراديلي perfused مع Ca2 +-الحرة المخزن المؤقت الذي يحتوي على إنزيمات الجهاز الهضمي، مثل collagenases والبروتياز. الكالسيوم ثم مجددا على نحو تدريجي للظروف الفسيولوجية. ومع ذلك، حتى ولو كانت البروتوكولات المخصصة لعزل تابع متاح20،21، بسبب زيادة التليف والخلافات المتعلقة بالضغوط، فائدتها في نماذج المرض مع إعادة عرض الرجفان محدودة.
في هذه المقالة، قمنا بتنفيذ بروتوكول لعزل أذينية cardiomyocytes خلية واحدة من الحيوانات التي تظهر الرجفان يعيد البناء (أي، وبخاصة لنموذج فأر ZFS1 هفبيف ذات الصلة ميتس)22. القائمة عزل البروتوكولات الأمثل ويكمله جهاز بسيطة، مصنوعة خصيصا لمراقبة وتعديل ضغط إينترالومينال تجاويف القلب، مما يؤدي إلى زيادة الغلات في cardiomyocytes سليمة شكلياً ووظيفيا. ويوفر البروتوكول التالي الباحث مع دليل خطوة بخطوة، ووصف مفصل لمعدات مصنوعة خصيصا، وقائمة بالحلول، فضلا عن دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع التجارب التي أقرتها "لجنة الأخلاقيات" المحلية (TVA T0060/15 و T0003--15) وتنفيذ الاتفاق مع المبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (المعهد الوطني للصحة، الولايات المتحدة الأمريكية).
ملاحظة: يظهر مخطط انسيابي مبسطة للإجراء في الشكل 1.
1-بريارانجيمينتس
- إعداد المخازن المؤقتة وفقا للجدول 1.
| الحل | الجريدة الرسمية | بناء القدرات | DB | بينالي الشارقة | S1 | S2 | S3 | NT | |
| كاشف (مم) | |||||||||
| كلوريد الصوديوم | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | |
| بوكل | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4 | |
| خ2ص4 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | ||
| غ2هبو4 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | ||
| مجسو4 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | ||
| مجكل | 1 | ||||||||
| حبيس | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| توراين | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | ||
| الجلوكوز | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| متخذي قرارات العمل | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| كاكل2 | 1 | 0.01 | 0.125 | 0.25 | 0.5 | 1 | |||
| جيش صرب البوسنة | 150 | 70 | 70 | 70 | |||||
| مزيج إنزيم المنقي (ثيرموليسين متوسط) | 0.195 Wünsch وحدة/مل | ||||||||
| تعديل درجة الحموضة | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | |
| تعديل درجة الحموضة في | 37 درجة مئوية | 4 درجة مئوية | 37 درجة مئوية | 37 درجة مئوية | 37 درجة مئوية | 37 درجة مئوية | 37 درجة مئوية | 37 درجة مئوية | |
| ضبط الأس الهيدروجيني مع | هيدروكسيد الصوديوم | هيدروكسيد الصوديوم | هيدروكسيد الصوديوم | هيدروكسيد الصوديوم | هيدروكسيد الصوديوم | هيدروكسيد الصوديوم | هيدروكسيد الصوديوم | هيدروكسيد الصوديوم |
الجدول 1: قائمة المخازن المؤقتة. الجريدة الرسمية: نضح العازلة، التي يمكن تخزينها لمدة 3 أيام عند 4 درجة مئوية (300 مل للحيوان الواحد). بناء القدرات: كانوليشن المخزن المؤقت، الذي يمكن تخزينه لمدة 3 أيام عند 4 درجة مئوية (200 مل للحيوان الواحد). DB: الهضم العازلة، التي قد تستخدم في اليوم (40 مل للحيوان الواحد). س: وقف المخزن المؤقت، الذي لديه لاستخدامها خلال اليوم (2 مل للحيوان الواحد). S1: الخطوة 1 العازلة، التي ستستخدم في اليوم (2 مل للحيوان الواحد). S2: الخطوة 2 العازلة، التي ستستخدم في اليوم (2 مل للحيوان الواحد). S3: الخطوة 3 العازلة، التي ستستخدم في اليوم (2 مل للحيوان الواحد). NT: عادي تيرودي، التي قد تستخدم في اليوم (50 مل للحيوان الواحد).
-
إعداد جهاز لانجيندورف (الشكل 2A).
- مسح النظام مع 100 مل إيثانول 70%، تليها الإحمرار 2 من 100 مل مقطر من الماء. ملء هذا النظام مع 200 مل من نضح المخزن المؤقت (الجريدة الرسمية).
- تعيين معدل تدفق مضخة تمعجية إلى 3 مل/دقيقة.
- معايرة درجة الحرارة من الجريدة الرسمية ترك الجهاز لانجيندورف إلى 39 درجة مئوية.
- وضع قنية مصنوعة خصيصا [ز 16، 25 مم طويلة، حادة تلميح إزالة (الشكل 3A)] على رأس جهاز لانجيندورف، وبدء التدفق. قم بتشغيل الوحدة النمطية تدفئة وقم بضبط قيمة التدفئة للوحدة النمطية للوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة من الجريدة الرسمية على طرف القنية. وبمجرد الانتهاء من معايرة درجة الحرارة، نقل قنية مصنوعة خصيصا للمحاقن المستخدمة كانوليشن (الشكل 2).
- إعداد جهاز التحكم بالضغط (الشكل 3) إلى جانب النظام لانجيندورف. جبل إبرة الفراشة على المشبك ترايبود وإعداد 3 عقده الحظر.
ملاحظة: يختلف نشاط إنزيم كولاجيناز مع درجة الحرارة. مطلوب رصد درجة الحرارة الاذين الأيسر، فضلا عن تسوية دينامية منه، لاحقاً في هذا الإجراء.
- قم بإعداد المعدات للختان الجهاز وكانوليشن وفقا الشكل 2B. تملأ الكأس، والمحاقن، وطبق بيتري مع مخزن مؤقت كانوليشن المثلج (CB) وتعد عقده كانوليشن.
-
هيبارينيزي الفئران مع 500 وحدة دولية من الهيبارين كل 100 غم وزن الجسم في الفئران كما يلي.
- ضع 2 مل إيسوفلوراني 100% في دائرة التعريفي لتخدير مناسبة للقوارض. نقل الفئران السمنة زفس-1 أسبوع من العمر 21 من القفص إلى قاعة التعريفي. السماح للفئران لإدخال التخدير العميق، أشار إلى تباطؤ التنفس إلى نصف ما تردد الأولية.
- إزالة الفئران من قاعة التعريفي. حقن 500 وحدة دولية من الهيبارين كل 100 غم وزن الجسم في الفئران في الصفاق استخدام المحاقن الهيبارين.
- عودة الفئران في قفصة والسماح لكي تستيقظ.
ملاحظة: ليس ضروريا للحفاظ على العقم خلال الخطوة 1.4. الانتظار 20 دقيقة قبل المتابعة إلى الخطوة التالية. يمكن أن يسبب منع تخثر الدم غير مكتملة الدم تخثر الدم، مما يؤدي إلى قال الصغيرة، التي يمكن أن تؤثر إلى حد كبير نوعية والعائد من كارديوميوسيتيس معزولة.
2. إعداد قلب
- ضع 2 مل إيسوفلوراني 100% في دائرة التعريفي لتخدير مناسبة للقوارض. نقل الفئران السمنة زفس-1 أسبوع من العمر 21 من القفص إلى قاعة التعريفي. السماح للفئران لإدخال التخدير العميق، أشار إلى تباطؤ التنفس إلى نصف ما تردد الأولية.
- Euthanize الحيوان بقطع الرأس باستخدام مقصلة مناسبة للقوارض. ثبت أطرافه الفئران على سطح رغوة البوليسترين. رفع وإزالة الجلد تغطي عملية الرهابه مع المقص الجراحي. فتح الصفاق أسفل الأقفاص الضلع على كلا الجانبين، وكشف الحجاب الحاجز.
- فتح الحجاب الحاجز بإجراء شق على طول القوس الأمامي باستخدام مقص جيد. قطع طريق الأضلاع على كلا الجانبين على طول ميدياكلافيكولاريس لينيا حتى العظم العضدي، استخدام المقص الجراحي، لفضح منصف في الموقع.
- إزالة الرئتين في نهايات القاصي يقضوا مع مقص جيد. قطع الغدة الصعترية لفضح القوس الاورطي.
- قرصه قاعدة القلب باستخدام الملقط وهدم بلطف نحو ذيل الحيوان. قص عبر الشريان الاورطي مع المحافظة على سحب في القلب، وترك شريحة طويلة 5 ملم من الشريان الاورطي تعلق للقلب. بسرعة نقل القلب في CB المثلج 50 مل في الكأس 50 مل (الشكل 2).
ملاحظة: أثناء خطوات 2.5-3-3، القلب فعال في ظروف الدماغية. تجنب تجاوز إجمالي 3 دقيقة لهذه الخطوات كي لا تلحق الضرر كارديوميوسيتيس.
3-كانوليشن
- انتظر حوالي 10 s للقلب لتهدئة واغتنام تقلصات. تحويل القلب إلى طبق بتري يحتوي على 50 مل جديد، CB المثلج. بعناية إزالة الأنسجة الدهنية المحيطة بالشريان الاورطي باستخدام الملقط، والمقص.
- إدراج قنية مصنوعة خصيصا (نفس المستخدمة في الخطوة 1.2.3)، التي أرفقت بحقنه 10 مل مليئة المثلج CB، 3 مم في الشريان الاورطي. ثبت الشريان الاورطي على القنية بربط واحد من عقده cannulation اثنين (الشكل 3B) في المسافة البادئة الدانية إلى الطرف القنية.
ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم إلحاق الضرر الصمام الابهري باختراق مع القنية. - بلطف تدفق الشريان الاورطي مع 5 مل من المثلج CB استخدام المحاقن يعلق على القنية حتى لا يوجد المزيد من الدم مرئياً في الشرايين التاجية. بلطف تدليك الاذين الأيسر استخدام الملقط وحقن 5 مل المتبقية لبناء القدرات، مما يسمح لأي الدم الزائد إلى إزالته من التجويف في طبق بتري.
- قرانهما cannulation الثانية (خياطة: جامعة جنوب المحيط الهادئ 3-0، الحرير) في المسافة البادئة القاصي إلى الطرف القنية. قم بإلغاء تحميل قنية بالقلب المرفقة من المحاقن. جبل قنية بالقلب المرفقة إلى لانجيندورف استخدام محول مناسب.
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول مرتفعة الضغط في تجويف البطين أثناء التروية في جهاز لانجيندورف. عقده cannulation الإضافي مطلوب للإبقاء على هذا الضغط بتجنب أي تسرب anterograde المخزن المؤقت عن طريق الشريان الاورطي.
4-الضغط على التلاعب والهضم
- بدء تشغيل مضخة تمعجية جهاز لانجيندورف لبدء نضح الأنسجة القلبية بالجريدة الرسمية. قرانهما تراكم مزدوجة (خياطة: جامعة جنوب المحيط الهادئ 3-0، الحرير) حول قاعدة القلب، باستثناء الشريان الاورطي. كرر هذه الخطوة حتى تضخم من الاذين الأيمن والأيسر، فضلا عن الجيوب التاجي، ويلاحظ.
- ثقب الأتريوم بإبرة الفراشة لجهاز التحكم بالضغط (3D الشكل) وتسمح الأتريوم انكماش. التعامل مع ضغط intraluminal الأتريوم بضبط ارتفاع خرطوم الفراشة. تبقى اتريوم مضخمة قليلاً في بقية أنحاء الإجراء؛ رصد وضبط وفقا لذلك.
ملاحظة: هذه الخطوة يحتاج إلى إجراء سريعاً، كما تضخم مطول الاذين الأيسر سوف يسفر عن وفاة كارديوميوسيتي. - قياس درجة الحرارة التقريبية الاذين الأيسر عن طريق وضع مجس درجة حرارة بين الاذين الأيسر والبطين الأيسر. ضبط درجة حرارة لانجيندورف تدفئة الوحدة تبعاً لذلك، واستهداف درجة حرارة تقارب 37 درجة مئوية من الاذين الأيسر.
- نتخلل القلب بالجريدة الرسمية لمدة 3 دقائق.
- قم بالتبديل نضح إلى المخزن مؤقت لهضم (DB) لما يقرب من 14-18 دقيقة.
ملاحظة: الهضم اكتمال عندما ينهار هيكل أذينية الأيسر والأنسجة يكتسب مادة حليبي. - قرصه اتريوم استخدام الملقط وسن سحب طفيف. إزالة الاذين الأيسر باستخدام مقص غرامة ونقل الأتريوم في قارب وزنها كبير الذي يحتوي على 2 مل من إيقاف المخزن المؤقت (SB)، غمر الأنسجة تماما.
- التخلص من أنسجة القلب المتبقية وفقا للمبادئ التوجيهية للمختبر حيث يتم تنفيذ الإجراء.
5-الخلية تجهيز وإعادة التكيف الكالسيوم
- تخطر أذينية الأنسجة إلى قطع صغيرة من تقريبا 2 × 2 مم باستخدام مقص جيد.
- تفريق الأنسجة بالشفط لطيف وطرد من قطع الأنسجة باستخدام ماصة نقل. متابعة هذا الإجراء لمدة 5 دقائق تقريبا حتى يمكن ملاحظتها الانفصال عيانية للأنسجة.
ملاحظة: تجنب أي فقاعات الهواء أثناء هذه الخطوة، كتعريض الخلايا للهواء سوف يسفر عن وفاة كارديوميوسيتي. - نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. السماح لقطع الأنسجة تسوية لنقل س. 30 المادة طافية في أنبوب مخروطي 15 مل آخر. السماح للخلايا بتسوية لمدة 15 دقيقة.
- إزالة وتجاهل المادة طافية. إضافة 2 مل الخطوة 1 المخزن المؤقت (انظر الجدول 1). السماح كارديوميوسيتيس على تسوية لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: تتضمن المادة طافية المهملة أيضا الخلايا الليفية، وخلايا بطانية. يرجى الرجوع إلى بروتوكولات أخرى إذا كان ذلك هو المطلوب لاستخدام هذه الخلايا لتجارب14،23. وسيتضمن بيليه معظمهم أذينية cardiomyocytes، الذي يمكن أن تؤكده مجهرية الخفيفة. وتناقش خصائص أذينية cardiomyocytes المجهري في الخطوة 6، 1. - إزالة وتجاهل المادة طافية. إضافة 2 مل من المخزن المؤقت في الخطوة 2. السماح كارديوميوسيتيس على تسوية لمدة 10 دقائق.
- إزالة وتجاهل المادة طافية. إضافة 2 مل من المخزن المؤقت في الخطوة 3. السماح كارديوميوسيتيس على تسوية لمدة 10 دقائق.
- إزالة وتجاهل المادة طافية. إضافة 250 ميليلتر من الطبيعي تيرودي (NT) الذي يحتوي على 1 مم Ca2 +.
- نقل 50 ميليلتر من تيرودي العادية التي تحتوي على كارديوميوسيتيس خوارج على طبق زجاج لأسفل، التي ما برحت المغلفة مع laminin 25% (والسماح لتجف مسبقاً). السماح كارديوميوسيتيس على تسوية لمدة 10 دقائق.
- ملء طبق زجاج السفلي مع 500 ميليلتر من NT الذي يحتوي على 1 مم كاكل2.
6. الوظيفية تقييم الإثارة-الانكماش-اقتران
- تقييم مورفولوجيا الخلايا والبقاء تحت مجهر خفيفة استخدام تكبير X 20 (الشكل 4A و 4B). عشوائياً تحديد ما يقرب من 100 خلية وتصنيفهما كقابلة للتطبيق أو غير قادرة على البقاء من أجل تقدير صلاحية إجراء عزل الخلية.
ملاحظة: خلايا قابلة للحياة تتميز ببنية ساركومير متماثل وفي غياب الغشاء بليبس وشكل قضيب. -
تحميل الخلايا مع Ca2 +-صبغة الفلورسنت الحساسة داخل 20 دقيقة لإتمام الخطوة 5.9.
- إضافة 10 ميكرون Fluo4-صباحا وحتى 500 ميليلتر من NT. إزالة المادة طافية من الطبق الزجاج السفلي (من الخطوة 5، 9). إضافة NT الذي يحتوي على Fluo4-صباحا إلى الطبق أسفل الزجاج. احتضان هذا الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة وتجاهل المادة طافية. تغسل العينة 2 x باستخدام 500 ميليلتر من NT.
-
تصور Ca2 +-الإثارة مع مجهر [كنفوكل] على النحو التالي.
- نقل الطبق أسفل الزجاج إلى مجهر [كنفوكل] وتصور Ca2 +-الإثارة مع مجهر [كنفوكل] (الليزر شدتها 5.8 في المائة، الإثارة في 488 نانومتر، والانبعاثات في 515 نانومتر) استخدام تكبير X 40.
- نتخلل الخلايا مع NT تسخينها إلى 37 درجة مئوية باستخدام جهاز سوبيرفوسيون مناسبة. وبدلاً من ذلك، إبقاء الخلايا الحارة استخدام حاضنة حرارة المجهر التي شنت.
- تنشيط كارديوميوسيتيس في حقل كهربائي مع أقطاب مشجعا المتاحة تجارياً، ومجهر التي شنت على تردد 1 هرتز وتيار كهربائي من 24 ألف-انتظر 1 دقيقة السماح بالوصول إلى حالة من الثبات من Ca2 + التعامل مع الخلايا.
- ضع السطر تفحص موازية للمحور مستعرضة، منتصف الطريق بين الحافة من اختيارها عشوائياً، والنواة الميكروسكوب المتعاقدة الخلية. الحصول على خط مسح الصور عن طريق مسح المتكررة.
- باستخدام برمجيات التصوير متاحة بحرية لتقدير كثافة إشارة مباشرة قبل تحفيز كهربائي (و0) عبر الخلية بأكملها. ارسم كثافة الإشارات عبر الخلية بأكملها على مدى دورة التحفيز 1 (و). القسمة (و) (و0) الحصول كل منهما Ca2 + عابرة.
رقم 1: مخطط انسيابي تبسيط إجراءات العزل. هذا الإجراء الغاية الحساسة للوقت حتى يتم إكمال الهضم الأنزيمي ميوسيتيس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: إعداد المعدات قبل العزلة. (أ) هذا الفريق يظهر جهاز لانجيندورف عصامي: (1) سفينة رد فعل تغلف بالجريدة الرسمية؛ (2) سفينة رد فعل تغلف ببناء القدرات؛ (3) 3-طريقة محبس الحنفية؛ (4) حقنه؛ (5) مضخة تمعجية؛ (6) هو غمر تدفئة؛ (7) فخ فقاعة تغلف؛ و (8) قنية والقلب. (ب) هذا الفريق يظهر الإعداد للختان كانوليشن وجهاز لتدفق عمل أمثل: (1) كوب 100 مل مع 50 مل من المثلج بناء القدرات؛ (2) حقنه 10 مل مع المثلج بناء القدرات؛ (3) طبق بيتري مع المثلج بناء القدرات؛ (4) مصدر ضوء؛ (5) قنية مصنوعة خصيصا مع كانوليشن عقده (انظر أيضا الشكل 3 ألف و 3 باء)؛ (6) دفع غرامة، منحنى ملقط؛ (7) ملقط الأنسجة؛ (8) الملقط غرامة، زاوية 45°؛ (9) البطن المقص الجراحي؛ (10) غرامة المقص الجراحي؛ (11) 4 × 30 ز الإبر؛ و (12) إبرة ز 15. (ج) هذا الفريق يوضح معدات محمولة على المجهر للتصوير [كنفوكل]: أقطاب مشجعا الكهربائية (1)؛ (2) قلم سوبيرفوسيون؛ (3) طبق زجاج لأسفل مع تابع؛ واقطاب مشجعا الكهربائية البلاتين مغمورة (4). (د) يظهر هذا الفريق إعداد المجهر للتصوير [كنفوكل]: (1) المجهر [كنفوكل]؛ (2) قلم سوبيرفوسيون؛ (3) خزان سوبيرفوسيون المخزن مؤقت؛ (4) منظم تدفق سوبيرفوسيون؛ (5) سوبيرفوسيون تدفئة الوحدة النمطية؛ (6) محطة عمل كمبيوتر؛ (7) مشجعا كهربائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: معدات مصنوعة خصيصا. (أ) هذا الفريق يظهر 15 التلاعب قنية ز مع قفل اللوير. تشير الأسهم إلى اﻻنبعاجات اثنين لعقدة كانوليشن. (ب) هذه هي عقده cannulation، هما عقده تراكم مزدوجة وضعت فوق بعضها البعض لتشديد السريع. الأسهم تشير إلى أين والذي أمر العقدة يحتاج إلى تشديد. (ج) هذا الفريق يظهر جهاز التحكم في ضغط المجمعة. إبرة فراشة ز 21 هو مدمن مخدرات في المشبك ترايبود. يتم الاحتفاظ الخرطوم في نفس ارتفاع الإبرة. يتم فتح رأس المسمار. ويمكن تغيير ارتفاع خرطوم الفراشة كما هو مبين بالأسهم من أجل تغيير ضغط الاذين الأيسر إينترالومينال. هو ثقب اتريوم (د) اليسار مع جهاز التحكم بالضغط. هذه الصورة توضح الاذين الأيسر مبالغ فيها من الناحية المثالية. علامات القطع الناقص موضع العقدة تراكم. هو ثقب atrium (ﻫ) اليسار مع جهاز التحكم بالضغط. هذه الصورة توضح الاذين الأيسر تضخم مفرط، مما سيؤدي إلى انخفاض عائد من تابع قابلة للحياة. علامات القطع الناقص موضع العقدة تراكم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في 21 أسبوعا عمر، 60 – 90% تابع قابلة للتطبيق (ويقدر كما هو موضح في الخطوة 6، 1)، بعد الكالسيوم إعادة التكيف (الخطوة 5، 4 – 5.7)، يمكن أن تكون معزولة من زسف-1 الفئران السمنة بهذه الطريقة (الشكل 4 أ). في الفئران، تتميز تابع بمختلف والنمط الظاهري ايربان أكثر بالمقارنة مع24،فكمس25. ويبين الشكل 4B ACM فردية مع الحفاظ على الأغشية وهيكل ساركومير، كل مؤشرات قوية لخلية متكاملة وظيفيا.
يمكن معالجة تابع المكتسبة في مجموعة متنوعة من الطرق. كما يتضح في الشكل 5، قد محملة الخلايا الفلورية الأصباغ المستخدمة لدراسة مورفولوجيا و/أو وظيفة. على سبيل المثال، استخدمت دي-8-أنيبس لتحديد نظام أنبوبي في خلية فأر الرجفان (الشكل 5A). في مجموعة أخرى من التجارب، يعمل صبغ الآن الأحمر-الأسفار تلطيخ الميتوكوندريا (مثلاً، ميتوتراكير-الأحمر-FM) للكشف عن سيتوسوليك الميتوكوندريا (الشكل 5B) في إعادة عرض الرجفان. كما هو موضح في الشكل 5، تابع معزولة مع هذا البروتوكول هي أيضا مناسبة لخلية يعيش Ca2 + تصوير وإظهار الإثارة-تقلص سليمة اقتران مع 1 هرتز الميدانية-التحفيز. يمكن استخدام كل الصور لمزيد من التحليل باستخدام مجموعة متنوعة من الخوارزميات المتوفرة للباحث6،7 (الشكل 5).
الشكل 4: غلة كل منهما من العجلات قابلة للاستمرار، وخلية واحدة (أ) هذا الفريق يبين العائد العزلة بعد إعادة تكييف تابع إلى 1 ملم Ca2 + في NT. (ب) هذا الفريق يبين كارديوميوسيتي أذينية منعزلة، وحيدة الخلية. هيكل ساركومير وغشاء الخلية، ونواة تكون مرئية بوضوح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: تلوين للفئران تابع مع الأصباغ الفلورية. (أ) يظهر هذا الفريق تلطيخ شبكة أنبوبية بصبغة الفلورسنت Di8ANNEPS وغشاء الخلية. (ب) هذا الفريق يظهر تلطيخ الميتوكوندريا صبغة الفلورسنت ميتوتراكير--الأحمر--FM. (ج) مع هذا الفريق ويبين مسح خط مستعرضة من Ca2 +-الإثارة مع صبغ نيون Fluo4-صباحا على خلية واحدة. تشير الأسهم إلى التحفيز الكهربائي، أجريت في 1 هرتز-(د) يظهر هذا الفريق لونجيتودينال Ca2 + العابرين المستمدة من الفريق ج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نحن أول من وصف بروتوكول لعزل تابع خلية واحدة من نموذج الفئران من المتصلة ميتس هفبيف تظهر علامة يعيد الرجفان22. الإجراء تحديا فريداً يمكن أن تجعل الأنسجة الدهنية المفرطة في إعداد العمليات الجراحية، فضلا عن كانولاتيون من الشريان الاورطي، تزداد صعوبة. وتقدم دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها في عناوين الجدول 2 القضايا الأكثر شيوعاً من إجراءات العزل.
| المشكلة | السبب المحتمل | الحل |
| أنه لا يوجد تدفق من خلال خرطوم الفراشة | الإغلاق غير لائق من الشريان الاورطي مع عقده كانوليشن | إزالة الأنسجة الدهنية قبل تشديد |
| إضافة عقده cannulation الثالثة مع المسافة البادئة الخاصة بكل منها | ||
| سحب عقده مع اليد لزيادة القوة | ||
| إبرة المحظورة | إعادة ضبط موضع في التجويف | |
| إلغاء حظر بسحب لطيف مع حقنه | ||
| الاذين الأيمن/لم تضخم الجيوب الأنفية التاجي | الإغلاق غير لائق من قاعدة القلب | تدفق كتلة مع عقده إضافية |
| الاذين الأيمن بأضرار أثناء الإعداد | تسرب وثيقة مع مقاطع/عقده | |
| سوء الهضم/عدم تليين اتريوم | نشاط إنزيم المخفضة من خلال درجة الحرارة خاطئ | ضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية |
| إنزيم الخاملة/المتدهورة | استبدال | |
| القديم مفرط تليفية اتريوم | زيادة وقت الهضم (بالخطوات + 50%) | |
| تلف الصمام الابهري | اختراق الضحلة خلال كانولاتيون | |
| خلية الفقراء العائد | اتريوم الإفراط يهضم | تقليل وقت الهضم (في الخطوات من + 25%) |
| تخفيض الضغط إينترالومينال عن طريق خفض خرطوم الفراشة | ||
| اتريوم يهضم تحت | زيادة وقت الهضم (في الخطوات من 25%) | |
| زيادة الضغط إينترالومينال برفع خرطوم الفراشة | ||
| تشتت الخلية عدوانية جداً | أن يكون أكثر لطيف |
الجدول 2: استكشاف الأخطاء وإصلاحها دليل. يعرض هذا الجدول القضايا المشتركة لإجراءات العزل وحلولها الخاصة بكل منها.
في دراسة أجريت مؤخرا، وقد أظهرنا أن يسلك نموذج الفئران السمنة زفس-1 إعادة عرض الرجفان واسعة النطاق مع زيادة حجم الرجفان22. زيادة في حجم الرجفان اليسرى قد اعترفت كعلامة تشخيصية هامة لاختلال وظيفي الانبساطي26 ويسبب راريفيكيشن للسفن ميكروفاسكولار بالنسبة للأنسجة. وهذا يؤدي إلى انخفاض توزيع المخزن المؤقت الجهاز الهضمي عن طريق نضح تراجعية من الشريان الاورطي أثناء إجراء العزل، مما يجعل عزل الخلايا المفردة في هذا النموذج لا سيما تحدي. ميزات مميزة أخرى يعيد البناء أذينية والتليف الاذيني، وزيادة التليف قد ثبت للفئران زد دي إف – نموذج الفئران للسكري الأيضية وسلالة أحد الوالدين من ZFS1 الجرذان27. الودائع الكولاجين يضعف فعالية الإنزيمات الهضمية تحرير كارديوميوسيتيس من المصفوفة خارج الخلية، وذلك، تتطلب مزيدا من التعديلات ل إجراءات عزل الخلية28.
أن الآلية التي تسهل وسيلة الضغط نتائج تحسين العزل في هذا النموذج لإعادة عرض الرجفان الأكثر احتمالاً تتصل توهين مترجمة من تدفق الدم التاجي الاذين الأيسر. واحد العناصر الرئيسية لتدفق الدم الشريان التاجي هو ضغط التروية التاجية، الذي يعرف بأنه التدرج بين ضغط الشريان التاجي والضغط االنقباضي نهاية تجويف كل منها29. أثناء الإجراء المبين، انسداد قاعدة القلب يؤدي إلى زيادة عالمية في ضغط الشريان التاجي والضغط إينترالومينال في جميع أنحاء القلب. ثقب اللاحقة من الاذين الأيسر ييسر قطره المحلية، وانتقائية من الضغط إينترالومينال في تجويف أذينية الأيسر. وهكذا ينشأ تدرج ضغط التروية التاجية كبيرة، بل هو أيضا بزيادة حجم التروية بالحل الهضم المحولة من ازدحام البطين الأيسر إلى الاذين الأيسر.
وبالإضافة إلى ذلك، اختيار إنزيمات الهضم حاسم بالنسبة لعزل ACM: تنقية إنزيم مزيج من كولاجيناز الأول والثاني قد أظهرت أن تكون متفوقة على أقل الإنزيمات المستهدفة وأقل نقي مثل collagenases30. هذا الإنزيم لا تسمح إلا لعائد أعلى من كارديوميوسيتيس سليمة شكلياً ووظيفيا ولكن أيضا يقلل من أي تكتل الخلايا المفردة بعد عزلة عن31. يمزج إنزيم المنقي من collagenases مع ديسباسي عالية إضافية أو محتوى ثيرموليسين المتوسطة هي الأكثر شيوعاً للعزلة كارديوميوسيتي الفئران. بينما فكمس أفضل معزولة في تركيزات أعلى، نتائج أفضل من myocytes أذينية اقتنيت بتركيز 0.195 Wünsch وحدة/مل باستخدام هذا البروتوكول32.
كما يتزايد انتشار المتصلة ميتس هفبيف2 والقلب خوارج أذينية والرائدة لإعادة عرض الرجفان الاذيني ذات الصلة سريرياً عالية، للبحث في هذا المجال اهتمام محوري. تظهر العديد من نماذج حيوانية جديدة هفبيف33،34 ويعيد البناء تمشيا مع زيادة في حدوث اضطرابات إيقاع خوارج أذينية سمات مميزة لهذا المرض. الأسلوب وصف يسمح للباحثين لعزل cardiomyocytes واحدة قابلة للاستمرار من نماذج الفئران مع إعادة عرض الرجفان لمزيد من دراسة وبإنتاج عالية بشكل استثنائي، والحفاظ على وظيفة الميكانيكية والكهربائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
أيد هذا البحث دزهك (المركز الألماني "بحوث القلب والأوعية الدموية"، D.B.)، اكفس (Stiftung Else-كرنر-فريسينيوس، F.H.)، والألمانية (الوزارة الألمانية للتعليم والبحوث)، فضلا عن البوسنة والهرسك-مستشفى الشارتي تمويل برنامج العلماء اﻻكلينيكي بمستشفى الشارتي-برلين Universitätsmedizin ومعهد برلين للصحة (F.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
- Alberti, K. G., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
- International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention. IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome. , Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html (2006).
- Melenovsky, V., et al. Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).
- Goette, A., et al. EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication. EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).
- Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).
- Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).
- Hohendanner, F., et al. Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts. The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).
- Tada, Y., et al. Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats. Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).
- Iwasaki, Y. K., et al. Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model. Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).
- Field, L. J. Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice. Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50289 (2013).
- Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (91), e51109 (2014).
- Thum, T., Borlak, J. Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications. Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).
- Egorova, M. V., Afanas'ev, S. A., Popov, S. V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).
- Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments. (92), e51823 (2014).
- Hohendanner, F., et al. Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), e2033 (2010).
- Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes. Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).
- Smyrnias, I., et al. Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation. Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).
- Pritchett, A. M., et al. Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study. Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).
- Linz, D., et al. Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats. Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Deel, E. D., et al. In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).
- Wuensch, E., Heidrich, H. G. [On the Quantitative Determination of Collagenase]. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).
- Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
- Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction. Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).
