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Aislamiento de cardiomiocitos auricular de un modelo de rata de la falta de corazón relacionados con el síndrome metabólico con fracción de eyección preservada

Published: July 26, 2018 doi: 10.3791/57953
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Internal Medicine and Cardiology, Charité University Medicine, 2German Center for Cardiovascular Research (DZHK)

Summary

Aquí, describimos un procedimiento optimizado, a base de Langendorff para el aislamiento de cardiomiocitos la sola célula de un modelo de rata de la falta de corazón relacionados con el síndrome metabólico con fracción de eyección conservada. Una regulación manual de la presión intraluminal de las cavidades cardiacas se implementa para obtener funcionalmente intacto miocitos adecuado para estudios de excitación-contracción-acoplamiento.

Abstract

En este artículo describimos un procedimiento optimizado, a base de Langendorff para el aislamiento de cardiomiocitos atrial unicelular (ACMs) de un modelo de rata de síndrome metabólico (MetS)-relacionados con la insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (ICFEP). Está aumentando la prevalencia de ICFEP relacionadas con MetS y aurículas miocardiopatías asociadas con remodelado auricular y fibrilación auricular son clínicamente muy relevantes como remodelado auricular es un predictor independiente de mortalidad. Estudios con cardiomiocitos unicelular aislado se utilizan con frecuencia para corroborar y complementar los resultados en vivo . Enrarecimiento de vasos circulatorios y fibrosis del tejido intersticial constituyen un factor potencialmente limitante para el aislamiento exitoso de unicelular de ACMs de modelos animales de esta enfermedad.

Hemos abordado este problema mediante el empleo de un dispositivo capaz de regular manualmente la presión intraluminal de las cavidades cardíacas durante el procedimiento de aislamiento, incrementar sustancialmente el rendimiento de ACMs morfológicamente y funcionalmente intactas. Las células adquiridas pueden utilizarse en una variedad de diferentes experimentos, como el cultivo celular y funcional proyección de imagen de calcio (es decir, excitación-contracción-acoplamiento).

Proporcionamos el investigador con un protocolo paso a paso, una lista de soluciones optimizadas, completa instrucciones para preparar el equipo necesario y una guía completa de la solución de problemas. Mientras que la aplicación inicial del procedimiento puede ser bastante difícil, una exitosa adaptación permitirá al lector realizar aislamientos de ACM de vanguardia en un modelo de rata de ICFEP relacionadas con MetS para un amplio espectro de experiencias.

Introduction

MetS describe un conjunto de factores de riesgo para enfermedad cardiovascular y diabetes mellitus tipo 2 e incluye una mayor tensión arterial, dislipemia (elevado los triglicéridos y bajar el colesterol de lipoproteína de alta densidad), mayor ayuno glucosa y obesidad central1. La prevalencia mundial de MetS se estima que 25-30% y constantemente el aumento de2. ICFEP es un síndrome clínico heterogéneo, a menudo asociado con los MetS. La remodelación cardiaca durante sus fases anteriores (es decir, enfermedad cardíaca hipertensiva) e ICFEP también es acompañada por una remodelación de las aurículas3. Reduce la función contráctil y cambios estructurales de la aurícula izquierda se han asociado con aumento de la mortalidad, la fibrilación auricular y la insuficiencia cardíaca de nueva aparición4. Remodelación atrial se caracteriza por cambios en la función de canal de iones, homeostasis de Ca2 + , la estructura, activación de fibroblastos y tejido fibrosis5. Remodelación atrial en ICFEP relacionadas con los MetS y su subyacente mecanismos patológicos son todavía poco conocidos y requieren una investigación más a fondo a la izquierda. Modelos animales han demostrado ser una herramienta valiosa y dar lugar a muchos avances en el campo de la miocardiopatías6,7,8,9.

Estudios con cardiomiocitos unicelular aislado se utilizan con frecuencia para corroborar y complementar los resultados en vivo . Aislamiento y cultivo celular subsecuente potencial, permiten la investigación de la señalización de caminos, corrientes de canal iónico y excitación-contracción-acoplamiento. En condiciones fisiológicas, no proliferan los cardiomiocitos. La fusión entre las secuencias de regulación transcripcionales de factor natriurético atrial y un antígeno de T grande de virus de los simios 40 en ratones transgénicos llevó a la creación de las primera ACMs inmortalizados, denominado AT-110. El desarrollo de las células en-1 dio lugar a las células HL-1, que sólo pueden ser pasadas en serie pero también espontáneamente contratación11. , Sin embargo, presentan diferencias estructurales y funcionales en comparación con las células recién aisladas, como una ultraestructura menos organizada, una alta ocurrencia de desarrollo de miofibrillas11y una hiperpolarización-activado hacia adentro de la corriente12. El aislamiento de los cardiomiocitos ventriculares (VCM) en ratas y ratones de una variedad de modelos es bien establecida13,14,15,16,17,18 , 19. en general, el corazón suprimido es montado en un aparato Langendorff y retrogradely inundado con un Ca2 +-libre tampón que contiene enzimas digestivas, tales como colagenasas y proteasas. Calcio es entonces reintroducido de forma gradual a las condiciones fisiológicas. Sin embargo, aunque protocolos dedicados al aislamiento de ACMs están disponibles20,21, debido al aumento de la fibrosis y diferencias de presión, su utilidad en modelos de enfermedades con el remodelado auricular es limitada.

En este artículo, hemos implementado un protocolo para el aislamiento de la cardiomiocitos unicelular de los animales que muestran la remodelación (es decir, en particular para el modelo de rata ZFS1 relacionadas con MetS ICFEP)22. Los protocolos de aislamiento optimizados y complementados con un dispositivo simple, a la medida para controlar y modificar la presión intraluminal de las cavidades cardiacas, conduciendo a producciones más altas de cardiomiocitos morfológicamente y funcionalmente intactas. El siguiente protocolo proporciona al investigador una guía paso a paso, una descripción detallada de los equipos a medida, una lista de soluciones, así como una guía completa de la solución de problemas.

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Protocol

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de ética local (TVA T0060/15 y 15 T0003) y realizados de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Instituto Nacional de salud, U.S.A.).

Nota: Un diagrama de flujo simplificado del procedimiento se muestra en la figura 1.

1. preinstalaciones

  1. Preparar los topes según tabla 1.
Solución PB CB DB SB S1 S2 S3 NT
Reactivo (mM)
NaCl 135 135 135 135 135 135 135 135
JCM 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4.7 4
KH2PO4 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
Na2HPO4 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
MgSO4 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
MgCl 1
HEPES 10 10 10 10 10 10 10 10
Taurina 30 30 30 30 30 30 30
Glucosa 10 10 10 10 10 10 10
BDM 10 10 10 10 10 10 10
CaCl2 1 0.01 0,125 0.25 0.5 1
BSA 150 70 70 70
Enzima purificada mezcla (medio Thermolysin) 0.195 Wünsch unidades/mL
pH ajustado a 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4
pH ajustado en 37 ° C 4 ° C 37 ° C 37 ° C 37 ° C 37 ° C 37 ° C 37 ° C
pH ajustado con NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH

Tabla 1: lista de búferes de. PB: perfusión buffer, el cual puede guardarse durante 3 días a 4 ° C (300 mL por animal). CB: canulación buffer, el cual puede guardarse durante 3 días a 4 ° C (200 mL por animal). DB: tampón de digestión, que debe ser utilizado dentro del día (40 mL por animal). SB: detener el almacenador intermediario, que debe ser utilizado dentro del día (2 mL por animal). S1: Paso 1 buffer, el cual debe ser utilizado dentro del día (2 mL por animal). S2: Paso 2 buffer, el cual debe ser utilizado dentro del día (2 mL por animal). S3: Paso 3 buffer, el cual debe ser utilizado dentro del día (2 mL por animal). NT: Tyrode normal, que debe ser utilizado dentro del día (50 mL por animal).

  1. Preparar el aparato Langendorff (figura 2A).
    1. Lave el sistema con 100 mL de etanol al 70%, seguido de 2 lavados de 100 mL de agua destilada. Llenar el sistema con 200 mL de tampón de perfusión (PB).
    2. Fijar el caudal de la bomba peristáltica a 3 mL/min.
    3. Calibrar la temperatura de la PB dejando el aparato Langendorff a 39 ° C.
      1. Colocar la cánula por encargo [16 G, 25 mm de largo, agudas punta eliminado (Figura 3A)] en la parte superior del aparato Langendorff y empezar el flujo. Encienda el módulo de calefacción y ajuste el valor del módulo de calefacción al llegar a la temperatura deseada de la PB en la punta de la cánula. Una vez completada la calibración de la temperatura, mueva la cánula por encargo a la jeringa que se utiliza para la canulación (figura 2B).
    4. Preparar el dispositivo de control de presión (figura 3) junto al sistema de Langendorff. Monte la aguja de la mariposa sobre la pinza trípode y preparar 3 nudos de bloqueo.
      Nota: La actividad de la enzima colagenasa varía con la temperatura. Control de la temperatura de la aurícula izquierda, así como un ajuste dinámico, es necesaria más adelante en el procedimiento.
  2. Configurar el equipo para la supresión del órgano y la canulación según figura 2B. Llenar el vaso, jeringa y plato de Petri con un tampón de la canulación de la helada (CB) y preparar los nudos de la canulación.
  3. Heparinize la rata con 500 U.I. de heparina por cada 100 g de peso corporal de la rata como sigue.
    1. Poner 2 mL de 100% de isoflurano en una cámara de inducción de anestesia adecuado para los roedores. Transferencia de la 21 semana ZFS-1 obesa rata de la jaula a la cámara de inducción. Permitir que la rata entrar en anestesia profunda, indicada por una desaceleración de la respiración a la mitad su frecuencia inicial.
    2. Quite la rata de la cámara de inducción. Inyecte 500 U.I. de heparina por cada 100 g de peso corporal de la rata en el peritoneo utilizando una jeringa de heparina.
    3. Volver la rata en la jaula y permiten que despierte.
      Nota: No es necesario mantener la esterilidad durante el paso 1.4. Espere 20 minutos antes de proceder al siguiente paso. Una anticoagulación incompleta puede causar sangre coagulación, llevando a micro-infartos, que pueden afectar considerablemente la calidad y la producción de cardiomiocitos aislados.

2. corazón preparación

  1. Poner 2 mL de 100% de isoflurano en una cámara de inducción de anestesia adecuado para los roedores. Transferencia de la 21 semana ZFS-1 obesa rata de la jaula a la cámara de inducción. Permitir que la rata entrar en anestesia profunda, indicada por una desaceleración de la respiración a la mitad su frecuencia inicial.
  2. Eutanasia animal por decapitación con una guillotina adecuada para roedores. Para fijar las extremidades de la rata en una superficie de espuma de poliestireno. Levante y retire la piel que cubre el proceso xifoide con tijeras quirúrgicas. Abra el peritoneo debajo de las jaulas de la costilla en ambos lados y exponer el diafragma.
  3. Abrir el diafragma haciendo una incisión a lo largo del arco anterior con unas tijeras finas. Cortar las costillas en ambos lados a lo largo de la linea mediaclavicularis al hueso clavicular, con unas tijeras quirúrgicas, para exponer el mediastino in situ.
  4. Retire los pulmones en los extremos distales de la hila con tijeras finas. Corte el timo para exponer el arco aórtico.
  5. Pellizque la base del corazón con unas pinzas y tire suavemente hacia abajo hacia la cola del animal. Corte a través de la aorta manteniendo un tirón en el corazón, dejando un segmento largo de 5 mm de la aorta atado corazón. Transferir rápidamente el corazón en el CB helada de 50 mL en el vaso de precipitados de 50 ml (figura 2B).
    Nota: Durante los pasos de 2.5 – 3.3, el corazón es con eficacia en condiciones isquémicas. No superior a un total de 3 minutos para estos pasos para no dañar los cardiomiocitos.

3. canulación

  1. Espere aproximadamente 10 s para el corazón se enfríe y aprovechar las contracciones. Transferir el corazón en una placa Petri que contenga 50 mL de fresco, helada CB. Retire con cuidado el tejido graso que rodea la aorta utilizando pinzas y tijeras.
  2. Inserte la cánula por encargo (la misma utilizada en el paso 1.2.3), que se une a la jeringa de 10 mL llenada con CB helada, 3 mm en la aorta. Para fijar la aorta en la cánula atando uno de los dos nudos de canulación (figura 3B) en la muesca proximal a la punta de la cánula.
    Nota: Tenga cuidado de no dañar la válvula aórtica por una penetración con la cánula.
  3. Suavemente Lave la aorta con 5 mL de helado CB utilizando la jeringa conectada a la cánula hasta que no más sangre en las arterias coronarias. Suavemente masaje el atrio izquierdo con unas pinzas e inyectar los 5 mL restantes de CB, lo que permite cualquier exceso de sangre al ser quitado de la cavidad en la caja Petri.
  4. El segundo nudo de canulación (sutura: USP 3/0, seda) en la muesca distal a la punta de la cánula. Desmontar la cánula con el corazón atado de la jeringa. Montaje de la cánula con el corazón atado al Langendorff utilizando un adaptador apropiado.
    Nota: Este protocolo emplea la presión elevada en la cavidad ventricular durante la perfusión en el aparato de Langendorff. El nudo de la canulación de la adicional es necesaria para mantener esta presión evitando cualquier fuga de búfer anterógrada a través de la aorta.

4. manipulación y la digestión de presión

  1. Arrancar la bomba peristáltica del aparato Langendorff a iniciar la perfusión del tejido cardíaco con PB. Un doble nudo de rizo (sutura: USP 3/0, seda) alrededor de la base del corazón, excepto la aorta. Repita este paso hasta una inflación del atrio derecho e izquierdo, así como el seno coronario, se nota.
  2. Pinche el atrio con la aguja de la mariposa del dispositivo de control de presión (figura 3D) y permita que el atrio se desinfle. Manipular la presión intraluminal de la aurícula mediante el ajuste de la elevación de la manguera de la mariposa. Mantener el atrio ligeramente inflado en el resto del procedimiento. monitorear y ajustar en consecuencia.
    Nota: Este paso debe realizarse rápidamente, ya que una inflación prolongada de la aurícula izquierda en la muerte de los cardiomiocitos.
  3. Medir la temperatura aproximada de la aurícula izquierda colocando una sonda de temperatura entre la aurícula izquierda y ventrículo izquierdo. Ajuste la temperatura de Langendorff módulo de calefacción por lo tanto, dirigida a una temperatura aproximada de 37 ° C de la aurícula izquierda.
  4. Inundar el corazón con PB para un total de 3 minutos.
  5. Cambiar la perfusión a un buffer de digestión (DB) aproximadamente 14-18 minutos.
    Nota: La digestión es completa cuando la estructura de la izquierda se derrumba y el tejido adquiere una textura lechosa.
  6. Pellizque el atrio con unas pinzas y promulgar un leve tirón. Quitar la aurícula izquierda con unas tijeras finas y transferir el atrio en un gran barco de pesaje que contiene 2 mL de detener buffer (SB), sumergir completamente el tejido.
  7. Elimine el tejido cardiaco restante siguiendo las pautas del laboratorio donde se realiza el procedimiento.

5. tratamiento y readaptación de calcio de la célula

  1. Pique el tejido atrial en trocitos de aproximadamente 2 x 2 mm con tijeras finas.
  2. Dispersar el tejido por una suave succión y expulsión de los trozos de tejido utilizando una pipeta de transferencia. Continuar este procedimiento durante aproximadamente 5 minutos hasta que se observa una disociación macroscópica del tejido.
    Nota: Evitar las burbujas de aire durante este paso, como exponer las células al aire resultará en la muerte de los cardiomiocitos.
  3. Transferir las células a un tubo cónico de 15 mL. Permitir que los trozos de tejido a reposar 30 transferencia s. el sobrenadante a otro tubo cónico de 15 mL. Permitir a las células a reposar 15 minutos.
  4. Retire y descarte el sobrenadante. Añadir 2 mL de tampón de paso 1 (ver tabla 1). Permita que los cardiomiocitos a reposar 10 minutos.
    Nota: El sobrenadante descartado también incluye fibroblastos y células endoteliales. Consulte otros protocolos si se desea utilizar estas células para experimentos14,23. El sedimento contiene sobre todo auricular cardiomiocitos, que pueden ser confirmado por microscopía de luz. Se discuten las características microscópicas de cardiomiocitos atrial en el paso 6.1.
  5. Retire y descarte el sobrenadante. Añadir 2 mL de tampón de paso 2. Permita que los cardiomiocitos a reposar 10 minutos.
  6. Retire y descarte el sobrenadante. Añadir 2 mL de tampón de paso 3. Permita que los cardiomiocitos a reposar 10 minutos.
  7. Retire y descarte el sobrenadante. Añadir 250 μl de Tyrode normal (NT) que contiene 1 m m Ca2 +.
  8. Transferir 50 μl de la Tyrode normal con cardiomiocitos atrial en un plato de fondo de cristal, que ha sido revestido con laminina 25% (y deja secar previamente). Permita que los cardiomiocitos a reposar 10 minutos.
  9. Llenar un plato de fondo de cristal con 500 μl de NT que contiene 1 mM CaCl2.

6. funcional evaluación de excitación-contracción-acoplamiento

  1. Evaluar la morfología celular y la viabilidad de un microscopio óptico con un aumento de X 20 (Figura 4A y 4B). Al azar seleccione aproximadamente 100 células y clasificarlas como viable o inviable para estimar la viabilidad del procedimiento de aislamiento celular.
    Nota: Las células viables se caracterizan por la estructura del sarcómero simétrico, la ausencia de las ampollas de la membrana y una forma de varilla.
  2. Carga las células con el Ca2 +-colorante fluorescente sensible dentro de 20 minutos de completar el paso 5.9.
    1. Añadir 10 μm Fluo4-AM a 500 μl de NT. Retire el sobrenadante de la fuente de fondo de cristal (de paso 5.9). Añadir el NT que contienen Fluo4-AM para el plato de fondo de cristal. Incubar la mezcla por 20 min a temperatura ambiente. Retire y descarte el sobrenadante. Lavar la muestra 2 x utilizando 500 μl de NT.
  3. Visualizar el Ca2 +-excitación con un microscopio confocal como sigue.
    1. Transfiera el plato de fondo de cristal a un microscopio confocal y visualizar el Ca2 +-excitación con un microscopio confocal (láser de intensidad en el 5,8%, excitación a 488 nm, emisión a 515 nm) con un aumento de X 40.
    2. Perfusión de las células con calentado a 37 ° C utilizando un dispositivo apropiado de la superfusion de NT. Alternativamente, mantenga caliente utilizando una incubadora de calor montado en microscopio de las células.
    3. Estimular los cardiomiocitos en un campo eléctrico con una frecuencia de 1 Hz y una corriente eléctrica de 24 a. espere 1 minuto para permitir que las células alcanzar un estado estacionario de manejo de Ca2 + electrodos estimulador disponibles en el mercado, montado por el microscopio.
    4. Coloque la línea de exploración paralela al eje transversal, a medio camino entre el núcleo y el borde de un seleccionado al azar, contratación macroscópico de la célula. Adquirir imágenes de escaneo de línea escaneando repetitivos.
    5. Utilizar gratuitamente software tratamiento de imágenes para estimar la intensidad de la señal inmediatamente antes de una estimulación eléctrica (F0) a través de toda la célula. Parcela la intensidad de la señal a través de toda la célula a lo largo del ciclo de 1 estimulación (F). (F) se dividen por (F0) para obtener los respectivos Ca2 + transitoria.

Figure 1
Figura 1: Diagrama de flujo simplificado del procedimiento de aislamiento de. El procedimiento es altamente sensible a la vez hasta que se complete la digestión enzimática de los miocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: preparación del equipo antes del aislamiento. (A) este panel muestra un aparato Langendorff hecho a sí mismo: (1) un recipiente de reacción con camisa con PB; (2) un vaso de reacción con camisa con CB; (3) una llave de 3 vías; (4) una jeringa; (5) una bomba peristáltica; (6) una inmersión de calefacción; (7) una trampa burbuja camisa; y (8) la cánula y el corazón. (B) este panel muestra la configuración para la supresión de la canalización y órgano para un flujo de trabajo optimizado: (1) un vaso de precipitados de 100 mL con 50 mL de CB helada; (2) jeringa de 10 mL con CB helada; (3) una placa de Petri con CB helada; (4) una fuente de luz; (5) la cánula por encargo con una canulación del nudo (véase también Figura 3A y 3B); (6) pinzas finos, curvados; (7) fórceps de tejido; Pinzas finas (8), ángulo de 45°; (9) Tijeras quirúrgicas abdominales; (10) Tijeras quirúrgicas finos; (11) 4 x 30 agujas de G; y (12) una aguja de 15 G. (C) este panel muestra el equipo montado en un microscopio para la proyección de imagen confocal: electrodos estimulador eléctrico (1); (2) una pluma superfusion; (3) un plato de fondo de cristal con ACMs; y (4) electrodos electroestimulador platino inmerso. (D) este panel muestra la configuración del microscopio para la proyección de imagen confocal: (1) microscopio confocal; (2) una pluma superfusion; (3) un depósito tampón superfusion; (4) regulador de caudal superfusion; (5) una superfusion calefacción módulo; (6) una estación de trabajo de equipo; y (7) un estimulador eléctrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: equipo por encargo. (A) este panel muestra el manipulado 15 G cánula con un conector Luer lock. Las flechas indican dos muescas para los nudos de la canulación. (B) son los nudos de la canulación, dos nudos de rizo doble colocados encima de la otra para el apriete rápido. Las flechas indican donde y en que orden el nudo debe apretarse. (C) este panel muestra el dispositivo de control de presión montado. Una aguja de mariposa 21 G se engancha en una pinza trípode. La manguera se mantiene a la misma altura que la aguja. Se abre la tapa del tornillo. La elevación de la manguera de la mariposa puede ser modificada según lo indicado por las flechas para cambiar la presión intraluminal de la aurícula izquierda. (D) la izquierda atrio se pincha con el dispositivo de control de presión. Esta fotografía muestra una aurícula izquierda muy bien inflada. La elipse es la colocación del nudo. (E) la izquierda atrio se pincha con el dispositivo de control de presión. Esta fotografía muestra una aurícula izquierda inflada, que se traducirá en un menor rendimiento de ACMs viables. La elipse es la colocación del nudo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

A las 21 semanas de edad, 60 – 90% de viables ACMs (estimadas como se describe en el paso 6.1), después de la readaptación de calcio (paso 5.4-5.7), puede ser aislado de ratas obesas ZSF-1 por este método (Figura 4A). En ratas, ACMs se caracterizan por una forma diferente y más fenotipo heterogéneo comparado con VCMs24,25. Figura 4B se muestra un ACM individual con membranas preservadas y estructura del sarcómero, ambos fuertes indicadores de una celda funcional integral.

Las ACMs adquiridas pueden ser procesados en una variedad de maneras. Como se ejemplifica en la figura 5, las células podrían cargarse con tintes fluorescentes utilizados para estudiar la morfología y función. Por ejemplo, di-8-ANEPPS fue utilizado para delimitar el sistema tubular en una celda de la rata (figura 5A). En otra serie de experimentos, coloración de las mitocondrias mucho rojo fluorescencia tinte (por ejemplo, mitotracker-rojo-FM) se emplea para detectar mitocondria citosólico (figura 5B) en el remodelado auricular. Como se muestra en la figura 5, ACMs aislados con este protocolo son también convenientes para células vivas Ca2 + proyección de imagen y mostrar excitación-contracción intacta con 1 Hz campo de estimulación. Todas las imágenes pueden utilizarse para su posterior análisis utilizando una variedad de algoritmos disponibles al investigador6,7 (figura 5).

Figure 4
Figura 4: rendimiento respectivo de AM viable, unicelulares (A) este panel muestra el rendimiento de un aislamiento después de la nueva adaptación de ACMs a 1 mM de Ca2 + en NT. (B) este panel muestra un cardiomiocito atrial aislada, unicelular. La estructura del sarcómero, la membrana celular y el núcleo son claramente visibles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: tinción de rata ACMs con tintes fluorescentes. (A) este panel muestra la tinción de una red tubular con el colorante fluorescente Di8ANNEPS y membrana de la célula. (B) este panel muestra la coloración de las mitocondrias con el colorante fluorescente mitotracker-rojo-FM (C) este panel muestra el análisis de la línea transversal de Ca2 +-excitación con el colorante fluorescente Fluo4-AM en una sola celda. Las flechas indican la estimulación eléctrica, realizada a 1 Hz. (D) este panel muestra los longitudenal Ca2 + transitorios derivados de panel C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí, primero descrito un protocolo para el aislamiento de ACMs unicelular de un modelo de rata de MetS relacionadas con ICFEP que muestra marcada remodelación auricular22. El procedimiento es único desafiante como el exceso de tejido graso puede hacer la preparación quirúrgica, así como la canulación de la aorta, cada vez más difícil. La guía de solución de problemas proporcionados en las direcciones de la tabla 2 los problemas más comunes del procedimiento de aislamiento.

Problema Causa posible Solución
No hay flujo a través de la manguera de la mariposa Cierre inadecuado de la aorta con los nudos de la canulación de la Remover el tejido graso antes de apretar
Añadir 3 º nudo de canulación con indentación respectiva
Tire el nudo con la mano para mayor fuerza
Aguja bloqueaba Reajuste a la posición en el lumen
Desbloqueo por tracción suave con jeringa
Aurícula derecha / seno coronario no inflado Cierre incorrecto de la base del corazón Flujo del bloque con nudos adicionales
Aurícula derecha dañada durante la preparación Cerrar la salida con clips/nudos
Mala digestión / atrio no suavizar Actividad reducida de la enzima a través de temperatura mal Ajustar la temperatura a 37 ° C
Enzima inactiva/degradados Vuelva a colocar
De edad excesivamente fibrótica atrio Aumentar el tiempo de digestión (en pasos de + 50%)
Válvula aórtica dañada Penetración poco profunda durante la canulación de la
Rendimiento celular pobres Atrium demasiado digerido Disminuir el tiempo de digestión (en pasos de + 25%)
Reducir la presión intraluminal por bajar la manguera de la mariposa
Atrio en digestión Aumentar el tiempo de digestión (en pasos de 25%)
Aumentar la presión intraluminal levantando la manguera mariposa
Dispersión de células demasiado agresivo Ser más suave

Tabla 2: Guía de solución de problemas. Esta tabla muestra problemas comunes del procedimiento de aislamiento y sus respectivas soluciones.

En un estudio reciente, mostramos que el modelo de rata obesa de ZFS-1 exhibe el remodelado auricular extensa con un aumento en el tamaño auricular22. Un aumento en el tamaño auricular izquierdo ha sido reconocido como un importante marcador pronóstico de la disfunción diastólica26 y causa un enrarecimiento de los vasos microvasculares en relación con el tejido. Esto conduce a una distribución disminución del búfer digestiva a través de la perfusión retrógrada de la aorta durante el procedimiento de aislamiento, haciendo el aislamiento de unicelulares en este modelo especialmente desafiante. Otras características del sello del remodelado auricular, fibrosis auricular y aumento de la fibrosis han demostrado para las ratas ZDF, un modelo de la rata metabólica diabetes y tensión de uno de los padres de la ZFS1 ratas27. Depósitos de colágeno deterioran la eficacia de las enzimas digestivas para liberar a los cardiomiocitos de la matriz extracelular y, por lo tanto, requieren más ajustes de la aislamiento de célula procedimiento28.

El mecanismo por el cual el dispositivo de presión facilita los resultados de aislamiento mejorado en este modelo de remodelado auricular es más probable una atenuación localizada del flujo sanguíneo coronario de la aurícula izquierda. Uno de los principales componentes del flujo sanguíneo coronario son la presión de perfusión coronaria, que se define como el gradiente entre la presión de la arteria coronaria y la presión diastólica final de la cavidad respectiva29. Durante el procedimiento descrito, un bloqueo de la base del corazón conduce a un aumento global de presión de la arteria coronaria y presión intraluminal a través del corazón. La punción posterior de la aurícula izquierda facilita una caída local, selectiva de la presión intraluminal en la cavidad atrial izquierda. Por lo tanto, no sólo se establece un gradiente de presión de perfusión coronaria grande, sino también aumentar el volumen de perfusión por la solución de digestión desviados desde la congestionada ventrículo izquierdo a la aurícula izquierda.

Además, la elección de las enzimas de la digestión es crucial para el aislamiento de ACM: purificar mezclas de enzima de colagenasa I y II hemos demostrado ser superior al menos dirigidas y menos puras enzimas como colagenasas30. Esta enzima no sólo permite un mayor rendimiento de cardiomiocitos morfológicamente y funcionalmente intacto sino que también minimiza cualquier aglutinación de las células después de su aislamiento31. Mezclas de enzima purificada de colagenasas con un adicional dispase alta o media thermolysin contenido son más comúnmente utilizados para aislamientos de cardiomiocitos de rata. Mientras VCMs están mejor aislados en concentraciones más altas, los mejores resultados de miocitos atriales fueron adquiridos con una concentración de 0.195 Wünsch unidades/mL utilizando este protocolo32.

Como está aumentando la prevalencia de ICFEP relacionadas con MetS2 y aurículas miocardiopatías principales remodelado auricular y auriculares fibrilación auricular son clínicamente muy relevante, la investigación en este campo es de interés fundamental. Muchos nuevos modelos animales para ICFEP surgen33,34 y la remodelación en consonancia con una mayor incidencia de trastornos del ritmo auricular son características del sello de la enfermedad. El método descrito permite a los investigadores aislar cardiomiocitos viables solo de modelos de rata con remodelado auricular para un estudio adicional con un rendimiento excepcionalmente alto y conserva la función mecánica y eléctrica.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por el DZHK (centro alemán de Investigación Cardiovascular, D.B.), EKFS (Stiftung Else-Kröner-Fresenius, F.H.) y por el BMBF (Ministerio alemán de educación e investigación), así como Bosnia y Herzegovina-Charité financiado por el programa científico de la clínica por la Charité - Universitätsmedizin de Berlín y el Instituto de salud del estado de Berlín (F.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ZSF-1 Obese rat Charles River Laboratories, Inc. 21 weeks old
Fine Iris Scissors Fine Science Tools GmbH 14094-11
Surgical Scissors Fine Science Tools GmbH 14001-18
Micro Dressing Forceps (curved, serrated) Aesculap, Inc. BD312R
Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) Aesculap, Inc. BD537R
Tying Forceps (angled) Aesculap, Inc. MA624R
Rodent and Small Animal Guillotine Kent Scientific Corp. DCAP
Low Cost Induction Chamber 3.0 L Kent Scientific Corp. SOMNO-0730 
Butterfly Winged Infusion Set 21 G Hospira, Inc. 181106101
Abbocath 16 G Hospira, Inc. 0G7149702
Microlance Hypodermic Needle Becton Dickinson GmbH 301300 modify needle to make cannula
Braun Original Perfusor Syringe 50 ml B. Braun Melsungen AG 8728810F
Braun Inject Solo Syringe 10 ml B. Braun Melsungen AG 2057926
Beaker 50ml Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) 21 106 17
Duroplan petri dish (100 x 20 mm) Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) 21 755 48
Seraflex Suture USP 3/0 SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG IC208000
VWR disposable Square Weighin Boats 100ml VWR, Inc. 10803-148
Styrofoam surface
Sodium chloride Sigma-Aldrich, Inc. 71380
Potassium chloride Sigma-Aldrich, Inc. P4504
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich, Inc. P5379
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich, Inc. S0876
Magensium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich, Inc. 230391
Magensium chloride Sigma-Aldrich, Inc. M8266
HEPES Sigma-Aldrich, Inc. H3375
Taurine Sigma-Aldrich, Inc. T0625
Glucose Sigma-Aldrich, Inc. G7528
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich, Inc. B0753
Calcium chloride solution (1 M) Sigma-Aldrich, Inc. 21115
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich, Inc. A9647
Liberase Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) LIBTM-RO
Heparin Rotexmedica GmbH 3862357
Forene (Isoflurane) Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG 10182054
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane Sigma-Aldrich, Inc. L2020
WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm WillCo Wells B.V. HBST-3522
Fluo4 AM Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) F14201 5µM for 20min at RT
Di-8-ANNEPS Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) D3167 10µM for 45 min at 37° C 
Mitotracker RED FM Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) M22425 20nM for 30 min at 37° C
Jacketed reaction vessel 500 ml Gebr. Rettberg GmbH 107024414
Jacketed reaction vessel 1000 ml Gebr. Rettberg GmbH 107025414
Jacketed bubble trap Gebr. Rettberg GmbH 134720001
ED heating immersion circulator Julabo GmbH 9116000
Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) ISM 831
Voltcraft Thermometer 302 K/J Conrad Electronic SE 030300546
Tubing
LSM 700 microscope Carl Zeiss, Inc.
ZEN 2.3 imaging software Carl Zeiss, Inc. 410135-1011-240 
Single channel heater controller TC-324B Warner Instruments, LLC 64-2400
8 channel perfusion system Warner Instruments, LLC 64-0185
8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters Warner Instruments, LLC 64-0105

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References

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Medicina número 137 Atrial remodelación ICFEP síndrome metabólico disfunción atrial miocito auricular aislamiento modelo de la rata
Aislamiento de cardiomiocitos auricular de un modelo de rata de la falta de corazón relacionados con el síndrome metabólico con fracción de eyección preservada
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Bode, D., Guthof, T., Pieske, B. M., … More

Bode, D., Guthof, T., Pieske, B. M., Heinzel, F. R., Hohendanner, F. Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction. J. Vis. Exp. (137), e57953, doi:10.3791/57953 (2018).

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