Articolo metodologico

Misurazione di High-throughput di membrana plasmatica risigillazione efficienza in cellule di mammifero

DOI:

10.3791/58351

⸱

7 gennaio 2019

 ,  , 
1Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University, 3Infectious Diseases Institute, The Ohio State University, 4Division of Biostatistics, College of Public Health, The Ohio State University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui descriviamo un'analisi fluorescenza-basata di alto-rendimento che misura la membrana plasmatica risigillazione efficienza attraverso analisi fluorometriche e imaging in cellule viventi. Questo test può essere utilizzato per lo screening di farmaci o geni che regolano la chiusura della membrana plasmatica in cellule di mammifero.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nel loro ambiente fisiologico, cellule di mammiferi sono spesso sottoposti a sollecitazioni meccaniche e biochimiche che si traducono in danno della membrana del plasma. In risposta a questi danni, complessi macchinari molecolari risigillare rapidamente la membrana plasmatica per ripristinare la sua funzione di barriera e mantenere la sopravvivenza delle cellule. Nonostante i 60 anni di ricerca in questo campo, ci manca ancora una conoscenza approfondita della cella una chiusura di macchinari. Con l'obiettivo di identificare componenti cellulari che controllo chiusura della membrana plasmatica o farmaci che possono migliorare la risigillazione, abbiamo sviluppato un'analisi di alto-rendimento fluorescenza-basata che misura la membrana plasmatica risigillazione efficienza in cellule di mammifero coltivate in piastre microtiter. Come sistema modello per danno della membrana del plasma, le cellule sono esposte per la Listeriolisina di tossina batterica pore-forming O (LLO), che forma il grande 30-50 nm di diametro proteinico pori in colesterolo-contenere le membrane. L'uso di un lettore di micropiastre a modalità multipla temperatura controllata permette misurazioni rapide e sensibili spectrofluorometric in combinazione con campo chiaro e formazione immagine di microscopia di fluorescenza delle cellule viventi. Analisi cinetica dell'intensità di fluorescenza emessa da un fluorocromo acido nucleico-associazione impermeant membrana riflette l'estensione della membrana ferendo e una chiusura a livello di popolazione cellulare, consentendo per il calcolo della cella efficienza una chiusura della . Formazione immagine di microscopia di fluorescenza consente l'enumerazione delle cellule, che costitutivamente esprimono una chimera fluorescente del nucleare della proteina istone 2B, in ciascun pozzetto della micropiastra per tener conto delle variazioni di potenziale nel loro numero e permette per eventuali identificazione di popolazioni distinte delle cellule. Questa analisi di alto-rendimento è un potente strumento prevede di espandere la nostra comprensione dei meccanismi di riparazione della membrana tramite screening per geni ospitanti o esogenicamente aggiunto composti che controllo una chiusura della membrana plasmatica.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellule di mammifero sono soggetti a sollecitazioni meccaniche, osmotico e biochimici, causando la perdita di integrità della membrana del plasma. Senza una chiusura rapida ed efficiente, le cellule danneggiate sarebbero rapidamente soccombere alla morte programmata o necrotica. Dal 1960, sforzi per comprendere la membrana di plasma una chiusura processo sono stati motivati dalle conseguenze devastanti connesse con sue disfunzioni. Infatti, malattie come la distrofia muscolare dei cingoli, il diabete e la sindrome di Chediak-Higashi sono state collegate alla riparazione della membrana di plasma carente a causa di mutazioni nel gene codifica disferlina, produzione di prodotti finiti avanzati di glycation e difetti di il regolatore di traffico lisosomiale CHS1, rispettivamente1,2,3,4,5,6. Tuttavia, ad oggi, la nostra comprensione della membrana una chiusura è ancora limitata7. Gli studi iniziali hanno dimostrato che la chiusura della membrana viene avviata dall'afflusso di extracellulare Ca2 + attraverso la membrana plasmatica danneggiata8,9,10. Da allora, parecchi non escludono Ca2 +-dipendente meccanismi sono stati proposti per sigillare le cellule. L'ipotesi di patch propone che in vicinanza alla ferita, vescicole intracellulari fusibile con l'altro e la membrana plasmatica danneggiata di agire come un patch11,12,13,14. Un secondo modello propone che l'esocitosi calcio-dipendente dei lisosomi la ferita sito rilascia la sfingomielinasi acida lysosomal degli enzimi, che converte la sfingomielina alla ceramide l'opuscolo esterno della membrana plasmatica. Questo improvviso cambiamento nella composizione lipidica si traduce in ceramide-driven endocitosi del regione danneggiata15,16,17. Infine, il terzo meccanismo proposto prevede un ruolo per il endosomal ordinamento complessi necessari per il trasporto (ESCRT) promuovere la formazione di vescicole di rivolte che bud fuori dalla membrana plasmatica18. Solo un set limitato di proteine è stato identificato in questi modelli, e loro macchinari devono essere ulteriormente chiarito.

Qui descriviamo un saggio di alto-rendimento che misure sulla membrana plasmatica risigillazione efficienza in cellule di mammifero aderente sottoposto a danni mediati da ricombinante Listeriolisina O (LLO)19. LLO è una tossina che formano dei pori (PFT) secernuta dall'agente patogeno intracellulare facoltativo Listeria monocytogenes20,21,22 ed appartiene al MACPF/CDC (complesso di attacco della membrana, perforina, e Superfamiglia Citolisina colesterolo-dipendente). MACPF sono mammiferi poro-formare proteine coinvolte nelle difese immunitarie, mentre CDCs sono tossine batteriche principalmente prodotte da patogeni Gram-positivi che danneggiano le cellule dell'ospite per promuovere i loro stili di vita patogeni23. CDCs sono sintetizzati come monomeri solubili in acqua o dimeri che si legano al colesterolo presentano nella membrana plasmatica e oligomerizzazione in un complesso prepore di fino a 50 unità secondarie. Il complesso prepore quindi riorganizza per inserire β-fili attraverso il doppio strato lipidico, formando un poro del β-barilotto che si estende su 30-50 nm in diametro24,25,26,27.  Questi grandi pori consentono flussi di ioni e piccole componenti cellulari dentro e fuori la cellula; però, alcuni studi hanno proposto che i pori di dimensioni più piccole sono anche formato28,29,30. Tra il CDCs, LLO Visualizza proprietà uniche, tra cui l'aggregazione irreversibile e temperatura-dipendente dal pH, che è favorevole alla analisi di alto-rendimento31,32. LLO possa essere aggiunti al terreno di coltura cellulare a 4 ˚ c, una temperatura permissiva al suo legame alle cellule, ma non per la formazione del poro complessa. L'inizio della formazione dei pori può essere sincronizzato quindi alzando la temperatura a 37 ° c, consentendo la diffusione efficiente delle molecole di tossina nel piano della membrana per formare oligomeri e per il rimodellamento conformazionali coinvolti nella generazione del poro. Pertanto, seguendo l'interruttore della temperatura, la cinetica di danno delle cellule dipenderà la quantità di tossina associata alla membrana plasmatica. D'importanza, LLO solubile (non legato alla membrana plasmatica) rapidamente e irreversibilmente aggrega al raggiungimento della temperatura di 37 ° c, che riduce la necessità di lavare via molecole di tossina non associato e limita l'entità del danno di membrana nel corso del tempo. Infine, perché LLO lega al colesterolo e forma i pori nelle membrane ricchi di colesterolo, questo test è suscettibile di una vasta gamma di cellule di mammifero. È importante tenere a mente che LLO colpisce la cellula ospite segnalazione principalmente attraverso la formazione dei pori, con poche eccezioni in quale cella di poro-indipendente di segnalazione può verificarsi33,34,35,36 ,37,38,39. Pertanto, non può essere escluso che LLO segnalazione attività possono influenzare il processo di riparazione della membrana.

Questo test valuta direttamente la portata della cella ferendo misurando l'incorporazione di un fluorocromo impermeant cella (ad es., ioduro di propidio) che entra nelle cellule ferite e diventa altamente fluorescente, una volta che si associa con acidi nucleici passivamente . Quindi, il fluorocromo possa essere mantenuto in medium della coltura cellulare in tutto l'esperimento, permettendo analisi in tempo reale della cella ferendo. L'intensità di fluorescenza del colorante acido nucleico-associazione aumenterà con la concentrazione della tossina e, per una data concentrazione della tossina, aumenterà nel tempo fino a quando non si formano tutti i pori, e le cellule sono completamente riparate o finché non viene raggiunto la saturazione. L'afflusso di extracellulare Ca2 + attraverso i pori della membrana è un evento di conditio sine qua non per una chiusura. Di conseguenza, l'efficienza risigillazione può essere indirettamente evidenziato confrontando cella ferendo in terreno di coltura contenente Ca2 + (riparazione condizione permissiva) al ferimento in Ca2 +-mezzo libero (condizione restrittiva di riparazione). Poiché l'intensità della fluorescenza del colorante acido nucleico-associazione è direttamente proporzionale alla concentrazione delle cellule in ciascun pozzetto, è importante per le cellule di seme alla stessa concentrazione in tutti i pozzetti. È anche importante enumerare le cellule in ciascun pozzetto, prima e dopo il test per assicurare che distacco cellulare non si verifica, come mobili, cellule aggregate possono oscurare letture di fluorescenza che possono complicare l'interpretazione dei dati. Per enumerare le cellule, le cellule che esprimono nucleare localizzato istone 2B-GFP (H2B-GFP) sono state utilizzate in questo test. Temperatura controllata, multi-mode, lettori di micropiastre combinano misure di rapide, ad alta velocità (utilizzando un formato di piastra 96 o 384 pozzetti) delle intensità di fluorescenza con formazione immagine di microscopia di cellule viventi a 37 ° C. Quest'ultimo può essere utilizzato per enumerare il numero di cell e osservare l'eventuale formazione di popolazioni distinte delle cellule.

In definitiva, questo test fornisce agli utenti la possibilità di ampliare la loro conoscenza della complessità dei meccanismi di riparazione della membrana di screening per molecole ospitanti o ripristino esogenicamente aggiunto composti che possono controllare la membrana. Il seguente protocollo descrive la procedura sperimentale per misurare l'efficienza risigillazione delle cellule esposte a LLO e valutare gli effetti di un dato farmaco o trattamento cellulare sull'efficienza risigillazione.

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Protocollo

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1. preparazione

  1. Placcatura di cella
    Nota: Cellule epiteliali cervicali umane, HeLa e HeLa esprimendo istone 2B-GFP (H2B-GFP), sono state utilizzate in questo protocollo, ma questo dosaggio può essere adattato ad altre cellule di mammiferi19.
    1. Staccare le cellule aderenti da una boccetta di coltura cellulare di 75cm2 lavando le cellule con 2 mL di tripsina-EDTA 0,25%. Sostituire la tripsina usata con 2 mL di tripsina-EDTA fresco 0.25%.
    2. Incubare le cellule a 37 ˚ c per 5 minuti fino a quando le cellule sono arrotondati e staccato dal pallone.
    3. Risospendere le cellule in 8 mL di terreno di coltura (DMEM contenente siero bovino fetale inattivati 10%, 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina).
    4. Determinare la concentrazione di cellule utilizzando un emocitometro e 10 µ l di sospensione cellulare.
    5. Diluire le cellule in coltura ad una concentrazione di 2.5 x 105 cellule/mL.
    6. Versare la sospensione cellulare in un bacino di pipetta sterile e mescolare bene la sospensione utilizzando una pipetta sierologica di 10 mL.
    7. Utilizzando una micropipetta multicanale 12 e 200 µ l consigli, distribuire le cellule HeLa (2,5 x 104 cellule/100 µ l/pozzetto) in triplice copia (o quadruplice copia) in una piastra di coltura del tessuto-trattati polistirolo inferiore piatto 96 pozzetti, chiaro, nero.
      Nota: Una disposizione di placcatura è presentata come un esempio nella Figura 1.
    8. Coltura delle cellule per 24 h in un'incubatrice di coltura cellulare umidificata a 37 ˚ c e 5% di CO2.
  2. Preparazione della soluzione di riserva
    1. Preparare 1 L di uno stock di 10 x di tampone M (utilizzato per preparare M1 e M2) con l'aggiunta di 95g di Hanks equilibrata soluzione salina, 0,476 g di MgCl2 (5 mM) e g 23,83 di HEPES (100 mM) a 900 mL di acqua. Regolare il pH a 7,4 e aumentare il volume di 1 L. filtro sterilizzare.
    2. Preparare 50 mL di un 50 x (1,25 M) stock di glucosio aggiungendo 11,26 g di D-(+)-glucosio per un totale di 50 mL di acqua. Filtro sterilizzare la soluzione.
    3. Preparare 50 mL di un 100 x (120 mM) calcio di calcio con l'aggiunta di 0,666 g di CaCl2 per un totale di 50 mL di acqua. Filtro sterilizzare la soluzione.
    4. Preparare 50 mL di un 10x (50 mM) calcio di glicole etilenico-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N', acido etilendiamminotetraacetico (EGTA) aggiungendo 0,951 g di EGTA a 40 mL di acqua. Aumentare il pH a 8 con NaOH per sciogliere l'EGTA, quindi aumentare il volume di 50 mL. Filtro sterilizzare la soluzione.
    5. Per una singola piastra a 96 pozzetti, preparare 50 mL di Medium 1 (M1, contiene Ca2 +), 50 mL di Medium 2 (M2, Ca2 +-libero) e 15 mL di Medium 2 completati con EGTA, conseguenza:
      1. Per M1, aggiungere 5 mL di 10x Buffer M, 0,5 mL di 100 x CaCl2e 1 mL di glucosio di 50 x 43,5 mL di acqua.
      2. Per M2, aggiungere 5 mL di 10 x M di tampone e 1 mL di glucosio 50 x a 44 mL di acqua.
      3. Per M2/EGTA, aggiungere 1,5 mL di 10x Buffer M e 1,5 mL di 10 x EGTA a 12 mL di acqua.
        Nota: Tutte le soluzioni contenenti ioduro di propidio (PI) dovrebbero essere preparate direttamente prima dell'aggiunta alle cellule.
  3. Plate Reader/Imaging citometro impostazioni
    Nota: Utilizzare un lettore multi-mode dotato di due unità di rilevamento: un spettrofluorimetro e un citometro imaging. Limitare l'esposizione di fluorescenza per evitare photobleaching fluorophores.
    1. Pre-riscaldare il lettore di piastra a 37 ° C prima di eseguire il test.
    2. Impostare i parametri per l'analisi cinetica di conseguenza all'interno della modalità di Impostazioni :
      1. Scegli monocromatore, FL (fluorescenza)e cinetica per la configurazione ottica, modi di leggere e leggere tipo, rispettivamente.
      2. In Impostazioni di lunghezza d'onda, è necessario selezionare un passabanda eccitazione e di emissione di nm 9 e 15, rispettivamente. Per i dosaggi con ioduro di propidio (PI), impostare le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione a 535 e 617 nm, rispettivamente.
      3. Tipo di piastra, selezionare 96 pozzetti per il formato di piastra e una configurazione pre-piastra di fissaggio corrispondente ad una piastra di fondo chiaro nero-parete.
      4. Sotto Area lettura, evidenziare i pozzi che verranno analizzati durante la cinetica.
      5. Sotto PMT e ottica, lampeggiano per lettura a 6 e la casella di controllo per lettura dal basso.
      6. Sotto temporizzazione, inserire 00:30:00 nella casella Totale tempo di esecuzione per un'analisi cinetica di 30 min e 00:05:00 per l' intervallo.
        Nota: Per ogni volta che il punto e una lunghezza d'onda, il tempo di lettura di una piastra a 96 pozzetti completa è di 30 s.
      7. Confermare le impostazioni specificate nelle Informazioni delle impostazioni a destra e selezionare OK. Premere Leggi per avviare la cinetica eseguire.
    3. Impostare i parametri di imaging in conseguenza all'interno della modalità di impostazioni:
      1. Scegliere Minimax, Imaginged Endpoint per la configurazione ottica, modi di leggere e leggere tipo, rispettivamente.
      2. In lunghezze d'onda, selezionare luce trasmessae una o entrambe le caselle di fluorescenza corrispondenti alle lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione di 456/541 nm (GFP) e 625/713 nm (PI).
      3. Utilizzare le stesse opzioni per il Tipo di piastra e Zona lettura , come definito nei passaggi 1.3.2.3 e 1.3.2.4.
      4. In Ben Area impostazione, selezionare il numero di siti all'interno di un ben essere imaged.
        Nota: 12 siti corrispondono a un'immagine di benissimo.
      5. Sotto le Impostazioni di acquisizione immagine, selezionare i tempi di esposizione per la luce emessa, 541 (GFP) e 713 (PI). Per GFP, immagine l'intero bene con un tempo di esposizione di 20 ms/immagine. Per trasmettere luce (TL) e fluorescenza di PI, acquisire una sola immagine del centro di ciascun pozzetto con tempi di esposizione di 8 e 20 ms, rispettivamente.
      6. Confermare le impostazioni specificate nelle informazioni delle impostazioni a destra e selezionare OK. Il tempo di acquisizione per l'intera superficie dei pozzetti (12 immagini/pozzetto) di una piastra a 96 pozzetti di imaging e per una lunghezza d'onda è ~ 15 min premere Leggi per avviare la formazione immagine.
        Nota: Il tempo di acquisizione di un singolo immagine/pozzetto di una piastra a 96 pozzetti richiede ~2.5 min/piastra per una lunghezza d'onda. I parametri descritti sopra corrispondono all'equipaggiamento specifico nel nostro laboratorio. Spectrofluorometric misure: un flash allo xeno visualizzazione 1.0 nm incremento eccitazione lunghezze d'onda (250-850 nm) con un regolabile 9 o 15 nm passa-banda, un fotomoltiplicatore tubo rivelatore con un > 6 log gamma dinamica e un'emissione di nm 15 o 25 regolabile passa-banda. Citometro di imaging: una sorgente di luce di illuminazione in grado di luce bianca, 460 nanometro e 625 lunghezze d'onda di eccitazione di nm con un 20 nm passa-banda, filtri di emissione centrati a 541 nm (108 nm passa-banda) e 713 nm (123 nm passa-banda), rispettivamente, e un obiettivo 4x accoppiato ad un 1,25 12-bit charge coupled device fotocamera megapixel.

2. dosaggio

Nota: Al momento del test, le cellule devono essere 70-90% confluenti. Durante le fasi di lavaggio, il mezzo dovrebbe essere rimosso dal e applicato alla parete laterale del pozzo (non direttamente sopra le celle). Mantenere la temperatura di LLO a < 4 ˚ c per impedire la sua aggregazione fino al punto 3.1.5.

  1. Preparare un brodo di 30 µM PI in M1 e uno stock di 30 µM PI in M2 pre-riscaldati a 37 ˚ c.
  2. Lavare delicatamente le cellule in piastra 1 utilizzando una micropipetta multicanale 12 e 200 µ l consigli, come segue:
    1. Per condizioni di riparazione-permissive, rimuovere il terreno di coltura e lavare che le cellule due volte con 200 µ l/pozzetto M1 pre-riscaldate a 37 ˚ c. Sostituire il mezzo con 100 µ l/pozzetto di M1 caldo contenente 30 µM PI.
    2. Per ripristinare condizioni restrittive, rimuovere il mezzo di crescita e lavare le cellule una volta con 200 µ l/pozzetto calda M2 contenente 5 mM EGTA per chelare Ca2 +, seguito da un lavaggio con 200 µ l/pozzetto M2. Sostituire il supporto con 100 µ l/pozzetto calda M2 contenente 30 µM PI.
    3. Dopo il mezzo di crescita è stato lavato e sostituito con terreno contenente ioduro di propidio, saltare direttamente al punto 2.1.3.
  3. Immagine 1 piastra in luce trasmessa, GFP e PI come dettagliato sotto 1.3.3 (pre-cinetico). Questo passaggio richiede 15-20 min.
  4. Durante il periodo di 15 minuti al punto 2.1.3, preparare la piastra 2 utilizzando una micropipetta multicanale 12 e 200 µ l consigli come segue:
    1. Mettere una fondo tondo 96 pozzetti in polipropilene micropiastra sul ghiaccio. Configurare la piastra utilizzando un disegno sperimentale corrispondente per piastra 1 (Figura 1).
    2. Per condizioni di riparazione-permissive, aggiungere 100 µ l/pozzetto di M1 ghiacciata contenente 60 µM PI, seguita dall'aggiunta di 100 µ l/pozzetto di M1 ghiacciata contenente 4 x LLO o non per il controllo.
    3. Per le condizioni di riparazione-restrittive, aggiungere 100 µ l/pozzetto di gelida M2 contenente 60 µM PI, seguita dall'aggiunta di 100 µ l/pozzetto di M2 ghiacciata che contiene 4 x LLO o non per il controllo.
  5. Dopo formazione immagine piastra 1 (punto 2.1.3), immediatamente posto sul ghiaccio, con foglio di alluminio per separare la piastra dal contatto diretto con ghiaccio. Consentire la piastra 1 raffreddare per 5 min.
  6. Utilizzando una micropipetta multicanale 12 e 200 µ l consigli, trasferire 100 µ l di ciascun pozzetto nella piastra 2 (passo 2.1.4) ai rispettivi pozzetti della piastra 1. Per distribuire correttamente la tossina nei media della piastra 1, inserire le punte sotto il menisco e delicatamente espellere il volume senza introdurre bolle.
    Nota: Non pipettare su e giù, come questo può staccare inavvertitamente le cellule.
  7. Lasciare la piastra per un ulteriore 1 min consentire la tossina di legarsi alle cellule e trasferire immediatamente piastra 1 al lettore di piastra per l'analisi cinetica utilizzando la modalità spettrofluorimetro (punto 1.3.2).
  8. Alla fine del test cinetico, immediatamente immagine piastra 1 (post-cinetico) utilizzando punto 1.3.3.

3. analisi: Cella enumerazione

  1. Determinare il conteggio delle cellule basato sulla fluorescenza nucleare utilizzando il software di enumerazione delle cellule di micropiastre.
    1. All'interno delle impostazioni, selezionare Re-analisie nella sezione categoria all'interno delle Impostazioni di analisi di immagine selezionare Discreto oggetto analisi utilizzando 541 come la lunghezza d'onda per trovare oggetti.
    2. All'interno l'opzione di trovare oggetti, utilizzando il disegnare sulle immagini la ricerca metodo, selezionare Nuclei sotto la scheda Impostazioni e premere applica.
    3. Premere OK e Leggi per avviare la cella algoritmo di conteggio.
  2. In alternativa, se nessun tale strumento è disponibile, è possibile utilizzare un software di analisi di immagine come ImageJ per enumerare le cellule.
    1. In ImageJ, aprire il file di immagine come una pila.
    2. Convertire lo stack a 8-bit scala di grigi immagini facendo clic su immagine nella barra dei menu con il mouse su tipo e selezionare 8 bit.
    3. Sottrarre lo sfondo: Clicca sull' immagine nella barra dei menu, passa il mouse sopra la regolae selezionare Luminosità/contrasto. Regolare il valore minimo per rimuovere il rumore di fondo e selezionare applica.
    4. Soglia per creare immagini binarie: Clicca sull' immagine nella barra dei menu, passare sul regolaree selezionare soglia. Selezionare sfondo scuro, regolare i valori di soglia minima e massima e fare clic su applica.
    5. Nel caso di nuclei sovrapposti, uno strumento di spartiacque utilizzabile ai nuclei di segmento. Fare clic su processo nel menu, con il mouse su binario e selezionare spartiacque.
      Nota: Questo separerà automaticamente i nuclei collegati.
    6. Analizzare le immagini mascherate, applicando criteri specificati dall'utente (dimensioni e circolarità) per perfezionare l'identificazione dei nuclei ed escludere i detriti cellulari.
      1. Fare clic su Analyze nel menu e poi analizzare particelle. Impostare la dimensione desiderata (pixel ^ 2) e circolarità (un valore di 1 è un cerchio perfetto) varia che sono sufficienti per includere/nuclei di cellule singoli.
      2. Nella casella a discesa Visualizza, selezionare le opzioni desiderate, verifica Summarizee fare clic su OK per ottenere i conteggi delle cellule.

4. analisi: Cinetica delle curve

  1. Trasferire i dati cinetici dal software del lettore di piastra un software di dati analitici.
  2. Per ogni condizione sperimentale, media le intensità di fluorescenza dei replicati in ogni timepoint, insieme con la corrispondente deviazione standard e l'errore standard della media per ogni condizione sperimentale.
  3. Per ogni condizione sperimentale, tracciare il corrispondente diagramma cinetico: intensità di PI (asse y) rispetto al tempo (asse x).
  4. Per calcolare l'efficienza risigillazione di una condizione di trattamento determinato, calcolare l'area sotto la curva (AUC) dei + LLO in M1 (AUC(M1)) e + LLO in M2 (AUC(M2)). Utilizzare l'approccio suggerito qui di seguito per valutare l'efficienza (E) menzionerà:
    figure-protocol-1
  5. Eseguire un confronto fra il trattamento e di controllo determinando il rapporto di efficienza (REff) indicato di seguito:
    figure-protocol-2
    REFF = 1, test trattamento non ha alcun effetto sulla riparazione
    REFF < 1, test trattamento inibisce la riparazione
    REFF > 1, test trattamento migliora la riparazione
  6. Calcolare l'area sotto la curva utilizzando la seguente equazione:
    figure-protocol-3, dove k è il numero totale di follow-up.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Precisione di conteggio delle cellule: cellule HeLa sono frequentemente utilizzate come una linea di cellule di mammifero modello per esplorare i meccanismi di riparazione della membrana. Nel valutare la riparazione della membrana a livello della popolazione delle cellule, è importante alle cellule della piastra alla stessa concentrazione in tutti i pozzetti per interpretazione corretta dei dati. È anche importante verificare al momento del dosaggio che numeri di cellulare sono equivalent...

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Discussione

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Questo test misura l'efficienza della membrana una chiusura a livello della popolazione di cellule con capacità di alto-rendimento. Può essere utilizzato per schermare per componenti cellulari o librerie di farmaco che potrebbero influire sulla riparazione della membrana. Il saggio descritto utilizzato un formato di piastra a 96 pozzetti, ma può essere adattato a piastre da 384 pozzetti per un throughput più elevato. Un vantaggio di questo test è la sua capacità di ottenere misure di fluorescenza delle cellule viventi ad...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Riconosciamo il dottor Jesse Kwiek (The Ohio State University) per averci gentilmente di utilizzare la sua piattaforma di rilevamento multi-modalità per alcuni esperimenti preliminari. Ricerca riportata in questo articolo è stata sostenuta dal National Institute of Allergy e malattie infettive dei National Institutes of Health, in numero di premio RO1AI107250 da Stephanie Seveau. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Lettore di micropiastre multimodale SpectraMax i3xMolecular Devicesi3x
MiniMax 300 Citometro per imagingMolecular Devices5024062
TO-PRO-3ThermoFisher ScientificT3605
Ioduro di propidioThermoFisher ScientificP3566
HeLaATCCCCL2
HeLa H2B-GFPMilliporeSCC117
Tripsina-EDTA 0,25%ThermoFisher Scientific 25200056
96 pozzetti Corning fondo piatto polistirene nero coltura tissutale piastra trattataCorning3603
Sali bilanciati di HanksSigma-AldrichH4891
EGTAISC BioExpress0732-100G
HEPESFisher ScientificBP310-500
D-(+)-glucosio, HybriMaxSigma-AldrichG5146-1KG

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Current Topics in Membranes. 77, 67-96 (2016).
  2. Howard, A. C., McNeil, A. K., McNeil, P. L. Promotion of plasma membrane repair by vitamin E. Nature Communications. 2, 597(2011).
  3. Howard, A. C., et al. A novel cellular defect in diabetes: membrane repair failure. Diabetes. 60 (11), 3034-3043 (2011).
  4. Lozano, M. L., et al. Towards the targeted management of Chediak-Higashi syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 132(2014).
  5. Vainzof, M., et al. Dysferlin protein analysis in limb-girdle muscular dystrophies. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (1), 71-80 (2001).
  6. Huynh, C., et al. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (48), 16795-16800 (2004).
  7. Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiological Reviews. 95 (4), 1205-1240 (2015).
  8. Steinhardt, R. A., Bi, G., Alderton, J. M. J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263 (5145), 390-393 (1994).
  9. De Mello, W. C. Membrane sealing in frog skeletal-muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (4), 982-984 (1973).
  10. Fishman, H. M., Tewari, K. P., Stein, P. G. Injury-induced vesiculation and membrane redistribution in squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (3), 421-435 (1990).
  11. Davenport, N. R., Bement, W. M. Cell repair: Revisiting the patch hypothesis. Communicative & Integrative Biology. 9 (6), 1253643(2016).
  12. McNeil, P. L., et al. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. Journal of Cell Science. 113 (11), 1891-1902 (2000).
  13. Terasaki, M., Miyake, K., McNeil, P. L. Large plasma membrane disruptions are rapidly resealed by Ca2+-dependent vesicle-vesicle fusion events. Journal of Cell Biology. 139 (1), 63-74 (1997).
  14. Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Journal of Cell Biology. 131 (6 Pt. 2), 1747-1758 (1995).
  15. Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. Journal of Cell Biology. 189 (6), 1027-1038 (2010).
  16. Rodriguez, A., et al. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. Journal of Cell Biology. 137 (1), 93-104 (1997).
  17. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
  18. Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136(2014).
  19. Pathak-Sharma, S., et al. High-Throughput Microplate-Based Assay to Monitor Plasma Membrane Wounding and Repair. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 305(2017).
  20. Hamon, M. A., et al. Listeriolysin O: the Swiss army knife of Listeria. Trends in Microbiology. 20 (8), 360-368 (2012).
  21. Seveau, S. Multifaceted activity of listeriolysin O, the cholesterol-dependent cytolysin of Listeria monocytogenes. Subcellular Biochemistry. 80, 161-195 (2014).
  22. Osborne, S. E., Brumell, J. H. Listeriolysin O: from bazooka to Swiss army knife. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 372 (1726), (2017).
  23. Lukoyanova, N., Hoogenboom, B. W., Saibil, H. R. The membrane attack complex, perforin and cholesterol-dependent cytolysin superfamily of pore-forming proteins. Journal of Cell Science. 129 (11), 2125-2133 (2016).
  24. Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infection and Immunity. 73 (10), 6199-6209 (2005).
  25. Koster, S., et al. Crystal structure of listeriolysin O reveals molecular details of oligomerization and pore formation. Nature Communications. 5, 3690(2014).
  26. Duncan, J. L., Schlegel, R. Effect of streptolysin O on erythrocyte membranes, liposomes, and lipid dispersions. A protein-cholesterol interaction. Journal of Cell Biology. 67 (1), 160-174 (1975).
  27. Morgan, P. J., et al. Subunit organisation and symmetry of pore-forming, oligomeric pneumolysin. FEBS Letters. 371 (1), 77-80 (1995).
  28. Leung, C., et al. Stepwise visualization of membrane pore formation by suilysin, a bacterial cholesterol-dependent cytolysin. eLife. 3, (2014).
  29. Marchioretto, M., et al. What planar lipid membranes tell us about the pore-forming activity of cholesterol-dependent cytolysins. Biophysical Chemistry. 182, 64-70 (2013).
  30. Palmer, M., et al. Assembly mechanism of the oligomeric streptolysin O pore: the early membrane lesion is lined by a free edge of the lipid membrane and is extended gradually during oligomerization. European Molecular Biology Organization Journal. 17 (6), 1598-1605 (1998).
  31. Bavdek, A., et al. pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. Federation of European Biochemical Society Journal. 279 (1), 126-141 (2012).
  32. Schuerch, D. W., Wilson-Kubalek, E. M., Tweten, R. K. Molecular basis of listeriolysin O pH dependence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12537-12542 (2005).
  33. Cassidy, S. K., O'Riordan, M. X. More than a pore: the cellular response to cholesterol-dependent cytolysins. Toxins (Basel). 5 (4), 618-636 (2013).
  34. Lam, J., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes L. monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. , (2017).
  35. Gekara, N. O., Weiss, S. Lipid rafts clustering and signalling by listeriolysin O. Biochemical Society Transactions. 32 (Pt 5), 712-714 (2004).
  36. Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. European Molecular Biology Organization Reports. 11 (5), 400-405 (2010).
  37. Baba, H., et al. Induction of gamma interferon and nitric oxide by truncated pneumolysin that lacks pore-forming activity. Infection and Immunity. 70 (1), 107-113 (2002).
  38. Carrero, J. A., Vivanco-Cid, H., Unanue, E. R. Listeriolysin o is strongly immunogenic independently of its cytotoxic activity. Public Library of Science One. 7 (3), e32310(2012).
  39. Coconnier, M. H., et al. Listeriolysin O-induced stimulation of mucin exocytosis in polarized intestinal mucin-secreting cells: evidence for toxin recognition of membrane-associated lipids and subsequent toxin internalization through caveolae. Cell Microbiology. 2 (6), 487-504 (2000).
  40. Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 45 (1), 49-53 (1997).
  41. Bink, K., et al. TO-PRO-3 is an optimal fluorescent dye for nuclear counterstaining in dual-colour FISH on paraffin sections. Histochemistry and Cell Biology. 115 (4), 293-299 (2001).
  42. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  43. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nature Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  44. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  45. Zhang, X. D. A new method with flexible and balanced control of false negatives and false positives for hit selection in RNA interference high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 12 (5), 645-655 (2007).
  46. Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
  47. Davenport, N. R., et al. Membrane dynamics during cellular wound repair. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2272-2285 (2016).
  48. Defour, A., Sreetama, S. C., Jaiswal, J. K. Imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair. Journal of Visualized Experiments. (85), (2014).
  49. Lee, J. J. A., et al. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  50. Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. Journal of Visualized Experiments. (52), (2011).
  51. Corrotte, M., et al. Toxin pores endocytosed during plasma membrane repair traffic into the lumen of MVBs for degradation. Traffic. 13 (3), 483-494 (2012).
  52. Kuismanen, E., Saraste, J. Low temperature-induced transport blocks as tools to manipulate membrane traffic. Methods in Cell Biology. 32, 257-274 (1989).
  53. Togo, T., et al. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. Journal of Cell Science. 112, 719-731 (1999).
  54. Johnson, S. A., et al. Temperature-dependent phase behavior and protein partitioning in giant plasma membrane vesicles. Biochimica et Biophysica Acta. 1798 (7), 1427-1435 (2010).
  55. Lam, J. G. T., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes Listeria monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 270-284 (2018).

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