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Immunology and Infection

Medida de alto rendimiento de membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58351
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3
1Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University, 3Infectious Diseases Institute, The Ohio State University, 4Division of Biostatistics, College of Public Health, The Ohio State University

Summary

Aquí describimos un análisis basado en la fluorescencia de alto rendimiento que mide la membrana plasmática resellado eficiencia mediante análisis fluorométrico y proyección de imagen en células vivas. Este ensayo puede utilizarse para la detección de drogas o genes diana que regulan el cierre de membrana plasmática en células de mamíferos.

Abstract

En su entorno fisiológico, células de mamíferos a menudo son sometidas a tensiones mecánicas y bioquímicas que resultan en daño de la membrana plasmática. En respuesta a estos daños, maquinarias moleculares complejas rápidamente volver a cerrar herméticamente la membrana plasmática para recuperar su función de barrera y mantener la supervivencia celular. A pesar de 60 años de investigación en este campo, todavía no tenemos un conocimiento profundo de la célula resellado maquinaria. Con el objetivo de identificar los componentes celulares cierre de membrana del plasma de control o fármacos que pueden mejorar el servicio, hemos desarrollado un ensayo de alto rendimiento basado en la fluorescencia que mide la membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos cultivadas en microplacas. Como sistema modelo para el daño de la membrana plasmática, las células se exponen a la bacterianas formadoras de poro toxina listeriolysin O (LLO), que forma grandes 30-50 nm de diámetro proteínico poros en colesterol membranas. El uso de un lector de microplacas de varios modos de funcionamiento con control de temperatura permite mediciones spectrofluorometric rápido y sensible en combinación con brightfield y de imágenes de microscopía de fluorescencia de las células vivas. Análisis cinético de la intensidad de fluorescencia emitida por un fluorocromo membrana de unión a ácidos nucleicos impermeant reflejan el grado de membrana heridos y el cierre a nivel de la población de células, lo que permite el cálculo de la celda resellado eficiencia . Imágenes de microscopía de fluorescencia permite la enumeración de las células, que constitutivamente expresan una quimera fluorescente de la nuclear de la proteína histona 2B, en cada pocillo de la microplaca para tener en cuenta posibles variaciones en su número y permite la eventual identificación de poblaciones celulares distintas. Este ensayo de alto rendimiento es una poderosa herramienta pretende ampliar nuestra comprensión de los mecanismos de reparación de la membrana mediante proyección de genes host o exógeno agregado compuestos eso membrana del plasma de control resellado.

Introduction

Células de mamífero están sujetos a estrés mecánico, osmótico y bioquímico, resultando en la pérdida de la integridad de la membrana plasmática. Sin cierre rápido y eficiente, las células dañadas sucumbirían rápidamente a la muerte programada o necrótica. Desde la década de 1960, esfuerzos por entender la membrana plasmática resellado proceso han sido motivados por las devastadoras consecuencias asociadas con sus disfunciones. De hecho, enfermedades como miembro-rodea Distrofia Muscular, diabetes, síndrome de Chediak-Higashi se han ligado a membrana del plasma deficiente reparación debido a mutaciones en el gene codificación dysferlin, producción de productos finales de glicación avanzada o defectos en el regulador de tráfico lisosomal gen CHS1, respectivamente1,2,3,4,5,6. Sin embargo, hasta la fecha, nuestra comprensión de la membrana de cierre es todavía limitado7. Estudios iniciales han demostrado que la membrana resellado se inicia por la afluencia de extracelular Ca2 + a través de la membrana plasmática dañada8,9,10. Desde entonces, varios no-excluyentes Ca2 +-dependiente de mecanismos han sido propuestos para sellar las células. La hipótesis de parche propone que cerca de la herida, vesículas intracelulares se fusionan unos con otros y la membrana de plasma dañada para actuar como un parche11,12,13,14. Un segundo modelo propone que exocitosis dependiente de calcio de lisosomas en la herida sitio lanza la esfingomielinasa ácida lysosomal de la enzima, que convierte la esfingomielina a ceramida en el prospecto externo de la membrana plasmática. Este repentino cambio en la composición de lípido produce endocitosis ceramida-conducido de la región dañada15,16,17. Por último, el tercer mecanismo propuesto consiste en un papel para la endosomal clasificación compleja necesaria para que el transporte (TRASVESTIS) para promover la formación de vesículas de exteriores que brote fuera de la membrana plasmática18. Sólo un conjunto limitado de proteínas fue identificado en estos modelos, y su maquinaria debe ser aclarado aún más.

Aquí describimos un análisis de alto rendimiento que medidas de la membrana plasmática resellado eficacia en células de mamífero adherentes sujeto a daño mediadas por recombinante listeriolysin O (LLO)19. LLO es una toxina formadora de poros (PFT) secretada por el patógeno intracelular facultativo Listeria monocytogenes20,21,22 y pertenece a MACPF/CDC (complejo de ataque a membrana, perforin, y Superfamilia cytolysin dependiente de colesterol). MACPF son mamífero poro-formando las proteínas implicadas en las defensas inmunitarias, que son las toxinas bacterianas principalmente producción por patógenos gram-positivos que dañan las células del huésped para promover sus estilos de vida patógenos23. CDC se sintetiza como monómeros solubles en agua o dímeros que se unen al colesterol presentan en la membrana plasmática y oligomerize en un prepore complejo de subunidades hasta 50. El complejo del prepore luego reorganiza para insertar β-filamentos a través de la bicapa lipídica, formando un poro barril β que se extiende por 30-50 nm de diámetro24,25,26,27.  Estos poros grandes permiten flujos de iones y componentes celulares pequeños dentro y fuera de la célula; sin embargo, algunos estudios han propuesto que los poros de tamaños más pequeños son también formado28,29,30. Entre la CDC, LLO muestra características únicas incluyendo la agregación irreversible de dependiente de pH y temperatura, que es propicia para el análisis de alto rendimiento31,32. LLO se puede Agregar al medio de cultivo de células a 4 ° c, una temperatura permisiva para su unión a las células, pero no a la formación de lo complejos del poro. Inicio de formación de poro se puede sincronizar luego por aumento de la temperatura a 37 ° c, permitiendo para la eficiente difusión de las moléculas de toxina en el plano de la membrana a oligómeros de forma y para la remodelación conformacionales implicados en la generación de poro. Por lo tanto, después el interruptor de temperatura, la cinética de daño celular depende de la cantidad de toxina a la membrana plasmática. Lo importante, LLO soluble (no limitado a la membrana plasmática) rápidamente e irreversiblemente agregados cuando la temperatura alcance 37 ° c, que alivia la necesidad de eliminar las moléculas de la toxina no unida y limita la extensión del daño de la membrana con el tiempo. Por último, porque LLO se une al colesterol y forma poros en las membranas ricas en colesterol, este ensayo es sensible a una amplia gama de células de mamíferos. Es importante tener en cuenta que LLO afecta a la célula huésped señalización principalmente a través de formación de poro, con algunas excepciones en que celda independiente del poro de señalización puede ocurrir33,34,35,36 ,37,38,39. Por lo tanto, no puede ser excluido que LLO señalización actividades pueden influir en el proceso de reparación de la membrana.

Este análisis evalúan directamente el grado de herir la célula mediante la medición de la incorporación de una célula impermeant fluorocromo (p. ej., yoduro de propidio) que entra en las células heridas pasivo y se convierte en altamente fluorescente cuando se asocia a ácidos nucleicos . Por lo tanto, se puede mantener el fluorocromo en el medio de cultivo celular durante todo el experimento, permitiendo análisis en tiempo real de células herir. La intensidad de la fluorescencia del tinte de unión a ácidos nucleicos aumentará con la concentración de la toxina y, para una determinada concentración de toxina, se incrementará con el tiempo hasta que se forman todos los poros y las células se reparan completamente o hasta que se alcanza la saturación. La afluencia de extracelular Ca2 + a través de los poros de la membrana es un evento de la condición sine qua non para volver a sellar. Por lo tanto, la eficacia de la mismo-resellado puede ser evidenciada indirectamente comparando células heridas en medio de cultivo con Ca2 + (condición permisiva de reparación) para herir en un Ca2 +-medio libre (condición restrictiva de reparación). Debido a la intensidad de la fluorescencia del tinte de unión a ácidos nucleicos es directamente proporcional a la concentración de células en cada pozo, es importante para las células de la semilla en la misma concentración en todos los pocillos. También es importante enumerar las células en cada pozo antes y después del ensayo para asegurar que la separación de la célula no ocurre, como flotando, agregadas células pueden ocultar lecturas de fluorescencia que pueden complicar la interpretación de los datos. Para enumerar las células, las células que expresan las histonas nucleares localizados 2B-GFP (GFP-H2B) fueron utilizadas en este ensayo. Control de temperatura, varios modos de funcionamiento, los lectores de microplacas combinan medidas rápidas, alto rendimiento (utilizando un formato de 96 o 384 pocillos de la placa) de las intensidades de fluorescencia con imagen de microscopía de células vivas a 37 ° C. Este último puede utilizarse para enumerar el número de células y observar la posible formación de poblaciones celulares distintas.

En definitiva, este ensayo proporciona a los usuarios la capacidad de ampliar su conocimiento de la complejidad de los mecanismos de reparación de la membrana mediante la detección de las moléculas del anfitrión o exógeno agregados compuestos que pueden controlar la membrana de reparación. El siguiente protocolo se describen los pasos experimentales para medir la eficiencia mismo-resellado de las células expuestas a LLO y evaluar los efectos de un determinado medicamento o tratamiento celular en eficiencia mismo-resellado.

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Protocol

1. preparación

  1. Galjanoplastia de la célula
    Nota: Humanas células epiteliales cervicales, HeLa y HeLa expresando histona 2B-GFP (GFP-H2B), fueron utilizadas en el presente Protocolo, pero este análisis pueden ser adaptado a otras células de mamífero19.
    1. Separar las células adherentes de un frasco de cultivo celular 75 cm2 , lavar las células con 2 mL de tripsina-EDTA 0.25%. Reemplazar la tripsina usada con 2 mL de tripsina-EDTA fresco 0.25%.
    2. Incube las células a 37 ° c durante 5 minutos hasta que las células redondeadas y separadas del frasco.
    3. Resuspender las células en 8 mL de medio de cultivo (DMEM con 10% suero bovino fetal inactivado con calor, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 de μg/mL).
    4. Determinar la concentración de células usando un hemocitómetro y 10 μl de suspensión celular.
    5. Diluir las células en el medio de crecimiento a una concentración de 2,5 x 105 células/mL.
    6. Vierta la suspensión en una cuenca de pipeta estéril y mezclar bien la suspensión con una pipeta serológica de 10 mL.
    7. Usando una micropipeta multicanal de 12 y 200 μL puntas, distribuir las células HeLa (2.5 x 104 células/100 μL/pocillo) en triplicado (o cuadruplicado) en una placa de cultivo de tejidos tratados poliestireno de fondo plano de 96 pozos, claro, negro.
      Nota: Un arreglo de placas se presenta como un ejemplo en la figura 1.
    8. Cultura de las células durante 24 h en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 ° c y 5% CO2.
  2. Preparación de solución madre
    1. Preparar 1 L de un stock de 10 x de buffer M (usado para preparar M1 y M2) mediante la adición de 95 g de solución de sal equilibrada Hanks, 0,476 g de MgCl2 (5 mM) y g 23,83 de HEPES (100 mM) en 900 mL de agua. Ajustar el pH a 7,4 y subir el volumen a 1 L. filtro esterilizar.
    2. Preparar 50 mL de un 50 x stock (1,25 M) de la glucosa mediante la adición de 11,26 g de D-(+)-glucosa a un total de 50 mL de agua. Filtro de esterilizar la solución.
    3. Preparar 50 mL de 100 x stock (120 mM) de calcio mediante la adición de 0,666 g de CaCl2 para un total de 50 mL de agua. Filtro de esterilizar la solución.
    4. Preparar 50 mL de una 10 x stock (50 mM) de glicol de etileno-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N', ácido etilendiaminotetraacético (EGTA) mediante la adición de 0,951 g de EGTA en 40 mL de agua. Aumentar el pH a 8 con NaOH disolver el EGTA, y luego subir el volumen a 50 mL. Filtro de esterilizar la solución.
    5. Para una sola placa de 96 pocillos, preparar 50 mL de medio 1 (M1, contiene Ca2 +), 50 mL de medio 2 (M2, Ca2 +-libre) y 15 mL de medio 2 complementado con EGTA, por consiguiente:
      1. Para M1, añadir 5 mL de 10 x Buffer M, 0,5 mL de 100 x CaCl2y 1 mL de glucosa x 50 a 43,5 mL de agua.
      2. Para M2, añadir 5 mL de 10 m de Buffer y 1 mL de glucosa x 50 a 44 mL de agua.
      3. Para M2/EGTA, añadir 1,5 mL de 10 x Buffer M y 1,5 mL de 10 x EGTA a 12 mL de agua.
        Nota: Todas las soluciones que contienen yoduro de propidio (PI) deben estar preparadas directamente antes de agregar a las células.
  3. Placa lector e imágenes citómetro ajustes
    Nota: Utilice un lector de placas de varios modos de funcionamiento equipado con dos unidades de detección: un spectrofluorometer y un citómetro de proyección de imagen. Limitar la exposición de fluorescencia para evitar fotoblanqueo los fluoróforos.
    1. Caliente previamente el lector de la placa a 37 ° C antes de realizar el ensayo.
    2. Establecer los parámetros para el análisis cinético en consecuencia del modo de configuración :
      1. Elige monocromador, FL (fluorescencia)y cinética para la configuración óptica, modos de leer y leer tipo, respectivamente.
      2. En la Configuración de longitud de onda, seleccione un 9 y 15 nm de excitación y emisión bandpass, respectivamente. Para los ensayos utilizando yoduro de propidio (PI), establecen las longitudes de onda de excitación y emisión a 535 nm 617, respectivamente.
      3. En Tipo de la placa, seleccione 96 pocillos para el formato de placa y una configuración de la placa correspondiente a una placa de pared negro inferior transparente.
      4. Área de lectura, destacar los pozos que serán analizados a lo largo de la cinética.
      5. PMT y óptica, preselección los destellos por leer a 6 y marque la casilla para leer desde la parte inferior.
      6. Bajo tiempo, introduzca 00:30:00 en el cuadro de Tiempo Total de ejecución de un ensayo cinético de 30 min e inserte 00:05:00 para el intervalo.
        Nota: Cada vez el punto y una longitud de onda, el tiempo de lectura de una placa completa de 96 pocillos es 30 s.
      7. Confirmar la configuración especificada en la Información de configuración a la derecha y seleccione Aceptar. Prensa leer para iniciar el kinetic ejecutar.
    3. Configurar los parámetros de proyección de imagen en consecuencia del modo de configuración:
      1. Elegir Minimax, la proyección de imageny punto final para la configuración óptica, modos de leer y leer tipo, respectivamente.
      2. En longitudes de onda, seleccione transmite luzy uno o ambos los cuadros de fluorescencia correspondiente a longitudes de onda de excitación y emisión de 456/541 nm (GFP) y 625/713 nm (PI).
      3. Usar las mismas opciones para el Tipo de placa y Área de lectura tal como se define en los pasos 1.3.2.3 y 1.3.2.4.
      4. Bien el área Configuración, seleccione el número de sitios dentro de un pozo a ser reflejada.
        Nota: 12 sitios corresponden a una imagen de todo bien.
      5. En la Configuración de la adquisición de imágenes, seleccionar los tiempos de exposición para transmitir luz, 541 (GFP) y 713 (PI). Para GFP, la imagen todo bien con un tiempo de exposición de 20 ms/imagen. Para transmitir luz (TL) y fluorescencia de PI, adquirir una imagen única del centro de cada pocillo con tiempos de exposición de 8 y 20 ms, respectivamente.
      6. Confirmar la configuración especificada en la información de configuración a la derecha y seleccione Aceptar. El tiempo de la adquisición de imágenes de toda la superficie de cada pozo (12 imágenes/pocillo) de una placa de 96 pocillos y para una longitud de onda es de ~ 15 minutos pulse leer para iniciar la proyección de imagen.
        Nota: El tiempo de la adquisición de un único imagen/pozo de una placa de 96 pocillos requiere ~2.5 min/placa para una longitud de onda. Los parámetros descritos anteriormente corresponden a los equipos específicos en nuestro laboratorio. Spectrofluorometric medidas: una lámpara de flash de xenón mostrando 1.0 nm incremento excitación longitudes de onda (250-850 nm) con un ajustable 9 o 15 nm paso de banda, un detector de tubo fotomultiplicador con > 6 log rango dinámico y una emisión de nm ajustable de 15 o 25 paso de banda. Citometría de imagen: una fuente de luz de iluminación de luz blanca, 460 nm y longitudes de onda de excitación nm 625 con una banda de nm 20, filtros de emisión centrados en 541 nm (108 nm de paso de banda) y 713 nm (123 nm de paso de banda), respectivamente, y un objetivo de X 4, junto a un 1.25 megapíxeles dispositivo acoplado de carga 12 bits.

2. ensayo

Nota: En el momento del ensayo, las células deben ser confluente de 70-90%. Durante los pasos de lavado, el medio debe retirarse y aplicado a la pared lateral del pozo (no directamente sobre las células). Mantener la temperatura de LLO a < 4 ° c para evitar su agregación hasta el paso 3.1.5.

  1. Preparar un stock de 30 μm PI en M1 y un stock de 30 μm PI m2 pre-calentado a 37 ° c.
  2. Lave suavemente las células en la placa 1 utilizando una micropipeta multicanal de 12 y 200 μL consejos, como sigue:
    1. Para las condiciones permisivas de reparación, eliminar el medio de cultivo y lavado que las células dos veces con 200 μL/pocillo M1 calentadas previamente a 37 ° c. Reemplazar el medio con 100 μL/pocillo de M1 caliente que contiene 30 μm PI.
    2. Para reparar condiciones restrictivas, eliminar el medio de crecimiento y lave las células una vez con 200 μL/pocillo caliente M2 que contiene 5 mM EGTA al quelato Ca2 +, seguido de un lavado con 200 μL/pocillo M2. Reemplazar el medio con 100 μL/pocillo caliente M2 que contiene 30 μm PI.
    3. Después de que el medio de crecimiento ha sido lavado y reemplazado con medio que contiene yoduro de propidio, directamente hacia paso 2.1.3.
  3. Placa de la imagen 1 bajo luz transmitida, GFP y PI como se detalla bajo 1.3.3 (pre-cinético). Este paso tarda 15-20 minutos.
  4. Durante el período de 15 min en el paso 2.1.3, preparar la placa 2 utilizando una micropipeta multicanal de 12 y 200 μL puntas como sigue:
    1. Coloque una microplaca de polipropileno fondo redondo de 96 pozos en el hielo. Configurar la placa utilizando un diseño experimental correspondiente a la placa 1 (figura 1).
    2. Para las condiciones de reparación permisiva, añadir 100 μL/pocillo de M1 helada que contiene 60 μm PI, seguido por la adición de 100 μL/pocillo de M1 helada que contiene 4 x LLO o no para el control.
    3. Para las condiciones restrictivas del reparación, añadir 100 μL/pocillo de helada M2 que contiene 60 μm PI, seguido por la adición de 100 μL/pocillo de helada M2 que contiene 4 x LLO o no para el control.
  5. Después de la proyección de imagen placa 1 (paso 2.1.3), inmediatamente Coloque en hielo, con papel de aluminio para separar la placa de contacto directo con hielo. Permiten que la placa 1 se enfríe durante 5 minutos.
  6. Usando una micropipeta multicanal de 12 y 200 μL puntas, transfiera 100 μl de cada pocillo en la placa 2 (paso 2.1.4) a los pocillos correspondientes de la placa 1. Para distribuir correctamente la toxina en los medios de comunicación de la placa 1, inserte las puntas por debajo del menisco y expulse suavemente el volumen sin la introducción de burbujas.
    Nota: No tomar con pipeta hacia arriba y hacia abajo, esto sin darse cuenta puede separar las células.
  7. Dejar la placa durante un 1 minuto adicional permitir que la toxina se unen a las células y transferir inmediatamente la placa 1 para el lector de placas para el ensayo cinético mediante el modo de spectrofluorometer (paso 1.3.2).
  8. Al final del ensayo cinético, inmediatamente imagen placa 1 (post-cinético) usando paso 1.3.3.

3. Análisis: Enumeración de células

  1. Determinar el número de celular basado en la fluorescencia nuclear utilizando el software de enumeración celular de microplacas.
    1. Dentro de ajustes, seleccione nuevo análisisy en la sección de categoría dentro de la Configuración de análisis de imagen seleccione Análisis de objeto discreto con 541 como la longitud de onda para encontrar objetos.
    2. Dentro de la opción de encontrar objetos, utilizando el dibujar en las imágenes buscando método, seleccionar núcleos bajo la pestaña de configuración y pulse aplicar.
    3. Pulse OK y leer para iniciar la célula contando algoritmo.
  2. Como alternativa, si no tal herramienta está disponible, utilizar un software de análisis de imagen como el ImageJ para enumerar las células.
    1. En ImageJ, abra el archivo de imagen como una pila.
    2. Convertir la pila para imágenes de escala de grises de 8 bits haciendo clic en la imagen en la barra de menú, se ciernen sobre el tipo y seleccione 8-bit.
    3. Restar el fondo: haga clic en imagen en la barra de menú, pase sobre ajustey seleccione Brillo y contraste. Ajustar el valor mínimo para eliminar el ruido de fondo y seleccione aplicar.
    4. Umbral para crear imágenes binarias: haga clic en imagen en la barra de menú, pase sobre ajustey seleccione umbral. Seleccione fondo oscuro, ajuste los valores de umbral mínimo y máximo y haga clic en aplicar.
    5. En el caso de superposición de núcleos, puede utilizarse una herramienta de Cuenca para núcleos de segmento. Haga clic en proceso en el menú, se ciernen sobre binario y seleccione cuenca.
      Nota: Esto separará automáticamente núcleos conectados.
    6. Analizar las imágenes enmascaradas mediante la aplicación de criterios especificados por el usuario (tamaño y circularidad) para refinar la identificación de núcleos y excluyen restos celulares.
      1. Haga clic en analizar en el menú y luego analizar las partículas. Establecer el tamaño deseado (pixel ^ 2) y circularidad (un valor de 1 es un círculo perfecto) que son suficientes para incluir células/núcleos individuales.
      2. En el cuadro de lista desplegable Mostrar, seleccione la opción u opciones que desea, compruebe resumay haga clic en Aceptar para obtener un recuento.

4. Análisis: Curvas cinéticas

  1. Transferencia de los datos cinéticos desde el software de lector de placa a un software de datos analíticos.
  2. Para cada condición experimental, un promedio de las intensidades de fluorescencia de las repeticiones en cada punto, junto con la correspondiente desviación estándar y error estándar de la media para cada condición experimental.
  3. Para cada condición experimental, trazar la correspondiente curva de cinética: intensidad de PI (eje y) frente al tiempo (eje x).
  4. Para calcular la eficiencia mismo-resellado de una condición de tratamiento dado, calcular el área bajo la curva (AUC) de los + LLO en M1 (AUC(M1)) y + LLO en M2 (AUC(M2)). Utilizar el enfoque propuesto a continuación evaluar la eficiencia (E) de cierre:
    Equation
  5. Realizar una comparación entre el tratamiento control y prueba mediante la determinación del ratio de eficiencia (REff) indicados a continuación:
    Equation 2
    REFF = 1, prueba de tratamiento no tiene ningún efecto en la reparación de
    REFF < 1, prueba tratamiento inhibe la reparación
    REFF > 1, prueba de tratamiento mejora la reparación
  6. Calcular el área bajo la curva mediante la siguiente ecuación:
    Equation 3, donde k es el número total de visitas de seguimiento.

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Representative Results

Precisión de conteo celular: células HeLa se utilizan con frecuencia como una línea de células de mamífero modelo para explorar los mecanismos de reparación de la membrana. Al evaluar la reparación de la membrana a nivel de población de la célula, es importante a las células de la placa en la misma concentración en todos los pocillos para interpretación de datos adecuado. También es importante verificar en el momento de la prueba de que el número de células es equivalente a través de pozos. Las células HeLa que expresan constitutivamente histona 2B fusionada a GFP (GFP-H2B) fueron introducidas en este ensayo para enumerar automáticamente las células basadas en la detección de sus núcleos fluorescentes. Para establecer la exactitud en la enumeración de células, dos diluciones seriadas de las células HeLa H2B-GFP fueron plateadas en triplicado en una placa de 96 pocillos y cultivadas durante 4 horas. Esta cantidad de tiempo es suficiente para el accesorio de celular y proporciona limita la división celular. Completos pozos fueron imágenes bajo luz transmitida (TL) e iluminaciones de la fluorescencia de GFP y recuentos de células fueron evaluados basados en la fluorescencia de GFP utilizando el software de análisis de lector de la placa (figura 2A y 2B). La cuenta de celular promedio ± desviación estándar fue trazada contra la siembra de las concentraciones de la célula, y una línea de mejor ajuste indica una relación de 1.08:1 de la cuenta de célula a célula siembra, demostrando la exactitud de la cuenta (figura 2). Por proyección de imagen de los pozos antes de un ensayo de cinético, puede asegurar que un número de células es consistente entre todos los pozos. También, por proyección de imagen pozos después el ensayo cinético, uno puede establecer si la exposición a la toxina causó la separación de la célula.

Expresión de GFP no interfiera con medidas de intensidad de (PI) el yoduro de propidio (IPI): para asegurarse de que Asociación nuclear H2B-GFP no interfiera con la incorporación de PI o PI fluorescencia intensidad medida iPI, IPI se comparó en células HeLa y HeLa H2B-GFP que estuvieron expuestas o no a 1 nM LLO (figura 3). En la ausencia de PI, había un nivel igualmente bajo de fluorescencia del fondo en HeLa y HeLa H2B-GFP, indicando que la GFP no sangran a través de filtros de emisión de fluorescencia de PI. En presencia de PI, pero ausencia de LLO, hubo una similar emisión de fluorescencia basal del PI en HeLa y HeLa H2B-GFP que no cambió con el tiempo. Esto confirmó que expresión de GFP no afecta la medición de la fluorescencia de PI e indicó que PI no penetra en las células no dañadas en el marco de tiempo del experimento. Además de LLO dio lugar a un aumento en fluorescencia de PI en el tiempo que fue similar en HeLa y HeLa H2B-GFP. Este aumento es debido a la célula herida por LLO combinado con Asociación de PI con los ácidos nucleicos. Juntos, estos resultados establecen que expresión de histona-2B-GFP no afecta la incorporación de PI o la medición de la fluorescencia.

Fluorescencia de PI no interfiere con conteo celular basada en GFP: recíprocamente, fue importante verificar que incorporación nuclear de PI en células de heridos no interfiera con la célula basada en GFP cuenta. Imágenes de fluorescencia representante de HeLa y HeLa H2B-GFP exponen a 1 nM LLO en presencia de PI demostró que había una marcada acumulación de PI en células de la herida post cinética, como esperado (Figura 4A). Proyección de imagen reveló también que PI puede sangrar a través de la detección de la fluorescencia de GFP (Figura 4A y tabla 1). Este crossover de fluorescencia fue mejor apreciado en las imágenes de la cinéticas de las células HeLa que no expresan GFP, todavía se muestran núcleos fluorescentes verdes (Figura 4A). Este crossover podría ser evidenciado también por la medida de la intensidad de la fluorescencia de GFP (GFPi) en células HeLa H2B-GFP, que aumentaron significativamente la cinética respecto a la cinética (Figura 4B). Lo importante, cruce de fluorescencia de PI no afecta a célula contando porque el proceso de segmentación en la enumeración de núcleos no se ve afectado por un incremento en la fluorescencia de GFP (figura 4).

Membrana plasmática resellado eficiencia de medición: en esta sección, se presenta la metodología básica utilizada para medir la eficiencia de la membrana de cierre. Para evidenciar el proceso de cierre de membrana, las células HeLa H2B-GFP fueron expuestas, o no, a 1 nM LLO en la presencia (M1) o ausencia (M2) de extracelular Ca2 + (figura 5). Como era de esperar, en la ausencia de LLO,PI permanecía constante en M1 y M2. Además de LLO en Ca2 +-que contiene medio dio lugar a un aumento constante en la intensidad de fluorescencia de PI (IPI), mientras que en ausencia de extracelular Ca2 +, hubo un aumento significativamente mayor en fluorescencia de PI, lo que refleja la ausencia de cierre de membrana. Para evaluar la eficacia de mismo-resellado, que se define como la capacidad de las células para reparación de M1 con respecto a M2 (paso 1.5.4.1), se determinó el área bajo las curvas de M1 y M2 (AUC) y la eficiencia de la reparación (E) se calculó en 0.287.

Una alternativa a la PI: PI ha sido ubicuo utilizado como un marcador de daño de la membrana plasmática. Sin embargo, hay otros tintes de unión de ácidos nucleicos que también son adecuados para este análisis. Por ejemplo, un atascamiento de ácido nucleico del carbocyanine impermeant membrana tinte (CNABD) exhibe un espectro de emisión, alcanzando en el lejos rojo y tiene una alta especificidad para la DNA trenzada doble. PI por otra parte une a DNA y RNA40,41. A diferencia de PI, la excitación y los espectros de emisión de CNABD no se superponen con los de la GFP, lo que permite mejor resolución espectral entre los dos fluorocromos. Además, el CNABD utilizado en este protocolo tiene un coeficiente de extinción casi el doble de PI, que significa que para sus longitudes de onda de excitación respectivos, este colorante es más capaz de absorber la energía de PI, resultando en una mayor emisión de fluorescencia. Análisis de fluorescencia cuantitativa de imágenes CNABD y GFP demostró que este colorante exhibe un rango dinámico grande fluorescencia, significativamente no emite en las longitudes de onda de la fluorescencia de GFP y no afecta el conteo de células (figura 6A-D). De hecho, las células HeLa H2B-GFP incubadas en los medios M1 o M2 que contiene CNABD y dañada por 1 nM LLO exhibió un aumento 4 y 5.5 veces en ICNABD en relación con los controles no-dañado, respectivamente (Figura 7A). Para la comparación, las células se exponen a 1 nM LLO en presencia de PI exhibió un aumento de 2.5 y 3 veces en la intensidad de fluorescencia de PI en M1 y M2, respectivamente (figura 5). Como PI, objetos expuestos CNABD aumentar la intensidad de la fluorescencia con el aumento de la concentración de LLO en M1 (Figura 7A), y la resultante eficiencia de reparación se calculó como se describe en el paso 1.5.4.1 (figura 7B). Divulgamos la célula resellado eficiencia disminuciones como aumentos de la concentración de LLO. Este fenómeno refleja el hecho de que las células disminuyen su capacidad para sellar cuando son causados daños excesivos.

Evaluación de la calidad de la prueba de reparación de membrana: un aspecto crítico de cualquier análisis es su robustez o su capacidad para detectar y resolver las diferencias entre los controles positivos y negativos. Variación de la señal entre los controles positivos y negativos debe mostrar la reproducibilidad y un rango dinámico suficiente. En este ensayo de reparación de la membrana, los controles positivos y negativos son las células expuestas a LLO en reparación permisiva (M1) y reparación restrictivas condiciones (M2), respectivamente. Se tomaron dos enfoques para evaluar la robustez de este ensayo para el análisis de alto rendimiento. En primer lugar, el factor Z, o proyección de coeficiente de ventana, determina si un conjunto dado de condiciones proporciona un gran suficiente rango dinámico, mientras que representa la variabilidad de la señal. Z factores dentro de los rangos 0 < Z ≤ 0.5 y 0.5 < Z ≤ 1 corresponden a un ensayo aceptable y excelente, respectivamente42,43. Una limitación de utilizar el factor Z para evaluación de la calidad es que condiciones probadas típicamente exhiben valores más moderados en comparación con los controles positivos y negativos extremos. Por lo tanto, como una segunda aproximación, se calculó la diferencia de medias estandarizada terminantemente (SSMD, β), que puede identificar las diferencias entre las condiciones experimentales que de lo contrario serían categorizadas como un resultado negativo basado en un factor Z calificado44 ,45. Valores SSMD pueden categorizarse en fuerza de efecto desde ningún efecto (β = 0) a extremadamente fuerte (β ≥ 5). Usando los datos de la Figura 7A y AUC para la comparación de M1 versus condiciones de M2, la exposición a 0,25 y 0,5 nM LLO produjo valores del factor Z de 0.3100813, 0.137313 y β = 6.0672 y 4.803308, respectivamente, indicando que es una ventana de las concentraciones de LLO adecuado para el ensayo. Como la concentración de LLO se incrementa más allá de 1 nM, la brecha en elCNABD curvas cinéticas entre M1 y M2 se cierra dando lugar a valores de factor Z y SSMD drásticamente reducidos (figura 7B). Tales altas concentraciones de LLO corresponden a condiciones en las que el potencial de reparación es compensado por el daño y así anula el uso de la prueba en la identificación de factores que intervienen en la reparación de la membrana. Esto se ilustra más lejos por la disminución en la eficiencia de la reparación (E) como aumento de la concentración de LLO (figura 7B). Se obtuvieron todos los datos (factor Z, SSMD y E) con 3 repeticiones biológicos y técnicos de 3 repeticiones por condición experimental para la validación del ensayo. Juntos, estos datos demuestran que este ensayo tiene la robustez esperada para un ensayo de alto rendimiento con concentraciones de LLO inferiores a 1 nM para las células HeLa.

Prueba de principio: una vez que la robustez del análisis se estableció, se realizaron experimentos adicionales como una prueba del principio de que este ensayo tiene la sensibilidad y resolución para identificar un defecto en el proceso de reparación. También, considera que ensayos de alto rendimiento se utilizan como un proceso de selección para identificar los "hits" en pantallas de grandes tamaño, que pueden implicar menos 3 biológicos Replica. Por lo tanto, es pertinente que el diseño experimental proporciona la potencia de detección para identificar los "hits" en un solo análisis. Por lo tanto, debajo de una pantalla de alto rendimiento, el diseño del ensayo se puede ajustar para acomodar 4 repeticiones técnicas para aumentar la potencia estadística en un solo experimento. Las células fueron plateadas por cuadruplicado y fueron tratada previamente 1 h antes del ensayo con desipramina, un inhibidor farmacológico de la proteína lisosomal esfingomielinasa ácida (ASM) que desempeña un papel en membrana del plasma reparación15,17 ,46. Lo importante, el tratamiento con desipramina no afectó a un recuento a lo largo del ensayo, permitiendo la adecuada comparación entre desipramina-tratadas y no tratadas las células (figura 8A). Inhibición de la ASM en células tratadas con desipramina dio lugar a un defecto en la membrana de cierre eficiencia sobre la exposición a LLO, como lo demuestra la disminución de E y REff (figura 8B y 8C). Utilizando un modelo de efectos mixtos, comparación de desipramina tratados no tratados las células expuestas a 0.25 y 0.5 nM LLO en M1 presentaron valores de p de 0,0010 y 1 x 10-10, respectivamente. Juntos, los datos indican que 0.25 y 0,5 nM LLO son las concentraciones adecuadas para identificar defectos en la reparación en un ambiente experimental de alto rendimiento, con análisis estadísticos posibles de un experimento solo una vez se aumentan las repeticiones técnicas a cuatro . Tenga en cuenta que el enfoque estadístico del modelo de efectos mixtos entre cuadruplicado no representará variaciones potenciales a través de múltiples repeticiones biológicas. Cualquier resultados significativos mediante una repetición biológica deben ser verificadas en configuraciones experimentales adicionales.

Figure 1
Figura 1: diseño Experimental. El diagrama de flujo representa un diseño de placa representativa configurado para probar el efecto de siete condiciones de la prueba en comparación con las células del control no tratadas. Se debe incluidos controles adicionales si es necesario, en cuanto a vehículos de drogas ejemplo. Las células se platean (placa 1) 24 h antes del experimento. En el día del experimento, las células en la placa 1 se lavan con medio M1 o M2, previamente calentado a 37 ° C, y la placa es reflejada (fluorescencia TL, GFP y PI) la cinética. Durante lo 15 min de proyección de imagen, los reactivos se añaden en hielo a placa 2. Después de la proyección de imagen, placa 1 se coloca inmediatamente en hielo por 5 min y 100 μL/pocillo se transfieren de 2 a 1 de la placa de la placa. La placa 1 se coloca en el lector de placas para ejecutar el ensayo cinético a 37 ° C por 30 min, seguido de proyección de imagen (fluorescencia TL, GFP y PI). Datos son entonces analizados para contar las células y evaluar la eficiencia de la reparación en todas las condiciones experimentales. En grandes conjuntos de datos, el análisis pueden ser automatizado. Además, el número de repeticiones técnicas puede aumentarse a 4 en pantallas de alto rendimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: precisión de conteo celular. Las células HeLa expresando GFP-tagged histona 2B fueron sembradas en triplicado en las concentraciones indicadas. (A) las células fueron reflejadas a 37 ° C bajo luz transmitida (TL) y la fluorescencia de GFP (12 imágenes/bien) y un algoritmo de detección de células fue utilizado para delimitar núcleos individuales (en púrpura). Barra de escala = 1 mm. (B) mayor aumento de TL, GFP e imágenes de detección (púrpura) de la célula (zoom 2 X). Barra de escala = 100 μm. (C) imagen software de análisis fue utilizado para contar el número de células y la célula cuentas se trazaron contra la inicial concentración de siembra de la célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: medición de la fluorescencia de yoduro de propidio no es afectado por la expresión de GFP 2B histona. Histona expresando GFP 2B y no expresar las células HeLa fueron expuestas, o no, a 1 nM LLO en la presencia (líneas sólidas) o ausencia (líneas discontinuas) de 30 μM PI en Ca2 +-que contiene medio (M1). El análisis cinético midiendo intensidades de fluorescencia de PI de spectrofluorometry cada 5 min durante 30 min a 37 ° C. Los datos son la media PI intensidad de fluorescencia (IPI) expresada en unidades (RFU) de fluorescencia relativa ± SEM (n = 3 experimentos independientes, cada uno realizados en triplicado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: enumeración de la célula se ve afectada por fluorescencia PI. (A) pre- y post-cinéticos imágenes representativas (TL, PI y GFP) de las células expuestas o no a 1 nM LLO en M1. Barra de escala = 100 μm. (B) análisis de la microscopia de fluorescencia cuantitativa (queGFP± SEM) revela la mayor medición de fluorescencia de GFP debido a la incorporación nuclear de PI en células heridas por LLO (la cinética). (C) enumeración de células basada en GFP era inafectada por el aumento en la intensidad de la GFP. Recuento de células por pozo fue expresado como media ± SEM. (en B y C: barras negras = data de la cinético; barras rojas = data de la cinético; n = 3 experimentos independientes, cada uno realizado en triplicado; prueba t de Student dos colas se utilizó para analizar la fluorescencia cuantitativa cuentas de intensidad y de la célula de las imágenes adquiridas, ** p < 0.01). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: medición membrana plasmática resellado eficacia. Células de HeLa expresando su histona 2B-GFP expusieron, o no, a 1 nM LLO en Ca2 +-que contienen (M1) o Ca2 +-medio libre (M2) que contiene 30 μM PI. Datos cinéticos representan la intensidad de la fluorescencia de PI (IPI) en unidades (RFU) de fluorescencia relativa ± SEM, medido durante 30 min a 37 ° C. n = 3 experimentos independientes, cada uno realizados en triplicado. Se midió la eficacia de la mismo-resellado como se indica en el paso de protocolo 1.5.4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: ácido nucleico de Carbocyanine vinculante tinte como un colorante alternativa evaluar membrana resellado. Las células HeLa H2B-GFP expusieron, o no, a 0,5 nM LLO durante 30 min a 37 ° C en presencia de 1 μM CNABD en Ca2 +-que contienen (M1) o Ca2 +-medio libre (M2). (A) células imágenes de HeLa H2B-GFP fueron adquiridas pre- y post-cinética en M1 que contiene el tinte. Barra de escala = 100 μm. Intensidades de fluorescencia (B y C) integrado CNABD y GFP se midieron utilizando la citometría de imagen y expresada en unidades de fluorescencia relativa (RFU) ± SEM. imágenes de fluorescencia de GFP (D) fueron procesados para enumerar HeLa H2B-GFP células (negro barras = barras de datos pre-cinético, rojo = datos de la cinéticos, números = 3 experimentos independientes, cada uno realizados en triplicado). Prueba t de Student dos colas se utilizó para analizar la intensidad de fluorescencia cuantitativa y recuento de imágenes adquiridas, ** p < 0.01, *** p < 0.001) por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: efecto de la concentración de LLO en resellado SSMD, eficiencia y factor de Z. (A) HeLa H2B-GFP células incubadas en M1 o M2 con 1 μM CNABD fueron expuestas al aumento de las concentraciones de LLO y sometidas a ensayo cinético durante 30 min a 37 ° C. Los datos se expresan como intensidad CNABD (ICNABD) en (RFU) las unidades de fluorescencia relativa ± SEM. (B) el factor Z y diferencia de medias estandarizada terminantemente (SSMD) se calcularon como una evaluación de la calidad por la robustez de la reparación de la membrana Análisis, usando el área bajo la curva (AUC) como una medida para las curvas cinéticas42,43,44,45. Se calcularon las eficiencias mismo-resellado como se describe en las secciones de protocolo y resultados (n = 3 experimentos independientes, cada uno realizados en triplicado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: exposición celular a desipramina produce defectos en resellado. Las células HeLa H2B-GFP (plateadas por cuadruplicado) previo fueron tratadas con desipramina μM 30 (o no) por 1 h a 37 ° C y luego expuestas a 0.25 o 0.5 nM LLO en presencia de 1 μM CNABD en Ca2 +-que contienen (M1) o Ca2 +-medio libre (M2). Las células fueron imágenes (pre y post-cinética) y el ensayo cinético a 37 ° C por 30 minutos (A) las células fueron enumeradas; los datos se expresan como media célula cuenta ± CNABD SEM. (B) intensidad de fluorescencia (ICNABD) se expresa en fluorescencia relativa eficiencia de unidades (RFU) ± SEM. (C) resellado se calcularon en presencia y en ausencia de desipramina. Se utilizó un modelo de efectos mixtos en los valores de intensidad de registro-transformada asumiendo una intersección aleatoria para cada repetición técnica. Para capturar tanto cambio y cambio en la forma de las curvas cinéticas, el principal efecto de la condición de tratamiento y el efecto de la interacción entre la condición de tratamiento y tiempo fueron probadas conjuntamente para significación estadística. Se utilizó prueba t de Student dos colas para analizar un recuento de las imágenes adquiridas. El valor p se calculó utilizando el modelo de efectos mixtos. (técnica 4 replica, un experimento). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Especificaciones de la proyección de imagen de citómetro emisión canal
Fluoróforo Fluoróforo ex / em (nm) Canal verde (ex / em ± bandpass, nm) Canal rojo (ex / em ± bandpass, nm)
GFP 488/510 460/541 ± 20/108 625/713 ± 20/123
PI 533/617
CNABD 642/661

Tabla 1: Picos de excitación y emisión de GFP, PI y CNABD y el verde y rojo canalizan bandpasses de excitación y de emisión para la citometría de imagen.

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Discussion

Este ensayo mide la eficiencia de cierre de membrana a nivel de población celular con capacidad de alto rendimiento. Puede ser utilizado para detectar componentes celulares o las bibliotecas de drogas que pueden afectar la reparación de la membrana. El ensayo descrito utiliza un formato de placa de 96 pocillos, pero puede ser adaptado para placas de 384 pocillos para un mayor rendimiento. Una ventaja de este ensayo es su capacidad para obtener medidas de fluorescencia de las células vivas adherente en tiempo real sin necesidad de procesamiento tales como la separación de la célula, fijación o fluorescencia de etiquetado posteriores a la fijación de la célula excesiva. Lectores de placa multimodo, como el utilizado en este protocolo, tienen suficiente sensibilidad para la medición rápida spectrofluorometric intervalos tan bajos como 30 s para una placa de 96 pocillos. La adquisición de imágenes de fluorescencia proporciona información adicional, incluyendo la enumeración celular, eventuales cambios en la morfología de la célula y la identificación de potencial de poblaciones celulares distintas. El presente ensayo no establecer la cinética de la membrana plasmática resellado a nivel unicelular, pero identifica condiciones experimentales (compuestos farmacológicos o componentes celulares) que pueden afectar, positiva o negativamente, el proceso de membrana de cierre a nivel de población de la célula.

Varios otros enfoques experimentales se han desarrollado para evaluar la membrana mecanismos de cierre. Por ejemplo, la interrupción mecánica microneedle punción, abrasión del grano y la ablación del laser se han utilizado para daño de membrana mecánica del modelo. La medida de heridas y reparación participa citometría de flujo o microscopia de fluorescencia por cuantificar la entrada de sondas fluorescentes (FM 1-43, yoduro de propidio, dextranos conjugado con fluoresceína) o proteína fluorescente quimeras47 de seguimiento ,48,49,50. Cada uno de estos enfoques tiene sus propias ventajas; sin embargo, no son susceptibles de proyección de alto rendimiento en las células vivas que se presenta en este ensayo.

El presente ensayo se ha optimizado para analizar la eficiencia mismo-resellado de heridos por la proteína formadora de poro LLO, que poros grandes formas que permiten la enorme Ca2 + afluencia como provocado por rupturas mecánicas de la membrana plasmática de las células. Aunque las toxinas formadoras de poros representan una forma de daño de la membrana plasmática, reparación de toxina grandes poros y heridas mecánicas se propusieron compartir común Ca2 +-vías dependientes17,51. Es importante tener en cuenta esa interacción LLO con los componentes de la membrana celular como el colesterol puede afectar la señalización de las células y así puede influenciar membrana resellado mecanismos comparados con heridas mecánicas. Nuestro conocimiento sobre la reparación de la membrana es todavía limitada y más estudios se necesitan para establecer si cierre de heridas mecánicas difiere de resellado después de la formación de poros de toxinas. Hay varias ventajas de la utilización de LLO. En primer lugar, la iniciación del daño de la membrana puede ser sincronizada al elevar la temperatura de 4 a 37 ° C. En segundo lugar, la forma soluble de LLO (no limitado a la membrana celular) irreversible agregados a pH neutro y a 37 ° C, por lo tanto limitar efectos citotóxicos y abroga la necesidad de lavar las células. Por último, el grado de daño puede ajustarse variando la concentración de la toxina. Sin embargo, una limitación de este ensayo es el interruptor de la temperatura entre 37 y 4 ° C, lo cual puede afectar el mecanismo de reparación tales como transporte vesicular endocitosis y fluidez de la membrana, entre otros procesos, que son influenciados por temperatura52, 53,54. Es importante verificar que cualquier inhibidor farmacológico incluido en el ensayo no interfiere con la formación de poros LLO realizando un ensayo de hemólisis en la presencia (y ausencia) de los fármacos55. Debido a diferencias de potencial por lotes en la actividad LLO, es importante preparar un stock de LLO que es lo suficientemente grande como para una pantalla de alto rendimiento completa55.

Se incluyeron el uso de las células que expresan la quimera de histona-2B-GFP localizada nuclear como un medio para enumerar las células antes y después del ensayo de reparación de membrana a través de la proyección de imagen microscópica seguida automatizado de análisis de imagen. Importante, recuento equivalente en condiciones y celular no cambia cuenta antes y después de que el ensayo cinético son cruciales como PI o intensidades de fluorescencia de CNABD no pueden fácilmente ser normalizado. De hecho, una diferencia en la cuenta de célula dará lugar a diferencias en el grado de daño por una determinada concentración de LLO, que no puede corregirse a través de la normalización de la fluorescencia debido a variaciones en el servicio eficiencia (figura 7). Hemos mostrado que expresión de histona-2B-GFP no interfiera con la emisión de incorporación o fluorescencia PI o CNABD. Por el contrario, incorporación de PI o CNABD no afecta la enumeración celular basado en la GFP. Si se utilizan otras combinaciones de fluoróforos, sería necesario evaluar potencial solapamiento espectral entre fluorocromos, como se realizó en este trabajo. Aunque PI ha sido ampliamente utilizado para medir el daño de la membrana, se muestra que CNABD es un excelente sustituto que exhibe mayor rendimiento cuántico de fluorescencia, resultando en un mayor rango dinámico adecuado para caracterizar la eficiencia de cierre.

Factor Z y SSMD confirmaron que este ensayo tiene la robustez necesaria para llevar a cabo análisis de alto rendimiento. El cálculo de la eficacia de la mismo-resellado es una herramienta fundamental y confiable para identificar potenciales hits. Además, el modelo de efectos mixtos puede utilizarse como una herramienta estadística para evaluar éxitos dentro de una misma serie. El plan experimental debe incluir un mínimo de tres repeticiones técnicas si la pantalla se puede repetir varias veces. Quadruplicates debe utilizarse si herramientas estadísticas, tales como el modelo de efectos mixtos, deben incluirse en un experimento único, o no se repetirá. Se recomienda sin embargo para realizar la pantalla varias veces y para validar los resultados mediante la realización de experimentos complementarios.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Reconocemos el Dr. Jesse Kwiek (The Ohio State University) para que amablemente nos permite utilizar su plataforma de detección de varios modos de funcionamiento para algunos experimentos preliminares. En este artículo de investigación fue apoyado por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas de los institutos nacionales de salud con el número de concesión RO1AI107250 a Stephanie Seveau. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer Molecular Devices 5024062
TO-PRO-3 ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific P3566
HeLa ATCC CCL2
HeLa H2B-GFP Millipore SCC117
Trypsin-EDTA 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate Corning 3603
Hanks' balanced Salts Sigma-Aldrich H4891
EGTA ISC BioExpress 0732-100G
HEPES Fisher Scientific BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax Sigma-Aldrich G5146-1KG

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Inmunología infección número 143 membrana plasmática resellado reparación de membrana distrofia muscular yoduro de propidio ácido nucleico de carbocyanine vinculante tinte toxina formadora de poros listeriolysin O
Medida de alto rendimiento de membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos
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Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S.… More

Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S. High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (143), e58351, doi:10.3791/58351 (2019).

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