Misurazione di High-throughput di membrana plasmatica risigillazione efficienza in cellule di mammifero

Sommario

Qui descriviamo un'analisi fluorescenza-basata di alto-rendimento che misura la membrana plasmatica risigillazione efficienza attraverso analisi fluorometriche e imaging in cellule viventi. Questo test può essere utilizzato per lo screening di farmaci o geni che regolano la chiusura della membrana plasmatica in cellule di mammifero.

Abstract

Nel loro ambiente fisiologico, cellule di mammiferi sono spesso sottoposti a sollecitazioni meccaniche e biochimiche che si traducono in danno della membrana del plasma. In risposta a questi danni, complessi macchinari molecolari risigillare rapidamente la membrana plasmatica per ripristinare la sua funzione di barriera e mantenere la sopravvivenza delle cellule. Nonostante i 60 anni di ricerca in questo campo, ci manca ancora una conoscenza approfondita della cella una chiusura di macchinari. Con l'obiettivo di identificare componenti cellulari che controllo chiusura della membrana plasmatica o farmaci che possono migliorare la risigillazione, abbiamo sviluppato un'analisi di alto-rendimento fluorescenza-basata che misura la membrana plasmatica risigillazione efficienza in cellule di mammifero coltivate in piastre microtiter. Come sistema modello per danno della membrana del plasma, le cellule sono esposte per la Listeriolisina di tossina batterica pore-forming O (LLO), che forma il grande 30-50 nm di diametro proteinico pori in colesterolo-contenere le membrane. L'uso di un lettore di micropiastre a modalità multipla temperatura controllata permette misurazioni rapide e sensibili spectrofluorometric in combinazione con campo chiaro e formazione immagine di microscopia di fluorescenza delle cellule viventi. Analisi cinetica dell'intensità di fluorescenza emessa da un fluorocromo acido nucleico-associazione impermeant membrana riflette l'estensione della membrana ferendo e una chiusura a livello di popolazione cellulare, consentendo per il calcolo della cella efficienza una chiusura della . Formazione immagine di microscopia di fluorescenza consente l'enumerazione delle cellule, che costitutivamente esprimono una chimera fluorescente del nucleare della proteina istone 2B, in ciascun pozzetto della micropiastra per tener conto delle variazioni di potenziale nel loro numero e permette per eventuali identificazione di popolazioni distinte delle cellule. Questa analisi di alto-rendimento è un potente strumento prevede di espandere la nostra comprensione dei meccanismi di riparazione della membrana tramite screening per geni ospitanti o esogenicamente aggiunto composti che controllo una chiusura della membrana plasmatica.

Introduzione

Cellule di mammifero sono soggetti a sollecitazioni meccaniche, osmotico e biochimici, causando la perdita di integrità della membrana del plasma. Senza una chiusura rapida ed efficiente, le cellule danneggiate sarebbero rapidamente soccombere alla morte programmata o necrotica. Dal 1960, sforzi per comprendere la membrana di plasma una chiusura processo sono stati motivati dalle conseguenze devastanti connesse con sue disfunzioni. Infatti, malattie come la distrofia muscolare dei cingoli, il diabete e la sindrome di Chediak-Higashi sono state collegate alla riparazione della membrana di plasma carente a causa di mutazioni nel gene codifica disferlina, produzione di p....

Protocollo

1. preparazione

1. Placcatura di cella
   Nota: Cellule epiteliali cervicali umane, HeLa e HeLa esprimendo istone 2B-GFP (H2B-GFP), sono state utilizzate in questo protocollo, ma questo dosaggio può essere adattato ad altre cellule di mammiferi¹⁹.
   1. Staccare le cellule aderenti da una boccetta di coltura cellulare di 75cm² lavando le cellule con 2 mL di tripsina-EDTA 0,25%. Sostituire la tripsina usata con 2 mL di tripsina-EDTA fresco 0.25%.
   2. Incubare le cellule a 37 ˚ c per 5 minuti fino a quando le cellule sono arrotondati e staccato dal pallone.
   3. Risospendere le cellule in 8 mL di terreno di coltur....

Risultati

Precisione di conteggio delle cellule: cellule HeLa sono frequentemente utilizzate come una linea di cellule di mammifero modello per esplorare i meccanismi di riparazione della membrana. Nel valutare la riparazione della membrana a livello della popolazione delle cellule, è importante alle cellule della piastra alla stessa concentrazione in tutti i pozzetti per interpretazione corretta dei dati. È anche importante verificare al momento del dosaggio che numeri di cellulare sono equivalent.......

Discussione

Questo test misura l'efficienza della membrana una chiusura a livello della popolazione di cellule con capacità di alto-rendimento. Può essere utilizzato per schermare per componenti cellulari o librerie di farmaco che potrebbero influire sulla riparazione della membrana. Il saggio descritto utilizzato un formato di piastra a 96 pozzetti, ma può essere adattato a piastre da 384 pozzetti per un throughput più elevato. Un vantaggio di questo test è la sua capacità di ottenere misure di fluorescenza delle cellule viventi ad.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Lettore di micropiastre multimodale SpectraMax i3x	Molecular Devices	i3x
MiniMax 300 Citometro per imaging	Molecular Devices	5024062
TO-PRO-3	ThermoFisher Scientific	T3605
Ioduro di propidio	ThermoFisher Scientific	P3566
HeLa	ATCC	CCL2
HeLa H2B-GFP	Millipore	SCC117
Tripsina-EDTA 0,25%	ThermoFisher Scientific 25200056
96 pozzetti Corning fondo piatto polistirene nero coltura tissutale piastra trattata	Corning	3603
Sali bilanciati di Hanks	Sigma-Aldrich	H4891
EGTA	ISC BioExpress	0732-100G
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-(+)-glucosio, HybriMax	Sigma-Aldrich	G5146-1KG