Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

High-throughput meting van plasmamembraan opnieuw verzegelen efficiëntie bij zoogdiercellen

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58351
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3
1Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University, 3Infectious Diseases Institute, The Ohio State University, 4Division of Biostatistics, College of Public Health, The Ohio State University

Summary

Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer fluorescentie gebaseerde bepaling dat de maatregelen van het plasma-membraan opnieuw verzegelen efficiëntie door fluorimetrische en imaging analyses in levende cellen. Deze test kan worden gebruikt voor het screenen van drugs of doelgenen die regelen plasmamembraan opnieuw verzegelen in zoogdiercellen.

Abstract

In hun fysiologische omgeving, zijn zoogdiercellen vaak onderworpen aan mechanische en biochemische benadrukt dat leiden beschadiging van het plasma membraan tot. In reactie op deze schadevergoeding verzegelen complexe moleculaire machines snel het plasma-membraan om te herstellen van de barrièrefunctie en handhaven van de overleving van de cel. Ondanks 60 jaar van onderzoek op dit gebied, wij nog steeds gebrek aan een grondige kennis van de cel opnieuw verzegelen van machines. Met als doel het identificeren van cellulaire componenten die controle plasmamembraan opnieuw verzegelen of medicijnen die kunnen verbeteren opnieuw verzegelen, hebben we een fluorescentie-gebaseerde high-throughput assay dat maatregelen van het plasma-membraan opnieuw verzegelen efficiëntie bij zoogdiercellen gekweekt in microplates. Als een modelsysteem voor plasmamembraan schade, de cellen worden blootgesteld aan de bacteriële porie-vormende toxine listeriolysin O (LLO), die grote 30-50 nm diameter eiwithoudende poriën in het cholesterol-bevattende vormt membranen. Het gebruik van een temperatuurgevoelig multi-mode microplate-lezer zorgt voor snelle en gevoelige spectrofluorometric metingen in combinatie met helderveld en fluorescentie microscopie beeldvorming van levende cellen. Kinetische analyse van de intensiteit van de fluorescentie wordt uitgestraald door een membraan impermeant nucleic zuur-bindende fluorescerende weerspiegelt de mate van membraan verwonding en opnieuw verzegelen op het celniveau bevolking, waardoor voor de berekening van de cel opnieuw verzegelen van efficiëntie . Fluorescentie microscopie imaging voorziet in de opsomming van cellen, die constitutively express een fluorescerende hersenschim van de nucleaire eiwit Histon 2B, in elk putje van de microplate om potentiële meetvariaties in hun aantal en zorgt voor eventuele identificatie van afzonderlijke cel populaties. Deze high-throughput assay is een krachtig hulpmiddel verwacht uit te breiden ons begrip van membraan herstelmechanismes via screening voor host genen of exogenously toegevoegd verbindingen die controle plasmamembraan opnieuw verzegelen.

Introduction

Cellen van zoogdieren zijn onderworpen aan mechanische, osmotische en biochemische stress, wat resulteert in het verlies van plasma membraan integriteit. Zonder snelle en doeltreffende nieuwe sluiting, zou de beschadigde cellen snel bezwijken voor geprogrammeerde of necrotic dood. Sinds de jaren 1960, inspanningen te begrijpen van het plasma-membraan opnieuw verzegelen proces voort uit de verwoestende gevolgen die verband houden met haar functioneringsproblemen. Inderdaad, ziekten zoals Limb-Girdle spierdystrofie, diabetes en Chediak-Higashi syndroom zijn gekoppeld aan gebrekkige plasmamembraan reparatie als gevolg van mutaties in het gen coderen dysferlin, productie van advanced glycation end producten en gebreken in de lysosomale mensenhandel regulator CHS1, respectievelijk1,2,3,4,5,6. Tot op heden heeft ons begrip van membraan is opnieuw verzegelen echter nog beperkt7. Eerste studies hebben aangetoond dat membraan opnieuw verzegelen wordt geïnitieerd door de toestroom van extracellulaire Ca2 + via de beschadigde plasmamembraan8,9,10. Sindsdien verschillende niet-wederzijds exclusieve Ca2 +-afhankelijke mechanismen zijn voorgesteld om het verzegelen van de cellen. De patch-hypothese stelt dat in de nabijheid van de wond, intracellulaire vesikels zekering met elkaar en de beschadigde plasmamembraan om op te treden als een patch11,12,13,14. Een tweede model stelt dat calcium-afhankelijke exocytose van lysosomen op de wond site releases de lysosomale enzym zure sphingomyelinase, die sphingomyelinase naar ceramide in de buitenste bijsluiter van het plasma-membraan converteert. Deze plotselinge verandering in de samenstelling van lipide resultaten in ceramide gestuurde endocytose van de beschadigde regio15,16,17. Tot slot betreft het derde voorgestelde mechanisme een rol voor de endosomal sorteren complexe vereist voor transport (ESCRT) ter bevordering van de vorming van naar buiten gerichte blaasjes die bud af van het plasmamembraan18. Slechts een beperkt aantal proteïnen werd geïdentificeerd in deze modellen, en hun machines moet verder worden opgehelderd.

Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer assay die maatregelen het plasmamembraan opnieuw verzegelen efficiëntie in aanhangend zoogdiercellen onderworpen aan schade gemedieerd door recombinant listeriolysin O (LLO)19. LLO is een porie-vormende toxine (PFT) uitgescheiden door de facultatief intracellulaire pathogenen Listeria monocytogenes20,21,22 en behoort tot de MACPF/CDC (membraan aanval complex, Perforine, en cholesterol-afhankelijke cytolyse) superfamilie. MACPF zijn zoogdieren porie-vormende eiwitten die betrokken zijn in de immuun afweer, overwegende dat de CDCs zijn voornamelijk bacteriële toxines geproduceerd door gram-positieve ziekteverwekkers die gastheer cellen beschadigen ter bevordering van hun pathogene levensstijlen23. CDCs worden gesynthetiseerd als wateroplosbare monomeren of Dimeren die zich aan cholesterol binden presenteren in het plasma-membraan en oligomerize in een prepore complex van maximaal 50 subeenheden. De prepore complexe herschikt vervolgens als u wilt invoegen van β-strengen in de lipide dubbelgelaagde, vorming van een β-vat porie dat 30-50 nm in diameter24,25,26,27 omvat.  Deze grote poriën toestaan fluxen van ionen en kleine cellulaire componenten binnen en buiten de cel; Sommige studies hebben echter voorgesteld dat de poriën van kleinere maten ook gevormde28,29,30 zijn. LLO weergegeven onder de CDCs, unieke eigenschappen met inbegrip van bundeling van de onomkeerbare pH - en temperatuur-afhankelijke, die bevorderlijk is voor high-throughput analyses31,32. LLO kan worden toegevoegd aan het kweekmedium cel op 4 ˚C, een temperatuur tolerant te zijn binding naar cellen, maar niet tot de vorming van de complexe porie. Inleiding van porie vorming kan vervolgens worden gesynchroniseerd door het verhogen van de temperatuur naar 37 ˚C, waardoor voor de efficiënte verspreiding van toxine moleculen in het vlak van het membraan te formulier oligomeren en de conformationele remodelleren die betrokken zijn bij de porie generatie. Dus, na de schakelaar in de temperatuur, de kinetische van celbeschadiging zal afhangen van de hoeveelheid toxine gebonden aan het plasma-membraan. Belangrijker, oplosbare LLO (niet gebonden aan het plasma-membraan) snel en onherroepelijk aggregaten wanneer de temperatuur 37 ˚C, die verlicht de noodzaak bereikt om het wegwassen van niet-afhankelijke toxine moleculen en beperkt de omvang van membraan schade na verloop van tijd. Tot slot, omdat LLO aan cholesterol bindt en poriën in cholesterol-rijke membranen vormt, deze test is vatbaar voor een breed scala van zoogdiercellen. Het is belangrijk om in gedachten houden dat LLO beïnvloedt gastheercel signalering hoofdzakelijk via de porie vorming, met een paar uitzonderingen na in welke cel porie-onafhankelijke signalering kan optreden33,34,35,36 ,37,38,39. Daarom kunnen zij niet worden uitgesloten dat LLO signalering activiteiten invloed kunnen hebben op het proces van het membraan reparatie.

Deze test beoordeelt direct de mate van cel verwonding door het meten van de opneming van een cel impermeant fluorescerende (b.v., propidium jodide) dat passief gewonde cellen invoert en wordt sterk fluorescerende zodra gekoppeld aan nucleïnezuren . Vandaar, de fluorescerende kan worden gehandhaafd in het kweekmedium cel gedurende het gehele experiment, waardoor real-time analyses van cel verwonden. De intensiteit van de fluorescentie van de nucleic zuur-bindende kleurstof zal toenemen met de concentratie van toxine en, voor een bepaalde concentratie van toxine, zal toenemen in de tijd totdat alle poriën worden gevormd, en cellen volledig worden gerepareerd of verzadiging is bereikt. De toestroom van extracellulaire Ca2 + via de poriën van het membraan is een conditio sine qua non -evenement voor opnieuw verzegelen. Daarom de resealing efficiëntie kan niet indirect worden aangetoond door het vergelijken van cel verwonding in kweekmedium dat Ca2 + (reparatie tolerante voorwaarde) te verwonden in a Ca2 +-gratis medium (reparatie beperkende voorwaarde). Omdat de intensiteit van de fluorescentie van de nucleic zuur-bindende kleurstof recht evenredig met de concentratie van de cel in elk putje is, is het belangrijk om zaad cellen op dezelfde concentratie in alle putjes. Het is ook belangrijk bij het inventariseren van de cellen in elk putje vóór en na de bepaling om ervoor te zorgen dat mobiele-detachement niet optreedt, als zwevende, geaggregeerde cellen kunnen verdoezelen fluorescentie lezingen die data interpretatie kunnen bemoeilijken. Om te inventariseren cellen, werden cellen uiten van nucleaire-gelokaliseerde Histon 2B-GFP (H2B-GFP) gebruikt in deze test. Temperatuurregeling, multi-mode, microplate lezers combineren snelle, hoge-doorvoer metingen (met behulp van een indeling van 96 of 384-well plaat) de intensiteit van de fluorescentie van met microscopie beeldvorming van levende cellen bij 37 ° C. De laatste kan worden gebruikt voor het opsommen van celaantal en observeren van de uiteindelijke vorming van afzonderlijke cel populaties.

Uiteindelijk, deze bepaling biedt gebruikers de mogelijkheid uit te breiden hun kennis van de complexiteit van membraan herstelmechanismes door screening voor gastheer moleculen of exogenously toegevoegde stoffen waarmee membraan kunnen repareren. Het volgende protocol worden de experimentele stappen beschreven voor het meten van de resealing efficiëntie van cellen die zijn blootgesteld aan LLO en de effecten van een bepaalde drug of cellulaire behandeling op opnieuw verzegelen efficiëntie evalueren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereiding

  1. Cel Plating
    Opmerking: Menselijke cervicale epitheliale cellen, HeLa en HeLa uiten Histone 2B-GFP (H2B-GFP), werden gebruikt in dit protocol, maar deze bepaling kan worden aangepast aan andere zoogdiercellen19.
    1. Loskoppelen Adherente cellen uit een 75 cm2 cel cultuur kolf door het wassen van de cellen met 2 mL trypsine-EDTA-0,25%. De gebruikte trypsine vervangen door 2 mL verse trypsine-EDTA 0,25%.
    2. Incubeer de cellen bij 37 ˚C gedurende 5 minuten totdat de cellen hebben afgerond en losgemaakt van de kolf.
    3. Resuspendeer de cellen in 8 mL groeimedium (DMEM met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum, 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine).
    4. Bepaal de concentratie van de cel met behulp van een hemocytometer en 10 µL celsuspensie.
    5. De cellen in groeimedium om een concentratie van 2, 5 x 105 cellen/mL verdund.
    6. Giet de celsuspensie in een steriele Pipetteer bekken en grondig Meng de schorsing met behulp van serologische Pipetteer 10 mL.
    7. Met behulp van een 12-meerkanaals-micropipet en 200 µL tips, distribueren HeLa cellen (2.5 x 104 cellen/100 µL per putje) in drievoud (of viervoud) in een 96-Wells platte, heldere, zwarte polystyreen Weefselkweek behandeld bodemplaat.
      Opmerking: Een regeling van de beplating wordt gepresenteerd als een voorbeeld in Figuur 1.
    8. Cultuur van de cellen gedurende 24 uur in een bevochtigde cel cultuur incubator op 37 ˚C en 5% CO2.
  2. Bereiding van de stockoplossing
    1. Bereiden 1 L voor een 10 x voorraad van buffer M (gebruikt voor het bereiden van M1 en M2) door toevoeging van 95 g van Hanks evenwichtig zout-oplossing, 0.476 g MgCl2 (5 mM), en 23.83 g HEPES (100 mM) tot 900 mL water. Breng de pH op 7.4 en het volume op 1 L. Filter steriliseren te verhogen.
    2. Bereiden van 50 mL 50 x (1.25 M) voorraad van glucose door toe te voegen 11.26 g D-(+)-Glucose tot een totaal van 50 mL water. Filter steriliseren de oplossing.
    3. Voorbereiding 50 mL van een 100 x (120 mM) voorraad van calcium door 0.666 g voor CaCl2 tot een totaal van 50 mL water toe te voegen. Filter steriliseren de oplossing.
    4. Bereiden van 50 mL van een 10 x (50 mM) voorraad van ethyleen glycol-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N', Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EGTA) door 0.951 g voor EGTA aan 40 mL water toe te voegen. Verhogen van de pH tot en met 8 gebruik van NaOH te ontbinden de EGTA, en vervolgens het volume op 50 mL te verhogen. Filter steriliseren de oplossing.
    5. Voor een enkele 96-wells-plaat, bereiden 50 mL Medium 1 (M1, bevat Ca2 +), 50 mL Medium 2 (M2, Ca2 +-gratis), en 15 mL Medium 2 aangevuld met EGTA, dienovereenkomstig:
      1. Voor M1, voeg toe 5 mL 10 x 1 mL 50 x glucose, Buffer M en 0,5 mL 100 x CaCl2tot 43,5 mL water.
      2. Voor M2, meng 10 x Buffer M 5 mL en 1 mL 50 x glucose 44 mL water.
      3. Voor M2/EGTA, voeg 1,5 mL 10 x Buffer M en 1,5 mL 10 x EGTA tot 12 mL water.
        Opmerking: Alle oplossingen met propidium jodide (PI) moeten worden bereid direct voorafgaand aan toe te voegen aan de cellen.
  3. Plaat Reader/Imaging Cytometer instellingen
    Opmerking: Gebruik een multi-mode-afleesapparaat uitgerust met twee detectie eenheden: een spectrofluorometer en een imaging cytometer. De blootstelling van de fluorescentie Voorkom photobleaching de fluorophores te beperken.
    1. Vooraf warm de afleesapparaat tot 37 ° C alvorens de test uit te voeren.
    2. Stel de parameters voor de kinetische assay dienovereenkomstig binnen de instellingmodus :
      1. Monochromator, FL (fluorescentie)en kinetische , kiest voor de optische configuratie, Lees modi en type, respectievelijk te lezen.
      2. Selecteer een 9 en 15 nm excitatie en emissie bandpass, respectievelijk onder Golflengte instellingen. Ingesteld voor testen met behulp van propidium jodide (PI), de excitatie en emissie golflengten op 535 en 617 nm, respectievelijk.
      3. Selecteer onder Plaat Type 96-Wells voor de indeling van de plaat en de configuratie van een vooraf ingestelde plaat overeenkomt met een duidelijke zwart-muur bodemplaat.
      4. Markeer onder Lezen gebied, de putten die gedurende de kinetische zal worden geanalyseerd.
      5. Onder Bet en optica, voorinstelling van de flitsen per gelezen tot en met 6 en vink het vakje voor lezen vanaf onderkant.
      6. Onder Timing, 00:30:00 in het vak Totale bewerkingstijd voor een 30 min kinetische assay invoegen en invoegen van 00:05:00 voor het Interval.
        Opmerking: Voor elke keer dat de wijs en één golflengte, de leestijd van een volledige 96-wells-plaat is 30 s.
      7. Bevestig de opgegeven instellingen in de Instellingen rechts en selecteer OK. Druk op lezen om de kinetische uitvoeren.
    3. De imaging parameters dienovereenkomstig instellen binnen de instellingmodus:
      1. Minimax, Imagingen eindpunt kiezen voor de optische configuratie, Lees modi en type, respectievelijk te lezen.
      2. Onder golflengten, selectievakjes uitgezonden licht, en een of beide de fluorescentie overeenkomt met excitatie en emissie golflengten van 456/541 nm (GFP) en 625/713 nm (PI).
      3. Gebruik dezelfde opties voor de Plaat Type en Lezen gebied als omschreven in stap 1.3.2.3 en 1.3.2.4.
      4. Selecteer het aantal sites binnen een goed te beeld worden onder Goed gebied instelling.
        Opmerking: 12 sites overeen met de afbeelding van een full-well.
      5. Selecteer onder de Overname beeldinstellingen, de belichtingstijden voor uitgezonden licht, 541 (GFP) en 713 (PI). Voor GFP, het imago van de gehele goed met een belichtingstijd van 20 ms/afbeelding. Voor uitgezonden licht (TL) en PI de fluorescentie, verwerven van een enkel beeld van het centrum van elk putje met belichtingstijden van 8 en 20 ms, respectievelijk.
      6. Bevestig de opgegeven instellingen in de informatie van de instellingen rechts en selecteer OK. De Acquisitietijd voor imaging-het hele oppervlak van elk putje (12 beelden per putje) van een 96-wells-plaat en voor één golflengte is ~ 15 min. pers lezen tot imaging.
        Opmerking: Het tijdstip van de verwerving van een enkele afbeelding per putje van een 96-wells-plaat vereist ~2.5 min/plaat voor één golflengte. De hierboven beschreven parameters komen overeen met de specifieke apparatuur in ons laboratorium. Spectrofluorometric metingen: een xenon flitslamp 1.0 nm increment excitatie golflengten (250-850 nm) met een verstelbare 9 of 15 nm bandpass weergeven, een fotomultiplicator buis detector met een 6 > Meld u dynamisch bereik en een verstelbare 15 of 25 nm emissie bandpass. Imaging cytometer: een verlichting lichtbron staat van wit licht, 460 nm en 625 nm excitatie golflengtes met een 20 nm bandpass, emissie filters gecentreerd op 541 nm (108 nm bandpass) en 713 nm (123 nm bandpass), respectievelijk, en een 4 X doelstelling gekoppeld aan een 1,25 12-bit charge - coupled apparaat megapixelcamera.

2. assay

Opmerking: Op het moment van de bepaling, de cellen moeten 70-90% heuvels zijn. Tijdens de stappen wassen, moet het medium worden verwijderd uit en toegepast op de zijwand van de put (niet direct boven de cellen). Handhaving van de temperaturen van LLO op < 4 ˚C om te voorkomen dat de samenvoeging tot stap 3.1.5.

  1. Een voorraad van 30 µM PI in M1 voor te bereiden en een voorraad van 30 µM PI in M2 vooraf opgewarmd op 37 ˚C.
  2. Voorzichtig wassen de cellen in de plaat 1 met behulp van een 12-meerkanaals-micropipet en 200 µL tips, als volgt:
    1. Reparatie-tolerante voorwaarden, door het groeimedium en wassen die de cellen tweemaal met 200 µL per putje M1 vooraf opgewarmd op 37 ˚C te verwijderen. Het medium vervangen door 100 µL per putje van warme M1 met 30 µM PI.
    2. Voor Reparatievoorwaarden beperkende en verwijder het groeimedium wassen van de cellen een keer met 200 µL per putje warme M2 met 5 mM EGTA aan chelaat Ca2 +, gevolgd door een wassen met 200 µL per putje M2. Vervang het medium met 100 µL per putje warme M2 met 30 µM PI.
    3. Nadat het groeimedium is gewassen en vervangen met medium dat propidium jodide, direct naar stap 2.1.3 te verplaatsen.
  3. Afbeelding plaat 1 onder doorvallend licht, GFP en PI als gedetailleerde onder 1.3.3 (vooraf kinetische). Deze stap duurt 15-20 min.
  4. Tijdens de periode van 15 min in stap 2.1.3, bereiden plaat 2 met behulp van een 12-meerkanaals-micropipet en 200 µL tips als volgt:
    1. Plaats een polypropyleen microplate van 96-Wells-ronde bodem op ijs. Configureren van de plaat met behulp van een experimenteel ontwerp overeenkomt met plaat 1 (Figuur 1).
    2. Reparatie-tolerante voorwaarden, voeg 100 µL per putje van ijskoude M1 met 60 µM PI, gevolgd door de toevoeging van 100 µL per putje van ijskoude M1 met 4 x LLO of niet voor het besturingselement.
    3. Voor reparatie-beperkende voorwaarden, voeg 100 µL per putje van ijskoude M2 met 60 µM PI, gevolgd door de toevoeging van 100 µL per putje van ijskoude M2 met 4 x LLO of niet voor het besturingselement.
  5. Na het imaging plaat plaats 1 (stap 2.1.3), onmiddellijk het op het ijs, met behulp van aluminiumfolie te scheiden van de plaat van direct contact met ijs. Toestaan plaat 1 voor 5 min afkoelen.
  6. Met behulp van een 12-meerkanaals-micropipet en 200 µL tips, Pipetteer 100 µL van elk putje in plaat 2 (stap 2.1.4) de bijbehorende putjes in de plaat 1. Als u wilt goed verdelen de toxine in de media van plaat 1, invoegen van de tips hieronder de meniscus en voorzichtig het uitwerpen van het volume zonder bubbels.
    Opmerking: Niet Pipetteer omhoog en omlaag, als dit kan per ongeluk het loskoppelen van de cellen.
  7. Laat de plaat voor een extra 1 min om de toxine te binden aan de cellen en onmiddellijk overdracht plaat 1 aan de lezer van de plaat voor de kinetische assay met behulp van de spectrofluorometer-modus (stap 1.3.2).
  8. Aan het eind van de kinetische test, onmiddellijk afbeelding plaat 1 (post kinetische) met behulp van stap 1.3.3.

3. analyse: Cel (opsomming)

  1. Het bepalen van de telling van de cel op basis van de nucleaire fluorescentie met behulp van de microplate software voor de opsomming van de cel.
    1. Binnen instellingen, Selecteer Re-analysisen schakel onder de categoriesectie binnen de Analyse afbeeldingsinstellingen Discreet Object analyse met behulp van 541 als de golflengte om objecten te vinden.
    2. In de optie van de objecten vinden, met behulp van de vestigen op beelden vinden methode, selecteer kernen onder het tabblad instellingen en druk op toepassen.
    3. Druk op OK en lezen , tot inleiding van de cel tellen algoritme.
  2. Alternatief, als geen van deze tool beschikbaar is, gebruiken een software van de analyse van het beeld zoals ImageJ bij het inventariseren van de cellen.
    1. Open het imagebestand als een stapel in ImageJ.
    2. De stack omzetten in grijswaarden van de 8-bits afbeeldingen door te klikken op de afbeelding in de menubalk, zweven over Type, en selecteer 8-bits.
    3. Aftrekken van de achtergrond: Klik op de afbeelding in de menubalk, de muisaanwijzer op aanpassenen selecteer Helderheid/Contrast. Pas de minimale waarde voor de achtergrondgeluiden verwijderen en selecteer toepassen.
    4. Drempel om binaire afbeeldingen te maken: Klik op de afbeelding in de menubalk, de muisaanwijzer op aanpassenen selecteer drempel. Selecteer donkere achtergrond, aanpassen van de minimale en maximale drempelwaarden en klik op toepassen.
    5. In geval van samenloop van kernen, kan een waterscheiding tool worden gebruikt om segment kernen. Klik op proces in het menu, zweven over binaire en selecteer waterscheiding.
      Opmerking: Dit zal automatisch verbonden kernen scheiden.
    6. De gemaskerde afbeeldingen analyseren door de gebruiker opgegeven criteria (grootte en cirkelvormigheid) te verfijnen van de identificatie van kernen en uitsluiten van cel puin toe te passen.
      1. Klik op analyseren in het menu en vervolgens analyseren deeltjes. Instellen van de gewenste grootte (pixel ^ 2) en cirkelvormigheid (een waarde van 1 is een perfecte cirkel) bereiken die voldoende zijn om te omvatten individuele cellen/kernen.
      2. In het vak weergeven dropdown, selecteert u de gewenste optie, samenvattencontroleren en klik op OK om het verkrijgen van cellen.

4. analyse: Kinetische curven

  1. De kinetische gegevens overbrengen van de software van de lezer van de plaat naar een analytische gegevens-software.
  2. Gemiddelde voor elke experimentele voorwaarde, de intensiteiten van de fluorescentie van de replicatieonderzoeken bij elke timepoint, samen met de bijbehorende standaarddeviatie en de standaardfout van het gemiddelde voor elke experimentele voorwaarde.
  3. Experimentele voorwaarde, het traceren van de overeenkomstige kinetische curve: PI intensiteit (y-as) ten opzichte van de tijd (x-as).
  4. Voor het berekenen van de resealing efficiëntie van de voorwaarde van een bepaalde behandeling, berekenen van de oppervlakte onder de curve (AUC) van de + LLO in M1 (AUC(M1)) en + LLO in M2 (AUC(M2)). Gebruik de aanpak die hieronder voorgesteld om de efficiëntie (E) daarvan te beoordelen:
    Equation
  5. Voert een vergelijking tussen controle en test behandeling door het bepalen van de efficiencyratio (REVF) hieronder aangegeven:
    Equation 2
    REVF = 1, test behandeling heeft geen invloed op de reparatie
    REVF < 1, test behandeling remt reparatie
    REVF > 1, test behandeling verbetert reparatie
  6. Berekenen van de oppervlakte onder de curve met behulp van de volgende vergelijking:
    Equation 3, waar k is het totale aantal follow-ups.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cel tellen nauwkeurigheid: HeLa cellen worden vaak gebruikt als een Modelgroep zoogdiercellen membraan herstelmechanismes verkennen. Bij de beoordeling van membraan reparatie op celniveau bevolking, is het belangrijk op plaat cellen op dezelfde concentratie in alle putjes voor de juiste data interpretatie. Het is ook belangrijk om te controleren op het moment van de bepaling dat cel nummers over wells gelijkwaardig zijn. HeLa cellen die constitutively express Histon 2B gesmolten tot GFP (H2B-GFP) werden geïntroduceerd in deze test bij het automatisch inventariseren van cellen die zijn gebaseerd op de detectie van hun fluorescerende kernen. Om vast te stellen de juistheid in cel opsomming, werden tweevoudige seriële verdunningen van H2B-GFP HeLa cellen verguld in drievoudige in een 96-wells-plaat en gekweekte voor 4 uur. Deze hoeveelheid tijd is voldoende voor cel bevestiging en biedt beperkte celdeling. Volledige wells waren beeld onder doorvallend licht (TL) en GFP fluorescentie illuminations en cellen werden beoordeeld op basis van GFP fluorescentie met behulp van de software van de analyse van plaat-lezer, (figuur 2A en 2B). De gemiddelde cel telt ± standaardafwijking was uitgezet tegen cel zaaien van concentraties, en een lijn van passend aangegeven een verhouding van de 1.08:1 van graaf van cel naar cel zaaien, demonstreren de nauwkeurigheid van het tellen (figuur 2C). Door imaging al de putten voorafgaand aan een kinetische test, kan worden gewaarborgd dat de cel nummers onder alle putjes stroken. Ook door imaging putten na de kinetische test, een kunt tot stand brengen als de blootstelling aan de toxine mobiele-detachement veroorzaakt.

Expressie van GFP interfereert niet met propidium jodide (PI) intensiteit metingen (IPI): om ervoor te zorgen dat de nucleaire vereniging H2B-GFP niet met PI oprichtingsakte of PI fluorescentie intensiteit meting (IPI), ikPI interfereert werd vergeleken in HeLa en H2B-GFP HeLa cellen die werden blootgesteld, of niet, op 1 nM LLO (Figuur 3). In de afwezigheid van PI was er ook weinig achtergrond fluorescentie in HeLa en HeLa H2B-GFP, die aangeeft dat GFP niet door PI fluorescentie emissie filters bloeden doet. In aanwezigheid van de PI, maar gebrek aan LLO was er een soortgelijke basale PI fluorescentie emissie in zowel HeLa en HeLa H2B-GFP dat niet na verloop van tijd veranderde. Dit bevestigd dat expressie van GFP geen afbreuk doet aan de meting van PI fluorescentie en aangegeven dat PI niet in niet-beschadigde cellen over het tijdsbestek van het experiment doordringen doet. Toevoeging van LLO resulteerden in een stijging in PI fluorescentie na verloop van tijd dat qua HeLa zowel HeLa H2B-GFP was. Deze stijging is toe te schrijven aan de cel verwonding door LLO gecombineerd met PI vereniging met nucleic zuren. Deze resultaten stellen samen, dat uitdrukking van Histon-2B-GFP niet aan PI oprichtingsakte of meting van de fluorescentie afdoet.

PI fluorescentie interfereert niet met GFP gebaseerde cel tellen: samengebouwd, was het belangrijk om te verifiëren dat de nucleaire opneming PI in gewonde cellen niet met GFP gebaseerde cel tellen interfereert. Representatieve fluorescentie beelden van HeLa en HeLa H2B-GFP blootgesteld aan 1 nM LLO in aanwezigheid van PI bleek dat er een aanzienlijke accumulatie van PI in gewonde cellen post kinetiek, als verwachte (figuur 4A). Imaging bleek ook dat PI door GFP fluorescentie detectie (figuur 4A en tabel 1 bloeden kon). Deze crossover fluorescentie werd beste gewaardeerd op de post kinetische beelden van HeLa cellen die doen niet GFP uitdrukken, maar nog steeds groen fluorescent kernen (figuur 4A) wordt weergegeven. Deze crossover kan ook blijken uit de meting van GFP fluorescentie intensiteit (IGFP) in H2B-GFP HeLa cellen, die aanzienlijk verhoogd na kinetische ten opzichte van vooraf kinetische (figuur 4B). Bovenal PI fluorescentie crossover heeft geen invloed op cel tellen omdat het betrokken in de opsomming van kernen segmentatie-proces beïnvloed door een toename van GFP fluorescentie (figuur 4C wordt).

Plasmamembraan opnieuw verzegelen efficiëntie te meten: In deze sectie presenteren wij de basis methodiek voor het meten van de doelmatigheid van het membraan opnieuw verzegelen. Als u wilt bewijs van het proces van het membraan opnieuw verzegelen, H2B-GFP HeLa cellen werden blootgesteld, of niet, op 1 nM LLO in de aanwezigheid (M1) of afwezigheid (M2) van extracellulaire Ca2 + (Figuur 5). Zoals verwacht, in de afwezigheid van LLO, bleef ikPI constant in M1 en M2. Toevoeging van LLO in Ca2 +-bevattende medium resulteerde in een gestage toename in PI fluorescentie intensiteit (IPI), terwijl in de afwezigheid van extracellulaire Ca2 +, er een beduidend steiler verhoging van fluorescentie van de PI was, als gevolg van de het ontbreken van het membraan opnieuw verzegelen. Om de efficiëntie van resealing, die is gedefinieerd als de capaciteit van de cellen te herstellen in M1 ten opzichte van M2 te beoordelen (stap 1.5.4.1), het gebied onder de M1 en M2 curven (AUC) werden vastgesteld en de efficiëntie van reparatie (E) als 0.287 werd berekend.

Een alternatief voor PI: PI is overal gebruikt als merkstof voor plasmamembraan schade. Er zijn echter andere nucleïnezuur bindende kleurstoffen die ook geschikt voor deze test zijn. Bijvoorbeeld een membraan impermeant carbocyanine nucleïnezuur binding (CNABD) exposities een emissiespectrum bereiken in de veel rode kleurstof en heeft een hoge specificiteit voor dubbele gestrande DNA. PI bindt aan de andere kant zowel DNA en RNA40,41. In tegenstelling tot PI overlapt de excitatie en emissie spectra van CNABD niet met die van GFP waardoor beter spectrale resolutie tussen de twee fluorochromes. Bovendien, de CNABD gebruikt in dit protocol heeft een coëfficiënt van uitsterven bijna tweemaal die van PI, wat betekent dat voor hun respectieve excitatie golflengten, deze kleurstof meer geschikt is voor het absorberen van energie dan PI wat resulteert in een sterker fluorescentie-emissie. Fluorescentie van de kwantitatieve analyse van CNABD en GFP beelden bleek dat deze kleurstof een grote fluorescentie dynamisch bereik vertoont, doet niet aanzienlijk uitstoten bij golflengten van GFP fluorescentie, en heeft geen invloed op cel tellen (figuur 6A-D). Inderdaad, HeLa H2B-GFP cellen geïncubeerd in M1 of M2 Medium met CNABD en beschadigd door 1 nM LLO tentoongesteld een 4 - en 5.5 keer verhoging ikCNABD ten opzichte van de niet-beschadigde controles, respectievelijk (figuur 7A). Ter vergelijking: de cellen die blootgesteld is aan 1 nM LLO in aanwezigheid van PI tentoongesteld een verhoging van 2,5 - en 3-d keer PI-intensiteit van de fluorescentie in M1 en M2, respectievelijk (Figuur 5). Als PI, CNABD exposities verhogen van de intensiteit van de fluorescentie met toenemende LLO concentratie in M1 (figuur 7A), en de resulterende reparatie-efficiëntie werd berekend zoals beschreven in stap 1.5.4.1 (figuur 7B). We melden dat de cel opnieuw verzegelen efficiëntie daalt naarmate LLO concentratie toeneemt. Dit verschijnsel weerspiegelt het feit dat cellen hun vermogen om te verzegelen verlagen wanneer buitensporige schade wordt veroorzaakt.

Kwaliteitsbeoordeling van de membraan reparatie bepaling: een kritische aspect van elke test is zijn robuustheid of vermogen opsporen en oplossen van verschillen tussen de negatieve en positieve controles. Signaal variatie tussen positieve en negatieve controles moet voldoende dynamisch bereik en reproduceerbaarheid worden weergegeven. In dit membraan repair assay zijn de positieve en negatieve controles cellen blootgesteld aan LLO in reparatie-tolerante (M1) en reparatie-beperkende voorwaarden van de (M2), respectievelijk. Twee benaderingen werden meegenomen naar het beoordelen van de robuustheid van deze assay voor high-throughput analyse. Eerst, kan de Z-factor, of screening venster coëfficiënt, bepalen of een bepaalde set voorwaarden een ruime heeft voldoende dynamisch bereik, terwijl de boekhouding voor signaal variabiliteit. Z-factoren binnen het bereik 0 < Z ≤ 0,5 en 0,5 < Z ≤ 1 correspondeert met een aanvaardbaar en zeer goed assay, respectievelijk42,43. Een beperking van het gebruik van de Z-factor voor kwaliteitsbeoordeling is dat geteste voorwaarden meestal meer gematigde waarden in vergelijking met het extreem positieve en negatieve controles vertonen. Daarom, als een tweede benadering, berekend we het strikt gestandaardiseerde gemiddelde verschil (SSMD, β), waarin verschillen tussen experimentele omstandigheden dat anders zou worden gecategoriseerd als een negatief resultaat op basis van een gekwalificeerde Z-factor44 kan herkennen ,45. SSMD waarden kunnen worden onderverdeeld in effect sterkte variërend van geen effect (β = 0) tot zeer sterk (β ≥ 5). Met behulp van de gegevens uit figuur 7A en AUC voor vergelijking van M1 versus M2 voorwaarden, blootstelling aan 0,25 en de 0,5 nM LLO geproduceerd Z-factor waarden van β, 0.3100813 en 0.137313 = 6.0672 en 4.803308, respectievelijk, waarmee wordt aangegeven dat een venster van LLO concentraties geschikt voor de bepaling. Als de concentratie van LLO is toegenomen dan 1 nM, de kloof van de ICNABD kinetische curven tussen M1 en M2 voorwaarden sluit resulterend in een drastisch verminderde Z-factor en SSMD waarden (figuur 7B). Dergelijke hoge concentraties van LLO komen overeen met de voorwaarden waarin het potentieel van de reparatie wordt gecompenseerd door de schade en dus ontkent het gebruik van de bepaling in het identificeren van factoren die betrokken zijn bij de reparatie van het membraan. Dit wordt verder geïllustreerd door de afname van reparatie efficiëntie (E) als LLO concentratie toeneemt (figuur 7B). Alle gegevens (Z-factor, SSMD en E) zijn gegenereerd met 3 biologische replicatieonderzoeken en 3 technische repliceert per experimentele voorwaarden assay validatie. Samen, deze gegevens blijkt dat deze bepaling de verwachte robuustheid voor een high-throughput assay met LLO concentraties inferieur aan 1 heeft nM voor HeLa cellen.

Bewijs van beginsel: zodra de robuustheid van de bepaling werd opgericht, we extra experimenten uitgevoerd als een bewijs van het beginsel dat deze bepaling heeft de gevoeligheid en de resolutie te identificeren van een defect in het herstelproces. Ook vonden wij dat high-throughput assays worden gebruikt als een screening om te identificeren "hits" binnen grote schermen, waarbij minder dan 3 biologische kunnen worden gerepliceerd. Dus, is het relevant dat de proefopzet de kracht van de detectie biedt te identificeren "hits" binnen een enkele assay. Daarom onder een scherm van hoge-doorvoer, kan lay-out van de bepaling worden aangepast aan 4 technische replicatieonderzoeken te verhogen van statistisch onderscheidingsvermogen in een enkele experiment. Cellen werden verguld in viervoud en waren vooraf behandeld 1 uur vóór de bepaling met desipramine, een farmacologische Inhibitor van de omwenteling van de lysosomale eiwit zure sphingomyelinase (ASM) die een rol in het plasmamembraan reparatie15,17 speelt ,46. Belangrijker, beïnvloedde behandeling met desipramine niet de graven van de cel in de test, rekening houdend met de juiste vergelijking tussen desipramine behandeld en niet-behandelde cellen (figuur 8A). Remming van ASM in desipramine behandelde cellen resulteerde in een defect in de membraan opnieuw verzegelen efficiëntie bij blootstelling aan LLO, zoals wordt geïllustreerd door de afname van de E en REVF (figuur 8B en 8 C). Met behulp van een gemengde effecten-model, een vergelijking van desipramine-getrakteerd op niet-behandelde cellen blootgesteld aan 0,25 en de 0,5 nM LLO in M1 toonde p-waarden van 0.0010 en 1 x 10-10, respectievelijk. Samen, gegevens aangeven dat 0,25 en de 0,5 nM LLO juiste concentraties te identificeren van de gebreken in de reparatie in een high-throughput experimentele setting, met mogelijke statistische analyses van een enkel experiment ooit de technische replicatieonderzoeken worden verhoogd tot vier . Opmerking dat de statistische benadering van het model van de gemengde effecten tussen viervoud zal geen rekening met mogelijke variaties over meerdere biologische repliceert. Alle belangrijke bevindingen met behulp van een biologische repliceren in extra experimentele instellingen dient te worden geverifieerd.

Figure 1
Figuur 1: proefopzet. Het flow-diagram toont een representatieve plaat ontwerp geconfigureerd voor het testen van het effect van zeven testomstandigheden in vergelijking met niet-behandelde cellen. Extra besturingselementen moeten worden opgenomen indien van toepassing, wat voorbeeld drug voertuigen. Cellen zijn verguld (1) 24 uur voorafgaand aan het experiment plaat. Op de dag van het experiment, worden de cellen in plaat 1 gewassen met M1 of M2 medium vooraf bij 37 ° C opgewarmd, en de plaat is verbeelde (TL, GFP en PI fluorescentie) vooraf kinetische. Tijdens de 15 min van beeldvorming, reagentia worden toegevoegd op ijs aan bord 2. Na imaging, plaat 1 wordt onmiddellijk geplaatst op ijs gedurende 5 minuten en 100 μl per putje overbrengt van 2 naar 1 plaat plaat. Plaat 1 wordt geplaatst in de afleesapparaat de kinetische test op 37 ° C gedurende 30 minuten, gevolgd door imaging (TL, GFP en PI fluorescentie) wordt uitgevoerd. Gegevens worden vervolgens geanalyseerd voor cellen tellen en beoordelen van reparatie-efficiëntie in alle proefomstandigheden. In grote gegevenssets, kan analyse worden geautomatiseerd. Ook kan het aantal technische replicatieonderzoeken worden verhoogd tot 4 in high-throughput schermen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: cellen tellen nauwkeurigheid. HeLa cellen uiten GFP-gelabeld Histone 2B werden zaadjes in triplicates bij de aangegeven concentraties. (A) cellen werden beeld bij 37 ° C onder doorvallend licht (TL) en GFP fluorescentie (12 beelden per putje) en een cel detectie algoritme werd gebruikt om af te bakenen individuele kernen (in paars). Schaal bar = 1 mm. (B) hogere vergroting van TL, GFP en cel detectie (paars) beelden (ingezoomde 2 X). Schaal bar = 100 μm. (C) Image analysesoftware werd gebruikt om te tellen van het aantal cellen en de graven werden uitgezet tegen de oorspronkelijke cel cel seeding concentratie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Propidium jodide fluorescentie-meting wordt niet beïnvloed door Histon 2B-GFP expressie. Histon 2B-GFP uiten en niet-uiting van HeLa cellen werden blootgesteld, of niet, op 1 nM LLO in de aanwezigheid (ononderbroken lijnen) of afwezigheid (onderbroken lijnen) van 30 μM PI in Ca2 +-met medium (M1). De kinetische assay PI fluorescentie intensiteiten afgemeten aan spectrofluorometry elke 5 minuten gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Gegevens zijn de gemiddelde PI fluorescentie intensiteit (IPI) uitgedrukt in relatieve fluorescentie eenheden (RFU) ± SEM (n = 3 onafhankelijke experimenten, elk uitgevoerd in triplicates). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: cel opsomming wordt niet beïnvloed door PI fluorescentie. (A) representatieve pre-en post kinetische beelden (TL, PI, en GFP van cellen blootgesteld, of niet, op 1) nM LLO in M1. Schaal bar = 100 μm. (B) kwantitatieve fluorescentie microscopie analyse (ikGFP± SEM) bleek de verhoogde GFP fluorescentie-meting als gevolg van de nucleaire opneming van de PI op cel verwonding door LLO (post kinetische). (C) GFP gebaseerde cel opsomming werd niet beïnvloed door de toename van het GFP-intensiteit. Aantal cellen per putje werd uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. (In B en C: zwarte balken = vooraf kinetische gegevens; rode balken = post kinetische gegevens; n = 3 onafhankelijke experimenten, elk uitgevoerd in triplicates, een tweezijdige Student t-test werd gebruikt voor het analyseren van kwantitatieve fluorescentie intensiteit en cel graven verworven beelden, ** p < 0,01). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: meten van plasma membraan opnieuw verzegelen efficiëntie. Histon 2B-GFP waarin HeLa cellen werden blootgesteld, of niet, op 1 nM LLO in Ca2 +-bevattende (M1) of Ca2 +-gratis (M2) medium met 30 μM PI. Kinetische gegevens vertegenwoordigen PI fluorescentie intensiteit (IPI) in relatieve fluorescentie eenheden (RFU) ± SEM, gemeten gedurende 30 minuten bij 37 ° C. n = 3 onafhankelijke experimenten, elk uitgevoerd in triplicates. De resealing efficiëntie werd gemeten zoals aangegeven in protocol stap 1.5.4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: Carbocyanine nucleïnezuur kleurstof bindend als een alternatieve kleurstof te beoordelen membraan opnieuw verzegelen. H2B-GFP HeLa cellen werden blootgesteld, of niet, naar 0,5 nM LLO gedurende 30 minuten bij 37 ° C in de aanwezigheid van 1 μM CNABD in Ca2 +-bevattende (M1) of Ca2 +-gratis (M2) medium. (A) beelden van HeLa H2B-GFP cellen werden verworven pre-en post kinetische in M1 met de kleurstof. Schaal bar = 100 μm. (B en C) fluorescentie intensiteiten van geïntegreerde CNABD en GFP werden gemeten met behulp van het imaging cytometer en uitgedrukt in relatieve fluorescentie eenheden (RFU) ± SEM. (D) GFP fluorescentie beelden werden verwerkt om te inventariseren van HeLa H2B-GFP cellen (zwarte balken = vooraf kinetische, rode gegevensbalken = post kinetische gegevens, n = 3 onafhankelijke experimenten, elk uitgevoerd in triplicates). Een tweezijdige Student t-test werd gebruikt voor het analyseren van kwantitatieve fluorescentie intensiteit en cel telt verworven beelden, ** p < 0,01, *** p < 0.001) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: Effect van LLO concentratie op opnieuw verzegelen van efficiëntie, Z-factor en SSMD. (A) HeLa H2B-GFP geïncubeerd in M1 of M2 met 1 micrometer CNABD cellen werden blootgesteld aan toenemende concentraties van LLO en onderworpen aan de kinetische assay gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Gegevens zijn uitgedruct in CNABD intensiteit (ICNABD) in relatieve fluorescentie eenheden (RFU) ± SEM. (B) de Z-factor en strikt gestandaardiseerde gemiddelde verschil (SSMD) werden berekend als een kwaliteitsbeoordeling voor de robuustheid van de membraan-reparatie assay, met behulp van het gebied onder de curve (AUC) als een maatstaf voor de kinetische curven42,43,44,45. De efficiëntie van de resealing werden berekend zoals beschreven in het protocol en resultaten secties (n = 3 onafhankelijke experimenten, elk uitgevoerd in triplicates). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8: cel blootstelling aan desipramine veroorzaakt gebreken in opnieuw verzegelen. HeLa H2B-GFP cellen (verguld in viervoud) waren vooraf behandeld met 30 μM desipramine (of niet) gedurende 1 uur bij 37 ° C en vervolgens blootgesteld aan 0,25 of 0,5 nM LLO in aanwezigheid van 1 μM CNABD in Ca2 +-bevattende (M1) of Ca2 +-gratis (M2) medium. Cellen werden beeld (pre- en post kinetische) en onderworpen aan de kinetische test bij 37 ° C voor 30 min. (A) cellen werden geïnventariseerd; gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde cel telt ± SEM. (B) CNABD fluorescentie intensiteit (ICNABD) wordt uitgedrukt in relatieve fluorescentie eenheden (RFU) ± SEM. (C) Resealing efficiëntie werden berekend in de aanwezigheid en de afwezigheid van desipramine. Een gemengde effecten model werd gebruikt op log-getransformeerd intensiteitswaarden uitgaande van een willekeurige snijpunt voor elke technische repliceren. Vastleggen van beide een verschuiving en verandering in de vorm van de kinetische curven, werden het belangrijkste effect van behandeling voorwaarde en het interactie effect tussen behandeling voorwaarde en tijd gezamenlijk getest voor statistische significantie. Een tweezijdige Student t-test werd gebruikt voor het analyseren van de graven van de cel van verworven beelden. De p-waarde werd berekend aan de hand van de gemengde effecten-model. (4 technische repliceert, één experiment). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Imaging Cytometer emissie kanaal specificaties
Fluorophore Fluorophore ex / em (nm) Groene kanaal (ex / em ± bandpass, nm) Rode kanaal (ex / em ± bandpass, nm)
GFP 488/510 460/541 ± 20/108 625/713 ± 20/123
PI 533/617
CNABD 642/661

Tabel 1: GFP, PI, en CNABD excitatie en emissie pieken en de groene en de rode kanaal excitatie en emissie bandpasses voor de beeldvorming cytometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Deze test meet de efficiëntie van het membraan opnieuw verzegelen op celniveau bevolking met hoge gegevensdoorvoer capaciteit. Het kan worden gebruikt aan het scherm voor cellulaire componenten of drug-bibliotheken die invloed kunnen hebben op de membraan reparatie. De beschreven test gebruikt een 96-wells-plaat-indeling, maar het kan worden aangepast aan 384-Wells-platen voor hogere doorvoer. Een voordeel van deze test is de mogelijkheid om het verkrijgen van de fluorescentie metingen van aanhangend levende cellen in real time zonder de behoefte aan overmatig cel verwerking zoals mobiele-detachement, fixatie of fluorescentie na fixatie labeling. Multimode plaat lezers, zoals gebruikt in dit protocol hebben voldoende gevoeligheid voor snelle spectrofluorometric metingen op tijdstippen zo laag als 30 s voor een 96-wells-plaat. De overname van fluorescentie beelden bevat aanvullende informatie met inbegrip van cel opsomming, eventuele wijzigingen in de cel morfologie en potentiële identificatie van afzonderlijke cel populaties. De huidige bepaling bepaalt geen de kinetiek plasmamembraan daarvan op het niveau van één cel, maar is de aanduiding van de experimentele omstandigheden (farmacologische stoffen of cellulaire componenten) die, positief of negatief, het proces van beïnvloeden kunnen membraan opnieuw verzegelen op celniveau bevolking.

Verschillende andere experimentele benaderingen zijn ontwikkeld voor de beoordeling van het membraan mechanismen opnieuw te verzegelen. Bijvoorbeeld hebben mechanische verstoring door microneedle punctie, kraal schuren en laser ablatie mechanische membraan schade model is gebruikt. De meting van verwonding/reparatie heeft fluorescentie microscopie of stroom cytometry betrokken door het kwantificeren van de post van fluorescerende sondes (FM 1-43, propidium jodide, fluoresceïne-geconjugeerde dextrans) of het bijhouden van fluorescente proteïne Chimaera47 ,48,49,50. Elk van deze benaderingen heeft zijn eigen voordelen; ze zijn echter niet vatbaar voor high-throughput screening in levende cellen zoals gepresenteerd in deze test.

De huidige bepaling is geoptimaliseerd voor het analyseren van de resealing efficiëntie van cellen gewond door de porie-vormende proteïne LLO, welke vormen grote poriën die toestaan de massale Ca2 + toestroom zoals uitgelokt door mechanische breuken van het plasma-membraan. Hoewel porie-vormende toxines een vorm van plasmamembraan schade, reparatie van grote toxine poriën vertegenwoordigen en mechanische wonden waren voorgesteld voor het delen van gemeenschappelijke Ca2 +-afhankelijke trajecten17,51. Het is belangrijk op te merken dat LLO interactie met celmembraan onderdelen zoals cholesterol kan invloed hebben op cel signalering en daardoor invloed kan hebben op membraan opnieuw verzegelen mechanismen in vergelijking met mechanische wonden. Onze kennis over membraan reparatie is nog steeds beperkt en verdere studies zijn nodig om vast te stellen als nieuwe sluiting van mechanische wonden verschillen van de nieuwe sluiting na de vorming van toxine poriën. Er zijn verschillende voordelen van het gebruik van LLO. Ten eerste, de inleiding van membraan schade kan worden gesynchroniseerd door het verhogen van de temperatuur van 4 tot 37 ° C. Tweede, de oplosbare vorm van LLO (niet gebonden aan de celmembraan) onherroepelijk aggregaten bij een neutrale pH en 37 ° C, dus de beperking van de cytotoxische effecten en intrekking van de noodzaak om te wassen van de cellen. Tot slot, de mate van schade kan worden aangepast door het variëren van de concentratie van de toxine. Een beperking van deze bepaling is echter de temperatuur schakelaar tussen 37 en 4 ° C, die gevolgen kan hebben voor het reparatie-mechanisme zoals vesiculaire vervoer, endocytose en membraan vloeibaarheid, onder andere processen, die zijn beïnvloed door de temperatuur52, 53,54. Het is belangrijk om te verifiëren dat een farmacologische remmer opgenomen in de bepaling niet met de vorming van LLO poriën interfereert door het uitvoeren van een hemolyse assay in de aanwezigheid (versus afwezigheid) van de drug-55. Als gevolg van potentiaalverschillen batch in LLO activiteit is het belangrijk om voor te bereiden van een voorraad van LLO die groot genoeg is voor een volledige high-throughput scherm55.

We ook het gebruik van cellen, uiting geven aan de nucleaire-gelokaliseerde Histone-2B-GFP chimaera als een middel om cellen voordat en nadat de membraan repair assay via microscopische beeldvorming gevolgd door automatische beeldanalyse opsommen. Bovenal equivalente cel telt over voorwaarden en onveranderlijke cel telt voordat en nadat de kinetische test zijn van cruciaal belang als PI of CNABD fluorescentie intensiteiten niet gemakkelijk worden genormaliseerd. Inderdaad, een verschil in cellen zal leiden tot verschillen in de mate van schade door een bepaalde concentratie van LLO, die niet kan worden gecorrigeerd voor via fluorescentie normalisatie wegens verschillen in de efficiëntie (Figuur 7) opnieuw te verzegelen. We toonden dat Histone-2B-GFP expressie niet met PI of CNABD oprichtingsakte of fluorescentie emissie interfereert. Omgekeerd, opneming van PI of CNABD heeft geen invloed op cel GFP gebaseerde opsomming. Als andere combinaties van fluorophores worden gebruikt moeten, zou het nodig zijn om te beoordelen van eventuele spectrale overlap tussen fluorochromes, zoals in dit werk werd uitgevoerd. Hoewel PI uitgebreid gebruikt is voor het meten van membraan schade, laten we zien dat CNABD een uitstekende vervanger dat virusachtig hogere fluorescentie quantumrendement is, wat resulteert in een groter dynamisch bereik geschikt voor het karakteriseren van opnieuw verzegelen van efficiëntie.

Z-factor en SSMD bevestigden dat deze bepaling de robuustheid nodig high-throughput-analyses uitvoeren. De berekening van de resealing-efficiëntie is een kritische en betrouwbare hulpprogramma voor het identificeren van potentiële hits. Bovendien, kan het gemengde effecten model dienen als een statistisch instrument te evalueren hits binnen een enkele assay. De proefopzet moet een minimum van drie technische replicatieonderzoeken opnemen als het scherm meerdere malen kan worden herhaald. Quadruplicates moet worden gebruikt als statistische instrumenten, zoals het model van de gemengde effecten, worden opgenomen in een enkele experiment, moeten al dan niet het zal worden herhaald. Het is echter aangeraden om uit te voeren van het scherm meerdere keren en valideren van de resultaten door het uitvoeren van aanvullende experimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij erkennen Dr. Jesse Kwiek (The Ohio State University) voor kandidatuur waardoor wij zijn multi-mode detectie-platform te gebruiken voor enkele voorbereidende experimenten. Onderzoek gemeld in dit artikel werd gesteund door de National Institute of Allergy and Infectious Diseases van de National Institutes of Health award onder nummer RO1AI107250 om Stephanie Seveau. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer Molecular Devices 5024062
TO-PRO-3 ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific P3566
HeLa ATCC CCL2
HeLa H2B-GFP Millipore SCC117
Trypsin-EDTA 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate Corning 3603
Hanks' balanced Salts Sigma-Aldrich H4891
EGTA ISC BioExpress 0732-100G
HEPES Fisher Scientific BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax Sigma-Aldrich G5146-1KG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Current Topics in Membranes. 77, 67-96 (2016).
  2. Howard, A. C., McNeil, A. K., McNeil, P. L. Promotion of plasma membrane repair by vitamin E. Nature Communications. 2, 597 (2011).
  3. Howard, A. C., et al. A novel cellular defect in diabetes: membrane repair failure. Diabetes. 60 (11), 3034-3043 (2011).
  4. Lozano, M. L., et al. Towards the targeted management of Chediak-Higashi syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 132 (2014).
  5. Vainzof, M., et al. Dysferlin protein analysis in limb-girdle muscular dystrophies. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (1), 71-80 (2001).
  6. Huynh, C., et al. Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (48), 16795-16800 (2004).
  7. Cooper, S. T., McNeil, P. L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiological Reviews. 95 (4), 1205-1240 (2015).
  8. Steinhardt, R. A., Bi, G., Alderton, J. M. J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263 (5145), 390-393 (1994).
  9. De Mello, W. C. Membrane sealing in frog skeletal-muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (4), 982-984 (1973).
  10. Fishman, H. M., Tewari, K. P., Stein, P. G. Injury-induced vesiculation and membrane redistribution in squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 1023 (3), 421-435 (1990).
  11. Davenport, N. R., Bement, W. M. Cell repair: Revisiting the patch hypothesis. Communicative & Integrative Biology. 9 (6), 1253643 (2016).
  12. McNeil, P. L., et al. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. Journal of Cell Science. 113 (11), 1891-1902 (2000).
  13. Terasaki, M., Miyake, K., McNeil, P. L. Large plasma membrane disruptions are rapidly resealed by Ca2+-dependent vesicle-vesicle fusion events. Journal of Cell Biology. 139 (1), 63-74 (1997).
  14. Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Journal of Cell Biology. 131 (6 Pt. 2), 1747-1758 (1995).
  15. Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. Journal of Cell Biology. 189 (6), 1027-1038 (2010).
  16. Rodriguez, A., et al. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. Journal of Cell Biology. 137 (1), 93-104 (1997).
  17. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
  18. Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136 (2014).
  19. Pathak-Sharma, S., et al. High-Throughput Microplate-Based Assay to Monitor Plasma Membrane Wounding and Repair. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 305 (2017).
  20. Hamon, M. A., et al. Listeriolysin O: the Swiss army knife of Listeria. Trends in Microbiology. 20 (8), 360-368 (2012).
  21. Seveau, S. Multifaceted activity of listeriolysin O, the cholesterol-dependent cytolysin of Listeria monocytogenes. Subcellular Biochemistry. 80, 161-195 (2014).
  22. Osborne, S. E., Brumell, J. H. Listeriolysin O: from bazooka to Swiss army knife. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 372 (1726), (2017).
  23. Lukoyanova, N., Hoogenboom, B. W., Saibil, H. R. The membrane attack complex, perforin and cholesterol-dependent cytolysin superfamily of pore-forming proteins. Journal of Cell Science. 129 (11), 2125-2133 (2016).
  24. Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infection and Immunity. 73 (10), 6199-6209 (2005).
  25. Koster, S., et al. Crystal structure of listeriolysin O reveals molecular details of oligomerization and pore formation. Nature Communications. 5, 3690 (2014).
  26. Duncan, J. L., Schlegel, R. Effect of streptolysin O on erythrocyte membranes, liposomes, and lipid dispersions. A protein-cholesterol interaction. Journal of Cell Biology. 67 (1), 160-174 (1975).
  27. Morgan, P. J., et al. Subunit organisation and symmetry of pore-forming, oligomeric pneumolysin. FEBS Letters. 371 (1), 77-80 (1995).
  28. Leung, C., et al. Stepwise visualization of membrane pore formation by suilysin, a bacterial cholesterol-dependent cytolysin. eLife. 3, (2014).
  29. Marchioretto, M., et al. What planar lipid membranes tell us about the pore-forming activity of cholesterol-dependent cytolysins. Biophysical Chemistry. 182, 64-70 (2013).
  30. Palmer, M., et al. Assembly mechanism of the oligomeric streptolysin O pore: the early membrane lesion is lined by a free edge of the lipid membrane and is extended gradually during oligomerization. European Molecular Biology Organization Journal. 17 (6), 1598-1605 (1998).
  31. Bavdek, A., et al. pH dependence of listeriolysin O aggregation and pore-forming ability. Federation of European Biochemical Society Journal. 279 (1), 126-141 (2012).
  32. Schuerch, D. W., Wilson-Kubalek, E. M., Tweten, R. K. Molecular basis of listeriolysin O pH dependence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12537-12542 (2005).
  33. Cassidy, S. K., O'Riordan, M. X. More than a pore: the cellular response to cholesterol-dependent cytolysins. Toxins (Basel). 5 (4), 618-636 (2013).
  34. Lam, J., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes L. monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. , (2017).
  35. Gekara, N. O., Weiss, S. Lipid rafts clustering and signalling by listeriolysin O. Biochemical Society Transactions. 32 (Pt 5), 712-714 (2004).
  36. Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. European Molecular Biology Organization Reports. 11 (5), 400-405 (2010).
  37. Baba, H., et al. Induction of gamma interferon and nitric oxide by truncated pneumolysin that lacks pore-forming activity. Infection and Immunity. 70 (1), 107-113 (2002).
  38. Carrero, J. A., Vivanco-Cid, H., Unanue, E. R. Listeriolysin o is strongly immunogenic independently of its cytotoxic activity. Public Library of Science One. 7 (3), e32310 (2012).
  39. Coconnier, M. H., et al. Listeriolysin O-induced stimulation of mucin exocytosis in polarized intestinal mucin-secreting cells: evidence for toxin recognition of membrane-associated lipids and subsequent toxin internalization through caveolae. Cell Microbiology. 2 (6), 487-504 (2000).
  40. Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 45 (1), 49-53 (1997).
  41. Bink, K., et al. TO-PRO-3 is an optimal fluorescent dye for nuclear counterstaining in dual-colour FISH on paraffin sections. Histochemistry and Cell Biology. 115 (4), 293-299 (2001).
  42. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  43. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nature Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  44. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  45. Zhang, X. D. A new method with flexible and balanced control of false negatives and false positives for hit selection in RNA interference high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 12 (5), 645-655 (2007).
  46. Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
  47. Davenport, N. R., et al. Membrane dynamics during cellular wound repair. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2272-2285 (2016).
  48. Defour, A., Sreetama, S. C., Jaiswal, J. K. Imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair. Journal of Visualized Experiments. (85), (2014).
  49. Lee, J. J. A., et al. Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  50. Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. Journal of Visualized Experiments. (52), (2011).
  51. Corrotte, M., et al. Toxin pores endocytosed during plasma membrane repair traffic into the lumen of MVBs for degradation. Traffic. 13 (3), 483-494 (2012).
  52. Kuismanen, E., Saraste, J. Low temperature-induced transport blocks as tools to manipulate membrane traffic. Methods in Cell Biology. 32, 257-274 (1989).
  53. Togo, T., et al. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. Journal of Cell Science. 112, 719-731 (1999).
  54. Johnson, S. A., et al. Temperature-dependent phase behavior and protein partitioning in giant plasma membrane vesicles. Biochimica et Biophysica Acta. 1798 (7), 1427-1435 (2010).
  55. Lam, J. G. T., et al. Host cell perforation by listeriolysin O (LLO) activates a Ca(2+)-dependent cPKC/Rac1/Arp2/3 signaling pathway that promotes Listeria monocytogenes internalization independently of membrane resealing. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 270-284 (2018).

Tags

Immunologie en infecties probleem 143 plasmamembraan opnieuw verzegelen membraan reparatie spierdystrofie propidium jodide carbocyanine nucleïnezuur binden kleurstof porie-vormende toxine listeriolysin O
High-throughput meting van plasmamembraan opnieuw verzegelen efficiëntie bij zoogdiercellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S.… More

Lam, J. G. T., Song, C., Seveau, S. High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (143), e58351, doi:10.3791/58351 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter