Analisi dell'espressione genica di cellule endoteliali esposte per Shear Stress utilizzando più flusso parallelo-piastra Chambers

H.S. Jeffrey Man; Aravin N. Sukumar; Kyung Ha Ku; Michelle K. Dubinsky; Noeline Subramaniam; Philip A. Marsden

doi:10.3791/58478

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Articolo metodologico

Analisi dell'espressione genica di cellule endoteliali esposte per Shear Stress utilizzando più flusso parallelo-piastra Chambers

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DOI:

10.3791/58478

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21 ottobre 2018

H.S. Jeffrey Man¹^,² , Aravin N. Sukumar¹^,² , Kyung Ha Ku²^,³ , Michelle K. Dubinsky¹^,² , Noeline Subramaniam¹^,² , Philip A. Marsden¹^,²^,³^,⁴

¹Institute of Medical Science, University of Toronto, ²Keenan Research Centre in the Li Ka Shing Knowledge Institute, St. Michael's Hospital, ³Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, ⁴Department of Medicine, University of Toronto

In questo articolo

Sommario

Qui, un flusso di lavoro per l'analisi di espressione di cultura e gene delle cellule endoteliali sotto sollecitazione di taglio fluido è presentato. È inclusa una disposizione fisica per alloggiamento e monitoraggio più alloggiamenti di flusso in un ambiente controllato e l'uso di un RNA di riferimento esogeno per PCR quantitativa contemporaneamente.

Abstract

Descriviamo un flusso di lavoro per l'analisi dell'espressione genica da cellule endoteliali soggette a un costante utilizzando più monitorato parallelo-piastra flusso camere a flusso laminare. Le cellule endoteliali formano il rivestimento cellulare interno dei vasi sanguigni e sono cronicamente esposti alla forza di attrito del flusso sanguigno chiamato shear stress. In condizioni fisiologiche, funzione delle cellule endoteliali in presenza di diverse condizioni di sollecitazione di taglio. Così, l'applicazione delle condizioni di sollecitazione di taglio in modelli in vitro può fornire una maggiore visibilità sulle risposte endoteliali in vivo. La camera di flusso parallelo-piastra precedentemente pubblicata da Lane et al. ⁹ è adattato per studiare la regolazione genica endoteliale in presenza ed assenza di flusso laminare (non pulsante) costante. Chiavi adattamenti in allestimento per flusso laminare come presentato qui includono un ambiente grande, dedicato ai circuiti di flusso simultaneo di casa, il monitoraggio delle portate in tempo reale e l'inclusione di un riferimento esogeno RNA per la normalizzazione della dati quantitativi di PCR in tempo reale. Per valutare più trattamenti/condizioni con l'applicazione della sollecitazione di taglio, più circuiti di flusso e pompe sono utilizzate contemporaneamente all'interno dell'incubatore stesso riscaldata e umidificata. La portata di ogni circuito di flusso è misurata continuamente in tempo reale per standardizzare le condizioni di sollecitazione di taglio in tutto gli esperimenti. Perché questi esperimenti hanno più condizioni, usiamo anche un RNA di riferimento esogeno è a spillo-al momento dell'estrazione del RNA per la normalizzazione di estrazione del RNA e l'efficienza di sintesi del cDNA del primo-filo. Questi passaggi di ridurre al minimo la variabilità tra i campioni. Questa strategia è impiegata nella nostra pipeline per l'analisi di espressione genica con esperimenti di sollecitazione di taglio utilizzando la camera di flusso parallelo-piastra, ma parti di questa strategia, come ad esempio l'esogeno fa riferimento spike-nel RNA, può facilmente e in modo conveniente essere usati per altre applicazioni.

Introduzione

Le cellule endoteliali vascolari formano il rivestimento cellulare interno dei vasi sanguigni nel sistema cardiovascolare chiuso delle specie superiori. Essi formano l'interfaccia tra sangue e tessuti e sono caratterizzati da luminal e superfici abluminale. L'endotelio è un sistema diversificato, attivo e adattivo che regola il flusso sanguigno, traffico di sostanze nutritive, l'immunità e la crescita di nuovi vasi sanguigni¹. Nel corpo, le cellule endoteliali presenti normalmente in un ambiente dove sono esposti per la forza di attrito della circolazione, sollecitazione di taglio². Sollecitazione di taglio è un regolato....