Summary
Qui, un flusso di lavoro per l'analisi di espressione di cultura e gene delle cellule endoteliali sotto sollecitazione di taglio fluido è presentato. È inclusa una disposizione fisica per alloggiamento e monitoraggio più alloggiamenti di flusso in un ambiente controllato e l'uso di un RNA di riferimento esogeno per PCR quantitativa contemporaneamente.
Abstract
Descriviamo un flusso di lavoro per l'analisi dell'espressione genica da cellule endoteliali soggette a un costante utilizzando più monitorato parallelo-piastra flusso camere a flusso laminare. Le cellule endoteliali formano il rivestimento cellulare interno dei vasi sanguigni e sono cronicamente esposti alla forza di attrito del flusso sanguigno chiamato shear stress. In condizioni fisiologiche, funzione delle cellule endoteliali in presenza di diverse condizioni di sollecitazione di taglio. Così, l'applicazione delle condizioni di sollecitazione di taglio in modelli in vitro può fornire una maggiore visibilità sulle risposte endoteliali in vivo. La camera di flusso parallelo-piastra precedentemente pubblicata da Lane et al. 9 è adattato per studiare la regolazione genica endoteliale in presenza ed assenza di flusso laminare (non pulsante) costante. Chiavi adattamenti in allestimento per flusso laminare come presentato qui includono un ambiente grande, dedicato ai circuiti di flusso simultaneo di casa, il monitoraggio delle portate in tempo reale e l'inclusione di un riferimento esogeno RNA per la normalizzazione della dati quantitativi di PCR in tempo reale. Per valutare più trattamenti/condizioni con l'applicazione della sollecitazione di taglio, più circuiti di flusso e pompe sono utilizzate contemporaneamente all'interno dell'incubatore stesso riscaldata e umidificata. La portata di ogni circuito di flusso è misurata continuamente in tempo reale per standardizzare le condizioni di sollecitazione di taglio in tutto gli esperimenti. Perché questi esperimenti hanno più condizioni, usiamo anche un RNA di riferimento esogeno è a spillo-al momento dell'estrazione del RNA per la normalizzazione di estrazione del RNA e l'efficienza di sintesi del cDNA del primo-filo. Questi passaggi di ridurre al minimo la variabilità tra i campioni. Questa strategia è impiegata nella nostra pipeline per l'analisi di espressione genica con esperimenti di sollecitazione di taglio utilizzando la camera di flusso parallelo-piastra, ma parti di questa strategia, come ad esempio l'esogeno fa riferimento spike-nel RNA, può facilmente e in modo conveniente essere usati per altre applicazioni.
Introduction
Le cellule endoteliali vascolari formano il rivestimento cellulare interno dei vasi sanguigni nel sistema cardiovascolare chiuso delle specie superiori. Essi formano l'interfaccia tra sangue e tessuti e sono caratterizzati da luminal e superfici abluminale. L'endotelio è un sistema diversificato, attivo e adattivo che regola il flusso sanguigno, traffico di sostanze nutritive, l'immunità e la crescita di nuovi vasi sanguigni1. Nel corpo, le cellule endoteliali presenti normalmente in un ambiente dove sono esposti per la forza di attrito della circolazione, sollecitazione di taglio2. Sollecitazione di taglio è un regolatore importante di cellule endoteliali gene expression3e cellule endoteliali tentano di mantenere la sollecitazione di taglio all'interno di un determinato intervallo2,4. Cellule endoteliali dimostrano angiogenici patterning in assenza di sollecitazione di taglio5 che possono migliorare la perfusione tissutale. Modelli regionali di flusso disturbato e alterato shear stress sono associati con l'espressione di geni infiammatori6 e lo sviluppo di aterosclerosi7,8. Così, modelli che includono la sollecitazione di taglio sono una componente importante di comprensione regolazione genica endoteliale.
Descriviamo un metodo per lo studio della regolazione genica in cellule endoteliali vascolari sotto sollecitazione di taglio. Questo sistema utilizza flusso non pulsante e imita i livelli di fluido shear stress e concentrazione di ossigeno che condizioni di modello per cellule endoteliali arteriose. Questo protocollo include dettagli dei metodi per l'atterramento di gene usando RNA interference (RNAi), il set-up per l'applicazione della sollecitazione di taglio utilizzando l'apparato di flusso parallelo-piastra e metodi per lo spike-in di un riferimento esogeno RNA prima dell'analisi di reazione a catena della polimerasi quantitativa della trascrittasi inversa (RT-qPCR). Questa pipeline viene utilizzata per lo studio della regolazione genica in cellule endoteliali in presenza ed assenza di sollecitazione di taglio laminare e include un adattamento dell'apparato parallelo-piastra flusso descritto da Lane et al. 9. questo particolare set-up è stato progettato per facilitare la valutazione simultanea di più condizioni sperimentali che permette un confronto diretto delle condizioni di sollecitazione di taglio, così come la normalizzazione dell'analisi di RNA. Una grande unità riscaldata con umidità controllata viene utilizzata per consentire più flusso separato e le pompe in esecuzione contemporaneamente con portate monitorate per ogni assembly di camera di flusso in tempo reale. Viene utilizzata l'applicazione di questo set-up per atterramento di gene usando RNAi nella regolazione del flusso laminare/shear stress, ma gli aspetti di questo protocollo possono essere applicati a qualsiasi valutazione di espressione di RNA.
Approcci comuni per l'applicazione della sollecitazione di taglio per le cellule endoteliali sono di sistemi microfluidici10, un viscosimetro cono e piastra11e un flusso parallelo-piastra camera12. Sistemi microfluidici da vari produttori sono state utili nello studio mechanobiology e mechanotransduction in cella multipli e tipi di tessuto e una varietà di stimoli biofisici. Per le cellule endoteliali, essi sono stati utilizzati per studiare le cellule endoteliali in isolamento, come pure l'interazione delle cellule endoteliali e la tratta di cellule immunitarie o tumore10. Tuttavia, questi sistemi sono meno adatti per il recupero di un gran numero di cellule9. Camere a flusso parallelo-piastra sia il viscosimetro cono e piastra permettono il recupero di un gran numero di cellule in monostrati confluenti12. Questi sistemi possono generare una gamma di modelli e forze di taglio12. Il flusso parallelo-piastra camera Assemblea9 ha il vantaggio che la formazione immagine in tempo reale possono essere eseguite tramite la finestra di vetro per valutare la morfologia cellulare in qualsiasi momento. Inoltre, il perfusato possa essere raccolti in condizioni sterili. Per il sistema presentato qui, il flusso può anche essere monitorato in tempo reale e in un set-up del multi-alloggiamento, che facilita il mantenimento di condizioni di taglio tra le camere.
Per esperimenti di rappresentanza, cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVEC), che rappresentano un tipo di cellula endoteliale macrovascular, sono utilizzate, e le condizioni di sollecitazione di taglio usiamo (1 Pa) riflettono condizioni arteriose (0.1 - 0.7 Pa). Tuttavia, questo protocollo può essere usato con altri tipi di cellule endoteliali e le condizioni di sollecitazione di taglio possono essere regolate secondo la questione sperimentale. Ad esempio, la valutazione delle cellule endoteliali umane in condizioni che modellano la circolazione venosa richiederebbe più bassi livelli di sollecitazione di taglio (1-6 Pa) e studi che modellano la circolazione microvascolare hanno utilizzato i livelli di sollecitazione di taglio di 0.4 - 1.2 Pa13 , 14. Inoltre, la sollecitazione di taglio può variare anche tra cellule endoteliali all'interno del vaso sanguigno stesso6. Nell'attuale assetto, viene utilizzato un singolo sistema di monitoraggio che possono monitorare contemporaneamente quattro anelli di flusso separato. Per i laboratori che hanno bisogno di più cicli di flusso, c'è spazio nell'ambiente dedicato per un sistema di monitoraggio aggiuntivo.
RT-qPCR viene utilizzata per la quantificazione assoluta di espressione genica nella cornice della sollecitazione di taglio. L'espressione relativa dei geni target viene spesso utilizzato per confrontare l'espressione del RNA in condizioni. Alcune specie di RNA può trovarsi in quantità molto basse o essere assente, complicando così misure relative. Ad esempio, lungo non codificanti RNA nelle cellule endoteliali possa esercitare effetti potenti a numeri di copia relativamente basso per ogni cella5. Inoltre, le differenze di rendimento primer possono portare a un'interpretazione inesatta da utilizzando il metodo di delta-delta ciclo soglia (Ct) per analizzare i dati. Per risolvere questo problema, eseguiamo la quantificazione assoluta generando una curva standard usando una quantità nota di DNA plasmidico. Inoltre, complementari sintesi di DNA (cDNA) sono un processo inefficiente, e le differenze di rendimento di cDNA possono tenere conto delle differenze nell'espressione di RNA tra condizioni e tra campioni15. L'applicazione della sollecitazione di taglio e/o reagenti di transfezione può influenzare la vitalità, apoptosi e proliferazione delle cellule, o aggiungere componenti che potrebbero interferire con la sintesi di RNA isolamento e/o cDNA. Per tenere conto la possibilità di polarizzazione da isolamento del RNA e la sintesi di cDNA, usiamo un spike-in RNA controllo sintetizzato in laboratorio, aggiunto al momento dell'estrazione del RNA e misurato con ogni cDNA sintesi tramite RT-qPCR. Questo consente non solo l'adeguamento tecnico differenze nella sintesi di estrazione e cDNA RNA ma consente anche il calcolo delle quantità assolute per cella, quando è noto il numero di celle.
Questo sistema utilizza ulteriori passaggi per mantenere similitudini o tenere conto delle differenze tecniche tra le condizioni. In particolare sottolineiamo questi passi a causa della natura complessa di questi esperimenti, che coinvolgono molteplici configurazioni fisiche e condizioni sperimentali che possono condurre alla variabilità sperimentale.
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Protocol
1. preparazione di riferimento esogeno RNA
Nota: Scegliere un riferimento esogeno RNA che non esiste nella specie o modello di interesse. Per sistemi mammiferi, luciferasi firefly RNA possono essere utilizzato.
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Linearizzazione del plasmide esogeno riferimento RNA
- Preparare esogeno riferimento RNA almeno 48 h prima dell'estrazione di RNA atteso. Ottenere o produrre un clone di cDNA del riferimento esogeno selezionato RNA, come un clone di firefly luciferase cDNA in un vettore plasmidico appropriato per trascrizione in vitro (Vedi Tabella materiali).
- Eseguire la digestione degli enzimi di limitazione (RE) di 1 µ g del plasmide Full-Length (il plasmide di luciferasi firefly è pSP-luc + che ha 4100 bp) con single-cutter RE (XhoI) in provette da 1,5 mL microfuge. Scegliere un RE che è un taglio singolo (tagli plasmide solo 1x) all'estremità 3' del riferimento esogeno sequenza di RNA che lascia un 5' sporgenza o estremità smussata. Per una preparazione tipica, è possibile eseguire reazioni di sette plasmide linearizzazione (passaggi 1.1.4 - 1.1.7) in parallelo per generare sufficiente concentrazione di RNA e quantità per completare un set di esperimenti o un progetto.
- Misurare la concentrazione di plasmide mediante spettrofotometria o spettrofluorometria.
- Preparare una miscela RE in ogni tubo: 4 µ l di XhoI (20.000 unità/mL), 8 µ l di RE buffer, x µL di plasmide (1 µ g) e sufficiente H2O per raggiungere una soluzione totale di 80 µ l.
- Incubare la miscela RE per 2 ore a 37 ° C. Utilizzare il RE secondo il protocollo del produttore, in quanto eventuali modifiche possono provocare una maggiore attività della stella o aspecifici clivaggio del DNA bersaglio. Inattivare con il calore la miscela di reazione per 20 min a 65 ° C.
- Terminare il digest RE con precipitazione dell'etanolo in ogni provetta. Il mix RE, direttamente aggiungere 4 µ l di 0,5 M EDTA, pH 8.0, 8 µ l di 3 M sodio acetato a pH 5.2 e 184 µ l di etanolo al 100%. Mescolare bene e congelare la miscela a-20 ° C per 30 min.
- Rotazione verso il basso la miscela a 4 ° C per 20 min a una forza centrifuga relativa (RCF) di 16.100 x g.
- Rimuovere il surnatante con una punta fine, senza toccare il pellet. Asciugare il pellet per 5 min e risospendere in 6 µ l di H2O (riscaldato a 37 ° C) pipettando su e giù per 5x - 10x.
- Confermare la linearizzazione del plasmide luciferasi eseguendo il prodotto digerito su gel di agarosio al 2% contenente etidio bromuro (EtBr) insieme a una scala di 1 kb +, una scaletta supercoiled e taglio e plasmide non tagliato. Ispezionare il gel e procedere con la trascrizione in vitro se la corsia per il plasmide tagliato Mostra una singola banda a ~ 4 kb (il plasmide non tagliato avrà tre bande; Figura 1).
Attenzione: EtBr è cancerogeno. Lavorare in una cappa chimica.
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In trascrizione in vitro del plasmide esogeno riferimento RNA
- Per ogni provetta di prodotti plasmidico digerito, eseguire la trascrizione in vitro utilizzando un metodo di trascrizione in vitro (Vedi Tabella materiali). Seguire le istruzioni del produttore e utilizzare il fago appropriato RNA polimerasi. Se il metodo di sintesi del cDNA richiede una coda di poli (a), o altre applicazioni richiedono una coda di poli (a), scegliere un metodo di trascrizione in vitro che include un'aggiunta di coda di poli (a) (Vedi Tabella materiali).
- Combinare tutti in vitro trascritto prodotti in un unico tubo in polipropilene 1,5 mL prima della purificazione.
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Purif icazione di RNA dalla reazione di trascrizione in vitro
- Purificare in vitro trascritto prodotti con un in vitro trascrizione pulizia kit (Vedi Tabella materiali). Si prega di seguire il protocollo del produttore.
- Valutare la concentrazione di RNA misurando l'assorbanza a 260 nm usando spettrofotometria.
Nota: La concentrazione di RNA viene calcolata utilizzando la legge di Lambert-Beer. Questo afferma che la capacità di assorbimento degli acidi nucleici (che assorbono la luce fortemente a 260 nm) è proporzionale alla concentrazione. Un'assorbanza di 1.0 è pari a 40 µ g/mL di singoli filamenti di RNA.
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Aliquotare il brodo RNA in PCR provette per uso sperimentale
- Garantire che la concentrazione di RNA è di 1 µ g / µ l.
- Se la concentrazione di RNA è > 1 µ g / µ l, diluire il brodo a 1 µ g / µ l. aliquota 1 µ l in PCR tubi e conservarli a-80 ° C.
- Se la concentrazione di RNA è < 1 µ g / µ l, ulteriori precipitazioni utilizzando 5 M di acetato di ammonio (fornito nel kit) possono essere eseguita secondo il protocollo del produttore. Se la concentrazione di RNA è ancora < 1 µ g / µ l, procedere con aliquotare 1 µ l in provette per PCR.
- Garantire che la concentrazione di RNA è di 1 µ g / µ l.
2. far scorrere rivestimento
Nota: Procedura 2.1-2.10 dovrebbe essere eseguito 24-48 h prima la semina anticipata delle cellule.
- Preriscaldare il forno a 250 ° C.
- Utilizzando guanti sterili, avvolgere ogni vetrino 2 x con carta stagnola. Evitare di toccare direttamente la superficie della diapositiva.
- Cuocere le diapositive in forno per 1 ora a 250 ° C e lasciare raffreddare a temperatura ambiente i vetrini.
Nota: Questo passaggio è importante per la distruzione di qualsiasi contaminante dell'endotossina. - Mentre le diapositive sono raffreddamento, fare una soluzione stock di fibronectin di 1 mg/mL con acqua distillata e Incubare 30 min a 37 ° C per sciogliere. Rendere le aliquote 100-µ l. Mettere da parte le aliquote per un uso immediato e congelare le rimanenti aliquote per uso futuro.
- Scartare il rivestimento esterno del foglio di alluminio prima di mettere il vetrino in una biosicurezza armadietto. Eseguire passaggi 2.6-2.7 e 2.9 la cappa di biosicurezza.
- Inserire il vetrino in una piastra di coltura sterile cella 4 pozzetti rettangolare.
- Diluire la fibronectina soluzione madre 1: 100 con acqua distillata. Ricoprire ogni diapositiva con 1 mL di diluito fibronectina, goccia a goccia, utilizzando una pipetta. Assicurarsi che sia coperto l'intera diapositiva.
- Incubare i vetrini in un coltura tissutale incubatore a 37 ° C per 24-48 h.
- Dopo l'incubazione, aspirare la fibronectina inclinando la piastra di coltura delle cellule 4 pozzetti. Evitare di toccare la diapositiva direttamente con l'aspiratore.
3. semina su vetro cellulare scivola
- Contare le cellule endoteliali umane al primo passaggio (passaggio 2-5) e seme ~1.0 x 106 cellule su ogni lastra di vetro rivestite di fibronectina con 1 mL di media (1.0 x 106 supporti di cellule/mL). Se nessun altro trattamento deve essere eseguito il seeding le cellule 24h prima dell'applicazione anticipata del flusso laminare.
Nota: Questi numeri sono utilizzati come guida per esperimenti con 24h di flusso.- Regolare la densità di semina per ottenere un monostrato confluente di cellule al momento della raccolta delle cellule e di estrazione del RNA.
- Lasciate che le cellule aderiscono alla diapositiva per 15 min a 37 ° C.
- Aggiungere 3 mL di media in ciascun pozzetto della piastra di coltura cellulare per coprire la diapositiva e incubare le cellule a 37 ° C per 24 h con 5% CO2.
4. piccolo RNA interferenti (siRNA) transfezione
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Preparazione di cellule sulle lastre di vetro per esperimenti di transfezione e flusso di siRNA
- Seguire il protocollo nei passaggi 2 (rivestimento) e 3 (semina su vetrini cellulare) per la preparazione del vetrino vetro e rivestimento per esperimenti di flusso.
- Seme cellule 24 h prima del trattamento del siRNA (48h prima dell'applicazione del flusso laminare).
- Cellule endoteliali umane di seme in media senza antibiotico a 750.000 a 1 x 106 cellule per diapositiva per raggiungere 85% - 95% confluenza il giorno successivo.
Nota: HUVEC sono utilizzati nel presente protocollo.
-
Preparazione di complessi di reagente di transfezione di siRNA-lipido-basato (per vetrino)
- Design personalizzati siRNA o ordine preconfezionati siRNA per il gene di interesse desiderato.
Nota: Eseguire la procedura seguente in una cappa di biosicurezza. - Aggiungere 6 µ l di siRNA (stock 20 µM) in 414 µ l di siero riduttore terreno (Vedi Tabella materiali) e mescolare delicatamente pipettando.
- Diluire 49,5 µ l di reagente di transfezione delicatamente mista basata sui lipidi (Vedi Tabella materiali) a 130,5 µ l di siero riduttore terreno.
- Mescolare delicatamente e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Combinare diluito siRNAs e reagente di transfezione basata sui lipidi, mescolare delicatamente e incubare per 15 min a temperatura ambiente. Mescolare delicatamente per evitare perturbazioni dei complessi di reagente di transfezione basata sui lipidi.
Nota: È necessario che la soluzione venga nuvolosa come forma complessi. - Mentre si stanno formando complessi, rimuovere il mezzo di crescita e lavare le cellule 1 x con il mezzo di riduttore del siero.
- Aggiungere 2,4 mL di mezzo di riduttori del siero di ogni diapositiva.
- Aggiungere 600 µ l di complessi di reagente di transfezione di siRNA-lipido-based delicatamente misto a ogni piatto e rock la piastra avanti e indietro per mescolare. Garantire la concentrazione finale di siRNA è di 40 nM. Accertarsi che il vetrino sia completamente coperta.
- Incubare le cellule a 37 ° C per 4 h.
- Aggiungere 1 mL di coltura privo di antibiotici endoteliale delle cellule che contiene 3 x la normale concentrazione di siero bovino fetale (FBS) senza rimuovere la miscela di transfezione.
- Incubare le cellule a 37 ° C fino all'uso.
- Design personalizzati siRNA o ordine preconfezionati siRNA per il gene di interesse desiderato.
5. calcolo della portata basata sulla sollecitazione di taglio desiderata9
- Calcolare il tasso di flusso basato sulle sollecitazioni di taglio desiderate secondo la seguente equazione:
Qui,
Q è la portata in mL/min;
Τ è la sollecitazione di taglio desiderata dynes/cm2 (1 Pa = 10 dynes/cm2);
w è la larghezza della camera flusso parallelo-piastra in cm;
h è l'altezza della camera di flusso parallelo-piastra in cm;
µ è la viscosità dei media nel cP (g/cm·s).
Nota: Vengono condotti esperimenti di sollecitazione di taglio laminare tipico (non pulsante) in questo flusso di lavoro a τ = 1 Pa (10 dynes/cm2). µ può essere misurata con un viscosimetro ad esempio un viscosimetro cono e piastra e può variare in base al contenuto dei media tra cui il siero e destrano ulteriori9. - Per ottenere una specifica τ (shear stress), regolare la portata e/o la viscosità. Alle portate più elevate, le cellule aderenti possono dissociare dalla diapositiva. Portate con camere di flusso tipico per esempio sono riportate nella tabella 1.
6. messa a punto di un ambiente dedicato per il monitoraggio di sistema e più flusso parallelo-piastra Chambers (Figura 2)
- Utilizzare una grande unità/incubatrice riscaldata con le mensole, accesso interno dell'elettricità e porte in vetro — indicato come la spiaggia (built-in ambiente con regolabile CO2 ) e calore — per ospitare più camere di flusso simultaneamente per esperimenti che richiedono sia shear stress e confronto diretto tra due o più trattamenti o uscite (cioè, DNA, RNA e proteine).
Nota: La spiaggia consente il monitoraggio frequente del circuito flusso, compreso il tasso di flusso, senza frequenti interruzioni dell'ambiente. - Garantire un'adeguata CO2 è disponibile per l'esperimento e che il CO2 monitor è funzionale. Garantire la vaschetta dell'acqua è riempita in modo appropriato, tale che non ci sarà aria umidificata.
7. messa a punto dell'apparato di flusso parallelo-piastra
Nota: Per la produzione di piastre parallele, vedere Lane et al. 9.
- Autoclave il flusso dell'alloggiamento piastre, serbatoio, ammortizzatore, tubature e Luers per ogni set-up del camera di flusso parallelo-piastra come indicato nella tabella 2.
-
Set-up dell'Assemblea di ciclo di flusso (Figura 3).
- Collocare gli asciugamani sterili sulla sicurezza biologica armadio. Assemblare il sistema del ciclo di flusso, in primo luogo senza la camera di flusso parallelo-piastra, nell'armadietto di sicurezza biologica.
- Collegare il gruppo del tubo per il serbatoio:
- Inserire un tubo duro #14 in un foro e due #14 tubi molli negli altri due fori nel tappo del serbatoio flusso. Assicurarsi che uno dei tubi morbidi tocchi il fondo del serbatoio come tubazione di deflusso .
- Posizionare un 1/16" maschio Luer all'estremità del 14 # rigido tubo e montare un filtro sterile come un aeratore.
- Posizionare un 1/16" femmina Luer all'estremità del #14 morbido afflusso tubo, proveniente dal serbatoio e allegare un rubinetto a 4 vie.
Nota: Per analisi di espressione genica o altri studi dove perfusati non devono essere raccolti, rubinetti 2 vie possono essere utilizzati invece di rubinetti a 4 vie in questo protocollo. - Posizionare un 1/16" maschio Luer all'estremità del tubo di deflusso morbido #14, proveniente dal serbatoio.
- Collegare il tubo di deflusso del serbatoio al tubo della pompa: posizionare un 1/16" femmina Luer a ciascuna estremità di un tubo rigido #13 (tubazione della pompa). Collegare il tubo di efflusso morbido #14 dal serbatoio al tubo rigido #13 collegando 1/16" Luer maschio e femmina insieme.
- Collegare il tubo della pompa con la tubazione di 'ponte di smorzamento': posizionare un 1/8" maschio Luer e un 1/8" femmina Luer a ciascuna estremità di un tubo morbido #16. Collegare il 1/16" femmina Luer del tubo rigido #13 (all'estremità di uscita del tubo pompa) con 1/8" maschio Luer del tubo morbido #16.
- Montare il tubo per l'ammortizzatore di flusso: posizionare un 3/16" Luer maschio ad una estremità del tubo morbido #25 e ripetere l'operazione per l'altro lato dell'ammortizzatore di flusso. Collegare le estremità libere dei tubi morbidi #25 su ciascun lato dell'ammortizzatore di flusso.
- Collegare il tubo di 'ponte di smorzamento' con la tubazione per l'ammortizzatore di flusso: collegare un tubo morbido #25 dall'ammortizzatore di flusso con il tubo molle #16 del 'ponte ammortizzatore' usando i 1/8" femmina Luer dal lato #16 'ponte smorza' e il già inserito 3/16" Luer maschio dal lato tubo morbido ammortizzatore #25.
- Assemblare tubi 'ponte camera':
- Posizionare un 1/8" femmina Luer e un 1/8" maschio Luer a ciascuna estremità di un tubo morbido #16 ('ponte camera' della tubazione).
- Collegare il 1/8" femmina Luer del 'ponte camera' con 3/16" Luer maschio al #25 tubo morbido dall'estremità libera dell'ammortizzatore di flusso.
- A 1/8" maschio Luer (estremità libera) del tubo 'ponte camera', posto un rubinetto a 4 vie.
- Collegare il rubinetto a 4 vie dall'estremità libera del 'ponte camera' al rubinetto a 4 vie dal tubo serbatoio afflusso morbido (dal passaggio 7.2.2.3). Chiudere il rubinetto di arresto.
- Aggiungi media al serbatoio e smorzamento. Per l'esposizione di 48 h per shear stress, aggiungere 35 mL di media per il serbatoio e 25 mL e l'ammortizzatore. Regolare il volume dei mezzi di comunicazione basati sulla durata dell'esperimento flusso e il numero delle cellule seminate.
- Portare il sistema a circuito flusso assemblato alla pompa in spiaggia. Inserire il tubo rigido #13 (tubazione della pompa) la testa della pompa e fissarlo. Aprire il rubinetto di arresto.
- Accendere la pompa e aumentare lentamente la velocità della pompa. Lasciate che i media circolare attraverso il sistema a circuito. Verificare eventuali perdite o blocco (ad esempio, aumento della pressione). Assicurare che i media sta fluendo indietro al serbatoio.
-
Set-up dell'Assemblea camera di flusso
- Posizionare un 1/8" attacco Luer femmina ad una estremità di un 16 # morbido tubo e collegare un rubinetto a 4 vie. Fissare l'estremità libera del tubo al lato destro della piastra superiore (lato diafflusso ).
- Posizionare un 1/8" Luer maschio ad una estremità di un 16 # morbido tubo e collegare un rubinetto a 4 vie. Fissare l'estremità libera del tubo al lato sinistro della piastra superiore (lato diuscita ).
- Posizionare un 1/8" maschio Luer e un 1/8" femmina Luer a ciascuna estremità di un tubo morbido #16 (bubble trappola della tubazione). Collegare il tubo alla bolla trappola via 1/8" maschio Luer. Collegare un rubinetto a 4 vie per l'altra estremità della tubazione tramite il 1/8" femmina Luer.
- Utilizzando pinzette sterili, trasferire il vetrino cella-seminato dalla piastra di coltura delle cellule 4 pozzetti nella nicchia sulla piastra inferiore. Garantire che il lato cella-seminato del vetrino è rivolto verso l'alto.
- Usando una siringa 10 mL, aggiungere 10 mL di caldo media alla piastra inferiore all'interno della linea rossa guarnizione intorno alla piastra. Lasciare che i supporti a fluire attraverso il vetrino e coprire le cellule. Evitare di aggiungere contenuti multimediali direttamente nella diapositiva.
- Posizionare delicatamente la piastra superiore sulla piastra inferiore, allineando da un lato a altro. Evitare l'introduzione di bolle d'aria. Avvitare insieme le piastre.
- Rimuovere le bolle d'aria dalla trappola bolla aprendo il rubinetto sul lato destro (afflusso) della piastra e lavando delicatamente 20 mL di caldo usando una siringa da 30 mL. Assicurarsi che il rubinetto di arresto sul lato sinistro (deflusso) della piastra è chiuso e che i media è che fluisce attraverso il rubinetto di arresto per la trappola della bolla (aperto). Scartare i media arrossati.
- Chiudere il rubinetto di intercettazione sulla trappola bolla e aprire il rubinetto sul lato sinistro (deflusso) della camera. Elevare il lato sinistro (deflusso) della camera ad un angolo di 45° e lavare delicatamente 20 mL di caldo usando una siringa da 30 mL dal lato destro (afflusso) della camera per rimuovere le bolle d'aria dalla camera. Le bolle possono essere visualizzate attraverso la finestra. Scartare i media arrossati.
- Chiudere il rubinetto di arresto su entrambi i lati di sezione e tappo. Ispezionare le cellule da microscopia.
- Trasporti della camera alla spiaggia con il sistema a ciclo precedentemente assemblato.
- Lentamente diminuire la velocità della pompa e mettere in pausa la pompa. Chiudere il rubinetto di arresto del sistema di ciclo di flusso per evitare perdite.
- Collegare la camera e loop sistema insieme tramite rubinetti di arresto. Aprire tutti i rubinetti di arresto.
- Lentamente aumentare la velocità della pompa ed esaminare il set-up per qualsiasi perdita o il blocco. Assicurare i mezzi di comunicazione circola in una sola direzione e restituisce al serbatoio.
- Posizionare il sensore di flusso del tubo di 'ponte camera' situato sul lato di afflusso della camera. Assicurarsi che il sensore sia orientato correttamente nella direzione del flusso.
- Regolare la velocità della pompa per ottenere la portata che è stata calcolata in precedenza, basato sulla sollecitazione di taglio desiderata.
Nota: La portata può variare a seconda l'altezza e la larghezza di ogni camera, così come la viscosità dei media. - Accendere il serbatoio di CO2 per raggiungere il 5% CO2 e inserire un vassoio di acqua all'interno della spiaggia.
8. la raccolta delle cellule ed estrazione di RNA da camera di flusso
- Una volta completato il periodo di tempo desiderato di flusso, lentamente abbassare la velocità della pompa peristaltica a 0 e disattivare l'alimentazione. Chiudere tutti i rubinetti di arresto aperte e si rimuove rapidamente la camera e il tubo collegato con un rubinetto su ciascuna estremità.
- Prendere la camera per un pulito benchtop e delicatamente Svitare tutte le viti per rimuovere la piastra superiore. Utilizzando una pinzetta becchi, togliere il vetrino dalla piastra inferiore e metterlo in un piatto di coltura del tessuto di diametro 100 mm.
- Lavare il vetrino con 10 mL di soluzione tampone fosfato (PBS)- / - e fredda e controllare le cellule al microscopio per confermare l'adesione delle cellule e l'allineamento in direzione del flusso.
- Aspirare il PBS dalla piastra e trasferire la diapositiva a un piatto di diametro 100mm pulito. Aggiungere 350 µ l di tampone di lisi dell'estrazione di RNA da kit (Vedi Tabella materiali), contenente 1/100 di beta-mercaptoetanolo, alla diapositiva.
Attenzione: Aggiungere beta-mercaptoetanolo in una cappa chimica. - Raschiare le cellule fuori della diapositiva utilizzando un raschietto di cella a pale in polietilene. Inclinare il piatto di coltura del tessuto, consentendo al liquido di piscina nella parte inferiore e rimuovere il vetrino con le pinzette. Pipettare la cella lysata in una provetta da 1,5 mL e tenerlo sul ghiaccio.
- Diluire il riferimento esogeno stock RNA (RNA di luciferasi) a 0,0025 ng / µ l attraverso diluizione seriale prima di aggiungerla al campione. Ad esempio, se la concentrazione di stock è di 1 µ g / µ l, è necessaria una diluizione di 1/400.000 per raggiungere 0,0025 ng / µ l. aggiungere 10 µ l di diluito luciferasi RNA ad ogni campione di lysate per isolamento del RNA a valle e l'analisi delle cellule.
- Procedere con il protocollo di estrazione di RNA secondo le istruzioni del produttore, o congelare il lisato a-80 ° C fino a quando non è in grado di procedere con l'estrazione.
9. calcolo dell'efficienza dell'estrazione di RNA e sintesi del cDNA
Nota: Calcolare l'efficienza di luciferasi dopo RT-qPCR confrontando il rendimento teorico e la resa sperimentale.
- Determinare il rendimento teorico per la luciferasi RNA.
- Determinare la quantità totale di luciferasi copie aggiunto per campione. (Aggiunta di 0,025 ng/campione = 2.73 x 107 copie di RNA di luciferase per campione prima dell'estrazione di RNA.)
- Calcolare la massa molecolare di luciferasi RNA utilizzando una massa molecolare media al nucleotide di 330 g/mol e moltiplicando la lunghezza della luciferasi di lucciola RNA, 1652 nucleotidi.
- Dividere l'importo della luciferasi RNA aggiunto (0,025 ng) per ogni campione prima dell'estrazione di RNA dalla massa molecolare per produrre la quantità molare. Quindi, moltiplicare per il numero di Avogadro per produrre le copie aggiunte per campione.
- Calcolare il rendimento teorico per le copie di luciferase per ciascuna reazione di RT-qPCR utilizzando l'equazione:
- Calcolare il rendimento sperimentale per le copie di luciferase per ciascuna reazione di RT-qPCR utilizzando il plasmide di luciferase per generare una curva standard per RT-qPCR.
- Calcolare l'efficienza di luciferasi (%) utilizzando l'equazione:
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Representative Results
Linearizzazione di successo del plasmide luciferasi usando gli enzimi di restrizione è stata confermata da prodotti digeriti in esecuzione su un gel di agarosio (Figura 1). La dimensione del prodotto linearizzato è stata confermata usando le scalette del DNA e dal confronto con il plasmide non tagliato.
Abbiamo adattato il set-up camera di flusso parallelo-piastra da Lane et al. 9 per gli esperimenti che richiedono condizioni/trattamenti multipli con sollecitazione di taglio o più condizioni di sollecitazione di taglio. Usiamo un ambiente dedicato, la spiaggia, che può ospitare multiplo, circuiti di flusso completamente assemblato che tutti hanno monitorato le portate (Figura 2). La portata è monitorata a monte dell'Assemblea parallelo-piastra (Figura 3). I circuiti di flusso e tariffe possono essere monitorate direttamente attraverso le porte di vetro senza causare fluttuazioni di temperatura, umidità o gas contenuto all'interno di spiagge.
Processi di produzione possono portare a piccole variazioni in altezza della camera. Così, le portate devono essere calcolate per ogni camera raggiungere la stessa sollecitazione di taglio (tabella 1). In teoria, alloggiamenti con altezze identiche possono utilizzare portate identici per ottenere la stessa sollecitazione di taglio e possono essere utilizzati in serie. Tipici esperimenti con cellule endoteliali utilizzano sollecitazione di taglio 0 - 1,5 PA. laminare sollecitazione di taglio di 1 Pa è stato utilizzato in questo flusso di lavoro alla sollecitazione di taglio endoteliale arteriosa di modello. Possono esserci anche varianti tra le impostazioni testa della pompa e all'interno di teste della pompa nel tempo con l'uso. Utilizzando il misuratore di portata può spiegare queste differenze.
Esperimenti utilizzando l'applicazione della sollecitazione di taglio spesso coinvolgono molteplici condizioni di shear stress, condizioni di trattamento e punti di tempo. Dove possibile, utilizziamo un riferimento endogeno RNA all'account per qualsiasi variabilities in disposizione sperimentale. Per alcuni esperimenti, trovare un RNA di riferimento endogeno con stabilità quantitativa non è fattibile16. Inoltre, quantitativa stabilità o instabilità di geni endogeni riferimento tra campioni può essere attribuito a entrambi effetti di stimolo-dipendente sui livelli di espressione cellulare o variazioni nelle efficienze di estrazioni RNA o trascrizione inversa. Per tenere conto di queste inefficienze e nella cornice dove un gene di riferimento endogeno non è quantitativamente stabile, usiamo un gene di riferimento esogeno spike. Per gli esperimenti che incorporano laminare shear stress nelle cellule endoteliali dei mammiferi, usiamo una luciferasi di lucciola RNA come esogeno RNA spike-in (Figura 4A).
La figura 4 Mostra dati sperimentali RT-qPCR analizzati dagli esperimenti di shear stress valutazione Krüppel-come il fattore 2 (KLF2) perdita di funzione utilizzando siRNA. KLF2 è un aumentata di fattore di trascrizione di flusso laminare in cellule endoteliali e un mediatore importante trascrizionale dell'espressione genica endoteliale nella regolazione di flusso laminare2.
Figura 4A Mostra efficienze di luciferase per tre esperimenti separati, ognuno dei quali utilizza due alloggiamenti di flusso. Efficienze di luciferasi possono essere simili fra i campioni di un esperimento (esperimento 1) o mostrare alcune variabilità (esperimenti 2 e 3) (Figura 4A). Questi risultati sono particolarmente preziosi in sistemi sperimentali dove si vedono solo piccole variazioni assolute. L'uso di un gene di riferimento esogeno può essere particolarmente importante negli esperimenti dove trattamenti sperimentali possono interferire con l'efficienza di trascrizione inversa o PCR17. I risultati rappresentati in Figura 4A sono tipici. Un'efficienza di luciferasi del 5% indica che il 5% di luciferasi RNA (cioè, l'importo di partenza iniziale di RNA) aggiunto al campione prima dell'estrazione di RNA viene rilevata da RT-qPCR. Tra i campioni o le condizioni all'interno di un singolo esperimento, luciferasi efficienze sono solitamente ± 50%. Risultati devono essere interpretati con cautela se la variabilità delle efficienze di luciferasi è > 50% e dovrebbe includere una revisione delle procedure sperimentali e condizioni.
Figura 4B Mostra tipici risultati sperimentali di RT-qPCR dagli esperimenti ripetuti sforzi tangenziali, ciascuno utilizzando più flusso parallelo-piastra camere. All'interno di ciascun esperimento, l'espressione del mRNA di KLF2 è normalizzato in tre modi. La normalizzazione prima utilizza un RNA di riferimento endogeno, ciclofilina A (CycA). La normalizzazione seconda utilizza un RNA di riferimento esogeno, luciferasi di lucciola (Luc). La normalizzazione terza utilizza sia il riferimento endogeno ed esogeno RNA. All'interno di ogni esperimento mostrato in Figura 4B, tutti i tre metodi di normalizzazione (normalizzazione del gene di riferimento endogeno, il gene di riferimento esogeno e entrambi i geni endogeni ed esogeni riferimento insieme) produce risultati simili. Se il metodo di normalizzazione cambia in modo significativo i risultati (ad es., conduce a > 50% di differenza), i risultati devono essere interpretati con cautela. Quando c'è una considerevole variabilità tra i metodi di normalizzazione, i geni endogeni di riferimento dovrebbero essere rivisti, come può essere una variabile dipendente del sistema sperimentale. Allo stesso modo, le procedure sperimentali e condizioni dovrebbero essere rivisti. In Figura 4B, KLF2 atterramento utilizzando siRNA cede atterramento simile efficienza tra tre esperimenti separati (esperimento 1, 2 e 3). Abbiamo usato tre distinti campioni biologici per questi esperimenti, usando due alloggiamenti di flusso contemporaneamente in esecuzione con sollecitazione di taglio a 1 Pa per ogni esperimento.
Figura 1: immagine di gel di agarosio di linearizzazione del plasmide esogeno luciferasi. Scale del DNA supercoiled e 1 kb + sono usate come indicatori per determinare entrambi uncut e tagliare luciferasi dimensioni plasmide in kilobasi (kb). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Panoramica schematica del più assembly di circuito di flusso all'interno di un ambiente dedicato (sulla spiaggia). La velocità di flusso in entrambi i circuiti di flusso sono facilmente monitorato in tempo reale, senza disturbare l'ambiente ed entrambi i circuiti possono essere eseguiti simultaneamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: descrizione schematica di un'Assemblea di circuito di flusso singolo. I formati della tubazione e Luers utilizzati sono indicati in questa figura. Assicurarsi che il misuratore di portata è orientato nella direzione del flusso e posto a Monte della sezione di flusso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: rappresentante risultati dagli esperimenti di perdita-de-funzione di KLF2 in cellule endoteliali umane esposte per lo sforzo di taglio (1 Pa) per 24 h. (A), questo pannello mostra la quantificazione della luciferasi esogeno RNA in tre esperimenti di flusso separato. Efficienze di luciferasi possono essere simili fra i campioni di un esperimento (esperimento 1) o mostrare alcune variabilità (esperimenti 2 e 3). Luciferase (assolute copie) è il numero di copie della luciferasi RNA rilevato mediante PCR quantitativa della trascrittasi inversa (RT-qPCR) dalla quantificazione assoluta utilizzando una curva standard. Luciferase efficienza è le copie di luciferasi sperimentale divise per le copie di luciferasi teorica per ciascun campione moltiplicata per 100 (Vedi punto 8 del protocollo). Luciferasi relativa efficienza è l'efficienza di luciferasi di ciascun campione diviso per la condizione di riferimento (flusso + Ctlsi) all'interno di ogni esperimento. (B) questi pannelli mostrano la normalizzazione dell'espressione genica in un insieme di sollecitazione di taglio di campione esperimenti utilizzando entrambi i geni endogeni ed esogeni di riferimento. I risultati sono da PCR quantitativa della trascrittasi inversa (RT-qPCR). Atterramento di espressione del mRNA di KLF2 è indicato in presenza di flusso laminare con sollecitazione di taglio di 1 Pa per 24 h. FC = cambiamento di piega; CycA = ciclofilina A, utilizzato come riferimento endogeno RNA; Luc = luciferasi, utilizzato come riferimento esogeno RNA. I dati adattati da uomo et al. 5. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Altezza della camera (micron; µm) |
Ampiezza della camera (centimetri; cm) |
Portata (mL/min) per 1 Pa shear stress | Viscosità (centipoise; cP) |
| 303.80 | 1.90 | 19,48 | 0.90 |
| 326.10 | 1.90 | ore 22.45 | 0.90 |
| 344.84 | 1.90 | 25.10 | 0.90 |
| 319.06 | 1.90 | 21,49 | 0.90 |
Tabella 1: Alloggiamento altezze ed esempi delle portate per le varie camere di flusso raggiungere la sollecitazione di taglio di 1 PA.
| Panni di J |
| Pinzette |
| Tappo e bottiglia serbatoio |
| Smorzamento e Cap |
| Ciclo di flusso |
| 1/16" Luer maschio x 3 |
| 1/16" femmina Luer x 3 |
| 1/8" maschio Luer x 2 |
| 1/8" femmina Luer x 4 |
| Raccordo maschio da 3/16" x 2 |
| 14 L/S Hard Tube (2 pollici) x 1 |
| 14 L/S tubo morbido (5 pollici) x 2 |
| 16 L/S tubo morbido (3 pollici) x 2 |
| 25 tubo morbido L/S (3 pollici) x 2 |
| 13 L/S Hard Tube (10 pollici) x 1 |
| Camera di flusso |
| 1/8" maschio Luer x 2 |
| 1/8" femmina Luer x 2 |
| 16 L/S tubo morbido (3 pollici) x 3 |
| Superiore e piastre inferiori |
| Viti |
Tabella 2: Parti per essere sterilizzato nell'autoclave al punto 6.2 del protocollo.
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Discussion
Sollecitazione di taglio è una condizione fisiologica che modula la funzione endoteliale, in parte, colpendo allo steady-state gene expression2,5. Modelli di regolazione genica in diverse condizioni di sollecitazione di taglio contribuirà ad una maggiore comprensione della funzione endoteliale. Questo flusso di lavoro pragmatico include un circuito di flusso utilizzando una camera di flusso parallelo-piastra adattata da Lane et al. 9 e rappresenta il flusso laminare, non pulsante. L'impostazione complessiva delle attività è stato progettato per facilitare esperimenti che richiedono più alloggiamenti di flusso e ridurre al minimo la variabilità sperimentale in questa impostazione.
L'Assemblea del circuito di flusso è una componente importante del flusso di lavoro ed è adattato da Lane et al. 9. diversi adattamenti di questa Assemblea e il protocollo sono state fatte per rispecchiare le differenze nei sistemi sperimentali. Una grande unità riscaldata, la spiaggia, è un adattamento che facilita il funzionamento simultaneo e il monitoraggio di diversi circuiti di flusso all'interno dell'ambiente stesso. Questo sistema è stato utilizzato con successo per l'applicazione della sollecitazione di taglio alle cellule endoteliali per vari periodi di tempo, da 1 h a 7 giorni e a diversi livelli di sollecitazione di taglio (ad es., 1.0, 1.5 e 2.0 Pa). Questo sistema è stato utilizzato anche per gli studi di atterramento di gene per valutare la funzione di un gene endoteliale flusso-sensible a reagire nella cornice della sollecitazione di taglio (Figura 4)5. C'è una considerevole variabilità tra pompe e teste della pompa, che possono anche cambiare nel tempo a causa della normale usura. Per tenere conto di queste differenze, usiamo un sensore di flusso trova prossimale alla camera di flusso per monitorare continuamente le portate. Varie dimensioni dei tubi e Luers sono utilizzati per garantire una perfetta aderenza per ogni componente e per prevenire eventuali perdite durante gli esperimenti. Abbiamo contato le cellule e seminato circa 1.000.000 cellule per vetrino, goccia a goccia e poi lasciare che le celle Incubare a 37 ° C per 15 min aumentare l'efficienza di aderenza. Rispetto alle cellule progenitrici endoteliali, che possono essere seminate per un breve periodo prima dell'applicazione della sollecitazione di taglio9, seminiamo cellule endoteliali umane per almeno 24h prima dell'applicazione della sollecitazione di taglio. Durate più brevi possono portare a sloggiare delle cellule durante il flusso, o uno strato discontinuo delle cellule endoteliali, anche con la densità di semina appropriata. Sottolineiamo l'ispezione delle diapositive per un monostrato confluente di cellule endoteliali sia prima che dopo l'applicazione della sollecitazione di taglio. Troviamo che scivoli ricoperte di fibronectina, un componente naturale della matrice extracellulare18, mantengano il monostrato endoteliale più coerente rispetto ai lati rivestiti con gelatina (denaturato fibrillare del collagene di tipo I). Infine, gli smorzatori di flusso in questo protocollo sono ottimizzati per utilizzare 30 mL di mezzi di comunicazione, rispetto ai 190 mL di media per gli altri fabbricanti.
Diversi passaggi in Assemblea del circuito di flusso richiedono ulteriori cure. Occorre istituire un anche monostrato di cellule endoteliali prima dell'applicazione della sollecitazione di taglio. È importante per cellule di seme sul vetrino goccia a goccia per aumentare il numero delle cellule che aderiscono alla diapositiva e, quindi, la copertura complessiva di diapositiva. Il tempo di attesa tra cellula semina e l'aggiunta di ulteriori supporti alla diapositiva generalmente migliora l'efficienza semina come esso fornisce sufficiente tempo per cellule di aderire alla diapositiva anziché essere spazzati via nel vassoio multi-slide. Ispezionare visivamente le cellule prima, durante e dopo l'applicazione della sollecitazione di taglio. Un microscopio può essere messo in spiaggia per questo scopo. Il sensore di flusso deve essere collegato con l'orientamento corretto e la velocità di flusso di destinazione deve essere controllata per ogni camera di flusso individuale. Il sistema di ciclo di flusso dovrebbe essere irrorato senza la camera affinché nessuna perdita di media o altri problemi, come accumulo di pressione, per evitare di perturbare le cellule durante gli esperimenti reali. Ispezionare ed eliminare le bolle nel sistema. Durante il test il sistema di ciclo di flusso, garantire che il rubinetto di arresto è tutti aperti prima di accendere la pompa peristaltica per consentire il flusso ininterrotto, unidirezionale. Assicurarsi che tutti i rubinetti sono chiuse prima di fissare la camera di flusso per il ciclo e completamente aperta prima di riavviare la pompa.
Troviamo che l'aggiunta di un gene di riferimento esogeno è disponibile in una varietà di scenari. Media delle cellule endoteliali spesso contiene eparina, che è un inibitore di PCR17. Mentre alcuni protocolli di estrazione di RNA incorporano procedura per rimuovere l'eparina, tracce possono causare differenze nelle efficienze PCR tra campioni. Trattamenti potenti possono anche precludere l'identificazione di un gene di riferimento endogeno che è quantitativamente stabile. Il nostro laboratorio ha creato un efficiente protocollo per sintetizzare il RNA 5'-ricoperto e poli-A-tailed luciferasi per uso come un RNA di riferimento esogeno. Questa strategia ha dimostrato di essere un approccio conveniente rispetto all'acquisto di un RNA commercialmente disponibile. Durante la preparazione di riferimento esogeno RNA, è importante aliquota RNA in aliquote monouso per evitare più cicli di gelo-disgelo. Accurata miscelazione e pipettaggio accurata sono fondamentali per mantenere coerenza Inter-aliquota. Tipici esperimenti mostrano un'efficienza di luciferasi nella gamma di 5% ± 2,5% ma possono variare da 1-10%. È prudente correggere RT-qPCR risultati per l'efficienza di riferimento esogeno RNA sia un gene di riferimento endogeno (giornaliere).
Per gli esperimenti che conduciamo, firefly luciferase sequenze vengono utilizzate come mammiferi spike-in riferimento RNA in modelli mammiferi. Negli esperimenti dove luciferasi firefly sono espressa nelle cellule, questo non sarebbe un gene di riferimento appropriato. Possono essere utilizzati altri geni di riferimento specie-specifici, tra cui il Caenorhabditis elegans miRNA cel-miR-3919 e ribulosio bisfosfato carbossilasi pianta RNA20.
Questo circuito di flusso modelli un 2-D monostrato di cellule endoteliali coltivate su coltura del tessuto di plastica o vetro, che è abbastanza rigido. Rigidità di matrice possono influenzare la risposta endoteliale a sollecitazione di taglio fluido21. Questo sistema modello utilizza una concentrazione di ossigeno relativamente elevata più simile a arterioso che concentrazioni ossigeno venoso. Questo modello strettamente assomiglia a segmenti retti di più grandi vasi in un sistema cardiovascolare chiuso e fornisce un ambiente relativamente omogeneo per le cellule endoteliali sulla diapositiva. Altre condizioni specifiche nelle strutture 3-d, come biforcazioni o curvature dei vasi, non sono rappresentati con questo modello. Altri sistemi possono modellare altri schemi di flusso, compresi quelli nelle regioni curve del vasculature, ma resa meno cellule rispetto al sistema descritto in questo protocollo. Allo stesso modo, altri assembly potrebbe essere più appropriato se > 1 x 106 celle sono necessari, o se è richiesta un'analisi unicellulare. La nostra applicazione corrente modelli non-pulsante a flusso laminare. Ancora, questo modello può essere utilizzato per generare altre forme d'onda, tra cui forme d'onda pulsatile o oscillatorie, con coerenza, come le portate sono monitorate in continuo.
Nel complesso, questo flusso di lavoro pragmatico fornisce un sistema per l'applicazione simultanea di sollecitazione di taglio multiple nelle stanze di flusso con velocità di flusso monitorato. Materiali e procedure in tutto questo flusso di lavoro sono progettate per ridurre al minimo la variabilità sperimentale tra campioni e condizioni. Questo flusso di lavoro è stato utilizzato con successo per gli esperimenti di RNAi nella regolazione del flusso laminare e può essere utilizzato anche per eventuali esperimenti che richiedono più condizioni con laminar shear stress, o più grandezze di laminare shear stress e/o punti di tempo, tra cui forme d'onda alternative.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da CIHR MOP 142307 a P.A.M. H.S.J.M. è un destinatario di un canadese istituti di salute ricerca formazione programma in compagnia di medicina rigenerativa. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. e M.K.D. sono destinatari delle Queen Elizabeth II laurea Borse di studio nella scienza e nella tecnologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
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