Summary
כאן מוצג זרימת עבודה עבור ניתוח ביטוי תרבות, גנים של תאי אנדותל תחת גזירה נוזלים. כלול הוא סידור הפיזי בו זמנית דיור וניטור צ'יימברס מרובים זרימה בסביבה מבוקרת, את השימוש RNA אקסוגני עזר עבור ה-PCR כמותי.
Abstract
אנו מתארים זרימת עבודה עבור הניתוח של ביטוי גנים מתאי אנדותל בכפוף זרימה שכבתית קבועה באמצעות תאי זרימה במקביל-plate בפיקוח מרובים. תאי אנדותל ליצור תאי הציפוי הפנימי של כלי הדם, באופן כרוני חשופים לכוח חיכוך של זרימת הדם הנקרא גזירה. בתנאים פיזיולוגיים, תאי אנדותל פונקציה בנוכחות גזירה לתנאים שונים. לפיכך, היישום של גזירה תנאים במבחנה במודלים יכול לספק תובנות רבות יותר על תגובות אנדותל vivo בתוך. תא הזרימה במקביל-plate שפורסמו קודם לכן על ידי ליין. et al. 9 הוא מותאם ללמוד הכונה אנדותל הנוכחות ואת היעדר זרימה שכבתית (שאינם פועמת) קבוע. עיבודים מפתח בקביעת עבור זרימה שכבתית כפי שהוצג כאן כוללים סביבה גדול, ייעודי הבית זרימה בו-זמניות מעגלים, הפיקוח על המחירים זרימה ב בזמן אמת, והכללה של אקסוגני הפניה RNA על נירמול של נתונים כמותיים PCR בזמן אמת. כדי להעריך טיפולים/תנאים מרובים עם היישום של גזירה, זרימת החשמל מרובים, משאבות משמשים בו זמנית בתוך החממה מחוממת, humidified אותו. קצב הזרימה של כל מעגל זרימה נמדד באופן רציף בזמן אמת לתקנן את התנאים גזירה לאורך כל הניסויים. כי ניסויים אלה יש תנאים מרובים, אנו משתמשים גם של RNA אקסוגני עזר זה עלה בבזמנו של RNA חילוץ עבור נירמול של החילוץ-RNA, הראשון-strand cDNA סינתזה היעילות. השלבים למזער את השונות בין הדגימות. אסטרטגיה זו מועסק בצבר שלנו לניתוח ביטוי גנים עם גזירה ניסויים באמצעות תא הזרימה במקביל-צלחת, אבל חלקים של אסטרטגיה זו, כגון אקסוגני הפניה ספייק-ב-RNA, יכול בקלות, באופן חסכוני לשמש יישומים אחרים.
Introduction
תאי אנדותל כלי הדם בצורת תאי הציפוי הפנימי של כלי הדם במערכת הלב וכלי הדם הסגורה של מינים גבוה יותר. הם יוצרים את הממשק בין הדם לבין רקמות, מאופיינים luminal ומשטחים abluminal. אנדותל היא מערכת מגוונת, פעיל, והוא מסתגלת המווסת את זרימת הדם מזין סחר, חסינות, הצמיחה של כלי דם חדשים1. בגוף, תאי אנדותל קיימים בדרך כלל בסביבה שבה הם נחשפים לכוח חיכוך של מחזור הדם, גזירה2. גזירה הרגולטור חשוב של ביטוי גנים תא אנדותל3, תאי אנדותל לנסות לשמור על גזירה בתוך2,בטווח נתון4. תאי אנדותל מדגימים האנגיוגנזה תכנים בהעדר מאמץ גזירה5 שיכולות לשפר רקמות זלוף. דפוסים אזוריים של זרימה מופרעת, גזירה שינו משויכות הביטוי של גנים דלקתיים6 לבין התפתחות טרשת עורקים7,8. כך, דגמים הכוללים מאמץ גזירה הם מרכיב מרכזי להבנת הכונה אנדותל.
נתאר שיטת לימוד של הכונה בתאי אנדותל כלי הדם תחת גזירה. מערכת זו משתמשת זרימה פועמת ואת מחקה רמות הנוזלים גזירה, ריכוז חמצן את התנאים מודל עבור תאי אנדותל עורקי. פרוטוקול זה כולל פרטים על שיטות נוקאאוט גנטי באמצעות התערבות ב RNA (RNAi), הסידור של יישום באמצעות מכשירים במקביל-plate זרימה, שיטות ספייק-אין של אקסוגני הפניה RNA לפני הניתוח על ידי מאמץ גזירה תגובת שרשרת של פולימראז כמותית-טרנסקריפטאז (RT-qPCR). צינור זה משמש עבור הלומדים הכונה בתאי האנדותל הנוכחות ואת היעדר למינריות גזירה, כולל עיבוד של המנגנון הזרימה במקביל-plate מתוארת על ידי ליין. et al. 9. הגדרת המסוים הזה נועד לקדם את ההערכה בו זמנית של מספר תנאים ניסיוני המאפשר השוואה ישירה של תנאים גזירה, כמו גם את הנורמליזציה של RNA ניתוח. יחידה גדולה מחוממת עם מבוקרת לחות מנוצל כדי לאפשר זרימה נפרדת צ'יימברס מרובים, משאבות לנהל בו זמנית עם זרימה המחירים פיקוח להרכבה הקאמרית לכל הזרימה בזמן אמת. היישום של זה משמש נוקאאוט גנטי באמצעות RNAi בסביבה של זרימה שכבתית/גזירה, אך ניתן ליישם היבטים של פרוטוקול זה כל הערכה של RNA ביטוי.
גישות נפוצות היישום של גזירה עבור תאי אנדותל כוללים מערכות microfluidic10, עם מד צמיגות חרוט ופלייט-11קאמרית הזרימה במקביל-plate12. Microfluidic מערכות מיצרנים שונים היו שימושיים בלימוד mechanobiology ו- mechanotransduction תא מרובים, סוגי רקמות ואת מגוון רחב של גירויים ביופיזיקלי. עבור תאי אנדותל, הם שימשו ללמוד תאי אנדותל בידוד, כמו גם את האינטראקציה של תאי אנדותל וסחר של תאי החיסון או גידול10. עם זאת, מערכות אלו מתאימים פחות ההתאוששות של מספר גדול של תאים9. מד צמיגות קונוס-ו-plate והן במקביל-plate זרימה צ'יימברס לאפשר ההתאוששות של מספר גדול של תאים confluent monolayers12. מערכות אלה ניתן להפיק מגוון של הכוחות ודפוסי הטיה12. במקביל-plate זרימה קאמרית הרכבה9 יש את היתרון הזה הדמיה בזמן אמת יכול להתבצע דרך חלון זכוכית להערכת המורפולוגיה הסלולר בכל נקודת זמן. יתר על כן, ניתן לאסוף את perfusate בתנאים סטריליים. עבור מערכת המספרים המובאים כאן, הזרם ניתן גם לנטר בזמן אמת, מלכודת קאמרית מרובה, המאפשרת קיום התנאים הטיה בין צ'יימברס.
לניסויים נציג, הוא יפתור אנדותל תאים (HUVEC), אשר מייצגים סוג תאי אנדותל macrovascular, משמשים, ונשתמש התנאים גזירה (1 הרשות הפלסטינית) משקפים מצבים עורקי (0.1 - 0.7 הרשות הפלסטינית). עם זאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם סוגי תאים אנדותל אחרים, התנאים גזירה יכול להיות מותאם על פי השאלה ניסיוני. לדוגמה, ההערכה של תאי אנדותל אדם תנאים בהם מודל מחזור ורידים ידרוש רמות נמוכות יותר של גזירה (Pa 1-6), מחקרים כי מודל זרימת microvascular נעזרו גזירה רמות של 0.4 - הרשות הפלסטינית 1.213 , 14. בנוסף, גזירה יכול להשתנות אפילו בין תאי אנדותל בתוך כלי דם באותו6. הסידור הנוכחי, מערכת מעקב יחיד משמש זה יכול לעקוב אחר בו זמנית ארבע לולאות זרם נפרד. עבור מעבדות צריכה לולאות זרם נוסף, יש שטח בסביבה ייעודית למערכת ניטור נוספים.
RT-qPCR משמש את כימות מוחלטת של ביטוי גנים בהגדרה של גזירה. הביטוי היחסי של הגנים יעד משמש לעתים קרובות כדי להשוות RNA הביטוי על-פני תנאים. מינים מסוימים RNA יכול להתקיים כמויות נמוכות מאוד או להיעדר, ובכך שמסבך מידות יחסית. לדוגמה, זמן noncoding RNAs בתאי האנדותל שיכולים להפעיל אפקטים חזק במספרים עותק נמוך יחסית לכל תא5. בנוסף, הבדלי יעילות פריימר יכול להוביל פרשנות שגויה של ניצול שיטת הסף (Ct) של מחזור דלתא-delta לנתח את הנתונים. כדי לטפל חשש זה, אנו מבצעים כימות מוחלטת על ידי יצירת עיקול רגיל באמצעות כמות ידועה של פלסמיד ה-DNA. יתר על כן, משלימים לסינתזת DNA (cDNA) הוא תהליך לא יעיל, הבדלים cDNA יעילות יכול להסביר הבדלים בביטוי RNA בין בתנאים ובין דגימות15. היישום של גזירה ו/או תרביות תאים ריאגנטים יכול להשפיע על התפשטות תאים אפופטוזיס, הכדאיות, או להוסיף רכיבים עלולים להפריע סינתזה RNA בידוד ו/או cDNA. להביא בחשבון האפשרות של הטיה מן הבידוד רנ א cDNA סינתזה, אנו משתמשים בספייק RNA פקד מסונתז במעבדה, הוסיף בזמנו של החילוץ-RNA, נמדד עם כל cDNA סינתזה ויה RT-qPCR. פעולה זו מאפשרת לא רק את ההתאמה טכני הבדלי סינתזה RNA חילוץ ו- cDNA אך גם מאפשר חישוב כמויות מוחלטת בכל תא, כאשר ספירת ידוע.
מערכת זו משתמשת צעדים נוספים כדי לשמור על דמיון או בחשבון הבדלים טכניים בין תנאי. שלבים אלה מודגשת במיוחד בגלל האופי המורכב של ניסויים אלה, בהם מעורבים מספר set-ups פיזי ותנאים ניסיוני זה יכול להוביל השתנות ניסיוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת אקסוגני עזר RNA
הערה: בחר הפניה אקסוגני RNA שאינו קיים מינים או מודל של עניין. עבור מערכות יונקים, גחלילית לוציפראז RNA עשוי לשמש.
-
לינאריזציה של פלסמיד אקסוגני עזר RNA
- להכין הפניה אקסוגני RNA לפחות 48 שעות לפני החילוץ RNA הצפויה. להשיג או לייצר שיבוט cDNA של שבחרת אקסוגני ההתייחסות RNA, כגון שיבוט cDNA גחלילית לוציפראז וקטור פלסמיד מתאים במבחנה שעתוק (ראה טבלה של חומרים).
- לבצע אנזים הגבלה (RE) העיכול של µg 1 של פלסמיד באורך מלא (פלסמיד לוציפראז גחלילית זה pSP-לוק + אשר 4100 bp) משתמש יחיד-חותך מחדש (XhoI) 1.5-mL microfuge צינורות. לבחור RE זה בחותך יחיד (חתכים פלסמיד x רק 1) בקצה 3' של ההפניה אקסוגני רצף ה-RNA שמשאירה של 5' החריגה או סוף בוטה. עבור הכנה טיפוסי, לבצע פלסמיד שבע לינאריזציה תגובות (שלבים 1.1.4 - 1.1.7) במקביל ליצירת RNA ריכוז וכמות מספקת כדי להשלים סט אחד של ניסויים או פרויקט אחד.
- מודדים את ריכוז פלסמיד באמצעות ספקטרופוטומטר או spectrofluorometry.
- להכין תערובת רי ב כל שפופרת: להוסיף 4 µL של XhoI (20,000 יחידות/mL), µL 8 של RE מאגר, x µL של פלסמיד (1 µg), ולהגיע H מספיקות2O פתרון כולל של 80 µL.
- דגירה התערובת RE עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. השתמש האדומ לפי הנוהל של היצרן, כל השינויים עלול לגרום פעילות מוגברת כוכב או שאינם ספציפיים המחשוף של יעד ה-DNA. חום להשבית את תערובת התגובה כעשרים דקות ב 65 º C.
- לסיים את התקציר RE עם אתנול משקעים כל שפופרת. לתערובת RE, להוסיף ישירות µL 4 של 0.5 M EDTA pH 8.0, µL 8 של 3 מ' סודיום אצטט pH 5.2, 184 µL של 100% אתנול. מערבבים היטב, להקפיא את התערובת ב-20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- ספין למטה התערובת ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות-כוח צנטריפוגלי היחסי (RCF) של 16,100 x g.
- הסר את תגובת שיקוע עם טיפ טוב, בלי לגעת בגדר. מילה נהדרת בגדר במשך 5 דקות, resuspend זה ב 6 µL של H2O (התחמם עד 37 ° C) על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 x - 10 x.
- לאשר את לינאריזציה של פלסמיד לוציפראז על-ידי הפעלת המוצר מתעכל על 2% agarose ג'ל המכיל אתידיום ברומיד (EtBr) יחד עם סולם 1 kb +, supercoiled הסולם, ולא גזור, פלסמיד נימולים. בדוק את הג'ל והמשך שעתוק במבחנה אם הנתיב עבור פלסמיד לחתוך מראה להקה אחת ~ 4 kb (פלסמיד נימולים יהיו שלוש להקות; איור 1).
זהירות: EtBr היא סרטנית. לעבוד בשכונה fume כימי.
-
ב חוץ גופית שעתוק של פלסמיד אקסוגני עזר RNA
- לכל שפופרת של מוצרים פלסמיד מעוכל, לבצע תמלול חוץ גופית בתוך באמצעות שיטת תיעתוק במבחנה (ראה טבלה של חומרים). בצע הוראות היצרן ולהשתמש phage המתאים של RNA פולימראז. אם השיטה של cDNA הסינתזה דורש זנב poly(A), או יישומים אחרים דורשים זנב poly(A), בחר פעולת שירות של שעתוק במבחנה הכוללת תוספת הזנב poly(A) (ראה טבלה של חומרים).
- לשלב את כל במבחנה עיבד מוצרים לתוך צינור פוליפרופילן 1.5-mL יחיד לפני טיהור.
-
Purif ication של RNA מן התגובה שעתוק במבחנה
- לטהר במבחנה עיבד מוצרים עם במבחנה תמלול הניקיון קיט (ראה טבלה של חומרים). אנא עקוב אחר הפרוטוקול של היצרן.
- להעריך את ריכוז ה-RNA על ידי מדידת ספיגת ב-260 nm באמצעות ספקטרופוטומטר.
הערה: ריכוז ה-RNA מחושבת באמצעות החוק למברט. זה קובע ספיגת חומצות גרעין (אשר סופגים אור חזק-260 ננומטר) פרופורציונלי לריכוז. ספיגת של 1.0 שווה 40 µg/mL של RNA חד-גדילי.
-
Aliquoting המניה RNA לתוך ה-PCR צינורות לשימוש ניסיוני
- ודא ריכוז ה-RNA µg 1/µL.
- אם ריכוז ה-RNA > 1 µg/µL, לדלל את המניה 1 µg / Aliquot 1 µL µL. לתוך ה-PCR צינורות ואחסן אותם ב- 80 ° c
- אם ריכוז ה-RNA < 1 µg/µL, משקעים נוספים באמצעות 5 מ' אמוניום אצטט (שסופק בערכה) יכולה להתבצע לפי הפרוטוקול של היצרן. אם ריכוז ה-RNA הוא עדיין < 1 µg/µL, להמשיך עם aliquoting 1 µL לתוך המבחנות.
- ודא ריכוז ה-RNA µg 1/µL.
2. החלק ציפוי
הערה: השלבים 2.1-2.10 צריך להיות h 24-48 שבוצעו לפני תא הצפויה זריעה.
- מחממים התנור ל 250 מעלות צלזיוס.
- שימוש בכפפות סטריליות, לעטוף כל שקופית זכוכית 2 x עם רדיד אלומיניום. הימנע לגעת במשטח של השקופית ישירות.
- אופים את השקופיות בתנור לשעה ב 250 מעלות צלזיוס ולאפשר את השקופיות להתקרר לטמפרטורת החדר.
הערה: שלב זה הוא חשוב עבור השמדת כל אנדוטוקסין משחיתה. - בעוד השקופיות הן קירור להפוך את פתרון fibronectin מניות של 1 מ"ג/מ"ל מים מזוקקים, דגירה זה במשך 30 דקות ב 37 ° C כדי להמיס. להפוך aliquots 100-µL. . לקבוע את aliquots לשימוש מיידי ומקפיאים את aliquots הנותרים לשימוש עתידי.
- לפתוח את הכיסוי החיצוני של רדיד אלומיניום לפני שמכניסים את השקופית זכוכית לתוך אבטחה ארון. ביצוע השלבים 2.6-2.7 ו- 2.9 אבטחה הקבינט.
- מניחים את השקופית זכוכית לתוך תבשיל תרבות עקרה תא 4-ובכן מלבני.
- לדלל fibronectin מטריים פתרון מניות עם מים מזוקקים. כל שקופית עם 1 מ"ל של fibronectin מדולל, טיפה על ידי ירידה, באמצעות פיפטה של המעיל. ודא כי כל השקופית מכוסה.
- דגירה השקופיות חממה תרביות רקמה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות.
- לאחר הדגירה, וארוקן את fibronectin בהטיית המנה התרבות התא 4-. טוב. להימנע מלגעת השקופית ישירות עם העצמות.
3. זריעה על גבי זכוכית תא שקופיות
- ספור תאי אנדותל אנושי-מעבר מוקדם (מעבר 2-5), זרע ~1.0 x 10 תאים6 על כל שקופית fibronectin מצופה זכוכית עם 1 מ"ל של מדיה (1.0 x 106 תאים למ"ל מדיה). זרע התאים 24 שעןת לפני היישום הצפויה של זרימה שכבתית אם אין טיפול אחר נמצא שיבוצע.
הערה: מספרים אלה משמשים כמדריך עבור ניסויים עם 24 שעות של זרימה.- התאם את צפיפות זריעה כדי להשיג של טפט confluent של תאים בזמנו של קציר תאים והפקת RNA.
- . תן את התאים לדבוק השקופית למשך 15 דקות ב 37 º C.
- להוסיף 3 מ"ל של מדיה בכל היטב של המנה התרבות התא כדי לכסות את השקופית, דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה עם 5% CO2.
4. Interfering קטן RNA (siRNA) תרביות תאים
-
הכנה של תאים בשקופיות זכוכית לניסויים תרביות תאים וזרימה siRNA
- לפי התקנון בשלבים 2 (שקופית ציפוי) ו- 3 (תא זריעה על גבי מדרון זכוכית) עבור ציפוי לניסויים זרימה והכנה של שקופיות זכוכית.
- זרע תאים 24 שעות לפני הטיפול siRNA (48 שעות לפני היישום של זרימה שכבתית).
- זרע תאי אנדותל האנושי בתקשורת תרופתיים-750,000-1 x 106 תאים לכל שקופית כדי להשיג הנהרות 85-95% למחרת.
הערה: HUVEC נמצאים בשימוש בפרוטוקול זה.
-
הכנת קומפלקסים ריאגנט siRNA-השומנים מבוססי תקנים (לכל השקופיות)
- עיצוב מותאם אישית siRNAs או סדר premade siRNAs עבור הגן הרצוי של עניין.
הערה: בצע את הפעולות הבאות באבטחה ארון. - מוסיפים 6 µL של siRNA (20 מיקרומטר מניות) 414 µL של מדיום מופחת סרום (ראה טבלה של חומרים) ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting.
- µL 49.5 של ריאגנט בעדינות מעורב המבוסס על השומנים תרביות תאים למהול (ראה טבלה של חומרים) ב- µL 130.5 של מדיום מופחת סרום.
- לערבב בעדינות, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- לשלב siRNAs מדולל ריאגנט ליפיד המבוסס על תרביות תאים, מערבבים בעדינות, תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. מערבבים בעדינות כדי למנוע שיבוש מתחמי ריאגנט ליפיד המבוסס על תרביות תאים.
הערה: הפתרון עשוי להופיע מעונן כטופס תסביכים. - בעוד מתחמי יוצרים, להסיר את מדיום הגידול ולשטוף את התאים 1 x מופחת סרום בינונית.
- להוסיף 2.4 מ של מדיום מופחת סרום כל שקופית.
- הוסף 600 µL של מתחמי ריאגנט בעדינות מעורב siRNA-השומנים מבוססי תקנים בכל צלחת, סלע את הצלחת הלוך ושוב כדי לערבב. להבטיח הריכוז הסופי של siRNA 40 ננומטר. ודא כי השקופית מכוסה לגמרי.
- דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
- להוסיף 1 מ"ל של התא ללא אנטיביוטיקה אנדותל הצמיחה המדיה המכילה 3 x ריכוז רגיל של סרום שור עוברית (FBS) מבלי להסיר את התערובת תרביות תאים.
- דגירה התאים ב 37 ° C עד מוכן לשימוש.
- עיצוב מותאם אישית siRNAs או סדר premade siRNAs עבור הגן הרצוי של עניין.
5. חישוב קצב הזרימה בהתבסס על גזירה הרצוי9
- לחשב את קצב הזרימה בהתבסס על הלחצים ההטיה הרצויה לפי המשוואה הבאה:
כאן,
Q הוא קצב הזרימה ב- mL/min;
Τ הוא הלחץ ההטיה הרצויה dynes/ס מ2 (1 Pa = 10 dynes/cm2);
w הוא ברוחב של התא במקביל-plate זרימה ב ס"מ;
h הוא הגובה של התא במקביל-plate זרימה ב ס"מ;
ממוצע הוא צמיגות של אמצעי התקשורת cP (g/cm·s).
הערה: גזירה למינריות טיפוסי (הלא-פועמת) של זרימת עבודה זו מתבצעות בτ = 1 הרשות (10 dynes/cm2). ממוצע ניתן למדוד באמצעות מד צמיגות כגון מד צמיגות קונוס-ו-plate, יכול להשתנות בהתאם לתוכן של המדיה כולל סרום לתוספי נוספים9. - כדי להשיג ספציפי τ (גזירה), להתאים את קצב הזרימה ו/או צמיגות. בקצבי זרימה גבוהים תאים חסיד ייתכן מביצועם של השקופית. שיעורי דגימה זרימה עם זרימה טיפוסי צ'יימברס מוצגים בטבלה 1.
6. הגדרת סביבה ייעודי עבור ניטור המערכת, במקביל-plate זרימה מרובים צ'יימברס (איור 2)
- להשתמש גדולה מחוממת יחידה/חממה עם מספר מדפים, גישה חשמל פנימית, דלתות זכוכית – המכונה החוף (מובנה סביבת מתכוונן CO2 ) וחום – לבית תאי זרימה מרובים בו-זמנית עבור ניסויים זה דורשים מאמץ גזירה והן השוואה ישירה בין שניים או יותר טיפולים או תפוקות (קרי, DNA, RNA, חלבון).
הערה: חוף הים מאפשר ניטור תכופים של המעגל זרימה, כולל קצב הזרימה, ללא הפרעה תכופים של הסביבה. - ודא CO נאותה2 זמין עבור הניסוי שהצג2 CO אינו פונקציונלי. ודא שהמגש מים בהתאם מלא, כך יהיו אוויר humidified.
7. הגדרת על מנגנוני זרימה במקביל-צלחת
הערה: עבור הייצור של לוחות מקבילים, נא עיין ליין. et al. 9.
- אוטוקלב הזרם קאמרית צלחות, אגירה, dampener, אבובים ו Luers עבור הגדרת הקאמרית לכל הזרימה במקביל-plate כמצוין בטבלה מס ' 2.
-
הקמה של ההרכבה לולאת זרם (איור 3).
- מניחים מגבות סטריליות בטיחות ביולוגית בארון. להרכיב מערכת loop הזרימה, קודם בלי התא במקביל-plate זרימה, בארון בטיחות ביולוגית.
- לחבר את מכלול אבובים על המאגר:
- הכנס צינור קשיח #14 לתוך חור אחד וצינורות שני #14 רך לתוך החורים שני אחרים בתוך הכיפה של המאגר זרימה. ודא כי באחד הצינורות רך נוגע בתחתית של המאגר כמו אבובים יצוא .
- במקום "1/16" זכר סכינים סטריליים בסוף #14 קשה צינור ולצרף מסנן סטרילי כמו אוורור.
- במקום "1/16" הנשי סכינים סטריליים בסוף #14 רך תזרים צינור, בא מן המאגר, וצירוף של צימוד 4-way.
הערה: עבור ניתוח ביטוי גנטי או מחקרים אחרים. איפה perfusates לא צריך להיות שנאספו, 2-way stopcocks יכול לשמש במקום stopcocks 4-way בפרוטוקול זה. - במקום "1/16" סכינים סטריליים זכר בסוף הצינור תזרים רכים #14, בא מן המאגר.
- להתחבר לאורך צינור זרימה יוצאת של מאגר מים משאבת אבובים: במקום "1/16" סכינים סטריליים הנשי בכל קצה של שפופרת קשה #13 (משאבת צינור). לחבר את הצינור תזרים רכים #14 מן המאגר הצינור הקשיח #13 על ידי התחברות "1/16" Luers זכר ונקבה ביחד.
- לחבר את צינור משאבת עם אבובים "גשר dampener": מקום 1/8" סכינים סטריליים זכר ו- 1/8" הנשי סכינים סטריליים בקצה אחד של צינור רך #16. מחבר "1/16" סכינים סטריליים הנשי של #13 קשה הצינור (בסוף יצוא לאורך צינור המשאבה) עם "1/8 זכר סכינים סטריליים של הצינור רך #16.
- להרכיב צינורות עבור dampener זרם: מקום "3/16" זכר סכינים סטריליים בקצה אחד של הצנרת רך #25, חזור על הפעולה עבור הצד השני של dampener הזרימה. לצרף הפנויות של הצינורות רך #25 בכל צד של dampener הזרימה.
- לחבר את הצנרת "גשר dampener" עם אבובים עבור dampener זרם: חיבור צינור רך #25 מתוך dampener זרימה עם הצינור רך #16 של "גשר dampener" באמצעות "1/8 סכינים סטריליים נקבה מן הצד #16"גשר dampener", את ה" 3/16 להציב כבר את "זכר סכינים סטריליים מן הצד צינור #25 dampener רך.
- להרכיב צינורות 'קאמרית bridge':
- מקום 1/8" סכינים סטריליים נקבה ו- 1/8" זכר סכינים סטריליים בקצה אחד של צינור רך #16 ('קאמרית גשר צינורות).
- מחבר "1/8 סכינים סטריליים הנשי של 'הגשר הקאמרית" עם "3/16" זכר סכינים סטריליים על הצינור רך #25 בסוף dampener זרימה חופשית.
- ב- "1/8 זכר סכינים סטריליים (סיום חופשי) של הצנרת 'קאמרית bridge', המקום של צימוד 4-way.
- לחבר את צימוד 4-way מהקצה חינם 'קאמרית bridge' צימוד 4-way מן המאגר תזרים רכים הצנרת (מתוך שלב 7.2.2.3). לסגור את stopcocks.
- הוסף מדיה המאגר ואת dampener. לחשיפה 48-h להטיית מתח, להוסיף 35 מ של המדיה המאגר ואת מ"ל 25 עד dampener. לכוון את עוצמת הקול של המדיה על סמך את משך הניסוי הזרימה ואת מספר התאים נזרע.
- להביא מערכת loop הזרימה שהורכב המשאבה על החוף. המקום הצינור הקשיח #13 (משאבת אבובים) לראש המשאבה ואבטח אותו. פתח את stopcocks.
- הפעל את המשאבה ולאחר לאט להגדיל את מהירות המשאבה. תן את המדיה לזרום דרך מערכת loop. בדוק כל דליפה או חסימה (למשל, הצטברות הלחץ). ודא כי המדיה זורם בחזרה למאגר המים.
-
הקמה של ההרכבה קאמרית זרימה
- מקום 1/8" הנשי סכינים סטריליים בקצה אחד של 16 # רכים צינור וצירוף של צימוד 4-way. לצרף את קצה הצינורית חינם לצד הנכון של הפלטה (תזרים בצד).
- מקום 1/8" זכר סכינים סטריליים בקצה אחד של 16 # רכים צינור וצירוף של צימוד 4-way. לצרף את קצה הצינורית חינם בצד שמאל של הפלטה (יצוא בצד).
- מקום 1/8" סכינים סטריליים זכר ו- 1/8" הנשי סכינים סטריליים בקצה אחד של צינור רך #16 (בועה מלכודת צינורות). לצרף את הצנרור בועה השמנה באמצעות "1/8 זכר סכינים סטריליים. צימוד 4-way לצרף הקצה השני של צינורות דרך "1/8 סכינים סטריליים הנשי.
- באמצעות פינצטה סטרילי, להעביר השקופית נזרע תא זכוכית מתוך קערה התרבות התא 4-ובכן ההפסקה על צלחת התחתון. ודא שפונה מעלה, לצד נזרע תא של השקופית זכוכית.
- באמצעות מזרק 10-mL, להוסיף 10 מ של מדיה חמה צלחת התחתון בתוך הקו האדום אטם סביב הצלחת. לאפשר את מדיה זורמת דרך השקופית בלבד לכסות את התאים. הימנע הוספת מדיה ישירות על גבי השקופית.
- הנח בעדינות את הפלטה על צלחת התחתון, יישור מצד אחד לשני. הימנע המבוא של בועות אוויר. בורג הלוחות יחדיו באופן הדוק.
- להסיר בועות אוויר מן המלכודת בועה על-ידי פתיחה של צימוד מצד ימין (תזרים) של הצלחת ומרוקן בעדינות 20 מ של מדיה חמים באמצעות מזרק 30-mL. ודא שצימוד בצד שמאל (יצוא) של הצלחת סגורה כי התקשורת הוא זורם דרך צימוד מלכודת בועות (פתוח). למחוק את התקשורת סמוקות.
- לסגור את צימוד על המלכודת בועה ולפתוח את צימוד בצד שמאל (יצוא) של התא. לרומם בצד שמאל (יצוא) של התא כדי בזווית של 45° ותוציאו בעדינות 20 מ של מדיה חמים באמצעות מזרק 30-mL מצד ימין (תזרים) של התא כדי להסיר בועות אוויר מן החדר. בועות, ניתן לאבחן דרך החלון. למחוק את התקשורת סמוקות.
- לסגור את stopcocks משני הצדדים של הקאמרית, קאפ. לבדוק את התאים על ידי מיקרוסקופ.
- תחבורה התא אל החוף עם מערכת loop שהורכב בעבר.
- לאט לאט להאט את מהירות המשאבה, להשהות את המשאבה. לסגור את stopcocks על מערכת loop זרימה כדי למנוע דליפה.
- התחבר התא, לולאה מערכת יחד דרך stopcocks. פתח את כל stopcocks.
- אט-אט להגדיל את מהירות המשאבה ולבחון את הסידור בגין כל דליפה או חסימה. ודא שהמדיה מסתובב בכיוון אחד וחוזר אל המאגר.
- מניחים את חיישן הזרימה על הצנרת 'קאמרית bridge' ממוקם בצד תזרים של התא. ודא כי החיישן הוא מונחה כראוי בכיוון של זרימה.
- כוון את מהירות המשאבה כדי לקבל קצב הזרימה זה מחושב בעבר, בהתבסס על הלחץ ההטיה הרצויה.
הערה: קצב הזרימה עשוי להשתנות בהתאם הגובה ואת הרוחב של כל חדר, כמו גם את צמיגות של המדיה. - להפעיל את הטנק2 CO כדי להשיג 5% CO2 ומניחים על מגש מים בתוך החוף.
8. קציר של תאים החילוץ של RNA מן החדר זרימה
- לאחר סיום תקופת הזמן הרצוי של זרימה, לאט להנמיך את מהירות משאבת סחרור ל- 0, מכבה את החשמל. לסגור את כל stopcocks פתוחים ובמהירות להסיר את התא ואת הצנרת המצורפת עם צימוד בכל קצה.
- לקחת את החדר benchtop נקי, בעדינות להתיר כל הברגים כדי להסיר את הפלטה. באמצעות פינצטה פינצטה, להסיר את השקופית זכוכית צלחת התחתון ומניחים אותו לתוך תבשיל תרביות רקמה של קוטר 100 מ מ.
- לשטוף את השקופית הכוללת 10 מ ל תמיסת מלח קרות באגירה פוספט (PBS)- / - וסמנו את התאים במיקרוסקופ כדי לאשר תא הדבקות ויישור בכיוון של זרימה.
- האחות של PBS מהצלחת ולהעביר את השקופית צלחת בקוטר 100 מ מ נקי. הוסף µL 350 פירוק מאגר החילוץ RNA קיט (ראה טבלה של חומרים), המכילה 1/100 מערכו של בטא-mercaptoethanol, לשקופית.
התראה: להוסיף בטא-mercaptoethanol בשכונה fume כימי. - לגרד את התאים מחוץ לשקופית באמצעות המגרד של התא פוליאתילן להבים. להטות את המנה תרביות רקמה, המאפשר את הנוזל למאגר בתחתית, ולהסיר את השקופית זכוכית עם מלקחיים. Pipette תא lysate לתוך צינור 1.5-mL ולשמור אותו בקרח.
- לדלל התייחסות אקסוגני מניות RNA (לוציפראז RNA) 0.0025 ng/µL באמצעות דילול טורי לפני הוספתו לפקודה המדגם. לדוגמה, אם ריכוז מניות µg 1/µL, לדילול 1/400,000 נדרש בכדי להגיע 0.0025 ng / µL. µL להוסיף 10 של מדולל לוציפראז RNA כל מדגם של תא lysate בידוד RNA במורד הזרם וניתוח.
- להמשיך עם פרוטוקול החילוץ RNA לפי הוראות היצרן, או להקפיא את lysate ב-80 מעלות צלזיוס עד תוכל להמשיך עם מיצוי.
9. חישוב של היעילות של החילוץ-RNA ו- cDNA סינתזה
הערה: לחשב את היעילות לוציפראז לאחר RT-qPCR על-ידי השוואת התשואה התיאורטית, התשואה ניסיוני.
- לקבוע את התשואה התיאורטית של לוציפראז RNA.
- לקבוע את הסכום הכולל של עותקים לוציפראז הוסיף לדגימה. (הוספת 0.025 ng/דגימה = 2.73 x 107 עותקים של לוציפראז RNA לדגימה לפני חילוץ רנ א.)
- לחשב את המסה המולקולרית של לוציפראז RNA באמצעות של מסה מולקולרית ממוצעת לכל נוקלאוטיד של 330 גרם/מול ו הכפלתו באורך של גחלילית לוציפראז RNA, 1652 נוקלאוטידים.
- לחלק את כמות לוציפראז RNA הוסיף (0.025 ng) עבור כל דגימה לפני החילוץ-RNA על ידי המסה המולקולרית להניב את הכמות טוחנת. לאחר מכן, להכפיל את זה ב מספר אבוגדרו של להניב את העותקים הוסיף לדגימה.
- לחשב את התשואה התיאורטית של העותקים לוציפראז עבור כל תגובה RT-qPCR באמצעות המשוואה:
- לחשב את התשואה ניסיוני עבור ההעתקים לוציפראז עבור כל תגובה RT-qPCR באמצעות פלסמיד לוציפראז ליצירת עיקול רגיל עבור RT-qPCR.
- לחשב את היעילות לוציפראז (%) באמצעות המשוואה:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לינאריזציה מוצלחת של פלסמיד לוציפראז באמצעות אנזימי הגבלה אושר על-ידי מוצרי מתעכל פועל על ג'ל agarose (איור 1). הגודל של המוצר ליניארית אושר באמצעות סולמות DNA ו by comparison with פלסמיד נימולים.
לנו יש להתאים את הסידור קאמרית במקביל-plate זרימה של ליין. et al. 9 לניסויים הדורשים תנאים מרובים/טיפולים עם גזירה או גזירה תנאים מרובים. אנו משתמשים סביבה ייעודי, החוף, אשר מסוגל להכיל מרובות, מעגלים-הושלם זרימה כל יש פיקוח המחירים זרימה (איור 2). קצב הזרימה מנוטר רק במעלה הזרם של ההרכבה במקביל-plate (איור 3). זרימת החשמל, המחירים ניתן לנטר באופן ישיר דרך דלתות זכוכית מבלי לגרום תנודות טמפרטורה, לחות או גז תוכן בתוך החוף.
בתהליכי ייצור יכול להוביל וריאציות קטן בגובה קאמרית. לכן, המחירים זרימה יש לחשב עבור כל תא להשיג את אותה גזירה (טבלה 1). בתיאוריה, צ'יימברס עם גבהים זהים ניתן להשתמש המחירים זהים זרימה כדי להשיג את אותו מאמץ גזירה והוא יכול לשמש בסדרה. ניסויים טיפוסי עם תאי אנדותל להשתמש גזירה של 0 - 1.5 גזירה למינריות אבא של 1 הרשות הפלסטינית היה בשימוש זרימת עבודה זו כדי דגם עורקי אנדותל גזירה. שם ניתן גם וריאציות בין הגדרות לראש המשאבה בתוך משאבת ראשי לאורך זמן עם השימוש. באמצעות מד זרימה יכול להסביר הבדלים אלה.
ניסויים באמצעות היישום של גזירה לעתים קרובות כרוך מרובים גזירה תנאים, תנאי טיפול ונקודות זמן. במידת האפשר, אנו משתמשים הפניה אנדוגני RNA לחשבון עבור כל variabilities בקביעת ניסיוני. עבור ניסויים, מציאת RNA הפניה אנדוגני עם יציבות כמותית היא לא ריאלי16. יתר על כן, כמותיות יציבות או אי יציבות של גנים התייחסות אנדוגני בין דוגמאות ניתן לייחס גם השפעות תלויי-גירוי על רמות הביטוי הסלולר או וריאציות של היעילות של RNA עקירות או שעתוק במהופך. לקחת בחשבון עבור אלה שיגביר, בהגדרת איפה ג'ין הפניה אנדוגני אינה יציבה באופן כמותי, אנו משתמשים גן ספייק-אין התייחסות אקסוגני. לניסויים שילוב גזירה למינריות בתרבית של תאי אנדותל, אנו משתמשים של גחלילית לוציפראז RNA אקסוגני RNA ספייק-in (איור 4A).
איור 4 מראה ניתחו נתונים ניסיוני RT-qPCR גזירה ניסויים הערכת פקטורי Krüppel דמויי 2 (KLF2) אובדן-של-פונקציה באמצעות siRNA. KLF2 הוא upregulated פקטור שעתוק ע י זרימה שכבתית בתאי האנדותל מתווך תעתיק העיקריים של ביטוי גנים אנדותל בהגדרה של זרימה שכבתית2.
איור 4A מראה לוציפראז יעילות עבור 3 ניסויים נפרדים, כל אחד באמצעות שני תאי זרימה. לוציפראז היעילות יכול להיות דומה בין דגימות של ניסוי (ניסוי 1) או להראות כמה השתנות (ניסויים 2 ו- 3) (איור 4A). תוצאות אלה הן יקר במיוחד במערכות ניסוי שבו נראים שינויים מוחלט קטן בלבד. השימוש ג'ין הפניה אקסוגני עשוי להיות חשוב במיוחד בניסויים איפה ניסיוני טיפולים יכולים להפריע היעילות של שעתוק במהופך או PCR17. התוצאות מצטיירת דמות 4A אופייניות. יעילות לוציפראז של 5% ציון 5% לוציפראז RNA (כלומר, הסכום ההתחלתי הראשונית של RNA) נוספו המדגם לפני החילוץ-RNA הוא זוהה על ידי RT-qPCR. בין הדוגמאות או תנאים במסגרת ניסוי יחיד, היעילות לוציפראז בדרך כלל ± 50%. תוצאות יש לפרש בזהירות אם ההשתנות של יעילות לוציפראז הוא > 50%, צריכה לכלול סקירה של נהלים ניסיוני ובתנאים.
איור 4B מראה תוצאות ניסויית טיפוסית של RT-qPCR של ניסויים גזירה חוזרת ונשנית, כל שימוש מרובות במקביל-plate זרימה צ'יימברס. בתוך כל ניסוי, ביטוי KLF2 mRNA הוא מנורמל בשלוש דרכים. נירמול הראשון משתמש של RNA הפניה אנדוגני, Cyclophilin א (CycA). נירמול השני משתמש של RNA הפניה אקסוגני, גחלילית לוציפראז (לוק). נירמול השלישי משתמש בשני אנדוגני, אקסוגני ההפניה RNA. בתוך כל ניסוי שמוצג באיור 4B, כל שלוש שיטות נורמליזציה (נורמליזציה הגן הפניה אנדוגני, הגן הפניה אקסוגני של שני גנים התייחסות אנדוגני, אקסוגני יחד) מניב תוצאות דומות. אם השיטה נורמליזציה משתנה באופן משמעותי את התוצאות (למשל, שמוביל > 50% הבדל), התוצאות יש לפרש בזהירות. כאשר יש השתנות ניכר בין השיטות של נורמליזציה, ההתייחסות אנדוגני gene (s) יש להותירה, כפי שהוא יכול להיות משתנה תלוי במערכת ניסויית. באופן דומה, בצרות והתנאים להותירה. ב- איור 4B, נוקאאוט KLF2 באמצעות siRNA התשואות יעילות תמונות ציפורים דומות בין 3 ניסויים נפרדים (ניסוי 1, 2 ו- 3). היינו שלושה ייחודי דגימות ביולוגיות לניסויים אלה, באמצעות שני תאי זרימה פועל בו זמנית עם גזירה-1 הרשות עבור ניסוי.
איור 1: Agarose ג'ל דימוי לינאריזציה של פלסמיד לוציפראז אקסוגני. Supercoiled ו- kb 1 + DNA סולמות משמשים כסמני כדי לקבוע את שניהם נימולים, גזור לוציפראז פלסמיד גדלים kilobases (kb). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: סקירה סכמטי של הרכבות מרובות מעגל זרימה בתוך סביבה ייעודי (על החוף). הזרימה בבתי בשני מעגלים זרימה מנוטרים בקלות בזמן אמת, מבלי להפריע לסביבה, ואת שני מעגלים אפשרות לפעול בו-זמנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: סקירה סכמטי של אסיפה מעגל זרימה אחת. באיור זה נקובים Luers בשימוש וגדלים אבובים. ודא מד זרימה אוריינטציה בכיוון הזרימה ממוקמים במעלה הזרם של התא זרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: נציג נובעת KLF2 אובדן-של-פונקציה ניסויים בתאי האנדותל האדם חשוף להטיית מתח (1 הרשות הפלסטינית) עבור ה 24 (א) לוח זה מציג כימות של אקסוגני לוציפראז RNA 3 ניסויים זרימה נפרדת. לוציפראז יעילות יכול להיות דומה בין דגימות של ניסוי (ניסוי 1) או כמה השתנות (ניסויים 2 ו- 3). לוציפראז (עותקים מוחלטת) הוא העתק מספר לוציפראז RNA שזיהה רוורס טרנסקריפטאז PCR כמותי (RT-qPCR) על ידי כימות מוחלט באמצעות עיקול רגיל. לוציפראז יעילות הוא העותקים לוציפראז ניסיוני מחולק העותקים לוציפראז תיאורטי עבור כל דגימה מוכפלים ב- 100 (ראה שלב 8 לפרוטוקול). לוציפראז יחסי היעילות היא יעילות לוציפראז כל דגימה המחולק התנאי הפניה (זרימה + Ctlsi) בתוך כל ניסוי. (B) הצג חלוניות אלה נירמול גנים בקבוצת מדגם גזירה ניסויים באמצעות שני גנים התייחסות אנדוגני, אקסוגני. התוצאות הן מ- PCR כמותי-טרנסקריפטאז (RT-qPCR). נוקאאוט של KLF2 mRNA ביטוי מוצג בנוכחות זרימה שכבתית עם גזירה של 1 הרשות עבור 24 ה FC = השינוי לקפל; CycA = A cyclophilin, משמש הפניה אנדוגני RNA; לוק = לוציפראז, משמש הפניה אקסוגני RNA. הנתונים מ האיש. et al. 5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| גובה תא (מיקרון; מיקרומטר) |
רוחב תא (סנטימטרים; ס מ) |
Flow Rate (mL/min) עבור הרשות הפלסטינית 1 גזירה | צמיגות (centipoise; cP) |
| 303.80 | 1.90 | 19.48 | 0.90 |
| 326.10 | 1.90 | 22.45 | 0.90 |
| 344.84 | 1.90 | 25.10 | 0.90 |
| 319.06 | 1.90 | 21.49 | 0.90 |
טבלה 1: הקאמרית הייטס ודוגמאות של זרימה המחירים עבור לשכות זרימה שונות להשיג גזירה של 1 אבא
| בדי ג'יי |
| פינצטה |
| בקבוק לאגירת |
| Dampener, קאפ |
| לולאת זרם |
| "1/16" זכר סכינים סטריליים x 3 |
| "1/16" זכוכית הנשי x 3 |
| 1/8 זכר סכינים סטריליים x 2 |
| 1/8" זכוכית הנשי x 4 |
| "3/16" מתאם זכר x 2 |
| 14 L/S צינור קשיח (2 אינץ ') x 1 |
| 14 צינור רך L/S (5 סנטימטרים) x 2 |
| 16 L/S צינור רך (3 אינץ ') x 2 |
| 25 ל'/ש' צינור רך (3 אינץ ') x 2 |
| 13 צינור קשיח L/S (10 ס מ) x 1 |
| זרימה קאמרית |
| 1/8 זכר סכינים סטריליים x 2 |
| 1/8" זכוכית הנשי x 2 |
| 16 L/S צינור רך (3 אינץ ') x 3 |
| העליון והחלק התחתון צלחות |
| ברגים |
טבלה 2: חלקי להיות בלוק בשלב 6.2 של הפרוטוקול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמץ גזירה הוא מצב הפיזיולוגיות ממיקרו הפונקציה אנדותל, בחלקו, על-ידי המשפיעים על מצב יציב ג'ין ביטוי2,5. מודלים של הכונה בתנאים שונים של גזירה יתרום להבנה גדולה יותר של פונקציית אנדותל. זרימת עבודה מעשית זו כוללת מעגל זרימה באמצעות תא הזרימה במקביל-plate מקורי ליין. et al. 9 , מייצג למינריות, שאינם פועמת זרימה. הסידור הכללי נועדה להקל על הניסויים אשר דורשים תאי זרימה מרובים ולצמצם את השתנות ניסיוני בהגדרה זו.
מכלול מעגל הזרימה הוא מרכיב עיקרי של זרימת עבודה זו ומותאם של ליין. et al. 9. מספר עיבודים של פרוטוקול האסיפה הזאת נעשו כדי לשקף הבדלים במערכות ניסיוני. יחידת מחוממת גדול, חוף הים, הוא עיבוד המקל על פעולת סימולטני וניטור של מספר מעגלים זרימה בתוך באותה הסביבה. מערכת זו שימש בהצלחה עבור היישום של גזירה לתאי אנדותל לתקופות זמן שונות, מ- h 1 עד 7 ימים, במספר רמות גזירה (למשל1.0, 1.5, 2.0 הרשות הפלסטינית). מערכת זו שימשה גם ללימודי תמונות ציפורים גנים כדי להעריך את תפקוד הגן אנדותל מגיב זרימה בסביבה של גזירה (איור 4)5. יש השתנות ניכר בין משאבות משאבת ראשים, אשר גם עשויים להשתנות עם הזמן עקב בלאי נורמלי. להביא בחשבון הבדלים אלה, אנו משתמשים חיישן הזרימה ממוקם מקורב לתא זרימה כדי לפקח באופן רציף זרימה המחירים. גדלים שונים של צינורות, Luers משמשים כדי להבטיח התאמה. הדוקה עבור כל אחד מהרכיבים וכדי למנוע דליפה כלשהי במהלך הניסויים. אנחנו נספר תאים נזרע כ 1,000,000 תאים לכל שקופית זכוכית, dropwise, אז תן את התאים דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות להגביר את היעילות הדבקות. בהשוואה ובתאים אנדותל, אשר יכול להיות נזרע למשך זמן קצר לפני היישום של גזירה9, אנחנו זרע תאי אנדותל אדם לפחות 24 שעות לפני היישום של גזירה. משכי זמן קצרים יותר יכול להוביל מוציאים של תאים במהלך הזרימה, או שכבה מקוטע של תאי אנדותל, אפילו עם צפיפות זריעה המתאים. אנו מדגישים את הבדיקה של שקופיות טפט confluent של תאי אנדותל הן לפני והן אחרי היישום של גזירה. אנו מוצאים כי שקופיות מצופה fibronectin, רכיב טבעי מטריצה חוץ-תאית18, לשמר את טפט אנדותל יותר בעקביות בהשוואה הצדדים מצופה עם ג'לטין (שפגע בסימני fibrillar מסוג קולגן). לבסוף, לחות גרעינים זרימה בפרוטוקול זה אופטימיזציה לשימוש 30 מ של מדיה, לעומת 190 מ של המדיה עבור יצרנים אחרים.
מספר צעדים באסיפה מעגל זרימה דורשים טיפול נוספים. טפט אפילו תאי אנדותל גלובאלים לפני היישום של גזירה. חשוב לתאי הזרע על גבי השקופית זכוכית dropwise כדי להגדיל את מספר התאים לדבוק השקופית וכיסוי, לפיכך, את הכוללת שקופית. זמן ההמתנה בין תא seeding, הוספת מדיה נוספים לשקופית בדרך כלל משפר את יעילות זריעה כפי שהיא מספקת זמן מספיק תאים לדבוק השקופית מאשר להשטף במגש שקופיות מרובות. לבדוק את התאים באופן חזותי לפני, במהלך, ואחרי היישום של גזירה. מיקרוסקופ ניתן להציב על החוף למטרה זו. חובה לצרף את חיישן זרימה לכיוון הנכון, קצב הזרימה היעד צריך להיבדק על כל תא זרימה בודדות. צריך להיות perfused מערכת loop הזרימה ללא תא כדי לוודא. אין נזילה מדיה או בעיות אחרות, כגון הצטברות הלחץ, כדי להימנע perturbing את התאים במהלך הניסויים בפועל. בדיקה לאיתור ולחסל את בועות בתוך המערכת. בזמן בדיקות מערכת loop הזרימה, להבטיח ש-stopcocks פתוחות כל לפני הפעלת את משאבת סחרור כדי לאפשר זרימה ללא הפרעה, חד כיווני. ודא stopcocks כל הם סגורים לפני צירוף תא זרימה הלולאה פתיחה מלאה לפני הפעלה מחדש של המשאבה.
אנו מוצאים כי התוספת של ג'ין הפניה אקסוגני עוזרת במגוון תרחישים. תא אנדותל מדיה מכיל לעיתים קרובות הפארין, אשר הוא מעכב של PCR17. בעוד כמה פרוטוקולים החילוץ RNA לשלב שלבים להסרת הפארין, כמות מזערית יכולה לגרום ההבדלים PCR היעילות בין דגימות. טיפולי חזק עשויה גם למנוע זיהוי ג'ין הפניה אנדוגני הוא יציב באופן כמותי. המעבדה שלנו יצרה פרוטוקול יעיל לסנתז לוציפראז 5' הכתיר, poly-A-זנבי RNA לשימוש RNA הפניה אקסוגני. אסטרטגיה זו התבררה בגישה חסכונית לעומת רכישה של RNA זמינים מסחרית. במהלך הכנת אקסוגני עזר RNA, חשוב RNA aliquot לתוך aliquots לשימוש יחיד כדי למנוע מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה. ערבוב יסודי, מדויק pipetting הם קריטיים לשמירה על עקביות בין-aliquot. ניסויים טיפוסי להראות את יעילות לוציפראז בטווח של 5% ± 2.5% אך יכול לנוע בין 1% - 10%. הוא זהיר לתקן RT-qPCR תוצאות יעילות ההפניה אקסוגני RNA והן של ג'ין הפניה אנדוגני (משק בית).
עבור הניסויים שההתנהלות, גחלילית לוציפראז רצפים משמשים כהפניה מידע שאינם יונקים ספייק ב- RNA בתרבית של דגמים. בניסויים שבהם גחלילית לוציפראז מתבטא בתאים, לא יהיה ג'ין ההתייחסות המתאימה. גנים התייחסות ספציפית אחרים ניתן להשתמש, כולל Caenorhabditis elegans miRNA צ'ל-מיר-3919 ו ribulose bisphosphate קרבוקסילאז צמח RNA20.
מעגל זרם זה מודלים של טפט דו-ממדי של תאי אנדותל גדל על תרביות רקמה פלסטיק או זכוכית, וזה די נוקשה. מטריצת קשיחות יכול להשפיע על התגובה אנדותל נוזלים גזירה21. מערכת מודל זו משתמשת בריכוז חמצן גבוה יחסית דומה יותר עורקי יותר ריכוז חמצן ורידים. מודל זה מקרוב דומה מקטעים ישרים של כלי גדול יותר במערכת לב וכלי דם סגורה, ומספק סביבה הומוגנית יחסית עבור תאי אנדותל בשקופית. תנאים ספציפיים אחרים מבנים תלת-ממדיים, כגון פלוקה או עקמומיות של כלי, שאינם מיוצגים במודל הזה. מערכות אחרות יכול מודל אחר תבניות זרימה, כולל אלה באזורים מעוקל להערכת, אבל תשואות תאים פחות מאשר מערכת שמתואר פרוטוקול זה. באופן דומה, הרכבות אחרות יכול להיות מתאים יותר אם נדרשים > 1 x 106 תאים, או אם נדרש ניתוח מתא בודד. היישום הנוכחי שלנו דגמים שאינם פועמת זרימה שכבתית. ובכל זאת, מודל זה יכול לשמש כדי ליצור ואת אחרים, לרבות ואת פועמת או מתנדנדות, עם עקביות, כפי שיעור זרימת מנוטרים באופן רציף.
בסך הכל, זרימת עבודה מעשית זו מספק מערכת של יישום סימולטני גזירה ללשכה זרימה מרובים עם זרימה תחת פיקוח המחירים. חומרים ונהלים לאורך כל זרימת עבודה זו נועדו כדי למזער את השתנות ניסיוני בין דוגמאות ומצבים. זרימת עבודה זו שימש בהצלחה לניסויים RNAi בסביבה של זרימה שכבתית והוא יכול לשמש גם עבור כל הניסויים הדורש תנאים מרובים עם למינריות גזירה, או מרובים מגניטודות למינריות גזירה ו/או נקודות זמן, כולל ואת חלופי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי CIHR מגב 142307 P.A.M. H.S.J.M. הוא הנמען של קנדי מוסדות של הבריאות מחקר תוכנית אימונים במלגת רפואה רגנרטיבית. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. ו- M.K.D. הם הנמענים המלכה אליזבת השנייה לתואר שני מלגות המדע והטכנולוגיה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
- Aird, W. C.
- Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
- Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
- Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
- Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645 (2015).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).
- Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).
- Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
- Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
- Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
- Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984 (2014).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
- Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
- Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
