Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Gen expressie analyse van endotheliale cellen blootgesteld als u wilt schuintrekken Stress met behulp van meerdere parallelle-plaat Flow Chambers

Published: October 21, 2018 doi: 10.3791/58478
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Keenan Research Centre in the Li Ka Shing Knowledge Institute, St. Michael's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Department of Medicine, University of Toronto

Summary

Hier, wordt een workflow voor de cultuur en gen expressie analyse van endotheliale cellen onder vloeistof schuifspanning gepresenteerd. Inbegrepen is een fysieke schikking voor gelijktijdig huisvesting en bewaking van meerdere stroom kamers in een gecontroleerde omgeving en het gebruik van een exogene referentie RNA voor kwantitatieve PCR.

Abstract

We beschrijven een workflow voor de analyse van genexpressie uit endotheliale cellen onder voorbehoud van een gestage laminaire stroom met behulp van meerdere gecontroleerde parallel-plaat stroom kamers. Endotheliale cellen vormen de cellulaire binnenbekleding van bloedvaten en chronisch worden blootgesteld aan de wrijvingskracht van de bloedstroom schuifspanning genoemd. Onder fysiologische omstandigheden, endotheliale cellen functie in aanwezigheid van verschillende shear stress omstandigheden. Dus, de toepassing van shear stress voorwaarden in in vitro modellen kan meer inzicht geven in endotheel reacties- in vivo. De zaal van de parallel-plaat stroom eerder gepubliceerd door Lane et al. 9 is aangepast aan het studeren endothelial genregulatie in de aanwezigheid en de afwezigheid van gestage (niet-Pulsatiele) laminaire flow. Belangrijke aanpassingen in de set-up voor laminaire flow zoals hier gepresenteerd omvatten een grote en toegewijde omgeving aan huis gelijktijdige stroom circuits, de monitoring van de stroomsnelheid in real-time, en het opnemen van een exogene referentie RNA voor de normalisatie van kwantitatieve real-time PCR-gegevens. Om te beoordelen meerdere behandelingen/voorwaarden met de toepassing van shear stress, worden meerdere stroom circuits en pompen gebruikt gelijktijdig binnen de dezelfde verwarmd en bevochtigde incubator. Het debiet van elk circuit van de stroom wordt gemeten voortdurend in real time op de standaardisering van shear stress voorwaarden tijdens de experimenten. Omdat deze experimenten meerdere voorwaarden hebben, gebruiken we ook een exogene referentie-RNA dat spiked-in op het moment van RNA extractie voor de normalisatie van RNA extractie en eerste-strand cDNA synthese efficiëntie. Volgt minimaliseren de variabiliteit tussen de monsters. Deze strategie is werkzaam in onze pijplijn voor de analyse van gen expressie met schuifspanning experimenten met behulp van de zaal parallel-plaat stroom, maar delen van deze strategie, zoals de exogene verwijst naar RNA spike-in, kunnen gemakkelijk en kosteneffectief worden gebruikt voor andere toepassingen.

Introduction

Vasculaire endotheliale cellen vormen de cellulaire binnenbekleding van bloedvaten in de gesloten cardiovasculaire systeem hogere soorten. Zij vormen de interface tussen het bloed en de weefsels en wordt gekenmerkt door luminal en abluminal oppervlakken. Het endotheel is een divers, actieve en adaptieve systeem dat regelt de bloedstroom, nutriënten mensenhandel, immuniteit en de groei van nieuw bloed schepen1. In het lichaam bestaan endotheliale cellen normaliter in een omgeving waar ze worden blootgesteld aan de wrijvingskracht van verkeer, shear stress2. Shear stress is een belangrijke regulator van endothelial cel gene expression3en endotheliale cellen poging om de schuifspanning binnen een bepaald bereik2,4. Endotheliale cellen tonen angiogenic patronen in de afwezigheid van shear stress5 die perfusie van het weefsel kunt verbeteren. Regionale patronen van verstoorde stroom en veranderde shear stress worden geassocieerd met de expressie van genen van inflammatoire6 en de ontwikkeling van atherosclerose7,8. Modellen met shear stress zijn dus een belangrijk onderdeel van het endotheel genregulatie begrip.

Beschrijven we een methode voor het bestuderen van de genregulatie in vasculaire endotheliale cellen onder de schuifspanning. Dit systeem maakt gebruik van niet-Pulsatiele stroom en bootst vloeistof shear stress niveaus en gehalte aan zuurstof dat model voorwaarden voor arteriële endotheliale cellen. Dit protocol bevat details van methoden voor de gene knockdown met behulp van RNA-interferentie (RNAi), de set-up voor de toepassing van shear stress met parallel-plaat stroom apparatuur en methoden voor de piek van een exogene reference RNA vóór de analyse door reverse-transcriptase kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR). Deze pijpleiding wordt gebruikt voor het bestuderen van genregulatie in endotheliale cellen in de aanwezigheid en de afwezigheid van laminaire schuifspanning en omvat een aanpassing van het apparaat van de stroom van parallel-plaat beschreven door Lane et al. 9. deze bijzondere set-up was bedoeld om de gelijktijdige evaluatie van meerdere experimentele omstandigheden waarmee directe vergelijking van shear stress voorwaarden, alsmede de normalisatie van RNA analyse. Een grote verwarmde eenheid met gecontroleerde luchtvochtigheid wordt gebruikt om meerdere afzonderlijke stroom chambers en pompen gelijktijdig worden uitgevoerd met een spuitsnelheid gecontroleerd voor elke vergadering van de kamer stroom in real time. De toepassing van deze set-up wordt gebruikt voor gene knockdown met behulp van RNAi in de omgeving van laminaire flow/schuifspanning, maar aspecten van dit protocol kunnen worden toegepast op elke beoordeling van RNA expressie.

Gemeenschappelijke aanpak van de toepassing van shear stress voor endotheliale cellen omvatten microfluidic systemen10, een kegel-en-plate viscosimeter11, en een parallel-plaat flow kamer12. Microfluidic systemen van verschillende fabrikanten zijn nuttig bij het bestuderen van mechanobiology en mechanotransduction in meerdere cel en weefseltypes (HLA) en een verscheidenheid van biofysische stimuli geweest. Voor endotheliale cellen, zijn zij gebruikt om te studeren endotheliale cellen in isolatie, evenals de interactie van endotheliale cellen en de handel in immuun of tumor cellen10. Deze systemen zijn echter minder geschikt voor het herstel van grote aantallen cellen9. Zowel de kegel-en-plate viscosimeter en parallel-plaat stroom chambers toestaan dat het herstel van grote aantallen cellen in confluente monolayers12. Deze systemen kunnen allerlei schuintrekken krachten en patronen12genereren. De parallel-plaat flow kamer vergadering9 heeft het voordeel dat real-time beeldvorming door het glazen raam te evalueren van de cellulaire morfologie op elk tijdstip kan worden uitgevoerd. Bovendien kan het perfusaat onder steriele omstandigheden worden verzameld. Voor het systeem hier gepresenteerd, kan de stroom ook worden gevolgd in real time en in een multi-kamer set-up, dat het onderhoud van shear voorwaarden tussen kamers vergemakkelijkt.

Voor representatieve experimenten, menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVEC), die een macrovascular endothelial celtype vertegenwoordigt, worden gebruikt, en de shear stress voorwaarden die we gebruiken (1 Pa) arteriële omstandigheden (0,1 - 0,7 Pa). Echter dit protocol kan worden gebruikt met andere endothelial celtypes, en de voorwaarden van de afschuifweerstand kunnen worden aangepast volgens de experimentele vraag. Bijvoorbeeld, de evaluatie van menselijke endotheliale cellen in omstandigheden die model veneuze circulatie zou vereisen lagere niveaus van shear stress (1-6 Pa) en studies die model microvasculaire verkeer hebben gebruikt shear stress niveaus van 0.4 - 1.2 Pa13 , 14. Bovendien schuifspanning zelfs tussen endotheliale cellen binnen de dezelfde bloedvat6kan variëren. In de huidige opzet, een enkele controlesysteem wordt gebruikt dat tegelijkertijd vier afzonderlijke stroom lussen kunt controleren. Voor labs moeten meer stroom lussen, is er ruimte in de speciale omgeving voor een extra systeem van toezicht.

RT-qPCR wordt gebruikt voor de absolute kwantificatie van genexpressie in de omgeving van shear stress. De relatieve uitdrukking van doelgenen wordt vaak gebruikt om RNA expressie van voorwaarden met elkaar vergelijken. Sommige soorten RNA kan bestaan in zeer lage hoeveelheden of afwezig, dus complicerende relatieve metingen. Bijvoorbeeld, kunnen lang noncoding RNAs in endotheliale cellen krachtige effecten op relatief lage moleculen per cel5uitoefenen. Bovendien kunnen verschillen in de efficiëntie van de primer leiden tot een onjuiste interpretatie met behulp van de delta-delta cyclus drempel (Ct) methode om de gegevens te analyseren. Om aan deze bezorgdheid, voeren wij absolute kwantificatie door het genereren van een standaard curve met behulp van een bekende hoeveelheid van plasmide DNA. Anderzijds complementaire DNA (cDNA)-synthese is een inefficiënt proces, en verschillen in cDNA efficiëntie kunnen goed zijn voor verschillen in RNA expressie tussen voorwaarden en monsters15. De toepassing van shear stress en/of transfectie reagentia kan beïnvloeden celproliferatie, apoptosis en levensvatbaarheid, of toevoegen van onderdelen die met isolatie en/of cDNA synthese van RNA interfereren kunnen. Om de mogelijkheid van bias van RNA isolatie en cDNA synthese te verklaren, gebruiken we een spike-in RNA besturingselement gesynthetiseerd in het lab, toegevoegd op het moment van RNA extractie en gemeten met elke cDNA synthese via RT-qPCR. Dit maakt niet alleen de aanpassing voor technische in RNA extractie en cDNA synthese verschillen, maar maakt het ook mogelijk de berekening van de absolute hoeveelheden per cel, wanneer het aantal cellen is bekend.

Dit systeem maakt gebruik van aanvullende stappen te handhaven gelijkenis of verantwoordelijk voor de technische verschillen tussen voorwaarden. Wij benadrukken bijzonder volgt vanwege de complexe aard van deze experimenten, waarbij meerdere fysieke set-ups en experimentele omstandigheden die tot experimentele variabiliteit leiden kunnen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereiding van exogene referentie RNA

Opmerking: Kies een exogene verwijzing RNA dat niet bestaat in de soort of het model van belang. Voor zoogdieren systemen, kan firefly luciferase RNA worden gebruikt.

  1. Linearisatie van exogene referentie RNA plasmide
    1. Bereiden van exogene referentie RNA ten minste 48 uur vóór de verwachte RNA extractie. Verkrijgen of vervaardiging van een cDNA-kloon van de gekozen exogene verwijzing RNA, zoals een firefly luciferase cDNA kloon in een plasmide vector geschikt is voor in vitro transcriptie (Zie Tabel van materialen).
    2. Restrictie-enzym (RE) vertering van 1 µg full-length plasmide uitvoeren (de firefly luciferase plasmide is pSP-luc + beroepsmoraliteit 4100 bp) met behulp van single-cutter RE (XhoI) in 1.5-mL microfuge buizen. Kies een RE thats een enkele cutter (snijdt plasmide slechts 1 x) aan de 3' eind van de exogene verwijzing RNA-reeks die een 5' overhang of botte uiteinde laat. Voor een typische voorbereiding, verrichten u zeven plasmide linearisatie Reacties (stappen 1.1.4 - 1.1.7) parallel aan het genereren van voldoende concentratie van RNA en de hoeveelheid aan een aantal experimenten of een project te voltooien.
      1. Het meten van de concentratie van de plasmide met behulp van spectrofotometrie of spectrofluorometry.
      2. Een RE-mengsel in elke buis te bereiden: Voeg 4 µL van XhoI (20.000 eenheden/mL), 8 µL van RE buffer, x µL van plasmide (1 µg) en voldoende H2O naar een totale oplossing van 80 µL.
      3. Incubeer de RE-mengsel gedurende 2 uur bij 37 ° C. Gebruik de RE volgens protocol van de fabrikant, want alle wijzigingen leiden verhoogde ster activiteit of aspecifieke splitsing van DNA van het doel tot kunnen. Warmte inactivering van het reactiemengsel gedurende 20 minuten bij 65 ° C.
      4. De RE-digest met ethanol neerslag in elke buis te beëindigen. Aan de RE-mix, Voeg rechtstreeks 4 µL van 0.5 M EDTA pH 8.0, 8 µL van 3 M natrium acetaat pH 5.2 en 184 µL van 100% ethanol. Meng goed en bevriezen van het mengsel bij-20 ° C gedurende 30 minuten.
      5. Draai van het mengsel bij 4 ° C gedurende 20 minuten bij een relatieve centrifugale kracht (RCF) van 16.100 x g.
      6. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met een fijne tip, zonder te raken de pellet. De pellet gedurende 5 minuten drogen en resuspendeer het in 6 µL van H2O (opgewarmd tot 37 ° C) door pipetteren op en neer 5 x - 10 x.
      7. Bevestig de linearisatie van luciferase plasmide door de verteerd product uitgevoerd op 2% agarose gel met ethidiumbromide (EtBr) samen met een ladder 1 kb +, een supercoiled ladder, en knippen en Onbesneden plasmide. Inspecteer de gel en ga verder met de transcriptie in vitro als de baan voor de geknipte plasmide een enkele band op ~ 4 kb toont (het Onbesneden plasmide hebben drie bands; Figuur 1).
        Let op: EtBr is kankerverwekkend. Werken in een chemische zuurkast.
  2. In vitro transcriptie van exogene referentie RNA plasmide
    1. Voer voor elke buis verteerd plasmide vanproducten, in vitro transcriptie met behulp van een in vitro transcriptie methode (Zie Tabel van materialen). Volg de instructies van de fabrikant en gebruik van de juiste phage polymerase van RNA. Als de methode van cDNA synthese een poly(A) staart vereist, of andere toepassingen een poly(A) staart vereisen, kiezen voor een methode van in vitro transcriptie, waarin een poly(A) staart toevoeging (Zie Tabel van materialen).
    2. Combineer alle in vitro getranscribeerd producten in een enkele 1.5-mL polypropyleen buis voorafgaand aan de zuivering.
  3. Purif ties van RNA uit de transcriptie in vitro reactie
    1. In vitro transcriptie zuiveren producten met een in vitro transcriptie schoonmaak kit (Zie Tabel van materialen). Volg protocol van de fabrikant.
    2. Beoordelen van de RNA-concentratie door het meten van de absorptie bij 260 nm met behulp van spectrofotometrie.
      Opmerking: RNA concentratie wordt berekend volgens de wet van Lambert-Beer. Daarin staat dat de extinctie van nucleic zuren (die absorberen licht sterk op 260 nm) is evenredig met de concentratie. Een extinctie van 1.0 is gelijk aan 40 µg/mL single-stranded RNA.
  4. Aliquoting de voorraad RNA in PCR buizen voor experimenteel gebruik
    1. Controleer dat de concentratie van RNA is 1 µg/µL.
      1. Indien de concentratie van RNA > 1 µg/µL, Verdun de voorraad aan 1 µg / µL. aliquoot 1 µL in PCR buizen en bewaar ze bij-80 ° C.
      2. Als de concentratie van RNA < 1 µg/µL is, kan extra neerslag met 5 M ammoniumacetaat (meegeleverd in de kit) worden uitgevoerd volgens protocol van de fabrikant. Als de concentratie van RNA nog steeds < 1 µg/µL is, gaat u verder met aliquoting 1 µL in PCR buizen.

2. Schuif Coating

Opmerking: Moet stappen 2.1-2.10 uitgevoerde 24-48 h voorafgaand aan het zaaien van de verwachte cel.

  1. Verwarm de oven tot 250 ° C.
  2. Met behulp van steriele handschoenen, wikkel elke glasplaatje 2 x met aluminiumfolie. Raak het oppervlak van de dia direct.
  3. Bak de dia's in de oven gedurende 1 uur bij 250 ° C en laat de dia's afkoelen tot kamertemperatuur.
    Opmerking: Deze stap is belangrijk voor de vernietiging van alle contaminerende endotoxine.
  4. Terwijl de dia's zijn koeling, maken van een stamoplossing van fibronectine van 1 mg/mL met gedestilleerd water en Incubeer het gedurende 30 minuten bij 37 ° C te ontbinden. 100-µL aliquots maken De aliquots voor onmiddellijk gebruik gereserveerd en bevriezen van de resterende aliquots voor toekomstig gebruik.
  5. Het uitpakken van de buitenste omhulsel van aluminiumfolie alvorens het glasplaatje in een bioveiligheid kabinet. Voer stappen 2.6-2.7 en 2.9 in het biosafety kabinet.
  6. Plaats het glasplaatje in een steriele rechthoekige 4-well cel cultuur schotel.
  7. Fibronectine stockoplossing 1:100 met gedestilleerd water verdunnen. Jas van elke dia met 1 mL verdunde fibronectin, druppel voor druppel, met behulp van een precisiepipet. Zorg ervoor dat de hele dia wordt gedekt.
  8. Incubeer de dia's in een weefselkweek incubator bij 37 ° C gedurende 24-48 uur.
  9. Na de incubatie, gecombineerd de fibronectine door het kantelen van de 4-well cel cultuur schotel. Raak de dia rechtstreeks met de aspirator.

3. cel zaaien op glas dia 's

  1. Tellen van de menselijke endotheliale cellen bij vroege passage (doorgang 2-5) en seed ~1.0 x 106 cellen op elke fibronectine beklede glasplaatje met 1 mL van media (1.0 x 106 cellen/mL media). Beënt de cellen 24 h vóór de verwachte toepassing van laminaire flow als geen andere behandeling is om te worden uitgevoerd.
    Opmerking: Deze getallen zijn gebruikt als een gids voor experimenten met 24u van stroom.
    1. Pas de seeding dichtheid om een confluente enkelgelaagde van cellen op het moment van oogsten van de cel en RNA extractie.
  2. Laat de cellen die voldoen aan de dia gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
  3. Voeg 3 mL media in elk putje van de cel cultuur schotel ter dekking van de dia, en Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 24 uur met 5% CO2.

4. kleine invloed RNA (siRNA) transfectie

  1. Voorbereiding van cellen op glas dia's van siRNA transfectie en stroom experimenten
    1. Volg het protocol in stap 2 (dia coating) en 3 (cel zaaien in glas dia's) voor het prepareren van objectglaasjes glas en de coating voor stroom experimenten.
    2. Zaad cellen 24 h vóór de siRNA behandeling (48u vóór de toepassing van laminaire flow).
    3. Zaad menselijke endotheliale cellen in antibioticum-vrije media op 750.000 tot 1 x 106 cellen per dia tot de samenvloeiing van de 85% - 95% de volgende dag.
      Opmerking: HUVEC worden gebruikt in dit protocol.
  2. Voorbereiding van siRNA lipide-gebaseerde transfectie reagens complexen (per dia)
    1. Het ontwerpen van aangepaste siRNAs of bestel premade siRNAs voor het gewenste gen van belang.
      Opmerking: De volgende stappen uitvoeren in een kabinet bioveiligheid.
    2. Voeg 6 µL van siRNA (20 µM stock) in 414 µL van verminderde serum medium (Zie Tabel van materialen) en meng zachtjes door pipetteren.
    3. Verdun 49,5 µL van zachtjes gemengde lipide gebaseerde transfectiereagens (Zie Tabel van materialen) in 130.5 µL van verminderde serum medium.
    4. Meng voorzichtig en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    5. Combineren van verdunde siRNAs en lipide-gebaseerde transfectiereagens, meng zachtjes en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Mix voorzichtig om te voorkomen dat verstoring van het lipide gebaseerde transfectie reagens complexen.
      Opmerking: Kan de oplossing troebel als complexen formulier verschijnen.
    6. Terwijl complexen uitmaken, verwijderen van het groeimedium, en wassen van de cellen 1 x met verminderde serum medium.
    7. 2.4 mL van verminderde serum medium aan elke dia toevoegen.
    8. 600 µL van zachtjes gemengde siRNA lipide-gebaseerde transfectie reagens complexen toevoegen aan elke plaat, en rock van de plaat heen en weer te mengen. De uiteindelijke concentratie van siRNA er 40 nM. Zorg ervoor dat de dia volledig bedekt is.
    9. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 4 uur.
    10. Voeg 1 mL antibiotica-vrij endothelial cel groei media met 3 x de normale concentratie van foetale runderserum (FBS) zonder het verwijderen van de transfectie mengsel.
    11. Incubeer de cellen bij 37 ° C tot klaar voor gebruik.

5. berekening van de stroomsnelheid op basis van de gewenste Shear Stress9

  1. Berekenen van het debiet op basis van de gewenste schuifspanningen volgens de volgende vergelijking:
    Equation 1
    Hier,
    Q is de stroomsnelheid in mL/min;
    Τ is de gewenste schuifspanning in dynes/cm2 (1 Pa = 10 dynes/cm2);
    w is de breedte van de kamer van de parallel-plaat stroom in cm;
    h is de hoogte van de kamer van de parallel-plaat stroom in cm;
    µ is de viscositeit van de media in cP (g/cm·s).
    Opmerking: Typische laminaire schuifspanning experimenten (niet-Pulsatiele) in deze werkstroom zijn uitgevoerd op τ = 1 Pa (10 dynes/cm2). µ kan worden gemeten met een viscosimeter zoals een kegel-en-plate viscosimeter en kan variëren afhankelijk van de inhoud van de media met inbegrip van het serum en de extra dextran9.
  2. Aanpassen om een specifieke τ (shear stress), de stroomsnelheid en/of de viscositeit. Bij hoger debiet, kunnen Adherente cellen distantiëren van de dia. Monster debiet met typische stroom kamers staan vermeld in tabel 1.

6. de opzet van een speciale omgeving voor Monitoring systeem en meerdere Parallel-plaat Flow Chambers (figuur 2)

  1. Een grote verwarmde eenheid/incubator gebruiken met meerdere planken, interne elektriciteitsmarkt toegang en glazen deuren — genoemd naar het strand (ingebouwde omgeving met instelbare CO2 ) en warmte — naar het huis van meerdere stroom kamers tegelijk voor experimenten die vereisen zowel schuifspanning en directe vergelijking tussen twee of meer behandelingen of uitgangen (d.w.z., DNA, RNA en eiwitten).
    Opmerking: Het strand zorgt voor regelmatige monitoring van het stroom circuit, met inbegrip van de stroomsnelheid, zonder frequente verstoring van het milieu.
  2. Zorgen voor voldoende CO2 is beschikbaar voor het experiment en dat de CO2 -monitor functioneel is. Zorgen voor dat de water-lade op de juiste wijze is gevuld, zodat zal er bevochtigde lucht.

7. de opzet van het apparaat van de stroom van Parallel-plaat

Opmerking: Raadpleeg voor de vervaardiging van parallelle platen, Lane et al. 9.

  1. Autoclaaf de stroom kamer platen, reservoir, demping, leidingen en Luers voor elke set-up van parallel-plaat flow kamer, zoals aangegeven in tabel 2.
  2. Set-up van de stroom lus vergadering (figuur 3).
    1. Plaats steriele handdoeken in de biologische veiligheid kabinet. Monteer de lus-stroomsysteem, eerst zonder de parallel-plaat flow kamer, in het kabinet-biologische veiligheid.
    2. Sluit de vergadering van de leidingen voor het reservoir:
      1. Plaats een harde buis van #14 in een gat en de zachte buizen twee #14 in de andere twee gaten in de dop van het reservoir van de stroom. Zorg ervoor dat een van de zachte buizen de bodem van het reservoir als uitstroom slang aanraakt.
      2. Plaats een 1/16" mannelijke Luer aan het einde van de #14 harde tube en een steriel filter als een ontluchter hechten.
      3. Plaats een 1/16" vrouwelijke Luer aan het einde van de #14 zachte instroom tube, afkomstig uit het reservoir, en bevestig de afsluiter van een 4-weg.
        Opmerking: Voor gen expressie analyse of andere studies waar de perfusates moet niet te worden verzameld, 2-weg kranen kunnen worden gebruikt in plaats van 4-way kranen in dit protocol.
      4. Plaats een 1/16" mannelijke Luer aan het einde van de buis #14 zachte uitstroom, afkomstig uit het reservoir.
    3. Het reservoir uitstroom buizen verbinden met pomp slang: plaats een 1/16" vrouwelijke Luer aan weerszijden van een harde buis van #13 (pomp slang). Verbinden met de buis #14 zachte uitstroom uit het reservoir de #13 harde buis door het aansluiten van 1/16" mannelijke en vrouwelijke Luers samen.
    4. Sluit de slang van de pomp met "demping passerelle" tubing: plaats een 1/8" mannelijke Luer en een 1/8" vrouwelijke Luer aan weerszijden van een zachte buis van #16. Verbinding maken met de 1/16" vrouwelijke Luer van de #13 harde buis (aan het einde van de uitstroom van de slang van de pomp) met de 1/8" mannelijke Luer van de #16 zachte buis.
    5. Samenstellen van buizen voor de demping van de stroom: plaats een 3/16" mannelijke Luer aan het ene uiteinde van de #25 zachte buis en herhaal dit voor de andere kant van de demping van de stroom. De vrije uiteinden van de #25 zachte buizen hechten aan elke zijde van de demping van de stroom.
    6. De "demping passerelle"-buizen verbinden met buis voor de demping van de stroom: verbinding maken met een zachte buis van #25 van de demping van de stroom met de zachte buis van #16 van de "demping passerelle" met behulp van de 1/8" vrouwelijke Luer van de demping #16"passerelle"-kant en de al geplaatste 3/16" mannelijke Luer de #25 zachte demping buis kant.
    7. "Kamer passerelle" buis monteren:
      1. Plaats een 1/8" vrouwelijke Luer en een 1/8" mannelijke Luer aan weerszijden van een zachte buis van #16 ("kamer passerelle" buis).
      2. Verbinding maken met de 1/8" vrouwelijke Luer van de"passerelle"' kamer' met de 3/16" mannelijke Luer op de #25 zachte buis van het vrije uiteinde van de demping van de stroom.
      3. Op de 1/8" mannelijke Luer (vrije uiteinde) van de slang"kamer passerelle", plaats de afsluiter van een 4-weg.
    8. Verbinden met de 4-weg afsluiter van het vrije uiteinde van de "kamer passerelle" de 4-weg afsluiter van het reservoir instroom zachte buizen (uit stap 7.2.2.3). Sluit de kranen.
    9. Media toevoegen aan het reservoir en de demping. Voor de 48 uur blootstelling aan stress schuintrekken, 35 mL media aan het reservoir en 25 mL tot de demping te toevoegen. Regel het volume van de media op basis van de duur van het experiment van de doorstroming en het aantal cellen zaadjes.
    10. De geassembleerde stroomsysteem voor de lus aan de pomp in het strand brengen. Plaats de #13 harde buis (pomp buis) in het hoofd van de pomp en veilig. Open de kranen.
    11. Zet de pomp en Verhoog langzaam het toerental van de pomp. Laat de media circuleren door middel van de lussensysteem. Controleer eventuele lekkage of blokkade (b.v., druk opbouw). Ervoor zorgen dat de media Terug naar het reservoir stroomt.
  3. Opzet van de vergadering van de kamer van de stroom
    1. Plaats een 1/8" vrouwelijke Luer aan het ene uiteinde van een #16 zacht tube en het koppelen van een 4-weg-afsluiter. Het vrije uiteinde van de buis aan de juiste kant van de bovenste plaat (instroom kant) koppelen.
    2. Plaats een 1/8" mannelijke Luer aan het ene uiteinde van een #16 zacht tube en het koppelen van een 4-weg-afsluiter. Het vrije uiteinde van de buis aan de linkerkant van de bovenste plaat (uitstroom kant) koppelen.
    3. Plaats een 1/8" mannelijke Luer en een 1/8" vrouwelijke Luer aan weerszijden van een zachte buis van #16 (bubble trap buis). Sluit de slang aan op bubble trap via de 1/8" mannelijke Luer. Een 4-weg afsluiter hechten aan het andere uiteinde van de slang via de 1/8" vrouwelijke Luer.
    4. Met behulp van steriele pincet, overbrengen in de cel-geplaatste glasplaatje uit de 4-well cel cultuur schotel de uitsparing op de bodemplaat. Zorg ervoor dat de cel-geplaatste kant van het glasplaatje boven ligt.
    5. Behulp van een spuit van 10 mL, voeg toe 10 mL warme media aan de bodemplaat binnen de pakking van de rode lijn rond de plaat. Laat de media stromen door de dia te dekken van de cellen. Vermijd het toevoegen van media direct in de dia verschijnt.
    6. Voorzichtig plaats de bovenste plaat op de bodemplaat, uitlijnen van de ene kant naar de andere. De invoering van luchtbellen vermijden. De platen aan elkaar schroeven stevig vast.
    7. Luchtbellen uit het waterventiel verwijderen door te openen van de afsluiter aan de rechterkant (instroom) van de plaat en voorzichtig spoelen 20 mL warme media met behulp van een 30-mL spuit. Controleer of de afsluiter aan de linker kant (uitstroom) van de plaat is gesloten en dat de media via de bubble trap afsluiter (open stroomt). Gooi de afgeboekte media.
    8. Sluit de afsluiter op de waterventiel en openen van de afsluiter aan de linker kant (uitstroom) van de kamer. De linkerzijde (uitstroom) van de kamer te verheffen tot een hoek van 45° en zacht leegmaken 20 mL warme media met behulp van een spuit voor 30 mL vanaf de rechterkant (instroom) van de kamer voor het verwijderen van luchtbellen uit de zaal. Bubbels kunnen worden gevisualiseerd door het raam. Gooi de afgeboekte media.
    9. Sluit de kranen aan beide zijden van de kamer en het gemeenschappelijk landbouwbeleid. Inspecteer de cellen door microscopie.
    10. Het vervoer van de zaal naar het strand met de eerder geassembleerde lussysteem.
    11. Langzaam verlagen van het toerental van de pomp en de pomp te onderbreken. Sluit de kranen op de stroom lussensysteem ter voorkoming van lekkage.
    12. Sluit de zaal en lus systeem samen via kranen. Alle de kranen open.
    13. Langzaam verhogen van het toerental van de pomp en onderzoeken de set-up voor elke lekkage of blokkade. Controleer de media circuleert in één richting en keert terug naar het reservoir.
    14. Plaats de flowsensor op de buis van de "kamer passerelle" gelegen aan de kant van de instroom van de kamer. Zorg ervoor dat de sensor is goed georiënteerd in de richting van de stroom.
    15. Pas de snelheid van de pomp om te verkrijgen van het debiet dat voorheen werd berekend op basis van de gewenste schuifspanning.
      Opmerking: Het debiet kan variëren afhankelijk van de hoogte en de breedte van elke kamer, alsmede de viscositeit van de media.
    16. Inschakelen van de CO2 -tank te bereiken van 5% CO2 en plaats de lade van een water binnen het strand.

8. oogsten van de cellen en de extractie van RNA uit de Flow-zaal

  1. Zodra de gewenste duur van stroom voltooid is, langzaam de peristaltische pomp snelheid op 0 zet en de stroom uitschakelen. Snel sluiten alle de kranen open en verwijder de kamer en de bijgevoegde buizen met een afsluiter aan elk uiteinde.
  2. Neem de kamer naar een schone benchtop en verwijder voorzichtig alle schroeven te verwijderen van de bovenste plaat. Met behulp van naald-neus pincet, het glasplaatje uit de bodemplaat verwijderen en plaatsen het in een schotel van 100 mm diameter weefselkweek.
  3. Wassen van de dia met 10 mL koude-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)- / - en controleer de cellen onder een microscoop te bevestigen de naleving van de cel en de uitlijning in de richting van de stroom.
  4. Gecombineerd de PBS van de plaat en de dia overbrengen in een schone 100 mm diameter schotel. Voeg 350 µL van lysis buffer van het RNA extractie kit (Zie Tabel van materialen), met 1/100 van de bèta-mercaptoethanol, naar de dia.
    Let op: Voeg bèta-mercaptoethanol in een chemische zuurkast.
  5. De cellen van de dia met behulp van een polyethyleen-blads cel schraper Schraap. Kantelen van de schotel van weefselkweek, waardoor de vloeistof zwembad aan de onderkant, en verwijder het glasplaatje met een tang. Pipetteer van de cel lysate in een 1.5-mL-buis en bewaar deze op ijs.
  6. Verdunde voorraad exogene verwijzing RNA (luciferase RNA) naar 0.0025 ng/µL via seriële verdunning voorafgaand aan het aan het monster toe te voegen. Bijvoorbeeld, als de voorraad concentratie 1 µg/µL is, een verdunning van 1/400.000 is vereist om 0.0025 ng / µL. toevoegen 10 µL van verdund luciferase RNA aan elk monster van cel lysate voor downstream RNA isolatie en analyse.
  7. Doorgaan met het RNA extractie protocol volgens de instructies van de fabrikant, of bevriezen de lysate bij-80 ° C tot kunnen gaan met de extractie.

9. berekening van de efficiëntie van het RNA extractie en cDNA synthese

Opmerking: Bereken de luciferase efficiëntie na RT-qPCR door het vergelijken van de theoretische opbrengst en de experimentele opbrengst.

  1. Het bepalen van de theoretische opbrengst van luciferase RNA.
    1. Het bepalen van de totale hoeveelheid luciferase kopieën per monster toegevoegd. (Toevoegen van 0,025 ng/monster = 2.73 x 107 exemplaren van luciferase RNA per monster vóór RNA extractie.)
    2. Bereken de moleculaire massa van de luciferase RNA met behulp van een gemiddelde moleculaire massa per nucleotide van 330 g/mol en vermenigvuldiging met de lengte van de firefly luciferase RNA, 1652 nucleotiden.
    3. Verdeel de hoeveelheid luciferase RNA toegevoegd (0,025 ng) voor elk monster vóór RNA extractie door de molecuulmassa aan opbrengst de molaire hoeveelheid. Vervolgens, vermenigvuldig dat met Avogadro van nummer opleveren van de kopieën per monster toegevoegd.
    4. Bereken de theoretische opbrengst van de luciferase kopieën voor elke reactie RT-qPCR met behulp van de vergelijking:
      Equation 2
  2. Bereken de experimentele opbrengst voor de luciferase kopieën voor elke reactie RT-qPCR met behulp van de plasmide luciferase voor het genereren van een standaard curve voor RT-qPCR.
  3. Bereken de luciferase rendement (%) met behulp van de vergelijking:
    Equation 3

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Succesvolle linearisatie van luciferase plasmide met behulp van restrictie-enzymen werd bevestigd door lopende verteerd producten op een agarose gel (Figuur 1). De grootte van het gelineariseerde product werd bevestigd met behulp van DNA ladders en vergelijking met Onbesneden plasmide.

We hebben de parallel-plaat flow kamer set-up van Lane et al. aangepast 9 voor experimenten die meerdere voorwaarden/behandelingen met shear stress of meerdere shear stress voorwaarden vereisen. We gebruiken een speciale omgeving, het strand, dat kan meerdere huis, volledig geassembleerde stroom circuits dat alle debiet (figuur 2) hebben gevolgd. Het debiet wordt gecontroleerd net voorafgaand aan de vergadering van de parallel-plaat (figuur 3). De stroom circuits en tarieven controleerbaar rechtstreeks via glazen deuren zonder schommelingen in temperatuur, vochtigheid of gasinhoud binnen het strand.

Productieprocessen kan leiden tot kleine verschillen in hoogte van de kamer. Debiet moeten dus worden berekend voor elke kamer tot het bereiken van de zelfde schuifspanning (tabel 1). In theorie, kamers met identieke hoogten identiek debiet kunnen gebruiken om de dezelfde schuifspanning en kunnen worden gebruikt in de serie. Typische expermenteren endotheliale cellen gebruiken schuifspanning voor 0 - 1,5 Pa. laminaire schuifspanning 1 Pa werd gebruikt in deze werkstroom model arteriële endothelial schuifspanning. Er kunnen ook variaties tussen pomp hoofd instellingen en binnen de hoofden van de pomp na verloop van tijd met gebruik. Met behulp van de debietmeter kan goed zijn voor deze verschillen.

Experimenten met behulp van de toepassing van shear stress vaak betrekking hebben op meerdere shear stress voorwaarden, voorwaarden van behandeling en tijdstippen. Waar mogelijk gebruiken we een endogene verwijzing RNA naar de rekening voor elke variabiliteiten in de experimentele opstelling. Voor sommige experimenten, vinden een endogene referentie RNA met kwantitatieve stabiliteit is niet haalbaar16. Bovendien, kwantitatieve stabiliteit of instabiliteit van endogene referentie genen tussen monsters kan worden toegeschreven aan beide prikkel-afhankelijke effecten op cellulaire expressie niveaus of variaties in efficiëntie van RNA extracties of omgekeerde transcriptie. Om voor deze inefficiënties, en in de instelling waar een endogene referentie-gen niet kwantitatief stabiel is te verklaren, gebruiken we een spike-in exogene referentie-gen. Voor experimenten met laminaire shear stress in de endotheliale cellen van zoogdieren, gebruiken we een firefly luciferase RNA als een exogene RNA spike-in (figuur 4A).

Figuur 4 toont geanalyseerde RT-qPCR experimentele gegevens van shear stress experimenten beoordeling van Krüppel-achtige factor 2 (KLF2) verlies-van-functie met behulp van siRNA. KLF2 is een transcriptie factor upregulated door laminaire flow in de endotheliale cellen en een grote transcriptionele bemiddelaar van endothelial genexpressie in de omgeving van laminaire flow2.

Figuur 4A toont luciferase efficiëntie voor drie aparte experimenten, elk met twee kamers van de stroom. Luciferase efficiëntie kunnen worden vergelijkbaar tussen monsters van een experiment (experimenteren 1) of Toon van sommige variabiliteit (experimenten 2 en 3) (figuur 4A). Deze resultaten zijn vooral waardevol in experimentele systemen waarin slechts kleine wijzigingen van de absolute worden beschouwd. Het gebruik van een exogene referentie-gen kan met name belangrijk in experimenten waar experimentele behandelingen kunnen interfereren met de doeltreffendheid van omgekeerde transcriptie of PCR17. De resultaten afgebeeld in figuur 4A zijn typisch. Een luciferase rendement van 5% geeft aan dat 5% van de luciferase RNA (dat wil zeggen, het eerste beginbedrag van RNA) toegevoegd aan het monster vóór RNA extractie is gedetecteerd door RT-qPCR. Tussen monsters of voorwaarden binnen een enkele experiment, luciferase efficiencyeffecten zijn meestal ± 50%. Resultaten moeten met de nodige omzichtigheid worden geïnterpreteerd als de variabiliteit van luciferase efficiencyverbeteringen > 50% en een herziening van de experimentele procedures en voorwaarden moet omvatten.

Figuur 4B toont typische experimentele resultaten van RT-qPCR uit herhaalde schuifspanning experimenten, elk met behulp van meerdere parallelle-plaat stroom kamers. Binnen elk experiment, is KLF2 mRNA uitdrukking genormaliseerd op drie manieren. De eerste normalisatie gebruikt een endogene referentie RNA, Cyclophilin A (CycA). De tweede normalisatie maakt gebruik van een exogene referentie RNA, firefly luciferase (Luc). De derde normalisatie gebruikt zowel de endogene en exogene verwijzing RNA. Binnen elk experiment weergegeven in figuur 4B, alle drie normalisatie methoden (normalisatie het endogene referentie-gen, het gen exogene verwijzing en beide samen endogene en exogene referentie-genen) vergelijkbare resultaten oplevert. Als de methode van de normalisatie aanzienlijk verandert de resultaten (bvleidt tot verschil van > 50%), moeten de resultaten worden geïnterpreteerd met de nodige voorzichtigheid. Wanneer er aanzienlijke variabiliteit tussen de methoden van de normalisatie, moet de gene(s) van de endogene verwijzing worden herzien, als het kan een afhankelijke variabele in het experimentele systeem. Ook moeten de experimentele procedures en voorwaarden worden herzien. In figuur 4Blevert KLF2 knockdown met behulp van siRNA soortgelijke vechtpartij efficiëntie tussen drie aparte experimenten (Experiment 1, 2 en 3). We gebruikt drie verschillende biologische monsters voor deze experimenten, met behulp van twee gelijktijdig lopende stroom kamers met shear stress bij 1 Pa voor elk experiment.

Figure 1
Figuur 1: Agarose gel beeld van de linearisatie van exogene luciferase plasmide. Supercoiled en 1 kb + DNA ladders worden gebruikt als markers om te bepalen zowel Onbesneden en snijd luciferase plasmide maten in kilobases (kb). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Schematisch overzicht van meerdere stroom circuit assemblees in een toegewijde omgeving (het strand). De stroomsnelheid in zowel stroom circuits zijn gemakkelijk gecontroleerd in real-time, zonder verstoring van het milieu, en beide circuits kunnen gelijktijdig worden uitgevoerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Schematisch overzicht van een enkele stroom circuit vergadering. De buis maten en Luers gebruikt zijn aangegeven in deze figuur. Ervoor zorgen dat de flowmeter is georiënteerd in de richting van de stroom en stroomopwaarts van de stroom kamer geplaatst. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: vertegenwoordiger resultaten uit KLF2 verlies-van-functie experimenten in menselijke endotheliale cellen als u wilt schuintrekken stress worden blootgesteld (1 Pa) voor 24 h. (A) dit paneel toont de kwantificering van exogene luciferase RNA in drie aparte stroom experimenten. Luciferase efficiëntie kunnen worden vergelijkbaar tussen monsters van een experiment (experimenteren 1) of Toon van sommige variabiliteit (experimenten 2 en 3). Luciferase (absolute kopieën) is het exemplaaraantal van luciferase RNA gedetecteerd door kwantitatieve PCR reverse-transcriptase (RT-qPCR) door absolute kwantificatie met behulp van een standaard curve. Luciferase efficiëntie is de experimentele luciferase-kopieën gedeeld door de theoretische luciferase kopieën voor elk monster vermenigvuldigd met 100 (zie stap 8 van het protocol). Relatieve luciferase efficiëntie is de luciferase efficiëntie van elk monster gedeeld door de referentie-voorwaarde (Flow + Ctlsi) binnen elk experiment. (B) deze panelen Toon de normalisering van de genexpressie in een aantal monster schuifspanning experimenten met behulp van beide genen endogene en exogene referentie. De resultaten zijn van kwantitatieve PCR reverse-transcriptase (RT-qPCR). Knockdown van KLF2 mRNA uitdrukking wordt weergegeven in het bijzijn van laminaire flow met shear stress van 1 Pa voor 24 h. FC = vouw wijzigen; CycA = cyclophilin A, gebruikt als een endogene verwijzing RNA; Luc = luciferase, gebruikt als een exogene verwijzing RNA. De gegevens aangepast van Man et al. 5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Kamer hoogte
(micron; µm)		 Kamer breedte
(centimeter; cm) 		Flow Rate (mL/min) voor 1 Pa shear stress Viscositeit (centipoise; cP)
303.80 1.90 19.48 0.90
326.10 1.90 22.45 0.90
344.84 1.90 25.10 0.90
319.06 1.90 21.49 0.90

Tabel 1: Vergaderzaal hoogten en voorbeelden van debiet voor verschillende kabinetten van de stroom om de schuifspanning van 1 Pa.

J doeken
Pincet
Reservoir fles en Cap
Demping en Cap
Stroom lus
1/16" mannelijke Luer x 3
1/16" vrouwelijke Luer x 3
1/8" mannelijke Luer x 2
1/8" vrouwelijke Luer x 4
3/16" mannelijke adapter x 2
14 L/S harde buis (2 inch) x 1
14 L/S zachte buis (5 inch) x 2
16 L/S zachte buis (3 inch) x 2
25 L/S zachte buis (3 inch) x 2
13 L/S harde buis (10 inch) x 1
Flow kamer
1/8" mannelijke Luer x 2
1/8" vrouwelijke Luer x 2
16 L/S zachte buis (3 inch) x 3
Boven- en onderkant platen
Schroeven

Tabel 2: Onderdelen worden gesteriliseerde met autoclaaf in stap 6.2 van het protocol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Shear stress is een fysiologische toestand die de functie van het endotheel, gedeeltelijk moduleert door het beïnvloeden van de stationaire toestand gen expressie2,5. Modellen van genregulatie in verschillende shear stress omstandigheden zal bijdragen tot een beter begrip van endothelial functie. Deze pragmatische workflow omvat een circuit van de stroom met behulp van een kamer van de stroom van parallel-plaat aangepast van Lane et al. 9 en vertegenwoordigt laminaire, niet-Pulsatiele stroom. De algemene opzet was bedoeld om experimenten die vereisen meerdere stroom kamers en experimentele variabiliteit in deze instelling te minimaliseren.

De vergadering van de stroom-circuit is een belangrijk onderdeel van deze workflow en uit Lane et al. is aangepast 9. verschillende aanpassingen van deze vergadering en protocol zijn aangebracht weerspiegelen verschillen in de experimentele systemen. Een grote verwarmde eenheid, het strand, is een aanpassing die vergemakkelijkt de gelijktijdige werking en monitoring van verschillende circuits van de stroom binnen dezelfde omgeving. Dit systeem met succes is gebruikt voor de toepassing van shear stress bij endotheliale cellen voor verschillende periodes, van 1 h tot 7 dagen, en op verschillende niveaus van shear stress (bijvoorbeeld1.0, 1.5, en 2.0 Pa). Dit systeem werd het ook gebruikt voor gene vechtpartij studies om te beoordelen van de functie van een stroom-responsieve endothelial gen in de omgeving van shear stress (afbeelding 4)5. Er is een aanzienlijke variabiliteit tussen de pompen en hoofden van de pomp, die ook in de tijd als gevolg van normaal gebruik en slijtage veranderen kan. Om deze verschillen te verklaren, gebruiken we een flowsensor ligt proximaal aan de kamer van de stroom continu volgen debiet. Verschillende maten van leidingen en Luers worden gebruikt om een strakke pasvorm voor elk onderdeel en ter voorkoming van lekkages tijdens experimenten. We geteld cellen en ontpit ongeveer 1.000.000 cellen per glasplaatje, dropwise, en laat dan de cellen Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten naleving van efficiëntie te vergroten. Ten opzichte van endotheliale voorlopercellen, die voor een korte tijd vóór de toepassing van shear stress9kunnen worden uitgezaaid, zaad wij menselijke endotheliale cellen gedurende ten minste 24 uur vóór de toepassing van shear stress. Kortere looptijden kunnen leiden tot het loskomen van cellen tijdens de stroom, of een niet-aaneengesloten laag van endotheliale cellen, zelfs met de juiste seeding dichtheid. Wij benadrukken de inspectie van de dia's voor een confluente enkelgelaagde endotheliale cellen zowel voorafgaand aan als na de toepassing van de schuifspanning. Wij vinden dat dia's bedekt met fibronectin, een natuurlijke extracellulaire matrix onderdeel18, de endothelial enkelgelaagde meer consequent ten opzichte van zijden bekleed met gelatine handhaven (gedenatureerd fibrillar typ ik collageen). Tot slot, de demping van de stroom in dit protocol zijn geoptimaliseerd voor het gebruik van media, in vergelijking met 190 mL van media voor andere fabrikanten 30 mL.

Verschillende stappen in de vergadering van de stroom circuit vereisen extra zorg. Een zelfs enkelgelaagde endotheliale cellen moet worden vastgesteld voor het verlijmen van shear stress. Het is belangrijk om zaad cellen op het glasplaatje ontkleuring te verhogen van het aantal cellen die aan de dia en daarmee de algehele dekking van dia voldoen. De wachttijd tussen cel zaaien en extra media in het algemeen aan de dia toe te voegen wordt seeding efficiëntie verbeterd aangezien deze voldoende tijd voor de cellen die biedt moeten voldoen aan de dia in plaats van weggewassen worden in de lade, meerdere dia. Cellen worden visueel inspecteren vóór, tijdens en na de toepassing van de schuifspanning. Een microscoop kan worden geplaatst in het strand voor dit doel. De flowsensor moet worden vastgemaakt in de juiste stand en het debiet van de doelstelling moet worden gecontroleerd voor elke individuele flow kamer. De stroom lussensysteem moet worden geperfundeerd zonder de kamer om ervoor te zorgen geen lekkage van de media of andere problemen, zoals de opbouw van de druk, om te voorkomen dat de storing veroorzaakt de cellen tijdens de feitelijke experimenten. Inspecteer op en elimineren van luchtbellen in het systeem. Tijdens het testen van de stroom lussensysteem, zorgen de kranen alle geopende voordat ik overga op de peristaltische pomp voor ononderbroken, unidirectionele stroom. Er zorg voor dat alle kranen zijn gesloten vóór de zaal stroom aansluiten in de lus en volledig geopend voordat het opnieuw opstarten van de pomp.

Wij vinden dat de toevoeging van een exogene referentie-gen nuttig in een aantal verschillende scenario's is. Endothelial cel media bevat vaak heparine, die een remmer van PCR17 is. Terwijl sommige protocollen van de extractie van RNA stappen nemen voor het verwijderen van heparine, kan bedragen op te sporen verschillen in PCR efficiëntie tussen de monsters. Krachtige behandelingen kunnen ook de identificatie van een endogene referentie-gen dat is kwantitatief stabiel beletten. Onze lab heeft een efficiënt protocol om te synthetiseren 5'-afgetopte en poly-A-tailed luciferase RNA voor gebruik als een exogene referentie RNA gemaakt. Deze strategie is gebleken een rendabele benadering in vergelijking tot de aankoop van een commercieel beschikbare RNA. Tijdens de voorbereiding van exogene referentie RNA is het belangrijk om aliquoot RNA in eenmalig gebruik aliquots om te voorkomen dat meerdere bevriezen-ontdooien cycli. Homogenisatie van het mengsel en nauwkeurige pipetteren zijn cruciaal voor de Inter aliquoot consistentie van. Typische experimenten tonen een luciferase efficiëntie in de range van 5 ± 2,5%, maar kunnen variëren van 1-10%. Het is verstandig om de resultaten van de RT-qPCR voor zowel de exogene referentie RNA-efficiëntie en een gen van de endogene Referentie (huishouden) corrigeren.

Voor de experimenten die wij voeren, worden firefly luciferase sequenties gebruikt als een niet-zoogdier spike-in verwijzing RNA in zoogdieren modellen. In experimenten waar firefly luciferase wordt uitgedrukt in cellen, zou dit niet een geschikte referentiestoffen gen. Andere genen soortspecifieke referentie kunnen worden gebruikt, met inbegrip van de Caenorhabditis elegans miRNA cel-miR-3919 en ribulose difosfaat carboxylase plantaardige RNA20.

Dit circuit flow modellen een 2D-enkelgelaagde endotheliale cellen geteeld op weefselkweek plastic of glas, die vrij stijf is. Matrix stijfheid kan beïnvloeden het endotheel antwoord op vloeistof schuifspanning21. Dit modelsysteem maakt gebruik van een relatief hoge zuurstofconcentratie meer vergelijkbaar arterial dan veneuze zuurstofconcentraties. Dit model nauw lijkt op rechte segmenten van grotere schepen in een gesloten cardiovasculaire systeem en biedt een relatief homogene omgeving voor endotheliale cellen op de dia. Andere specifieke voorwaarden in 3D-structuren, zoals bifurcaties of kromming van de vaartuigen, worden niet weergegeven met dit model. Andere systemen kunnen model andere stromingspatronen, met inbegrip van de inwoners van gebogen gebieden van de therapieën, maar leveren minder cellen dan het systeem zoals beschreven in dit protocol. Ook wellicht andere samenstellingen meer geschikt als > 1 x 106 cellen zijn vereist, of als een eencellige analyse is vereist. Onze huidige applicatie modellen niet-Pulsatiele laminaire flow. Echter kan dit model worden gebruikt voor het genereren van andere golfvormen, met inbegrip van gepulseerde of oscillerende golfvormen, met consistentie, zoals het debiet doorlopend worden gecontroleerd.

Over het geheel genomen is deze pragmatische workflow biedt een systeem voor de gelijktijdige toepassing van shear stress op meerdere stroom kamers met een gecontroleerde spuitsnelheid. Materialen en procedures in deze werkstroom zijn ontworpen om te minimaliseren van experimentele variabiliteit tussen monsters en voorwaarden. Deze workflow is met succes gebruikt voor RNAi experimenten in het kader van laminaire flow en kan ook worden gebruikt voor alle experimenten waarbij meerdere voorwaarden met laminaire shear stress, of meerdere laminaire schuifspanning grootheden en/of tijd punten, met inbegrip van alternatieve golfvormen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door CIHR MOP 142307 P.A.M. H.S.J.M. is een ontvanger van een Canadese instituten van gezondheid onderzoek trainingsprogramma in regeneratieve geneeskunde Fellowship. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. en M.K.D. zijn de ontvangers van de Queen Elizabeth II afgestudeerde beurzen in de wetenschap en technologie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA gibco 25300-062
10 mL Syringe BD 302995
10 mm2 Culture Dish Sarstedt 83.3902
30 mL Syringe BD 302832
4-Way Stopcocks Discofix D500
Aluminum foil
BEACH Darwin Chambers Company MN: HO85, SN: 4947549
Cell Scrapers
CO2 Meter BioSphenix, Ltd. MN: P120, SN: 0342
CO2 Sensor BioSphenix, Ltd. MN: C700, SN: 52852
Distilled water gibco 15230-170
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- gibco 14190-144
Endothelial Cell Growth Medium 2 Promo Cell C-22011
Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix Promo Cell C-39216
Fibronectin (pure) Sigma-Aldrich 11051407001
Filter (0.20 um) Sarstedt 83.1826.001
Flow Dampener and Cap U of T glass blowing shop
Flow Meter: 400 Series Console Transonic Scisense Inc. T402
Flow Meter: 400 Series Tubing Transonic Scisense Inc. TS410
Flow Reservoir and Cap U of T glass blowing shop
Flow Sensor Transonic Scisense Inc. ME4PXL
Isotemp 737F Oven Fisher Scientific FI-737F
J cloth J cloth
Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) Fisherfinest 12-544-4
Paper sterilization pouch Cardinal Health 92713
Pump (Masterflex L/S Economy Drive) Cole-Parmer 7554-90
Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) Cole-Parmer 7518-00
Rectangular 4 Well Dish Thermo Scientific 267061
Tweezers
Name Company Catalog Number Comments
Tubing
Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing Cole-Parmer 06424-25
Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing Cole-Parmer 06424-14
Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing Cole-Parmer 06424-16
Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing Cole-Parmer 06508-13
Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing Cole-Parmer 06508-14
Name Company Catalog Number Comments
Luer
3/16" Male Luer Cole-Parmer 45518-08 For #25 tubing
1/8" Male Luer Cole-Parmer 30800-24 For #16 tubing
1/8" Female Luer Cole-Parmer 30800-08 For #16 tubing
1/16" Male Luer Cole-Parmer 45518-00 For #14 tubing
1/16" Female Luer Cole-Parmer 45508-00 For #14 tubing
Name Company Catalog Number Comments
Knockdown reagents
Oligofectamine Reagent Invitrogen 12252-011
Opti-MEM I Reduced Serum Medium gibco 31985-070
Name Company Catalog Number Comments
In vitro transcription
Generuler 1kb+ DNA ladder Thermo Scientific SM1331
MEGAclear Kit Ambion AM1908
mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340
pSP-luc+ Promega E4471
Supercoiled DNA Ladder New England BioLabs Inc. N0472S
UltraPure Agarose Invitrogen 16500-500
UltraPure Ethidium Bromide Invitrogen 15585011
XhoI Restriction Enzyme New England BioLabs Inc. R0146S
Name Company Catalog Number Comments
RNA extraction
Beta-mercaptoethanol Sigma M3148-100mL
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).
  2. Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
  3. Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
  4. Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
  5. Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
  6. Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
  7. Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645 (2015).
  8. Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
  9. Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).
  10. Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
  11. Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
  12. Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
  13. Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
  14. DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).
  15. Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
  16. Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
  17. Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
  18. Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984 (2014).
  19. Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
  20. Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
  21. Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).

Tags

Bioengineering kwestie 140 Flow kamer schuifspanning laminaire flow parallel-plaat toezicht endotheel genexpressie genregulatie kwantitatieve PCR normalisatie luciferase verwijst naar RNA
Gen expressie analyse van endotheliale cellen blootgesteld als u wilt schuintrekken Stress met behulp van meerdere parallelle-plaat Flow Chambers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Man, H. S. J., Sukumar, A. N., Ku,… More

Man, H. S. J., Sukumar, A. N., Ku, K. H., Dubinsky, M. K., Subramaniam, N., Marsden, P. A. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. J. Vis. Exp. (140), e58478, doi:10.3791/58478 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter