Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Berike og utvide sjeldne Antigen-spesifikke T-celler med magnetiske nanopartikler

Published: November 17, 2018 doi: 10.3791/58640
Automatic Translation
1,2,3,4, 2,4
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 2Institute for Cell Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 3Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 4Department of Pathology, School of Medicine, Johns Hopkins University

Summary

Antigen-spesifikke T-celler er vanskelig å karakterisere eller bruke i terapi på grunn av deres ekstremt lav frekvens. Her gir vi en protokoll for å utvikle en magnetiske partikler som kan binde seg til antigen-spesifikke T celler å berike disse cellene og deretter vise dem flere ganger for både karakterisering og terapi.

Abstract

Vi har utviklet et verktøy som både berike og utvide antigen-spesifikke T-celler. Dette kan være nyttig i tilfeller som A) oppdage eksistensen av antigen-spesifikke T-celler, B) sonde dynamikken i antigen-spesifikke tiltak, C) forstår hvordan antigen-spesifikke tiltak påvirke sykdom tilstand som autoimmunitet, D) avmystifisere heterogene Svar for antigen-spesifikke T celler eller E) benytte antigen-spesifikke celler for terapi. Verktøyet er basert på en magnetiske partikler som vi bøye antigen-spesifikke og T celle co-stimulatory signaler, og at vi kaller som kunstig antigen presentere celler (aAPCs). Derfor, siden teknologien er enkle å produsere, det kan lett bli vedtatt av andre laboratorier; Dermed er vårt formål her å beskrive i detalj fabrikasjon og påfølgende bruk av aAPCs. Vi forklarer hvordan du knytter antigen-spesifikke og co-stimulatory signaler til aAPCs, hvordan du kan bruke dem til å berike for antigen-spesifikke T celler og hvordan å utvide antigen-spesifikke T-celler. Videre vil vi markere engineering design hensyn basert på eksperimentelle og biologiske informasjon av vår erfaring med karakteriserer antigen-spesifikke T-celler.

Introduction

Med fremveksten av mange immunotherapies er det behov for å karakterisere og kontrollere immunreaksjoner. Spesielt er tilpasset immunforsvaret interessant spesifisitet og holdbarhet av cellene. Nylig er chimeric-antigen-reseptor T cellen terapi godkjent for kreft terapi; Imidlertid er antigen-receptors basert på felles celle overflate antigen CD19, i stedet for antigener bestemt av kreft1. Utover spesifisitet, kan immunotherapies også lider av mangel på kontroll og begrenset forståelse dynamisk immunrespons i kreft eller autoimmunitet.

En av utfordringene med å studere antigen-spesifikke tiltak er deres ekstremt lav frekvens, f.eks., antigen-spesifikke T-celler er 1 av hver 104 106 T celler2,3. Dermed for å undersøke hvilke T celler er til stede eller svarer, cellene må enten beriket og utvidet, eller deres signal må bli forsterket. Det er dyrt og vanskelig å opprettholde mater cellene med gjeldende teknikker som fokuserer på utvidelse av antigen-spesifikke celler. Dagens teknikker som fokuserer på forsterke signalet av antigen-spesifikke T celler, som de koblede enzym-immunospot (ELISPOT) analysen, begrense viderebruk av disse T celler4. Til slutt, på grunn av lav følsomhet, disse to teknikker må ofte kombineres for antigen-spesifikke opplisting.

For å løse disse problemene, har vi utviklet den magnetiske hydrogenion-basert kunstig antigen presentere celle (aAPC)5,6,7,8. AAPC kan være functionalized med et antigen-spesifikke signal-peptid lastet store histocompatibility kompleks (pMHC) og co-stimulatory molekyler -f.eks., et anti-CD28 antistoff-både berike antigen-spesifikke T celler og deretter stimulere deres ekspansjon (figur 1). Partiklene kan således være en kostnadseffektiv sokkel produkt som kan være både tilpasset antigen-spesifikke stimulations men påkrevd eksperimenter og pasienter. Utfører den berikelse og utvidelse prosessen resulterer i hundrevis til tusenvis ganger utvidelse av antigen-spesifikke CD8 + T celler og kan resultere i frekvenser opptil 60 prosent etter bare en uke, slik at karakteristikk eller terapeutisk bruk av den store antall celler. Her, vi beskrive hvordan gjøre hydrogenion aAPCs, viktige Utformingshensyn velger hydrogenion egenskapene, og viser noen typiske resultater ved disse partiklene i isolere og utvide sjeldne antigen-spesifikke CD8 + T celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle mus ble opprettholdt per retningslinjer godkjent av Johns Hopkins Universitys institusjonelle Review Board.

1. Legg Dimeric Major Histocompatibility Complex immunglobulin Fusion Protein (MHC-Ig) ønsket Antigen peptid sekvens.

Merk: Hvis bruker H - 2Kb: Ig, deretter følger protokollen i trinn 1.1. Hvis bruker H-2Db:Ig og følge protokollen i trinn 1.2.

  1. Aktive lasting av peptid sekvens i H - 2Kb: Ig.
    1. Forbered nødvendig buffere. Forberede rødsprit bufferen ved å 150 mM NaCl og 15mM Na2CO3 i deionisert vann og deretter justere pH til 11,5. Forberede renaturation bufferen ved å lage en løsning av 250 mM Tris HCl i deionisert vann og justere pH til 6.8.
      Merk: Vanligvis vil det kreve ca 5 mL av både rødsprit og renaturation buffere for 1 mg av H - 2Kb: Ig.
    2. Denature H - 2Kb: Ig å tillate utvidet peptid binding. Bringe H - 2Kb: Ig konsentrasjon å mellom 0,5-2 mg/mL med fosfat-bufret saltvann (PBS). Deretter fortynne H - 2Kb: Ig til en siste konsentrasjon av 100-200 µg/mL med 5-10 volumet ekvivalenter av rødsprit buffer og tillate for å ruge ved romtemperatur i 15 min.
    3. Legge til 50 molar overskudd av peptid sekvens (vanligvis lager peptid holdes på 1 mM ved-80 ° C) til H - 2 Kb: Ig løsning.
      Merk: Vanligvis peptid antigener trenger å bli oppløst i minst 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) og deretter lagt sakte til PBS forbli vannløselig. Avhengig av aminosyresekvens må mengden av DMSO økes.
    4. Renature H - 2Kb: Ig med peptid. Umiddelbart etter tillegg av peptid, ta løsningen å en pH på 7,4 ved å legge til renaturation buffer. Tillate men løsningen å ruge 48 h på 4 ° C.
    5. Konsentrere seg og vaske peptid-lastet H - 2Kb: Ig. bruker en sentrifugal konsentrator med en 50 kDa molekylvekt cut-off (MWCO), følg produsentens instruksjoner å vaske peptid-lastet H - 2Kb: Ig løsning 3 ganger med PBS, konsentrere til minst 1 mg/mL og kvantifisere konsentrasjonen på et spektrofotometer.
  2. Aktive lasting av peptid sekvens i H-2Db:Ig.
    1. Forbered nødvendig buffere. Klargjør rødsprit bufferen ved å lage en løsning av 131 mM sitronsyre og 150 mM NaCl 124 mM Na2HPO4 i deionisert vann og deretter justere pH til 6.5. Forberede renaturation bufferen ved å lage en løsning av 120 mM Tris HCl i deionisert vann og justere pH til 8,8.
      Merk: Vanligvis vil det kreve ca 5 mL rødsprit bufferstørrelsen og 1 mL av renaturation bufferen for 1 mg av H-2Db:Ig.
    2. Denature H-2Db:Ig å tillate utvidet peptid binding. Bringe H-2Db:Ig konsentrasjon til en siste konsentrasjon på 0,5-2 mg/mL med PBS. Deretter fortynne H-2Db:Ig til en siste konsentrasjon av 100-200 µg/mL med 5-10 volumet ekvivalenter rødsprit bufferen.
    3. Legge til 50 molar overskudd av peptid rekkefølge (vanligvis lager peptid holdes på 1 mM ved-80 ° C) til H-2Db:Ig løsning og tillate for å ruge 1t på 37 ° C.
    4. Legg β2 microglobulin og renature H-2Db:Ig med peptid. Legg 2-fold molar overskudd av β2 microglobulin. Deretter bringe løsningen til en pH på 7,4 ved å legge til renaturation buffer. Tillate men løsningen å ruge 24 h på 4 ° C.
    5. Konsentrere seg og vaske peptid-lastet H-2Db:Ig. bruker en sentrifugal konsentrator med en 50 kDa MWCO, følg produsentens instruksjoner å vaske peptid-lastet H - 2 Kb: Ig løsning 3 ganger med PBS, konsentrere til minst 1 mg/mL og Kvantifisere det konsentrasjonen på et spektrofotometer.

2. bøy MHC-peptid komplekser og Co-Stimulatory molekyler på overflaten av magnetiske nanopartikler å danne hydrogenion kunstig Antigen presentere celler. Bruk en av tre forskjellige metoder, avhengig av partikkelstørrelse og anvendelse.

Merk: En rekke ulike teknikker kan brukes å bøye proteiner til overflaten av partikler. Her, 3 separate tilnærminger er beskrevet: Amin-belagt partikler (trinn 2.1), N-hydroxysuccinimide (NHS)-belagt partikler (trinn 2.2) og anti-biotin-belagt partikler (trinn 2.3). Disse prosessene har også blitt beskrevet i detalj i delen metoder to dokumenter publisert6,7. Utføre alle skritt i biosikkerhet avtrekksvifte sterilt løsninger å opprettholde sterilitet av lager aAPC partikler.

  1. Coat antigen-spesifikke og stimulerende signaler til Amin-belagt magnetiske partikler (figur 2). Denne prosessen er beskrevet for 100 nm, Amin-belagt superparamagnetiske nanopartikler.
    Merk: Detaljert protokoller for å feste antistoffer til overflaten av en Amin belagt partikkel kan bli funnet på https://www.micromod.de/en/technotes-2.html, hvor Technote 201 beskriver hvordan å thiolate antistoffer og konjugert til maleimide functionalize partikler og 202 beskriver prosessen for å functionalize Amin-belagt partikler med maleimide funksjonelle grupper. Her, utheves bare små endringer for MHC-Ig og co-stimulatory signaler knyttet til disse partiklene.
    1. Thiolate antistoffer med mos reagens (Technote 201).
      1. Forberede en 10 x PBS-ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) buffer (0.1 M PBS og 100 mM EDTA). Legge til 10 x PBS-EDTA buffer antistoffer på en 1:10 forhold å hindre oksidasjon av gratis thiols lagt til antistoffer.
      2. Legge til 20 molar overskudd av MOS reagens (2-iminothiolane) antistoffer og ruge for 2 timer ved romtemperatur med miksing. Mål ut den Mo reagens (pulver) innenfor kjemisk avtrekksvifte å unngå åndedrett som konverterer Amin grupper thiol grupper.
      3. Vask grundig med 1 x PBS-EDTA buffer 3 ganger bruker en sentrifugal konsentrator med en 50 kDa MWCO, og følg produsentens instruksjoner, fokus til et endelig antall 500 µL. måle konsentrasjonen av antistoff løsning bruker en spektrofotometeret.
    2. Konvertere Amin funksjonelle gruppene i den magnetiske hydrogenion til maleimide grupper med sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-SMCC, Technote 202).
      1. Legge til 10 x PBS-EDTA buffer antistoffer på en 1:10 forhold til partikler.
      2. Løs opp Sulfo-SMCC i deionisert vann og vortex til resuspend i en konsentrasjon av 1 mg/mL. Mål ut Sulfo-SMCC (pulver) innenfor kjemisk avtrekksvifte å unngå åndedrett som konverterer Amin grupper maleimide grupper.
      3. Legge til 0.016 nmol Sulfo-SMCC løsningen hver kvadrat millimeter areal på partikler. 1 mg 100 nm partikler, bruke 0,3 mg av Sulfo-SMCC. La reagere for 1,5 t ved romtemperatur.
      4. Vask partikler med 1 x PBS-EDTA buffer 3 ganger ved hjelp av et magnetisk felt med en magnetisk kolonne og resuspend i 500 µL av 1 x PBS-EDTA buffer.
        Merk: Hvis bruker partikler mindre enn 200 nm, som 100 nm partikler beskrevet her, sannsynligvis magneter kan ikke kraftig nok til å trekke partikler for vask eller konsentrere formål. Dermed for å vaske mindre partikler, bruke en magnetisk består av ferromagnetisk kuler for å forsterke det magnetiske feltet.
    3. Reagere maleimide-functionalized partikler med thiolated antistoffer (Technote 201).
      1. Legge til partiklene i et hetteglass scintillation, legge til en mini-magnetic røre bar, sett bare en tomme ovenfor en magnetic røre plate og indusere magnetiske blanding av partikkel løsningen.
      2. Blande løsningen, legge thiolated antistoffer (0,5 mg antistoff for hver 1 mg av partikler) dropwise. La reagere over natten i romtemperatur.
      3. Vask med 1 x PBS buffer 3 ganger ved hjelp av et magnetfelt og resuspend i 500 µL av 1 x PBS. Merke og lagre på 4 ° C for inntil 6 måneder.
        Merk: Maksimal Bøyning effektivitet oppstår når maleimide-functionalized partikler umiddelbart blandes med thiolated protein.
  2. Coat antigen-spesifikke og stimulerende signaler til NHS-belagt magnetiske partikler (Figur 3). Denne prosessen er beskrevet for 200 nm, NHS-belagt superparamagnetiske nanopartikler.
    1. Forberede rørets buffer, slukke buffer, og lagring buffer. Rørets bufferen er 25 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre (MES) med 0,01% mellom 20 tilpasset pH 6.0. Slukke bufferen er en 100 mM løsning av Tris-HCl ved pH 7.4. Bufferen lagring er 10 mM PBS og 0,01% mellom ved pH 7.4.
    2. Resuspend lyofilisert partikler i 1 mL av rørets bufferen. Vortex kraftig i minst 15 min til ingen oppsamlinger er synlige.
    3. Plass magnetiske partikler på en magnetisk stå å fjerne nedbryting, resuspend med 0,5 mL rørets buffer og overføre til en scintillation hetteglass. Vortex til ingen oppsamlinger er synlige.
    4. Legge til 0,1 mg totale protein per 1 mg av resuspended partikler. Vortex å blande og reagere ved romtemperatur for 2,5 t mens.
    5. Legg til 0,1 mL slukke buffer og reagere ved romtemperatur for 30 min mens.
    6. Plasser scintillation ampullen på en magnetisk stå og vask partikler. Vent til nedbryting er klar fjerne. Fjerne partikler fra magnetiske stativet, Legg 1 mL av rørets buffer og vortex til ingen oppsamlinger er synlige. Gjenta denne prosessen tre ganger og resuspend partikler i 1 mL av rørets buffer. Lagre partikler på 4 ° C for inntil 6 måneder.
  3. Coat antigen-spesifikke og stimulerende signaler til anti-biotin-belagt magnetiske partikler (Figur 4). Denne prosessen er beskrevet for 50-100 nm, anti-biotin superparamagnetiske nanopartikler.
    1. Biotinylate MHC-Ig eller co-stimulatory molekyler.
      1. Justere protein konsentrasjonen til 0,5-2 mg/mL i PBS buffer. Resuspend sulfo-NHS-biotin i en konsentrasjon av 10 mg/mL i deionisert vann og legge 20-fold molar overskudd til stimulerende antistoff. Inkuber ved romtemperatur for 45 min.
      2. Vask grundig med PBS 3 ganger bruker en sentrifugal konsentrator med en 50 kDa MWCO, følg produsentens instruksjoner, fokus til et endelig antall 500 µL. måle konsentrasjonen av antistoff løsningen bruker et spektrofotometer.
    2. Bøy biotinylated MHC-Ig og/eller co-stimulatory signaler til anti-biotin nanopartikler. For 500 µL av lager anti-biotin partikler, Legg til 0,5 nmol stimulerende antistoff og ruge på 4 ° C over natten.
    3. Vask konjugert aAPC nanopartikler. Fordi disse partiklene er mindre enn 200 nm, våt en magnetisk kolonne og sette på en magnetisk stand.
    4. Legge til partikkel/protein suspensjon i kolonnen. Tillat alle protein/partikler helt inn kolonnen.
    5. Vask legger til 0,5 mL PBS tre ganger i kolonnen.
    6. Elute ved å fjerne kolonnen fra magnetiske stå og legge til 0,5 mL PBS kolonnen eller stempelet, utdriving partikkel-aAPCs i et hetteglass for scintillation. Lagre partikler på 4 ° C for inntil 6 måneder.
      Merk: Partikler er stabilt på 4 ° C (ikke bør være frosset) for inntil 6 måneder. Høyere temperaturer redusere funksjonaliteten til partikler og noen partikkel aggregering er observert (data ikke vist). Ikke holde ved romtemperatur for lengre perioder som dette reduserer betydelig holdbarheten av partikler.

3. karakterisere proteininnholdet på kunstig Antigen presentere celle nanopartikler med fluorescerende antistoff gjenkjenning.

Merk: Dette er en nyttig kvalitetskontroll av produseres kunstig antigen presentere celler. Hvor mye stimulerende signal brukes også til å produsere tilsvarende aAPC doser over bunker og ulike aAPC (f.eks., forskjellige størrelser).

  1. Måle partikkel konsentrasjonen av belagt aAPCs.
    1. Bruk unconjugated partikler fra lager løsning og en 1:2 dose titrering i en løsning av PBS over en 96-brønns flat bunn vev kultur plate med 100 µL per brønn.
    2. Lese partiklene i en plate-lesing spektrofotometer ved 405 nm å lage en standard kurve fra en kjent partikkel konsentrasjon.
    3. Ta en prøve av konjugert aAPCs, fortynne i PBS til et totalt volum på 100 µL og lese på spektrofotometeret.
  2. Fjern et utvalg av ferdige aAPCs og flekker med fluorescerende antistoffer.
    1. Beregne hvor mye prøve å fjerne, beregne antall antistoffer på overflaten av partikkel.
      Merk: Disse teknikkene, anta en tetthet på rundt 1000 antistoffer/µm2 av partikkel areal. For å kunne oppdage fluorescensen, krever det ca 1011 MHC-Ig eller CD28 molekyler totalt per fluorescerende test.
    2. Bringe det totale volumet av aAPCs til 100 µL i PBS, legge til farging antistoffer på en 1: 100 fortynning og ruge 1t på 4 ° C.
      Merk: Eksempel antistoffer brukt er FITC konjugert rotte-anti musen Ig λ1, λ2, λ3 lys kjeden, klone R26 46 å oppdage MHC-Ig, og FITC konjugert musen anti armensk/Syrian hamster IgG, klone G192-1, for å oppdage anti-musen CD28.
  3. Vask partikler og lese fluorescens på en fluorescerende plate leser.
    1. Magnetisk vask (som beskrevet i trinn 2) farget aAPC fraksjoner tre ganger med 0,5 mL PBS.
    2. Elute det vasket aAPCs med 0,5 mL PBS.
    3. Legge til 100 µL av eluted aAPCs en 96-brønns flat bunn plate lese konsentrasjonen bruker absorbansen som trinn 3.1.
    4. Ta de resterende 400 µL, delt opp i to 200 µL dele og legge til to brønner i en svart, polystyren 96-brønnen, flat bunn plate. Sjarmere i 1:2 forholdet ned platen ved å ta 100 µL av løsningen og blande med neste brønnen som har 100 µL av PBS i hver vel minst fire ganger.
      Merk: Gjennomsnittlig flere gjentak av målet å redusere støyen i målingen.
    5. På samme svart 96-brønns plate, gjøre en standardkurve fluorescerende antistoff brukes stain, ved å legge den på 1:200 i en godt med 200 µL PBS og titrating ned på 1:2 forholdet minst 12 brønner.
    6. Etter både aAPC og fluorescerende antistoffer er på tallerkenen, lese platen med en fluorescerende plate leser.
  4. Beregn mengden av protein per partikkel. Bestemme konsentrasjonen av antistoff ved å sammenligne verdiene i standardkurven, hvor antistoff konsentrasjonen er kjent, forutsatt en 1:1 ratio av flekker mot oppdaget antistoff. Deretter dele denne konsentrasjonen oppdaget antistoff med konsentrasjonen av partikler etter absorbansen analysen vil gi antall antistoffer per partikkel.

4. berike Antigen-spesifikke CD8 + T-celler med forberedt hydrogenion kunstig Antigen presentere celler.

  1. Isolere CD8 + T celler.
    1. Avlive dyrene ved eksponering for isoflurane etterfulgt av cervical forvridning.
    2. Fjern milten og lymfeknutene fra wildtype C57BL/6j mus og plasser i en løsning av PBS. Macerate organer og elute celler gjennom en steril 70 µm celle sil med hyppig vasker av PBS.
    3. For å eliminere ikke - CD8 + T celler, bruk en no touch CD8 + T celle isolering kit og følg produsentens instruksjoner.
      Merk: Hver antigen tilstand krever minst 3 x 106 CD8 + T celler.
  2. Legg hydrogenion aAPCs binde til CD8 + T celler.
    1. Etter isolasjon, konsentrere til et volum av 100 µL i PBS med 0,5% bovin serum albumin (BSA) og 2 mM EDTA.
    2. Finn nummeret av aAPCs å legge ved beregning basert på forholdet mellom 1011 aAPC-bundet, peptid lastet MHC-Ig for hver 106 CD8 + T celler.
    3. Inkuber aAPC partikler og CD8 + T celler 1t på 4 ° C med kontinuerlig blanding i et sterilt 5 mL isopor rundt bunnen rør.
  3. Forberede supplert media og T celle vekstfaktor (TCGF) elute og kultur CD8 + T celler.
    1. For supplert medier, supplere komplett RPMI 1640 medier (med glutamin) med 1 x ikke-essensielle aminosyrer, 1 mM natrium pyruvate, 0,4 x vitamin løsning, 92 µM 2-mercaptoethanol, 10 µM ciprofloxacin og 10% fosterets bovin serum (FBS).
    2. For å gjøre TCGF, følg protokoller allerede etablerte og refererte her9.
      Merk: TCGF er en husets cocktail av menneskelig immun cytokiner som er avgjørende for å gi T-celler flere stimulering signaler for å vokse. TCGF kan byttes for kjente T celle stimulerende cytokiner som IL-2, IL-7 eller IL-15; Imidlertid kan hver polarize T celle respons tilsvarende. Protokollen beskrevet her er ikke optimalisert med disse drinker; dermed andre teknikker bør konsulteres for konsentrasjoner og kombinasjoner hvis TCGF ikke brukes med eksempler oppført10,11.
  4. Vask og berike aAPC og CD8 + T celle blanding.
    1. Vask den magnetiske partikler aAPCs som beskrevet i trinn 2. Imidlertid vaske først med PBS bufferen med 0,5% BSA og 2 mM EDTA, andre bruker supplert media og tredje bruker supplert media med 1% TCGF.
    2. Elute aAPCs og beriket CD8 + T celler i 500 µL av supplert media med 1% TCGF.
    3. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og en plate i en 96 U bunn plate i 160 µL per brønn supplert medier med 1% TCGF i en konsentrasjon av 2.5 x 105 CD8 + T celler/mL.
    4. Hvis isolere bruker aAPCs med bare lastet peptid-MHC-Ig på overflaten (ingen co-stimulatory signaler), deretter fullfører trinn 4.5. Hvis isolere aAPCs med både peptid-lastet MHC-Ig på overflaten og co-stimulatory signaler, går du videre til trinn 5.
  5. Legg magnetiske partikler belagt med co-stimulatory signaler på overflaten til beriket brøk og Legg et magnetfelt for å co klynge stimulerende signalene på overflaten av T-celler.
    1. Beriket fraksjoner, legge til en ekvimolare (eller større avhengig av programmet-se avsnittet om aAPC egenskaper til kontroll) av stimulerende antistoff antall peptid-lastet MHC-Ig på partikkel.
    2. Tillat co-stimulatory magnetiske partikler binde til beriket CD8 + T celler 1t på 4 ° C.
    3. Legge til magnetisk felt ved å plassere kultur plate mellom to N52 disk neodymmagneter 1,9 cm (0,75 tommer) i lengde.
      Merk: N52 disk magneter har en ekstremt sterk felt. Forsiktighet bør utvises begge lagre dem med avstandsstykkene mellom magneter, som det er vanskelig å fjerne fra hverandre, og når å sette dem på kultur platene. For å minimere magneter stikker til metall komponentene i inkubator, plass dem i 50 mL konisk tube Styrofoam containere på begge bunnen og toppen.

5. utfolde og oppdage Antigen-spesifikke CD8 + T-celler med forberedt hydrogenion kunstig Antigen presentere celler.

  1. Legge til 96 U bunn godt platen med aAPCs og CD8 + T celler i en fuktet 5% CO2, 37 ° C inkubator for 3 dager. Dag 3, mate cellene med 80 µL per godt supplert medier med 2% TCGF og sted tilbake i inkubator til dag 7.
  2. På dag 7, høste stimulert cellene i en 5 mL rundt bunnen rør for opptelling.
  3. Når alle de løsning er høstet, Nedspinning høstet cellene til resuspend i 0,5 mL PBS med Natriumazid 0,05% og 2% FBS. Telle levedyktige cellers flekker med trypan blå og teller på en hemocytometer.
  4. Fjerne 50.000-500.000 telles cellene i to nye 5 mL rundt bunnen rør for antigen-spesifikke flekker. En tube vil bli brukt til beslektet peptid-MHC flekken og andre røret skal brukes for ikke-beslektet flekken for å finne bakgrunnen flekker.
  5. Legge 1 µg av biotinylated MHC-Ig (med teknikken er beskrevet i trinn 2) til respektive beslektet og ikke-beslektet rør i 100 µL av PBS med Natriumazid 0,05% og 2% FBS med allophycocyanin (APC)-konjugert rotte anti-musen CD8a, klone 53-6,7 (fortynning forholdet mellom 1: 100) 1 h på 4 ° C.
  6. Legge til sekundære streptavidin og levende døde flekken. Bleke overflødig biotinylated MHC-Ig med PBS gjennom sentrifugering. Deretter flekk alle prøver med en 1:350 av phycoerythrin (PE)-merket streptavidin og 1:1000 forholdet mellom en live/dead fixable grønne døde celle flekk i 15 min på 4 ° C.
  7. Les alle prøver på en flyt cytometer å bestemme spesifisitet og antall antigen-spesifikke celler.
    1. Vaske ut overflødig videregående og live/døde flekker med sentrifugering og resuspend med 150 µL PBS bufferen med Natriumazid 0,05% og 2% FBS å lese på en flyt cytometer.
  8. Bestemme antall og prosent av antigen-spesifikke celler med dataanalyse programvare.
    1. For å avgjøre prosent av antigen-spesifikke celler, bruk følgende porter i den rekkefølgen live + lymfocytt + (fremover punktdiagram ved siden XY), CD8 + og Dimer +. Finn Dimer + porten ved å sammenligne den ikke-beslektet til beslektet flekken.
    2. Bestemme prosentandelen av antigen-spesifikke celler i et eksempel ved å trekke andelen Dimer + beslektet MHC-Ig flekken fra ikke-beslektet MHC-Ig flekken.
    3. Bruker denne prosentandelen av antigen-spesifikke celler, multiplisere det med antall celler telt, gir antall antigen-spesifikke celler resulterende fra berikelse og ekspansjon.
      Merk: Kompensasjon må settes opp på flyt cytometer siden det spectral overlapper med fluorophores brukes i dette panelet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å fullføre en vellykket berikelse og utvidelse av antigen-spesifikke T-celler, skal peptid-lastet MHC-Ig og co-stimulatory molekyler kunne knyttes til aAPC partikkel. Basert på 3 metoder for partikkel vedlegg, gir vi noen representant data for en vellykket Bøyning prosedyren utfall (figur 5a). Faktisk hvis ligand tetthet er for lav, så det vil ikke være effektiv stimulering med antigen-spesifikke CD8 + T celler der dette skjer rundt lineære avstanden mellom ligander over 100 nm i vår erfaring (figur 5b)7.

Dessuten både kvantitative fluorescerende antistoff readouts og transgene CD8 + T celle utvidelser, kan hydrogenion aAPCs kontrolleres for kvalitetskontroll av i beslektet transgene antigen-spesifikke CD8 + T celler. Dette kan gjøres ved å isolere CD8 + T celler fra en transgene mus som en Pmel mus som har gp100-spesifikke antigen-spesifikke CD8 + T celler og doping i B6 bakgrunn i 1:1000 forholdet. Telle og flekker før og etter berikelse gjør opplisting av både brett berikelse (figur 6a) og prosent utvinning (figur 6b)6. Disse representant resultatene viser vi at signal-1 bare aAPCs gi mest effektiv berikelse (nesten 10 ganger), og rundt 80% celle utvinning, som er utvidet over tradisjonelle signal 1 og 2 aAPCs som har ikke-spesifikk anti-CD28 på partikkel også.

Når partikkel aAPCs har vært tilstrekkelig preget og kvalitetssikret, så de kan brukes i berikelse og utvidelse av sjeldne antigen-spesifikke CD8 + T celler fra wildtype mus. Nøyaktige resultater er det avgjørende å ha funksjonelle oppdagelsen reagenser, som biotinylated-dimer. Kvalitetssikringen av biotinylated-dimer kan også gjøres på transgene CD8 + T celler å bekrefte flekker. Her, viser representant resultatene den positive flekker med gp100-spesifikke CD8 + T celler med B6 CD8 + T celler som en bakgrunn (figur 7). Figur 7 også viser at hvis det er for høye nivåer av biotinylated-dimer, så det vil redusere sin avidity som det vil konkurrere med seg og viser mono-valent binding.

Etter berikelse og utvidelse av musen CD8 + T celler i syv dager, kunne man forvente mellom 5 og 50 prosent antigen-spesifikke CD8 + T celler, med nesten 20.000 til 200.000 antigen-spesifikke CD8 + T celler etter starter med 5 x 106 CD8 + T celler per betingelse (Figur 8) 6. spesielt når flekker for antigen-spesifikke CD8 + T celler, er det viktig å vite den bakgrunnen flekker av biotinylated-dimer der i dette tilfellet var det 4.15%. noen prosent lavere enn dette fra beslektet flekken er ansett som et negativt resultat (figur 8a). I tillegg vises hvor å trekke flyt cytometri portene for å fastslå den faktiske prosenten av antigen-spesifikke CD8 + T celler. Dette er viktig i tilfeller der antigen-spesifikke CD8 + T celler har ikke forskjellige populasjoner (som vist i figur 8a) men kan vises som en bred smøre.

Den samme prosessen kan brukes til å isolere og stimulere menneskelige antigen-spesifikke CD8 + T celler. Lignende kvalitetskontroll og resultater bør sees der betydelige økninger i prosenter og tall av antigen-spesifikke CD8 + T celler er observert etter bare en uke for utvidelse etter den berikelse (figur 9)5.

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk av antigen-spesifikke berikelse og utvidelse med hydrogenion kunstig antigen presentere celler. Først fullføre en no touch CD8 + T cellen Aisolering. Deretter legge til hydrogenion aAPCs CD8 + T celler. Berike med et magnetfelt, kultur, og stimulerer med aAPCs. Til slutt, oppdage beriket og utvidet antigen-spesifikke CD8 + T celler ved flowcytometri. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: skjematisk for bøye peptid-lastet MHC-Ig og co-stimulatory molekyler på overflaten av Amin-belagt magnetiske partikler. Kort, Sulfo-SMCC crosslinker til å functionalize magnetiske partikler overflaten med maleimide funksjonelle grupper. MHC-Ig og co-stimulatory molekyler er samtidig functionalized med mos reagenser å produsere thiol funksjonelle grupper. Aktivert partikler og protein signaler er reagerte sammen og deretter vasket for å produsere antigen-spesifikke kunstig antigen-presentasjon celle magnetiske nanopartikler. Dette tallet er endret fra supplerende materiale av vårt laboratorium publikasjon i Nano brev7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: skjematisk for bøye peptid-lastet MHC-Ig og co-stimulatory molekyler på overflaten av NHS-belagt magnetiske partikler. Kort, NHS-belagt partikler reagerte peptid-lastet MHC-Ig og co-stimulatory molekyler og deretter vasket for å produsere antigen-spesifikke kunstig antigen-presentasjon celle magnetiske nanopartikler. Dette tallet er endret fra supplerende materiale av vårt laboratorium publikasjon i Nano brev7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Skjematisk for bøye peptid-lastet MHC-Ig og co-stimulatory molekyler på overflaten av anti-biotin-belagt magnetiske partikler. MHC-Ig og co-stimulatory molekyler er functionalized med NHS-biotin å produsere biotin funksjonsgrupper. Deretter er anti-biotin-belagt partiklene reagert functionalized peptid-lastet MHC-Ig og co-stimulatory molekyler. Etterpå er disse partiklene vasket for å produsere antigen-spesifikke kunstig antigen-presentasjon celle magnetiske nanopartikler. Dette tallet er endret fra supplerende materiale av vårt laboratorium publikasjon i Nano brev7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Bøyning effektivitet er viktig for den berikelse og utvidelse av antigen-spesifikke T celler. (a) representant data for Bøyning effektivitet med tre Bøyning metodene til tre forskjellige base magnetiske partikler beskrevet i den: Amin-belagt partikler, NHS-belagt partikler og anti-biotin-belagt partikler. Hvert datapunkt representerer en ulike partikkelstørrelse forberedelse teknikk og feilfelt representerer S.E.M. (b) hvordan ligand tetthet påvirker transgene CD8 + T celle stimulering, der ligand tetthet er representert som lineære avstanden mellom ligander i nanometer på 600 NM og 50 nm aAPCs (n = 5 og feilfelt representerer S.E.M.). Dette tallet er endret fra vårt laboratorium publikasjon i Nano brev7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Kvalitetskontroll aAPC berikelse. Transgene Pmel gp100-spesifikke CD8 + T celler ble dopet i i 1:1000 forholdet i wildtype B6 CD8 + T celler. (a) fold berikelse ble målt ved hjelp av flowcytometri etter anriking av flekker congenic markøren Thy1.1 og CD8. Her var en sammenligning mellom signal 1 bare partikler eller Db-Ig lastet med gp100, tradisjonelle signal 1 og 2 partikler eller Db-Ig lastet med gp100 og anti-CD28, og ikke-beslektet signal 1 og 2 partikler. (b) celler var også regnet før og etter for å måle celle utvinning av hver av metodene. Dataene representerer tre uavhengige eksperimenter og feil barer representerer kombineres S.E.M. Data ble målt ved veis VARIANSANALYSE med Tukeys post-test (*p< 0,05, **p< 0,01). Dette tallet er endret fra vårt laboratorium publikasjon i Nano bokstaver6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : Kvalitetskontroll av biotinylated dimer. Gp100-spesifikk CD8 + T celler ble isolert fra transgene Pmel mus og beiset i 100 µL av PBS med tre konsentrasjoner av biotinylated Db-Ig lastet med gp100 og APC anti-CD8a, bruke wildtype B6 CD8 + T celler som en negativ kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8 : Berikelse og utvidelse av antigen-spesifikke CD8 + T celler. B6 wildtype CD8 + T celler ble beriket med enten signal 1 bare (Kb-Ig lastet med TRP2) eller signal 1 og 2 (Kb-Ig lastet med TRP2 og anti-CD28 konjugert til overflaten av partikkel). Signalet 2 ble deretter lagt til beriket brøkdel av signal 1 bare aAPCs og alle celler ble kultivert i 7 dager. (a) CD8 + T celler er farget og port på en live/dead fluorescerende flekken, da gated CD8 + og KbTRP2 +, og sammenlignet med en ikke-beslektet Kb-Ig å oppdage antigen-spesifikke CD8 + T celler. (b) prosentandel og (c) antall TRP2-spesifikke CD8 + T celler kan dermed være bestemt, der høyere og antall antigen-spesifikke CD8 + T celler ble oppdaget signal 1 bare berikelse tilnærming (n = 7 feilfelt representerer standardavvik, tosidige parvise t-test *p < 0,05, **p < 0,01). Dette tallet er endret fra vårt laboratorium publikasjon i Nano bokstaver6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9 : Berikelse og utvidelse av antigen-spesifikke CD8 + T menneskeceller. (a) representant flow cytometri plott dagen 0 før berikelse og dag 7 viser dramatiske effekten av berikende og utvide antigen-spesifikke CD8 + T celler fra friske blodgivere med tradisjonelle hydrogenion aAPCs der A2-Ig lastet med NY-ESO1 og A2-Ig lastet med MART1 antigener vises. (b) genererer høye prosenter (~ 10-20%) og tall (0,5-1 x 106) av antigen-spesifikke CD8 + T celler ved dag 7 (n = 3 fra uavhengige givere, feilfelt representerer S.E.M.). Dette tallet er endret fra vårt laboratorium publikasjon i ACS Nano5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende filen 1 boks 1. Klikk her for å laste ned denne filen. 

Supplerende filen 2-boks 2. Klikk her for å laste ned denne filen. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har opprettet en roman antigen-spesifikke T cellen aisolering teknologien basert på hydrogenion kunstig antigen presentere celler (aAPCs). Hydrogenion aAPCs har peptid-lastet MHC på overflaten som tillater antigen-spesifikke T celle bindende og aktivisering sammen med co-stimulatory aktivisering. aAPCs er også spinn, og således kan brukes å berike sjeldne antigen-spesifikke T celler ved hjelp av et magnetfelt. Vi har optimalisert og studerte nøkkel hydrogenion egenskapene til størrelse, ligand tetthet, og ligand valg og deres innflytelse på bindingen, berikelse, aktivisering og celle-berikelse (Supplerende fil 1 boks 1).

Dermed berikelse og utvidelse prosedyreresultatene i antigen-spesifikke CD8 + T celle ekspansjon av flere produsere thousand-fold antigen-spesifikke prosenter så høy som 60% og, kan brukes i både murine og menneskelige innstillinger (Supplerende fil 2-boks 2 ). Slike høye tall og prosenter av antigen-spesifikke T-celler aktiverer karakterisering av immunreaksjoner for sykdommer (f.eks., kreft, autoimmune, etc.), tillater romanen immun mål og mekanismer, og tilbyr muligheten til å brukt i adoptive immunterapi. Et eksempel på et bestemt program skal sekvens pasientens svulst, identifisere mutasjoner, finne potensielle MHC-permer fra mutant sekvenser, produsere aAPCs med disse toppkandidat antigener og deretter bruke aAPCs for å avgjøre om pasienten har noen svulst-spesifikke neoantigens.

Faktisk metodologiske begrensningene er en viktig barriere å studere og identifisere antigen-spesifikke tiltak. Gjeldende teknikker krever (a) betydelig tid og arbeider intensiv prosedyrer, (b) tilstede problemer i å opprettholde linjer som behovet for å samle autologous dendrittiske celler, (c) krever uker T celleutvidelse før oppnå resultater, (d) resultatet i lav særegenheter (1-2%) og lave antall antigen-spesifikke CD8 + T kan ikke celler, (e) ofte med betydelig bakgrunn signal, og (f) CD8 + T celler som produseres ofte brukes eller studerte videre analyser. En metode krever immunisering med antigen før ELISPOT å karakterisere tilstedeværelsen av antigen-spesifikke svar14,15,16,17. En annen metoden bruker tandem-mini-genuttrykk plasmider å transfect antigen presentere celler krever multipleksing tetramer flekker cytokin + svar som IFNγ å øke følsomhet18. Selv peptid pulserende endogene antigen presentere celler i i vitro kultur, bare resultater i en 0,5% økning i antigen spesifisitet15.

Vår tilnærming løser disse metodologiske begrensninger og kan dermed fungere som et verktøy for diagnostiske og terapeutiske. Avgjørende skritt å sikre antigen-spesifikke CD8 + T celle berikelse og utvidelse er 1) effektivt laste MHC-Ig med peptid antigen, 2) bøy stimulerende signaler til overflaten av nanopartikler, 3) binde partikler til T-celler, 4) berike cellene bundet til nanopartikler med et magnetfelt, 5) utvider elut hydrogenion-bundet T celler i kultur og 6) gjenkjenner antigen-spesifikke CD8 + T celler i dag 7 med biotinylated, peptid-lastet MHC.

De viktigste problemene som oppstår i berikelse og utvidelse protokollen oppstå fra feil produksjon eller utløpt oppdagelsen reagenser eller hydrogenion aAPCs. Sikre at biotinylated dimer kan flekker antigen-spesifikke CD8 + T celler med testing på transgene antigen-spesifikke CD8 + T celler. Hvis peptid-MHC-Ig ikke har en tilsvarende transgene musemodell, kan det være nyttig å laste et positivt kontroll peptid og teste positivt kontrollen for å bekrefte lasting. Men kan noen peptider ikke laste inn MHC-Ig; Dette kan bli simulert med MHC-lasting algoritmer som Net-MHC, eller med RMAS-cellen basert eksperimentelt analyser13. aAPC partikkel stabilitet reduseres etter 6 måneder, så hvis det er noen variasjoner i berikelse og utvidelse resultater, så en annen fluorescerende plate leser analysen kan gjennomføres for å kontrollere stabiliteten.

I fremtidige arbeid, vi ønsker å utvide funksjoner, bredde og dybde i analysen. Vi arbeider for å øke både gjennomstrømningen og muligheten til å multiplex med flere antigener undersøkt om gangen i 96-brønnen plate format. Foreløpig er en Hovedbegrensningen at bare noen antigener kan undersøkes samtidig. Vi arbeider dette ved å undersøke hvordan størrelsen på partikler aAPC og ligand tetthet påvirker berikelse. I tillegg undersøker vi hvordan ulike komposisjoner effekt CD8 + T celle celleutvidelse i kultur. Til slutt, vi som mål å etterligne denne teknologien i MHC, klasse II å berike og utvide antigen-spesifikke CD4 + T celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklære den følgende konkurrerende økonomisk interesse (r): under en lisensavtale mellom NexImmune og Johns Hopkins University, Jonathan Schneck er berettiget til en andel av royalty mottatt av universitetet på salg av produktene som er beskrevet i dette artikkel. Han var også grunnleggeren av NexImmune eier egenkapitalen i selskapet. Han tjener som medlem av Neximmunes styre og vitenskapelige advisory board. Vilkårene i disse ordningene har blitt vurdert og godkjent av Johns Hopkins University i samsvar med sin interessekonflikt politikk.

Acknowledgments

J.W.H. takk NIH kreft nanoteknologi Training Center ved Johns Hopkins Institutt for NanoBioTechnology, National Science Foundation Graduate forskning fellesskap (DGE-1232825) og BUER grunnlaget for fellesskap støtte. Dette arbeidet ble finansiert av støtte fra National Institutes of Health (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/Maryland innovasjon initiativ og Coulter Foundation (JPS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein BD Biosciences 551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig BD Biosciences 551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein BD Biosciences 550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932257
Purified Human Beta 2 Microglobulin Bio-Rad PHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles Micromod 79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm Ocean Nanotech SN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure Miltenyi 130-105-637
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217
Sulfo-SMCC Crosslinker  ProteoChem c1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene Corning 3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46   BD Biosciences 553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1 BD Biosciences 554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice Jackson Laboratory 005023
C57BL/6J (B6 wildtype) mice Jackson Laboratory 000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse Miltenyi 130-104-075
MS Columns Miltenyi 130-042-201
LS Columns Miltenyi 130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE Biolegend 405203
N52 disk magnets of 0.75 inches  K&J Magnetics DX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 Biolegend 100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation  ThermoFisher L-34969

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).
  2. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  3. Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
  4. Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).
  5. Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
  6. Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
  7. Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
  8. ,, et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
  9. Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
  10. Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
  11. Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
  12. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
  13. Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
  14. Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
  15. Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
  16. Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
  17. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572 (2014).
  18. Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).

Tags

Engineering problemet 141 nanopartikler magnetiske berikelse kunstige antigen presentere celler T-celler immunterapi kreft sjeldne celle berikelse T celleutvidelse adopsjon T cellen terapi Neoantigen immunoengineering bioteknologi
Berike og utvide sjeldne Antigen-spesifikke T-celler med magnetiske nanopartikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hickey, J. W., Schneck, J. P. Enrich … More

Hickey, J. W., Schneck, J. P. Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles. J. Vis. Exp. (141), e58640, doi:10.3791/58640 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter