Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Обогащать и расширять редких антиген специфические Т-клеток с магнитных наночастиц

Published: November 17, 2018 doi: 10.3791/58640
Automatic Translation
1,2,3,4, 2,4
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 2Institute for Cell Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 3Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 4Department of Pathology, School of Medicine, Johns Hopkins University

Summary

Антиген специфические Т-клеток трудно характеризовать или использовать в терапии из-за их крайне низкой частоты. Здесь, мы предоставляем протокол к разработке магнитных частиц, который можно привязать к антиген специфические клетки T обогатить эти клетки и затем, чтобы расширить их несколько стократное характеристика и терапии.

Abstract

Мы разработали инструмент как обогатить и расширять антиген специфические Т-клеток. Это может быть полезно в тех случаях, таких, как A) обнаружить существование антиген специфические Т-клеток, B) зонд динамику антиген специфические реакции, C) понять как антиген специфические реакции влияют на болезненное состояние таких аутоиммунных заболеваний, D) демистификации гетерогенных Ответы на антиген специфические Т-клеток, или E) используют антиген специфические клетки для терапии. Инструмент основан на магнитных частиц, что мы конъюгат антиген специфические и Т-клеток co-stimulatory сигналов, и что мы термин как искусственные антиген представляющих клеток (aAPCs). Следовательно поскольку технология просто производить, он может легко быть принят другими лабораториями; Таким образом наша цель здесь заключается в том, подробно описать изготовления и последующего использования aAPCs. Мы объясняем, как прикрепить сигналы антиген специфические и co-stimulatory к aAPCs, как использовать их для обогащения для антиген специфические Т-клеток и как расширить антиген специфические Т-клеток. Кроме того мы будем освещать проектирование соображения на основе экспериментальных и биологической информации нашего опыта с характеризующие антиген специфические Т-клеток.

Introduction

С ростом многих immunotherapies необходимо уметь характеризовать и контроль иммунного ответа. В частности адаптивного иммунного ответа представляет интерес ввиду специфики и долговечность клеток. Недавно были утверждены химерных антиген рецепторов Т-клеточной терапии для лечения рака; Однако антиген рецепторы основаны покинуть общей ячейки поверхностного антигена CD19, вместо антигены, специфичные для рака1. За пределами специфичность immunotherapies могут также страдать от отсутствия контроля и ограниченное понимание динамических иммунный ответ в течение рака или аутоиммунных заболеваний.

Одна из задач изучения реакции антиген специфические является их крайне низкой частоты, например., антиген специфические Т-клетки являются 1 каждые 104 106 T клетки2,3. Таким образом расследовать какие T клетки присутствуют или отвечая, клетки необходимо либо обогащенный и расширена, или их сигнал должны быть усилены. Это дорого и сложно поддерживать с помощью текущих методов, направленных на расширение антиген специфические клетки клетки фидера. Существующие методы, которые сосредоточены на усиления сигнала антиген специфические T-клеток, как assay энзим соединенный immunospot (ELISPOT), ограничивать повторное использование этих клеток T4. Наконец из-за низкой чувствительностью, часто эти две техники нужно быть объединены для перечисления антиген специфические.

Для решения этих вопросов, мы разработали магнитных наночастиц на основе искусственного антиген представляющие клеток (aAPC)5,6,7,8. AAPC можно функционализированных с комплекс антиген специфические сигнал пептид загружен гистосовместимости (реализует) - и co-stimulatory молекул -например., антитела анти CD28-как обогатить антиген специфические Т-клеток и затем впоследствии стимулировать их расширение (рис. 1). Таким образом, частицы может быть экономически готовый продукт, который может быть как настроены для удовлетворения антиген специфические стимуляцию еще стандартизирована в эксперименты и пациентов. Выполнение на обогащение и расширение процесса результаты в сотни и тысячи раз расширение антиген специфические CD8 + Т-клеток и может привести к частоты до 60 процентов после всего за одну неделю, позволяя характеристика или терапевтического использования больших количество ячеек. Здесь мы опишем как сделать наночастиц aAPCs, некоторые критические дизайн соображения при выборе свойства наночастиц и продемонстрировать некоторые типичные результаты от использования этих частиц в изоляции и расширении редких антиген специфические CD8 + Т-клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все мыши были сохранены за руководящими принципами, утвержденными институциональных Наблюдательный Совет университета Джонса Хопкинса.

1. загрузить протеин сплавливания иммуноглобулина димерной майор комплекс гистосовместимости (MHC-Ig) с желаемой антигена пептид последовательности.

Примечание: При использовании H - 2 КБ: Ig, а затем следовать протоколу подробно шаг 1.1; При использовании H-2Db:Ig, а затем следовать протоколу, подробно описанные в шаге 1.2.

  1. Активные загрузки пептидной последовательности в H - 2 КБ: иг.
    1. Готовить необходимые буферы. Подготовьте денатурации буфера, делая решение 150 мм NaCl и 15 мм Na2CO3 в деионизированной воде и затем настраивая рН 11,5. Подготовьте буфере выемка, сделав решение 250 мм трис-HCl в дейонизированной воде и корректировка pH 6.8.
      Примечание: Как правило, это потребует около 5 мл денатурации и выемка буферов для 1 мг H - 2 КБ: иг.
    2. Денатурируйте H - 2 КБ: Ig разрешить расширение пептид привязки. Принесите H - 2 КБ: концентрация Ig между 0,5-2 мг/мл с фосфат амортизированное saline (PBS). Затем разбавить H - 2 КБ: Ig до конечной концентрации 100-200 мкг/мл с 5-10 объем эквиваленты денатурации буфера и позволить для инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин.
    3. Добавьте 50 Молярная избыток пептида последовательности (обычно запасов пептид хранится в 1 мм при температуре-80 ° C) до H - 2 КБ: раствор Ig.
      Примечание: Обычно пептидные антигены нужно будет расформирован в течение по крайней мере 10% диметилсульфоксида (ДМСО) и затем добавляется медленно PBS оставаться растворимые. В зависимости от аминокислотной последовательности количество ДМСО может потребоваться увеличить.
    4. RENATURE H - 2 КБ: иг с пептида. Сразу же после добавления пептида, принести решение рН 7,4, добавив выемка буфера. Разрешить нейтрализованы решение инкубировать в течение 48 часов при 4 ° C.
    5. Концентрат и мыть загрузки пептидной H - 2 КБ: Ig. Использование центробежных концентратор с 50 kDa свертывании молекулярной массой (MWCO), следуйте инструкциям производителя, чтобы мыть загрузки пептидной H - 2 КБ: раствор Ig 3 раза с PBS, концентрат для по крайней мере 1 мг/мл и количественно определить концентрацию на спектрофотометре.
  2. Активные загрузки пептидной последовательности в H-2Db:Ig.
    1. Готовить необходимые буферы. Подготовьте денатурации буфера, делая раствором лимонной кислоты 131 мм, 150 мм NaCl и 124 мм Na2HPO4 в деионизированной воде и затем настраивая рН 6,5. Подготовьте буфере выемка, сделав решение 120 мм трис-HCl в деионизированной воде и корректировка pH 8.8.
      Примечание: Как правило, это потребует около 5 мл буфера, денатурации и 1 мл буфера выемка для 1 мг H-2Db:Ig.
    2. Денатурируйте H-2Db:Ig, чтобы разрешить расширение пептид привязки. Принесите H-2Db:Ig концентрации до конечной концентрации 0,5-2 мг/мл с PBS. Затем разбавить H-2Db:Ig до конечной концентрации 100-200 мкг/мл 5-10 объем эквиваленты денатурации буфера.
    3. Добавьте 50 Молярная избыток пептида последовательности (обычно запасов пептид хранится в 1 мм при температуре-80 ° C) до H-2Db:Ig решения и позволяют инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
    4. Добавить β2-МИКРОГЛОБУЛИНА и renature H-2Db:Ig с пептида. Добавьте 2 раза Молярная избыток β2-микроглобулин. Затем принести решение рН 7,4, добавив выемка буфера. Разрешить нейтрализованы решение инкубировать в течение 24 ч при 4 ° C.
    5. Концентрат и мыть загрузки пептидной H-2Db:Ig. использованием центробежных концентратор с 50 kDa MWCO, следуйте инструкциям производителя, чтобы мыть загрузки пептидной H - 2 КБ: раствор Ig 3 раза с PBS, сосредоточиться на по крайней мере 1 мг/мл и количественно концентрация на спектрофотометре.

2. сопряженные MHC-пептидных комплексов и Co-Stimulatory молекул на поверхности магнитных наночастиц для формирования наночастиц искусственного антиген представляющих клеток. Используйте один из трех различных методов в зависимости от размера частиц и приложений.

Примечание: Ряд различных методов может использоваться для конъюгата белков на поверхности частиц. Здесь описаны 3 отдельные подходы: Амин покрытием частиц (шаг 2.1), N-оксисукцинимидного (NHS)-покрытием частиц (шаг 2.2) и покрытием biotin частиц (шаг 2.3). Эти процессы также были подробно описаны в разделе методы двух документов опубликованных6,7. Выполните все шаги в биобезопасности Зонта с стерильных растворов для поддержания стерильности запасов aAPC частиц.

  1. Герб антиген специфические и стимулирующее сигналов на магнитные частицы, Амин покрытием (рис. 2). Этот процесс описан для 100 Нм, Амин покрытием суперпарамагнетическим наночастиц.
    Примечание: Подробные протоколы для крепления антитела к поверхности с покрытием частицы Амин можно найти на https://www.micromod.de/en/technotes-2.html, где Technote 201 описывает, как для thiolate антител и сопряженное с maleimide functionalize частицы и 202 описывают процесс, необходимо functionalize Амин покрытием частиц с maleimide функциональных групп. Здесь MHC-Ig и co-stimulatory сигналов, придает эти частицы выделяются лишь незначительные изменения.
    1. Thiolate антитела с Траут реагент (Technote 201).
      1. Подготовка 10 x PBS-Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) буфера (0,1 М PBS и 100 мм ЭДТА). Добавить 10 x буфер PBS-ЭДТА антител 1:10 соотношение для предотвращения окисления бесплатно тиолами, добавлены к антителам.
      2. Добавить 20 Молярная избыток Траут реагента (2-iminothiolane) антитела и проинкубируйте втечение 2 ч при комнатной температуре с смешивания. Отмерьте Траут реагента (сухой порошок) в рамках химического Зонта чтобы избежать дыхания, как он преобразует аминов группы тиоловых групп.
      3. Тщательно промойте 1 x PBS-ЭДТА буфер 3 раза с помощью центробежных концентратор с 50 kDa MWCO и следовать инструкциям производителя, концентрации до тех пор, пока конечный объем 500 мкл. измерения концентрации антител решения с использованием Спектрофотометр.
    2. Преобразовать Амин функциональных групп на магнитных наночастиц maleimide групп с использованием sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) циклогексан-1-карбоксилатных (сульфогруппу-ККАП, Technote 202).
      1. Добавить 10 x буфер PBS-ЭДТА антител 1:10 соотношение частиц.
      2. Растворите сульфогруппу-ККАП в деионизированной воде и вихревые для Ресуспензируйте в концентрации 1 мг/мл. Отмерьте сульфогруппу-ККАП (сухой порошок) в рамках химического Зонта чтобы избежать дыхания, как он преобразует аминов группы maleimide групп.
      3. Добавление 0,016 нмоль сульфогруппу-ККАП решения для каждый квадратный миллиметр площадь поверхности частиц. Для 1 мг 100 Нм частиц используйте 0,3 мг сульфогруппу-ККАП. Позволяет реагировать на 1,5 ч при комнатной температуре.
      4. Вымойте частиц с 1 x PBS-ЭДТА буфер 3 раза с помощью магнитное поле с магнитной колонкой и Ресуспензируйте в 500 мкл 1 x PBS-ЭДТА буфера.
        Примечание: Если использование частиц меньше, чем 200 Нм, такие как 100 Нм частицами описанные здесь, скорее всего постоянные магниты не будет достаточно мощными, чтобы тянуть частиц для стирки или концентрации целей. Таким образом мыть мелкие частицы, используйте магнитные столбец, состоящий из ферромагнитных сфер для того чтобы усилить магнитного поля.
    3. РЕАКТ maleimide функционализированных частицы с thiolated антител (Technote 201).
      1. Добавить частицы стекла флакона сцинтилляционные, добавить мини магнитные перемешать бар, место просто дюйма выше Плиты магнитные перемешать и побудить магнитные Смешивание раствора частиц.
      2. Для перемешивания раствора добавьте thiolated антител (0,5 мг антитела для каждого 1 мг частиц) каплям. Позволяет реагировать на ночь при комнатной температуре.
      3. Вымойте с буфером PBS 1 x 3 раза с помощью магнитного поля и Ресуспензируйте в 500 мкл ПБС. Этикетки и хранить при 4 ° C на срок до 6 месяцев.
        Примечание: Максимальная эффективность спряжение происходит, когда maleimide функционализированных частицы немедленно смешиваются с thiolated белками.
  2. Герб антиген специфические и стимулирующее сигналы для ГСЗ покрытием магнитных частиц (рис. 3). Этот процесс описан для 200 Нм, NHS-покрытием суперпарамагнетическим наночастиц.
    1. Подготовьте ресуспендирования буфер, Закалочные буфер и буфер хранения. Ресуспендирования буфера составляет 25 мм 2-(N-Морфолино) ethanesulfonic кислота (MES) с 0,01% 20 анимации скорректирована до pH 6.0. Закалочные буфер — 100 мм растворе трис-HCl при рН 7,4. Буфер для хранения представляет собой решение 10 мм PBS и 0,01% анимации на рН 7,4.
    2. Ресуспензируйте лиофилизированные частиц в 1 мл буфера ресуспендирования. Вихрь энергично для по крайней мере 15 минут до тех пор, пока не агрегатов видны.
    3. Место магнитные частицы на магнитного стенд, чтобы удалить супернатант Ресуспензируйте с 0,5 мл ресуспендирования буфера и передачи флакон сцинтилляционные стекла. Вихрь, до тех пор, пока не агрегатов видны.
    4. Добавьте 0,1 мг общего белка на 1 мг ресуспензированы частиц. Вихрь смешать и реагировать при комнатной температуре в течение 2,5 ч во время смешивания.
    5. Добавить 0,1 мл тушения буфера и реагировать при комнатной температуре в течение 30 мин, помешивая.
    6. Место сцинтилляционные флакона на магнитную подставку и мыть частицы. Подождите, пока ясно, чтобы удалить супернатант. Удаление частиц из магнитного стенд, добавьте 1 mL ресуспендирования буфера и вихревой до тех пор, пока не агрегатов видны. Повторите этот процесс в три раза и Ресуспензируйте частицы в 1 мл буфера ресуспендирования. Храните частиц на 4 ° C на срок до 6 месяцев.
  3. Герб антиген специфические и стимулирующее сигналов на магнитные частицы, biotin-покрытием (рис. 4). Этот процесс описан на 50-100 Нм, анти биотина суперпарамагнетическим наночастиц.
    1. Biotinylate MHC-Ig или co-stimulatory молекул.
      1. Регулировка протеина концентрации 0,5-2 мг/мл в буфере PBS. Ресуспензируйте сульфогруппу ГСЗ биотина в концентрации 10 мг/мл в деионизированной воде и добавить кратной Молярная избыточные для стимулирующей антитела. Инкубации при комнатной температуре 45 мин.
      2. Тщательно промойте PBS 3 раза с помощью центробежных концентратор с 50 kDa MWCO, следуйте инструкциям производителя, концентрации до тех пор, пока конечный объем 500 мкл. измерения концентрации антител решения с помощью спектрофотометра.
    2. Сопряженное биотинилированным MHC-Ig и/или co-stimulatory сигналы анти биотина наночастиц. Для 500 мкл акций против биотина частиц добавить 0,5 нмоль стимулирующее антитела и Инкубируйте на 4 ° C на ночь.
    3. Вымойте конъюгированных aAPC наночастиц. Потому что эти частицы меньше чем 200 Нм, мокрой магнитной столбец и положить на магнитную подставку.
    4. Добавьте в столбец подвеска частиц/белков. Разрешить все белка/частицы полностью войти в столбце.
    5. Вымыть путем добавления столбца 0,5 мл PBS три раза.
    6. Элюировать, удаление столбца из магнитного стенд, добавив 0,5 мл PBS в столбце и с использованием плунжера, исключать aAPCs частиц во флакон сцинтилляционные стекла. Хранить частиц при температуре 4 ° C на срок до 6 месяцев.
      Примечание: Частицы являются стабильными при 4 ° C (не должны быть заморожены) на срок до 6 месяцев. Более высокие температуры снизить функциональность частиц и определенное агрегирование частиц наблюдались (данные не показаны). Не держать при комнатной температуре для длительных периодов времени, поскольку это значительно сокращает срок годности частиц.

3. охарактеризовать содержание белка на искусственных антиген представляющих клеток наночастиц с помощью флуоресцентных антител обнаружения.

Примечание: Это полезным контроля качества производства искусственного антиген представляющих клеток. Кроме того, количество стимулирующее сигнала используется для производства aAPC эквивалентных доз различных пакетов и различные типы aAPC (например., разных размеров).

  1. Измерение концентрации частиц с покрытием aAPCs.
    1. Используйте неконъюгированной частиц от Стоковый раствор и сделать титрования дозы 1:2 в растворе PBS через 96-луночных плоскодонной культуры ткани табличка с 100 мкл в колодец.
    2. Читайте частиц на пластине чтение спектрофотометром в 405 нм для создания стандартной кривой от концентрации известных частиц.
    3. Взять образец конъюгированных aAPCs, разбавленных в PBS в суммарный объем 100 мкл и читать на спектрофотометре.
  2. Удалить образец изготовлены aAPCs и пятна с флуоресцентных антител.
    1. Чтобы рассчитать сколько образец, чтобы удалить, оцените количество антител на поверхности частицы.
      Примечание: Для этих методов, предположим плотность около 1000 антитела/мкм2 площади поверхности частиц. Чтобы иметь возможность обнаружить флюоресценция, она требует около 1011 MHC-Ig или CD28 молекулы всего на флуоресцентные тест.
    2. Довести общий объем aAPCs до 100 мкл в PBS, добавить окрашивание антител в разведении 1: 100 и инкубировать 1 час при 4 ° C.
      Примечание: Пример антитела, которые успешно используются FITC конъюгированных крыса анти мыши Ig λ1, λ2, λ3 легкие цепи, клонировать R26 46 обнаружить что MHC-Ig, FITC конъюгированных мышь анти-Армянский/сирийский хомяк IgG и клонировать G192-1, для обнаружения анти мыши CD28.
  3. Вымойте частицы и читать флуоресцирования на флуоресцентные пластины читателя.
    1. Магнитно мыть (как описано в шаге 2) окрашенных aAPC дроби три раза с 0,5 мл ФСБ.
    2. Элюировать промывают aAPCs с 0,5 мл ФСБ.
    3. 100 мкл eluted aAPCs, 96-луночных плоскодонной пластины для чтения с помощью поглощения как шаг 3.1 концентрации.
    4. Возьмите оставшиеся 400 мкл, разделить на аликвоты два 200 мкл и добавить две скважины в черный, полистирола 96-луночных, плоскодонной плиты. Титруйте в соотношении 1:2 вниз плита, принимая 100 мкл раствора и смешивания с следующей хорошо, что есть 100 мкл PBS в каждом хорошо по крайней мере четыре раза.
      Примечание: Средняя несколько реплицирует измерения, чтобы уменьшить шум в измерении.
    5. На пластину же черный 96-луночных сделайте стандартной кривой флуоресцентные антитела используются для окраски, путем добавления его в 1: 200 в колодец с 200 мкл PBS и титрования вниз в соотношении 1:2 для по крайней мере 12 скважин.
    6. После aAPC и флуоресцентных антител на табличке, прочитайте пластину с читателем флуоресцентные пластины.
  4. Рассчитайте количество белка на частицы. Определить концентрацию антител, сравнивая значения калибровочной кривой, где концентрация антител, как известно, предполагая в соотношении 1:1 Пятнать антитела для обнаружения антител. Затем разделить этот концентрации обнаружены антитела с концентрации частиц, определяется поглощения пробирного даст количество антител на частицы.

4. обогатить антиген специфические CD8 + Т-клеток с готовым наночастиц искусственного антиген представляющих клеток.

  1. Изолируйте CD8 + Т-клеток.
    1. Усыпить животных под воздействием изофлюрановая следуют шейки матки дислокации.
    2. Удаление селезенки и лимфатических узлов от мышей C57BL/6j wildtype и место в растворе PBS. Размачиваем органов и элюировать клетки через стерильную 70 мкм клеток сито с частыми моет PBS.
    3. Для устранения не - CD8 + Т-клеток, использовать комплект изоляции клеток CD8 + T без-touch и следуйте инструкциям производителя.
      Примечание: Каждый антиген условие требует по крайней мере 3 х 106 CD8 + Т-клеток.
  2. Добавьте наночастиц aAPCs для привязки к CD8 + Т-клеток.
    1. После изоляции сосредоточиться на том 100 мкл в PBS с 0,5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и 2 мм ЭДТА.
    2. Определить число из aAPCs для добавления путем вычисления, основанные на соотношении 1011 aAPC привязкой, пептид загружен MHC-Ig на каждые 106 CD8 + Т-клеток.
    3. Инкубировать aAPC частиц и CD8 + Т-клеток для 1 ч при 4 ° C с непрерывного смешивания в 5 мл стерильной полистирол круглая труба внизу.
  3. Подготовьте дополненный СМИ и фактор роста Т-клеток (TCGF) элюировать и культуры CD8 + Т-клеток.
    1. Дополнено СМИ дополняют полный RPMI 1640 СМИ (с глютамином) 1 x несущественные аминокислот, пируват натрия 1 мм, 0,4 x раствор витамина, 92 2-меркаптоэтанол мкм, 10 мкм ципрофлоксацин и 10% плода бычьим сывороточным (ФБС).
    2. Чтобы сделать TCGF, следуйте протоколы уже созданы и ссылки здесь9.
      Примечание: TCGF является внутренний коктейль человеческой иммунной цитокинов, которая необходима для предоставления Т-клеток с дополнительной стимуляции сигналы, необходимые для роста. TCGF могут быть обменены на известных Т-клеток стимулирующее цитокинов например IL-2, IL-7, или ил-15; Однако каждый может поляризации клеток T ответ соответственно. Протокол, описанные здесь, не был оптимизирован с эти коктейли; Таким образом другие методы должны быть консультации для концентрации и комбинации, если TCGF не используется с примерами перечислены10,11.
  4. Вымойте и обогащают aAPC и CD8 + T ячейку смесь.
    1. Мыть aAPCs магнитных частиц, как описано в шаге 2. Однако, вымыть сначала с помощью буфера PBS с 0,5% BSA и 2 мм ЭДТА, второй использованием дополнить средства массовой информации и с помощью третьего дополнения СМИ с 1% TCGF.
    2. Элюировать aAPCs и обогащенного CD8 + Т-клеток в 500 мкл дополнениями СМИ с 1% TCGF.
    3. Подсчитать ячейки, используя Горяева и пластины в 96 пластине U-дном в 160 мкл на хорошо дополнен СМИ с 1% TCGF в концентрации 2,5 x 105 CD8 + T клеток/мл.
    4. Если изолировать с помощью aAPCs с пептида загружены только MHC-Ig на поверхности (не co-stimulatory сигналы), затем полный шаг 4.5. Если изолировать с помощью aAPCs с обоих загрузки пептидной MHC-Ig на поверхности и co-stimulatory сигналов, затем перейдите к шагу 5.
  5. Магнитные частицы, покрытые co-stimulatory сигналов на поверхности обогащенного фракции и добавить магнитное поле совместно кластера стимулирующее сигналов на поверхности Т-клеток.
    1. Для высокообогащенного фракции, добавьте эквимолярных (или больше в зависимости от приложения смотрите раздел о aAPC свойств для элемента управления) стимулирующее антитела на количество загрузки пептидной MHC-Ig на частицы.
    2. Разрешить co-stimulatory магнитные частицы для привязки к обогащенного CD8 + Т-клеток, за 1 ч при 4 ° C.
    3. Добавьте магнитное поле, поместив пластину культуры между двумя неодимовые магниты диска N52 1,9 см (0,75 дюйма) в длину.
      Примечание: N52 диск магниты имеют чрезвычайно сильное поле. Следует позаботиться как хранить их с прокладками между магнитами, как это трудно удалить друг от друга и когда положить их на культуры пластин. Чтобы свести к минимуму магниты от прилипания к металлических компонентов инкубатора, поместите их в 50 мл Конические трубки пенополистирола контейнеров на нижней и верхней.

5. расширять и обнаруживать антиген специфические CD8 + Т-клеток с готовым наночастиц искусственного антиген представляющих клеток.

  1. Добавьте 96 U-дном хорошо пластину с aAPCs и CD8 + Т-клеток в увлажненные 5% CO2, инкубатора 37 ° C в течение 3 дней. На третий день подача клетки с 80 мкл на хорошо дополнен СМИ с 2% TCGF и место обратно в инкубаторе до 7 день.
  2. На 7 день урожай стимулируется клетки в 5 мл круглая труба внизу для подсчета.
  3. Однажды все решения собирают, спин вниз заготовленных клеток Ресуспензируйте в 0,5 мл PBS с азидом натрия 0.05% и 2% FBS. Количество жизнеспособных клеток окрашивание с Трипановый синий и подсчета на Горяева.
  4. Удаление 50 000-500 000 подсчет клеток в два новых 5 мл вокруг нижней трубы для окрашивания антиген специфические. Одна трубка будет использоваться для родственных пептид MHC пятно, и другой трубки будет использоваться для не Когнаты пятно для определения фона пятнать.
  5. Добавить 1 мкг биотинилированным MHC-Ig (с использованием методики, описанной в шаге 2) в соответствующих узнаваемыми и не Когнаты трубы в 100 мкл PBS с азидом натрия 0.05% и 2% FBS с аллофикоцианин (APC)-конъюгированных крысы мыши и анти CD8a, клонировать 53-6.7 (коэффициент разрежения в 1: 100) за 1 ч при 4 ° C.
  6. Добавление вторичного стрептавидина и жить мертвых пятен. Промойте избыток биотинилированным MHC-Ig с PBS путем центрифугирования. Затем пятно все образцы с соотношением 1: 350 фикоэритрин (PE)-помечены стрептавидина и 1: 1000 в соотношении жить/мертвые поправимо зеленый мертвые клетки пятно для 15 мин при 4 ° C.
  7. Читайте все образцы на проточный цитометр определить специфику и количество антиген специфические клетки.
    1. Промыть превышение средней и жить/мертвые пятна центрифугированием и Ресуспензируйте с 150 мкл буфера PBS с азидом натрия 0.05% и 2% FBS читать на проточный цитометр.
  8. Определите количество и процент антиген специфические клетки с программного обеспечения для анализа данных.
    1. Чтобы определить процент антиген специфические клетки, используйте следующие ворота в соответствующих порядке живой +, + лимфоцитов (вперед разброс по стороне точечная), CD8 + и димеров +. Определите димер + ворота, сравнивая номера Когнаты родственных пятно.
    2. Определите процент антиген специфические клеток в образце путем вычитания процент димер + родственных MHC-Ig пятно от пятно не Когнаты MHC-Ig.
    3. Используя этот процент антиген специфические клетки, умножьте его на количество клеток подсчитано, уступая количество антиген специфические клетки полученный от обогащения и расширения.
      Примечание: Компенсации должны быть созданы на проточный цитометр, поскольку есть спектральных совпадения с флуорофоров, используемые в этой панели.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для завершения успешного обогащение и расширение антиген специфические Т-клеток, загрузки пептидной MHC-Ig и co-stimulatory молекулы должны быть успешно подключился к aAPC частиц. Основываясь на 3 методы частиц насадки, мы предоставляем некоторые репрезентативные данные для успешного сопряжения процедура завершения (Рисунок 5a). Действительно, если плотность лигандом является слишком низким, то не будет эффективным стимуляции антиген специфические CD8 + Т-клеток где это происходит вокруг линейное расстояние между лигандами выше 100 Нм в наш опыт (Рисунок 5b)7.

Помимо количественных флуоресцентные антитела отсчетов и трансгенных разложения клеток CD8 + T наночастиц aAPCs могут быть проверены для контроля качества допинг в родственных трансгенных антиген специфические CD8 + Т-клеток. Это может быть сделано путем изоляции CD8 + Т-клеток от трансгенные мыши например Pmel мыши, которая имеет gp100 специфичные антиген специфические CD8 + Т-клеток и допинг в B6 фон в соотношении 1: 1000. Подсчет и пятнать до и после обогащения позволяет перечисление как раз обогащения (рис. 6А), так и процент восстановления (Рисунок 6b)6. В этих представительных результатов мы демонстрируем, что сигнал-1 только aAPCs обеспечивают наиболее эффективное обогащение (почти в 10 раз) и около 80% клеток восстановления, которая усиливается над традиционными сигнала 1 и 2 aAPCs, которые имеют неспецифической анти CD28 на частицы а также.

Однажды aAPCs частиц были достаточно и контроль качества, то они могут быть использованы в обогащение и расширение редких антиген специфические CD8 + Т-клеток от wildtype мышей. Для получения точных результатов важно иметь функциональный обнаружения реагентов, например биотинилированным димер. Контроль качества димерных биотинилированным также может быть сделано на трансгенных CD8 + Т-клеток для проверки окрашивание. Здесь представитель результаты показывают положительный пятнать с gp100 конкретных CD8 + Т-клеток с B6 CD8 + Т-клеток как элемент фона (рис. 7). Рисунок 7 также демонстрирует, что, если есть слишком высоких уровней биотинилированным димер, то это уменьшит его алчность, как он будет конкурировать с самим собой и выставку моно Валент привязки.

После обогащения и расширения CD8 + Т-клеток мыши на семь дней можно было бы ожидать от 5 до 50 процентов антиген специфические CD8 + Т-клеток, с почти 20 000 до 200 000 антиген специфические CD8 + Т-клеток после начиная с 5 x 106 CD8 + Т-клеток в состояние (Рис. 8) 6. специально, когда пятная для антиген специфические CD8 + Т-клеток, важно знать, фон окраски биотинилированным димер, где в этом случае было 4,15%; отрицательный результат (рис. 8a) считается любой процент ниже, чем это от родственных пятно. Кроме того это покажет, где рисовать ворота цитометрии потока для определения фактической доли антиген специфические CD8 + Т-клеток. Это важно в случаях, когда антиген специфические CD8 + Т-клеток у различных групп населения (как показано на рис. 8А), но могут появиться как широким мазком.

Этот же процесс может использоваться для изоляции и стимулировать человека антиген специфические CD8 + Т-клеток. Подобный контроль качества и результаты должны рассматриваться где наблюдается значительное увеличение доли и числа антиген специфические CD8 + Т-клеток после всего за одну неделю расширения после обогащения (рис. 9)5.

Figure 1
Рисунок 1 : Схема процесса антиген специфические обогащения и расширения с помощью наночастиц искусственного антиген представляющих клеток. Во-первых полная изоляция клетки CD8 + T без-touch. Затем добавьте наночастиц aAPCs CD8 + Т-клеток. Обогатить с магнитным полем, культура и стимулировать с aAPCs. Наконец обнаружить обогащенного и расширение антиген специфические CD8 + Т-клеток, проточной цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: схема для спрягать загрузки пептидной MHC-Ig и co-stimulatory молекул на поверхности Амин покрытием магнитных частиц. Вкратце сульфогруппу-ККАП сшивателя используется для functionalize поверхности магнитных частиц с maleimide функциональных групп. MHC-Ig и co-stimulatory молекулы одновременно функционализированных с Траут реагенты для получения тиоловых функциональных групп. Активированных частиц и белка сигналы реагируют вместе и затем промывают производить антиген специфические искусственных антиген представляющих клеток магнитные наночастицы. Эта цифра была изменена от дополнительного материала публикации нашей лаборатории в Nano буквы7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: схема для спрягать загрузки пептидной MHC-Ig и co-stimulatory молекул на поверхности ГСЗ покрытием магнитных частиц. Вкратце ГСЗ покрытием частиц отреагировали вместе с загрузки пептидной MHC-Ig и co-stimulatory молекул и затем промывают производить антиген специфические искусственных антиген представляющих клеток магнитные наночастицы. Эта цифра была изменена от дополнительного материала публикации нашей лаборатории в Nano буквы7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Схема для спрягать загрузки пептидной MHC-Ig и co-stimulatory молекул на поверхности магнитных частиц, biotin-покрытием. MHC-Ig и co-stimulatory молекулы функционализированных с ГСЗ биотина для производства функциональных групп биотина. Затем вместе с функционализированных загрузки пептидной MHC-Ig и co-stimulatory молекулы являются отреагировали biotin-покрытием частиц. После этого эти частицы помыты производить антиген специфические искусственных антиген представляющих клеток магнитные наночастицы. Эта цифра была изменена от дополнительного материала публикации нашей лаборатории в Nano буквы7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Спряжение эффективности имеет решающее значение для обогащения и расширения антиген специфические Т-клеток. () репрезентативных данных для эффективности конъюгации с методами три сопряжения трех разных база магнитных частиц, описанные в этом документе: Амин покрытием частиц, NHS-покрытием частиц и частиц, biotin-покрытием. Каждая точка данных представляет технику приготовления различных частиц и погрешностей представляют S.E.M. (b) как лиганд плотность влияет трансгенных CD8 + Т-клеток стимуляции, где плотность лигандом представлена как линейное расстояние между лигандами в нанометрах на 600 Нм и 50 Нм aAPCs (n = 5 и погрешностей представляют S.E.M.). Эта цифра была изменена от нашей лаборатории публикации в Nano буквы7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 : Контроль качества обогащения aAPC. Трансгенные Pmel gp100-специфичные CD8 + Т-клетки были допированном в в соотношении 1: 1000 в wildtype B6 CD8 + Т-клеток. () фолд обогащения была измерена с помощью проточной цитометрии после обогащения путем пятнать маркер congenic Thy1.1 и CD8. Здесь было сравнение между сигнал 1 только частицы или Db-Ig загружен с gp100, традиционные сигнал 1 и 2 частиц или Db-Ig загружен с gp100 и анти CD28 и частицы не Когнаты сигнала 1 и 2. (b) клетки были также насчитывает до и после для измерения восстановления клеток каждого из методов. Данные представляют собой три независимых экспериментов и ошибка бары представляют S.E.M. данных объединены измерялась односторонний дисперсионный анализ с Тьюки после тестирования (*p< 0,05, **p< 0.01). Эта цифра была изменена от нашей лаборатории публикации Письма Nano6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7 : Контроль качества биотинилированным димер. Gp100-специфичные CD8 + Т-клетки были изолированы от трансгенные мыши Pmel и окрашенные в 100 мкл PBS с тремя концентрации биотинилированным Db-Ig загружен с gp100 и APC анти CD8a, используя wildtype B6 CD8 + Т-клеток в качестве отрицательного контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8 : Обогащение и расширение антиген специфические CD8 + Т-клеток. B6 wildtype CD8 + Т-клеток были обогащенный либо сигнала 1 только (КБ-Ig загружен с TRP2) или сигнал 1 и 2 (КБ-Ig загружен с TRP2 и анти CD28 конъюгированных на поверхности частицы). Сигнал 2 затем добавляется обогащенного часть сигнала 1 только aAPCs и все клетки были культивировали в течение 7 дней. () CD8 + Т-клетки запятнаны воротами на флуоресцентные жить/мертвые пятна, затем условного CD8 + и KbTRP2 + и по сравнению с не Когнаты КБ-Ig обнаруживать антиген специфические CD8 + Т-клеток. (б) (c) и процент количество TRP2-конкретных CD8 + Т-клеток, таким образом можно определить, где более высокие проценты и цифры антиген специфические CD8 + Т-клеток могут быть обнаружены от сигнала 1 подход только обогащения (n = 7, погрешностей представляют собой стандартное отклонение, двустороннее паре t-тест *p < 0,05, **p < 0.01). Эта цифра была изменена от нашей лаборатории публикации Письма Nano6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 9
Рисунок 9 : Обогащение и расширение клеток человека антиген специфические CD8 + Т. () представитель поток цитометрии участки на день 0, прежде чем день 7 и обогащения показывают драматических последствий обогащения и расширения антиген специфические CD8 + Т-клеток от здоровых доноров с традиционными наночастиц aAPCs где A2-Ig загружен с NY-ESO1 и А2-Ig загружен с MART1 антигенов отображаются. (b) это создает высокий процент (~ 10-20%) и цифры (0.5-1 x 10-6) антиген специфические CD8 + Т-клеток, день 7 (n = 3 независимых доноров, погрешностей представляют S.E.M.). Эта цифра была изменена от нашей лаборатории публикации в ACS Nano5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительный файл 1-Box 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. 

Дополнительный файл 2-Box 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы создали технологии изоляции Роман антиген специфические Т-клеток, на основе наночастиц искусственного антиген представляющих клеток (aAPCs). Наночастицы aAPCs пептид загружены MHC на поверхности, что позволяет привязке антиген специфические Т-клеток и активации вместе с co-stimulatory активации. aAPCs также парамагнитно и таким образом могут использоваться для обогащения редких антиген специфические Т-клеток с помощью магнитного поля. Мы имеем оптимизированы и изучены ключевые наночастиц свойства Размер, плотность лиганд и выбором лиганда и их влияния на привязки, обогащение, активации и клеток обогащение (Дополнительный файл 1-Box 1).

Таким образом обогащения и расширения процедуры результаты в антиген специфические CD8 + T клеток расширения нескольких thousand-fold производства антиген специфические показатели как высокий как 60% и могут использоваться в настройках мышиных и человека (Дополнительный файл 2-Box 2 ). Такие высокие цифры и проценты антиген специфические Т-клеток дать характеристику иммунных реакций для заболеваний (например., рак, аутоиммунных, и т.д.), позволяют за открытие новых иммунной цели и механизмы и предлагают возможность быть используется в адоптивной иммунотерапии. Пример приложения является последовательность опухоли пациента, выявления мутаций, найти потенциальных MHC-скоросшиватели от мутантов последовательностей, производить aAPCs с этими верхней кандидата антигены и затем использовать aAPCs, чтобы определить имеет ли пациент любой неоантигены опухоль – специфичные.

Действительно, методологические ограничения были основным препятствием для изучения и выявления антиген специфические реакции. Существующие методы () требуется значительное время и работа трудоемких процедур, (b) настоящий трудности в поддержании клеточных линий, таких как необходимость сбора аутологичной дендритные клетки, (c) требуют недель Т-клеток расширения до получения результатов, (d) результат в низкой специфики (1-2%) и низкого числа антиген специфические CD8 + T клетки, (e) часто с значительным фонового сигнала и (f) CD8 + T клетки, которые производятся часто нельзя использоваться или учился в дальнейших анализов. Один из методов требует иммунизации с антигеном до ELISPOT характеризовать наличие антиген специфические ответ14,,1516,17. Другой метод, используя выражение тандем мини гена плазмид в transfect антиген представляющих клеток требует мультиплексирования Тетрамер пятна с цитокина + ответы, такие как IFNγ увеличить чувствительность18. Даже пептид пульсирующей эндогенного антиген представляющих клеток в культуре в пробирке , только результаты в 0,5%, увеличение антигена специфика15.

Наш подход решает эти методологические ограничения и таким образом может выступать в качестве инструмента диагностики и лечения. Важнейшие шаги для обеспечения антиген специфические CD8 + Т-клеток обогащения и расширения являются 1) эффективно загружать MHC-Ig с пептидной антигена, 2) конъюгат стимулирующее сигналов на поверхности наночастиц, 3) связывают частицы T-клеткам, 4) обогащает клетки, обязан наночастицы с магнитным полем, 5) разверните eluted наночастиц привязкой Т-клеток в культуре и 6) обнаруживать антиген специфические CD8 + T клетки на 7 день с биотинилированным, загрузки пептидной MHC.

Основные проблемы, которые возникают в протоколе обогащения и расширения возникают от ненадлежащего производства или истек обнаружения реагентов или наночастиц aAPCs. Убедитесь, что биотинилированным димера может испачкать антиген специфические CD8 + Т-клеток с испытания трансгенных антиген специфические CD8 + Т-клеток. Если пептид MHC-Ig не имеют соответствующей модели трансгенные мыши, это может быть полезно для загрузки пептидной положительный контроль и тестирование позитивных элемента управления для проверки загрузки. Однако некоторые пептиды могут не загружаться в MHC-Ig; Это могут быть смоделированы с MHC-загрузки алгоритмы, такие как Net-MHC, или экспериментально с заказы RMA ячейки на основе анализов13. aAPC частиц стабильности может уменьшаться после 6 месяцев, так что если есть некоторые различия в результаты обогащения и расширения, то другой флуоресцентные пластины читателя пробирного может выполняться для проверки стабильности.

В будущей работе, мы стремимся расширить возможности, широту и глубину анализа. Мы работаем на увеличение пропускной способности и способность мультиплекс с несколькими антигены, расследовались в одно время в формате 96-луночных пластины. В настоящее время основным ограничением является, что одновременно могут быть исследованы только несколько антигенов. Мы работаем это путем расследования, как размер частиц aAPC и лигандом плотности влияет обогащения. Кроме того мы рассматриваем как различные клетки композиции эффект CD8 + T клеток расширения в рамках культуры. Наконец мы стремимся подражать этой технологии в рамках MHC класса II, чтобы иметь возможность обогатить и расширить антиген специфические CD4 + Т-клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют следующие конкурирующих финансовых interest(s): под лицензионного соглашения между NexImmune и Университетом Джона Хопкинса, Джонатан шнек имеет право на долю роялти, полученные в университете на продажах продуктов, описанных в этом статья. Он также был основателем NexImmune и владеет акций в компании. Он является членом научно-консультативного совета директоров и NexImmune в. С условиями этих соглашений были рассмотрены и одобрены университета Джонса Хопкинса в соответствии со своей политикой конфликта интересов.

Acknowledgments

J.W.H. Спасибо NIH рака нанотехнологический центр обучения в институте Джонса Хопкинса нанобиотехнологии, национальной науки фонд исследовательских стипендий (DGE-1232825) и Дуг фонд поддержки стипендий. Эта работа финансировалась поддержке национальных институтов здравоохранения (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), ТЕДКО/Мэриленд инновационной инициативы и Фонд Коултер (ОСЗ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein BD Biosciences 551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig BD Biosciences 551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein BD Biosciences 550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932257
Purified Human Beta 2 Microglobulin Bio-Rad PHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles Micromod 79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm Ocean Nanotech SN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure Miltenyi 130-105-637
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217
Sulfo-SMCC Crosslinker  ProteoChem c1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene Corning 3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46   BD Biosciences 553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1 BD Biosciences 554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice Jackson Laboratory 005023
C57BL/6J (B6 wildtype) mice Jackson Laboratory 000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse Miltenyi 130-104-075
MS Columns Miltenyi 130-042-201
LS Columns Miltenyi 130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE Biolegend 405203
N52 disk magnets of 0.75 inches  K&J Magnetics DX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 Biolegend 100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation  ThermoFisher L-34969

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).
  2. Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
  3. Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
  4. Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).
  5. Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
  6. Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
  7. Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
  8. ,, et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
  9. Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
  10. Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
  11. Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
  12. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
  13. Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
  14. Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
  15. Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
  16. Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
  17. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572 (2014).
  18. Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).

Tags

Машиностроение выпуск 141 наночастицы магнитного обогащения искусственных антиген представляющих клеток Т-клетки иммунотерапия рака редких клеток обогащения Т-клеток расширения приемных T клеточной терапии Neoantigen immunoengineering биоинженерии
Обогащать и расширять редких антиген специфические Т-клеток с магнитных наночастиц
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hickey, J. W., Schneck, J. P. Enrich … More

Hickey, J. W., Schneck, J. P. Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles. J. Vis. Exp. (141), e58640, doi:10.3791/58640 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter