Summary
将提供一种先进的显微镜, 可对这两种情况、隔离的质膜和周围的细胞内体积进行快速和高分辨率的成像。将纺盘和总内部反射荧光显微镜集成到一个装置中, 可以在每个图像堆栈的高采集速率下进行实时成像实验。
Abstract
在活细胞中, 粘附形成等过程涉及质膜和细胞内部的广泛结构变化。为了可视化这些高度动态的事件, 结合了两种互补的光显微镜技术, 可以快速成像实时样品: 旋转盘显微镜 (sd), 用于快速和高分辨率的体积记录和全面的内部反射荧光 (tirf) 显微镜, 用于精确定位和可视化质膜。将展示一个全面、完整的成像方案, 用于指导样品制备、显微镜校准、图像形成和采集, 从而形成具有高时空分辨率的多色 sd-tirf 实时成像系列。生成多维实时成像数据集所需的所有图像后处理步骤, 即各个通道的注册和组合,都在开源软件 imagej 的自写宏中提供。在粘附配合物的萌发和成熟过程中, 荧光蛋白的成像, 以及肌动蛋白细胞骨架网络的形成, 被用作这一新方法的原理证明。高分辨率三维显微镜和 tirf 的结合提供了对细胞环境中这些复杂过程的详细描述, 同时, 精确定位了与膜相关的分子。信噪比。
Introduction
我们的时代, 光显微镜技术提供了高/超分辨率成像的固定和活的标本是迅速发展。超分辨率技术, 如受激发射耗尽 (sted)、结构化照明显微镜 (sim) 和光激活定位显微镜 (palm) 或直接随机光学重建显微镜 (storm), 分别是商业上可获得的, 并使成像的亚细胞结构显示的细节几乎在分子规模 1,2,3, 4, 5,6。然而, 这些方法在现场成像实验中的适用性仍然有限, 在现场成像实验中, 需要以每秒多个帧的采集速度对大容量进行可视化。通过质膜调节的高度动态过程的品种,如内/外渗、粘附、迁移或信号, 在大细胞内高速发生。最近, 为了填补这一空白, 提出了一种集成的显微镜技术, 称为旋转磁盘 tirf (sd-tirf)7。具体而言, tirf 显微镜允许专门分离和定位质膜8,9, 而 sd 显微镜是最敏感和快速的实时成像技术之一, 用于可视化和跟踪细胞质中的亚细胞细胞器10,11。在过去的 12,13, 这两种成像技术的组合已经实现, 然而, 这里介绍的显微镜 (图 1) 终于符合执行实时成像 sd-tirf 实验的标准以每秒3帧的速度完成上述过程。由于这种显微镜是商业上可用的, 这份手稿的目标是详细描述, 并提供开源工具和协议的图像采集, 注册, 和可视化与 sd-tirf 显微镜。
该设置基于通过独立端口连接到两个扫描单元的倒置显微镜--左端口连接到 sd 单元, 后端口连接到 tirf 和光激活漂白实验的扫描仪单元。可用于激发的激光器 (40\ 445/488/48\ 56n--)。对于荧光信号的激发和检测, 分别采用了 100 xn1.45 油或60xéna1.49 油 tirf 目标。发射的光由双色反射镜 (561 纳米长通或561纳米长通) 分割, 并由放置在两个 em-ccd 凸轮前的各种带通滤波器 (55 纳米宽, 中心在561纳米, 54 纳米宽分别以609纳米为中心, 用于绿色和红色荧光)时代。请注意, zobiak 等人列出了有关设置的更多技术细节.7. 在 tirf 配置中, sd 单元在大约0.5 秒内移出光路, 以便可以使用相同的两个摄像机进行检测, 从而与过去13报告的大约1秒相比, 可以在两种成像模式之间更快地切换./c2 >。此功能可实现双通道同步采集, 因此可以以以前无与伦比的速度和精度执行4个通道 sd-tirf 成像。此外, sd 和 tirf 图像之间的对齐是不必要的。但是, 在开始实验之前, 必须检查两个摄像机之间的图像对齐情况, 并在必要时进行更正。在下面的协议中, 在自写 imagej 宏中实现了注册更正例程。此外, 该宏的主要目的是允许同时显示 sd 和 tirf 数据集, 尽管它们的维度不同。采集软件本身并没有提供这些功能。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 细胞的制备
- 实验前两天, 种子 3 * 105 h秒钟或 NIH3T3 细胞在2毫升的全生长培养基每口6井细胞培养板。确保在整个协议中, 细胞在层流引擎盖中处理。
- 在实验前一天, 根据制造商的建议或经验确定的协议准备转染试剂,例如:
- 在总共200μl 还原血清中稀释1微克的 rfp-生命和1μg 的 yfp-vinculin。短暂的转染试剂涡旋, 再向 200μl dna 中加入4μl 和涡旋。在室温下将转染混合物孵化15-20。
- 将整个转染混合直接滴入细胞。通过晃动盘子, 把它放回孵化器, 混合在一起。
- 在实验当天, 准备用于实时成像的样品:
- 在 pbs 中制备10μgml 纤维连接蛋白溶液, 以覆盖35毫米玻璃底盘的玻璃表面。只使用高品质 0.17 mm 的玻璃盖板, 以获得最佳的 tirf 性能, 避免塑料底盘。在室温下将溶液放在玻璃表面 30分钟, 然后取出, 让盘子风干。
- 将0.1μm 的多荧光珠溶液稀释到蒸馏水中每毫升1.8 x 10 9 粒粒子的密度, 并将该溶液添加到纤维镀膜玻璃表面30-60。立即取出溶液, 让盘子风干。
注: 只有在播种单元格之前找到 tirf 平面和/或获取用于基于珠子的图像配准的2色参考图像时, 才需要执行此步骤。 - 制备 0.1 m 抗坏血酸 (aa) 溶液, 并将其稀释到生长介质 (aa-介质) 中的最终浓度 0.1 mm。将溶液放在37°c 的水浴中。
注: 如有可能, 请使用荧光优化的细胞培养基, 如无酚类和 (核子) 减少黄酮的培养基。aa 是一种抗氧化剂, 可在实时成像14中减少光毒性效应。我们已经成功地在这个测试中测试它,即更多的细胞出现健康条件下应用比没有 aa 添加。然而, 该介质的 ph 值降低了 0.17 ph 单位。 - 用2毫升 pbs 清洗细胞, 加入250μl 胰蛋白酶-edta, 等待细胞完全分离 (37°c 孵化器中 2-3分钟)。用移液器在1毫升预热的 aa 介质中仔细地将细胞重新移植, 并将其添加到 15 ml 细胞培养管中的 4 ml aa 培养基中。将细胞悬浮液与稍微打开的盖子放在孵化器设置为37°c 和 5% co2 在显微镜附近。
- 在玻璃底盘中加入1毫升预热的 aa 介质, 并将其放置在预热显微镜的支架中 (见下一段)。
2. 实时成像
- 启动显微镜的环境控制, 达到稳定的37°c、5% 的二氧化碳和潮湿的大气。
注: 在这里, 使用了一个小的舞台顶部孵化器, 允许在大约15分钟内稳定设置. 较大的孵化器将需要更多的时间来实现稳定的条件。 - 在应用细胞悬浮液之前, 请在显微镜下修复所有采集设置:
- 将时间间隔设置为 30秒, 将持续时间设置为 60-90分钟, 激活每个时间点 (值 "1") 的基于硬件的自动对焦功能。
- 调整相机曝光和增益, 以及每个通道的激光功率。高增益水平、低曝光时间和低激光功率可减少光毒性。
注: 此处提供的数据是通过200毫秒曝光、增益级别500和20% 的激光功率获得的, 该功率等于488纳米的激发强度 0.5 w/cm²和561纳米的 1 wcm²。 - 将纺盘通道的 z 堆栈设置为 10μm, 间距为0.4μm。tirf 通道的停用 z 堆栈。将底部偏移量设置为 "0",即最低平面将是硬件自动对焦的焦点位置。
- 激活多点功能 "舞台位置"。
注: 在30秒的时间间隔内最多可以记录3个位置。
- 在眼睛或计算机屏幕上找到带有 epi-fluorescent 照明的荧光灯珠, 然后激活一个 tirf 通道, 并将照明角度设置为表示 tirf 照明的值。通过按下显微镜面板上的按钮激活自动对焦, 并使用偏移轮调整对焦。获取2色数据集,即tirf-488 和 tirf-561, 用于后续基于珠子的图像配准 (见 point 3.1)。
- 可选: 为确保 tirf 照明, 添加一些自由浮动的荧光多色珠悬浮液 (见点 1.3.2)。激活 tirf 通道的实时视图并增加照明角度。非粘附磁珠将消失在临界角度之外, 确保正确的 tirf 照明8。
- 通过将封闭的管反转2-3 次, 再次将细胞悬浮液混合在一起, 并将1毫升的细胞应用到成像盘中。
- 快速找到具有低电平波-荧光照明的双转染细胞。使用明亮的字段照明将实时相机预览中的单元格居中, 并标记位置。再找1-2 点兴趣, 并将其保存到仓位列表中。
注: 在开始时, 细胞可以很容易地分离由于阶段运动, 从而设置4-5 个位置, 并重新检查所有之前开始图像采集。随后, 丢弃1-2 个位置。 - 点击 "序列" 按钮开始数据采集。
3. 图像中的图像后处理 j
- 为了在 fiji15中生成一个无注册的超堆栈, 编写了一个名为 "sd-tirf _ 帮助器" 的宏, 该宏可应用于2-4 通道 sd-tirf 时间数据集。将文件 "sd-tirf _ 联接 _ jove. ijm" 保存在 fiji 子文件夹 "宏" 中, 然后通过单击菜单命令 "插件 > 的宏 > 运行..." 来运行宏。
- 如果颜色通道需要更正, 请选择该选项并创建新的基于珠子的注册引用 (地标文件), 或使用之前创建的现有文件。
注: 涡轮增压插件16将应用于荧光珠子参考图像。根据插件安装的一般指南, 在 fiji 软件中安装插件。 - 使用生物格式导入程序导入数据, 并选择超堆栈作为查看选项。加载图像数据集, 在第一步中选择 sd 系列, 在第二步中选择 tirf 系列。fiji 将显示按通道和阶段位置排序的数据,即通常所有 sd 通道和所有 tir 通道都显示为已选择的每个阶段位置的一个超堆栈。
注: 可以从各种文件类型导入数据, 例如 tiff 系列或与平台相关的文件类型, 如 *. nd。只有当采集软件未将文件类型导出为独立的、无压缩的 tiff 格式时, 才能识别该文件类型。 - 通过加载预先确定的地标文件, 将注册更正应用于相应的通道。
- 为每个 sd 和 tirf 通道选择所需的颜色查找表 (lut), 并将它们合并到一个多维超堆栈中。
注: 在处理 tirf 通道的过程中, 在底部平面的顶部添加了一些具有零强度值的 z 平面, 这些 z 平面与 sd 数据集中的 z 平面数相匹配。此步骤对于最终超堆栈的可视化非常重要。这种方法是正确的, 因为 tirf 照明的深度 (小于 200nm7) 小于 sd 堆栈的 z 步长 (400 nm)。
- 如果颜色通道需要更正, 请选择该选项并创建新的基于珠子的注册引用 (地标文件), 或使用之前创建的现有文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
为了显示 sd-tirf 成像的潜力, 我们开发了一种检测方法, 该方法应揭示细胞基质粘附物的时空组织及其在细胞粘附过程中与细胞骨架的相互作用。因此, 粘附的 hea 或 NIH3T3 细胞转染 yfp-vinculin 和 rfp-liveact 18-24, 胰蛋白酶化, 并播种到纤维镀膜玻璃底部的盘子。这些细胞系的选择是由于它们在实时成像实验中具有明显的细胞骨架和更高的鲁棒性, 而不是原代细胞。这些可能经不起成像在非常敏感的条件下, 因为他们是在胰蛋白酶治疗后。在显微镜下, 选择了 yfp/rfp 表达细胞, 并在60分钟的时间间隔内观察了粘附过程 (图 2和电影1和 2)。这个具体的分析很少和没有清楚地被描述在文学17,18。此外,在迁移细胞19、20 等方面, 主要研究了粘附形成。因此, 我们需要调整这种方法 (细胞系, 涂层, 介质, 成分), 以进行实验, 在本文中描述。
正如所料, 细胞在开始时呈圆形, 且仅有弱粘附, 而膜突起则感应环境并与底物接触。细胞基质接触迅速加强后, 形成所谓的新生粘连 20, 21 (图 2 a, tirf-488 通道, 时间点0-4.5 分钟)。后者是点状, 长春新素阳性结构在侧侧的细胞。这些结构在 tirf 图像中清晰可见。在粘连形成之初, 肌动蛋白均匀分布在细胞中, 没有定位到这些早期的复合物 (图 2a, sd-561 通道)。随着时间的推移, 粘附配合物扩大并成熟到焦点粘连 (图 2c)。这些拉长的结构在细胞的周围主要是明显的 (图 2A+B), 是由肌球蛋白纤维施加的力造成的。这些纤维开始连接到粘附配合物, 从而将它们拉向细胞中心, 并诱导细胞基质粘连的加强以及肌动蛋白纤维21的捆绑。显然, 由于肌动蛋白网络的形成, 细胞也会变平 (图 2 a, xz 视图)。sd 成像被证明是这里的首选方法, 因为它允许以高灵敏度、空间分辨率和从完整的角度对这一过程进行可视化。在上一份报告17中, tirf 本身只能推测外周粘连的起源, 而 sd-tirf 成像清楚地揭示了它与丝状体的联系 (图 2b, 时间点 17分钟, 白色箭头)。事实上, 从焦点粘连中出现的肌动蛋白纤维在27分钟后就显现出来了 (图 2b, 黄色箭头)。
然而, 这些实验的采集设置,即采集速度、激发强度和探测器增益, 需要仔细评估。30/时间点的间隔, 使多点采集, 似乎是理想的, 而激发激光的辐射强度 (在 0.5-1 s/timepoint 之间) 需要在关键考虑下。图 2d显示同一实验中无法连接到基板的不同位置的单元格。光毒性效应可能会影响细胞的生物学, 这最终导致膜冒泡大约60分钟后, 可能类似于细胞凋亡 (电影 2)。这再次表明敏感细胞对光毒性的反应, 重要的是要在输入的光量和被提取的信息之间找到很好的平衡。减少激光功率、z 堆栈中的图像数量或增加增益可能是降低光毒性的正确策略。然而, 所有这些设置都应调整到仍然能够实现足够分辨率和信噪比的水平, 从而能够从记录的时间间隔中提取量化信息。
图 1: sd-tirf 设置的原理图。a. sd 成像模式: 6 种不同的激光线 (40545/485/565-40nm, 绿线) 被连接到共聚焦扫描单元 (csu) 中, 通过 sd (位置 "in") 和显微镜体中的空过滤立方体 (mic)。样品 (spec) 的荧光发射通过 sd 的针孔投射, 并由不同的二色反射镜 (例如绿色或黄/黄核同时采集) 分裂到两个不同的 em-ccd 摄像机 (c1 和 c2) 上。荧光过滤器放置在摄像机的前面 (未显示)。b. tirf 成像模式: 激光线与 tirf 扫描仪 (tirf) 耦合。mic 中的多线分束器将光束定向到样品, 发射光绕过 sd ("out") 以实现最大传输。荧光是由 a 中描述的相同的摄像机和发射过滤器检测到的。这一数字已从 zobiak等人的报告中修改。7.请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 使用 sd-tirf 显微镜观察细胞扩散和粘附形成的代表性结果。a.双转染的 h la 细胞表示 rfp-liveact (红色, sd-561 通道) 和 yfp-vinculin (绿色, tirf-488 通道) 进行了色氨化, 并重新播种到纤维镀膜玻璃覆盖片上。粘附形成变得很容易看得见, 从小新生粘连 (长春素阳性斑点) 在0分钟后发展成更大的焦点粘连约5分钟后。皮质肌动蛋白在大约10分钟后是明显的, 并延伸在细胞的外围 (见12和24.5 分钟的框架)。b. a 中盒装区域的放大视图 (帧为 45分钟) 描述了细胞扩散和从新生的焦点粘连的过渡, 以及与丝状粘附 (白色箭头) 和应力纤维形成 (见27分钟的框架,黄色箭头)。a . d. 中绘制的虚线的 kymograph .(照片-)对细胞或其他不健康细胞的毒性影响会使它们无法附着在基板上。必须对成像条件进行严格评估, 以排除光毒性。刻度杆 = 5μm (a 和 d) 和 2μm (b 和 c)。a 和 d 中的 xz 视图是从其中绘制的虚线 (底部 = 基板) 中提取的正交投影。图像是线性对比增强和中间过滤与3x3 内核。请点击这里查看此图的较大版本.
电影1:3d 重建的时间流逝序列在图 2 a.利用三维成像软件对图像序列进行渲染。持续时间: 42.5 分钟采集率: 每分钟获得2个双通道 sd-tirf 堆栈 (共56帧)。请点击这里观看此视频。(右键单击下载.
电影 2: 图2c 中的时间流逝序列的电影.持续时间: 60分钟采集率: 每分钟获取2个双通道 sd-tirf 堆栈 (共56帧)。请点击这里观看此视频。(右键单击下载.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本文首次成功地实现了 sd 和 tirf 显微镜, 其配置适合进行活细胞成像实验,即3个不同阶段每分钟 2个 sd-tirf 图像堆栈的高采集率。位置, 相当于总共168帧 (约3帧/秒), 被收购。前面描述的少数 sd-tirf 显微镜, 主要是缺乏足够高的成像速度, 无法在3d 中跟踪细胞过程, 在3d 中, 每个图像堆栈的时间分辨率通常小于 2 s。该装置可实现高达0.78 图像堆栈每秒, 并在研究三维囊泡动力学的现场实验中证明了每个大图像堆栈的3.5秒的成像速率。此外, 以前的 sd-tirf 显微镜每个成像模式只有一个检测器, 进一步降低了多通道采集的速度。从技术上讲, 在这些系统中, 可以实现分视图配置, 也可以使用单个摄像机同时进行双色采集。然而, 这将只允许对一半的视野进行成像。其他用于生成具有高时空分辨率的多维数据集的方法, 如宽场成像与反卷积或3d 超分辨率显微镜相结合,即3d sim 或格子光片显微镜 22,23, 可能是有效的替代方案。然而, 基于解积的成像可以很容易地引入低信噪比采集中的图像伪影 (在实时成像应用中经常出现这种情况), 而超分辨率的3d 实时成像仍然是技术上的精心策划和具有挑战性的任务。在所提出的高级 sd-tirf 设置7的实现中, 利用了允许将双磁盘移入和移出检测路径的 sd 单元。此配置提供了两个主要优点: 第一, 相同的两个摄像机可用于检测 sd 和 tirf 信号, 从而导致这两个通道的高精度重叠。其次, 在 tirf 采集模式下运行时, 旋转盘的针孔不会阻挡任何发射光 (有关详细信息, 请参见图 1 b), 从而提高了对高灵敏度实时成像非常重要的收集效率。因此, 这种光学配置有利于将任何类型的 tirf 显微镜 (例如可变或固定角度照明) 实现到现有的 sd 显微镜中, 从而允许绕过 sd 单元。此外, 使用的 tirf 扫描仪可以在所谓的分时模式下运行, 在这种模式下, 两个 tirf 通道可以同时记录 (如 zobiak等人所示).7), 进一步加快多通道数据的采集。
使用 tirf 的最大优点之一是, 通过这种方法, 在生命细胞成像实验中, 可以以最高精度定位来自细胞膜的信号。事实上, 虽然像 sim 这样的方法提供了更好的 z 切片, 从而更好地隔离了固定样本中的细胞膜, 但在活细胞成像实验中, 细胞器荧光信号呈指数级增长/减少了。离开 tirf 界面可以更具体、更精确地定位细胞膜。定位精度虽然还没有量化, 但仍有许多小于150-200nm 的褶皱,即消失场的空间范围。
目前, 该方法的一个限制是将旋转盘单元从光路径中取出并开始 tirf 采集所需的时间,即0.5秒。此延迟限制了两个连续采购之间的最小时间间隔。从技术上讲, 应该可以通过绕过带有凹面镜的磁盘来减少这种延迟, 从而减少每个 sd-tirf 周期的整体采集。此外, 新一代摄像机可能会在高信噪比下减少曝光时间。因此, 通过升级硬件组件, 仍可以相应地提高此设置的整体性能。但是, 从成像的角度来看, 还有其他几种方法可以最大限度地减少采集时间 (按降序排列): 避免多个位置, 降低 z 堆栈高度, 增加 z 间距, 最大限度地减少曝光时间 (增加增益和可能使用分站), 缩短采集位置之间的距离, 仅在每个 n 个时间点 (n>1) 激活自动对焦。尽管实际存在限制, 但如果仔细评估所有这些参数, 则可以使用 sd-tirf 成像来跟踪和定位快速移动的细胞囊泡, 如 zobiak等人所述.7。
此外, 本文还提出了一种描述单通道 sd-tirf 数据集采集例程的协议。使用提供的宏, 可以在包含所有 sd 和 tirf 通道的单个 tiff 文件中导出原始数据。图像注册本身是不必要的;然而, 重要的是, 两个相机都要精确地相对于彼此进行对齐。剩余的像素移动 (平移和旋转) 可以在提供的宏中检测和更正。该修正算法利用了在开始实验前必须记录的荧光磁珠的多通道参考图像。在生成的文件中, tirf 平面设置在最低级别, 后面是与 sd 通道的维数匹配的一些零强度平面。因此, 如协议中所述, 获取数据非常重要, 其中成像的 tirf 平面类似于 sd 通道的 z 堆栈集的下端。
最后, 该系统可以通过 sim 模块或最近推出的多角度 tirfm24,25进行扩展, 以进一步提高空间分辨率。然而, 根据目前的最新技术, 只有以成像速度较慢为代价, 才能实现空间分辨率的提高。对于所有活细胞成像实验, 在其中定位结构在质膜上是至关重要的, 尽管保持了剩余细胞体积的高空间分辨率, 这里描述的 sd-tirf 设置是一个易于集成, 随时可用解决 方案。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们非常感谢大学医学中心汉堡-埃彭多夫的科学界为我们提供样本评估。也就是说, 我们感谢 sabine windhorst 的 NIH3T3 细胞, 感谢 andrea mordhorst 的 yfp-vinculin 和 rfp-liffolact 的马伦·鲁道夫。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
References
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
- Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
- Trache, A., Lim, S. -M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).
- Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
- Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R.
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
- Chen, B. -C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
- Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).
