Summary
Eine erweiterte Mikroskop, die es ermöglichen schnelle und hochauflösende werden Bildgebung des isolierten Plasmamembran sowohl die umliegenden intrazelluläre Volumen präsentiert. Die Integration von spinning-Disk und Gesamtbetrag interne Reflexion Fluoreszenzmikroskopie in einer Aufspannung ermöglicht live-imaging-Experimente bei hohen Erfassungsraten bis zu 3,5 s pro Bildstapel.
Abstract
In lebenden Zellen beinhalten Prozesse wie Adhäsion Bildung umfangreiche strukturelle Veränderungen in der Plasmamembran und das Zellinnere. Um diese hoch dynamischen Events sichtbar zu machen, wurden zwei komplementäre lichtmikroskopische Techniken, mit denen schnelle Bildgebung live Proben kombiniert: spinning Disk Mikroskopie (SD) für schnelle und hochauflösende Volumen Aufnahme und Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) für die präzise Lokalisierung und Visualisierung der Plasmamembran. Eine umfassende und vollständige imaging-Protokoll wird für Führung durch Probenvorbereitung, Mikroskop Kalibrierung, Imagebildung und Erwerb, wodurch Multi-Color SD-TIRF live imaging Serie mit hoher räumlich-zeitliche Auflösung angezeigt. Alle gewünschten Bild Nachbearbeitung Schritte, Multi-dimensionale live imaging Datasets, d.h. Anmeldung und Kombination der einzelnen Kanäle zu generieren sind ein selbst geschriebenes Makro für die open-Source-Software ImageJ zur Verfügung gestellt. Die Darstellung der fluoreszierenden Proteinen während der Initiation und Reifung der Adhäsion-komplexe sowie die Bildung des Aktin-Zytoskeletts Netzwerks, diente als Beweis der Grundsatz dieser neuartige Ansatz. Die Kombination aus hochauflösenden 3D Mikroskopie und TIRF zur Verfügung gestellt, einer detaillierten Beschreibung dieser komplexen Prozesse innerhalb der zellulären Umgebung und gleichzeitig präzise Lokalisierung der membranassoziierten Moleküle erkannt mit hohem Signal-Hintergrund-Verhältnis.
Introduction
Unsere Tage entwickeln sich rasch lichtmikroskopische Techniken bietet High/Super Resolution Imaging in festen und lebenden Exemplar. Höchstauflösung Techniken wie z. B. stimulierte Emission Depletion (STED), strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM) und Foto-Aktivierung Lokalisierung Mikroskopie (PALM) oder direkte stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm), bzw. sind im Handel erhältlich und ermöglichen die Darstellung der subzellulären Strukturen zeigt Details fast auf molekularer Ebene1,2,3,4,5,6. Allerdings haben diese Ansätze noch Anwendbarkeit für live-imaging-Experimente beschränkt, in denen große Mengen mit mehreren Frames pro Sekunde Erwerb visualisiert werden müssen. Sorten von hochdynamischen Prozessen über die Plasmamembran, z.B. Endo - reguliert / Exozytose, Adhäsion, Migration oder Signalisierung, mit hoher Geschwindigkeit in zellulären Großmengen auftreten. Um diese Lücke zu füllen, war eine integrierte Mikroskopie-Technik vor kurzem vorgeschlagenen genannt Spinning Disk-TIRF (SD-TIRF)7. Im einzelnen ermöglicht TIRF-Mikroskopie speziell isolieren und lokalisieren die Plasmamembran8,9, während SD Mikroskopie eine der sensibelsten und schnellen ist Leben bildgebende Verfahren zur Visualisierung und Verfolgung von subzellularen Organellen im Zytoplasma10,11. Die Kombination der beiden bildgebenden Verfahren in einer einzigen Aufspannung hat bereits in den vergangenen12,13realisiert, jedoch das Mikroskop (Abbildung 1) vorgestellte endlich erfüllt die Kriterien um live imaging SD-TIRF-Experimente durchzuführen die oben genannten Prozesse mit 3 Bildern pro Sekunde. Da dieses Mikroskop im Handel erhältlich ist, ist das Ziel dieser Handschrift zu ausführlich beschreiben und open Source Tools und Protokolle für Bildaufnahme, Registrierung und Visualisierung mit SD-TIRF-Mikroskopie verbunden.
Das Setup basiert auf einem inversen Mikroskop mit zwei Scan-Einheiten über unabhängige Ports verbunden - der linken Anschluss ist verbunden mit der SD-Einheit und den hinteren Port Scanner-Einheit für TIRF und Foto-Aktivierung /-bleichen Experimente. Bis zu 6 Laser (405/445/488/515/561/640 nm) kann zur Anregung verwendet werden. Für die Anregung und Detektion der Fluoreszenzsignal, entweder 100 X / NA1.45 Öl oder 60 X / NA1.49 Öl TIRF Ziel bzw. beschäftigt waren. Das ausgestrahlte Licht durch einen dichroitischen Spiegel (561 nm lang-Pass oder 514 nm lang-Pass) aufgeteilt und durch verschiedene Bandpass-Filter gefiltert (55 nm Breite zentriert auf 525 nm, 54 nm Breite zentriert auf 609 nm für grüne und rote Fluoreszenz, beziehungsweise) vor die beiden EM-CCD-Kamera platziert Epochen. Bitte beachten Sie, dass weitere technische Details über das Setup in Zobiak Et Al. aufgeführt sind 7. in TIRF Konfiguration, bewegt sich die SD-Einheit aus dem Strahlengang innerhalb von ca. 0,5 s, dass die gleichen zwei Kameras für die Erkennung verwendet werden können, so dass schneller Wechsel zwischen den beiden bildgebenden Verfahren im Vergleich zu ca. 1 s, die in der Vergangenheit berichtet wurde13 < /C2 >. Diese Funktion ermöglicht die simultane Erfassung Zweikanal-, 4 Kanäle SD-TIRF imaging bei bisher unerreichte Geschwindigkeit und Genauigkeit durchgeführt werden kann. Darüber hinaus ist Ausrichtung zwischen SD und TIRF Bilder nicht erforderlich. Bildausrichtung zwischen den beiden Kameras muss jedoch vor Beginn des Experiments überprüft und gegebenenfalls korrigiert werden. In das folgende Protokoll wurde eine Registrierung-Korrektur-Routine in einem selbstgeschriebenen ImageJ-Makro umgesetzt. Darüber hinaus wurde das Makro hauptsächlich entwickelt, um eine gleichzeitige Visualisierung von SD und TIRF Datasets trotz ihrer unterschiedlichen Dimensionalität zu ermöglichen. Die Datenerfassungs-Software selbst bieten nicht diese Funktionen.
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Protocol
1. Vorbereitung der Zellen
- Samen Sie zwei Tage vor dem Experiment, 3 * 105 HeLa oder NIH3T3 Zellen in 2 mL voll Wachstumsmedium pro Bohrloch einer 6-Well-Zellkultur-Platte. Stellen Sie sicher, dass Zellen in einer Laminar-Flow-Haube in diesem Protokoll behandelt werden.
- Bereiten Sie einen Tag vor dem Experiment, die Transfektion Reagenzien gemäß den Empfehlungen des Herstellers oder eine empirisch ermittelte Protokoll, z.B.:
- Verdünnen Sie 1 µg der RFP-Lifeact und 1 µg der YFP-Vinkulin in insgesamt 200 µL Serum Medium reduziert. Vortex Transfection Reagens kurz, hinzu kommen 4 µL 200 µL DNA und Wirbel wieder. Inkubieren Sie die Transfektion Mischung für 15-20 min bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie die gesamte Transfektion Mischung tropfenweise direkt auf die Zellen. Mischen Sie durch Schütteln der Plattenrandes und legen Sie sie wieder in den Brutkasten.
- Am Tag des Experiments bereiten Sie die Probe für live Imaging vor:
- Bereiten Sie eine 10 µg/mL Lösung von Fibronektin in PBS, die Glasoberfläche von einer Glasschale unten 35 mm zu beschichten. Verwenden Sie nur qualitativ hochwertige 0,17 mm Glasdeckgläser für eine optimale Leistung der TIRF und vermeiden Sie Kunststoffboden Speisen. Lassen Sie die Lösung auf der Glasoberfläche, für 30 min bei Raumtemperatur, dann entfernen Sie es und lassen Sie die Schale an der Luft trocknen.
- Der Fibronektin-beschichteten Glasoberfläche die Lösung für 30-60 s hinzufügen und eine 0,1 µm Multi-fluoreszierenden Perlen Lösung zu einer Dichte von 1,8 x 109 Partikel pro mL destilliertem Wasser verdünnen. Entfernen Sie sofort die Lösung und lassen Sie die Schale an der Luft trocknen.
Hinweis: Dieser Schritt ist nur erforderlich, wenn die TIRF Flugzeug vor der Aussaat Zellen und/oder ein 2-farbige Referenzbild für die Wulst-basiertes Abbild Registrierung erwerben gefunden werden sollte. - Bereiten Sie eine Lösung von 0,1 M Ascorbinsäure (AA) und verdünnen Sie es um eine Endkonzentration von 0,1 mM im Wachstumsmedium (AA-Mittel). Legen Sie die Lösung in einem 37 ° C-Wasserbad.
Hinweis: Verwenden Fluoreszenz-optimierte Zellkulturmedium wenn möglich, solche als Phenolred-frei und (Ribo)-Flavin reduziert Medium. AA ist ein Anti-oxidierende Mittel, das phototoxische Wirkung während der live-imaging-14verringern kann. Wir haben es erfolgreich in diesem Assay, d.h. getestet, die mehr Zellen gesund unter den Bedingungen, die gelten als ohne AA Zusatz erschienen. Jedoch wurde der pH-Wert des Mediums von 0,17 pH-Einheiten gesenkt. - Waschen Sie die Zellen mit 2 mL PBS, fügen Sie 250 µL Trypsin-EDTA und warten Sie, bis die Zellen voll sind getrennt (ca. 2-3 min in einem Inkubator 37 ° C). Aufschwemmen der Zellen vorsichtig in 1 mL vorgewärmt AA-Medium mit einer Pipette und 4 mL AA-Medium in einem 15 mL Zelle Kultur Rohr hinzufügen. Legen Sie die Zellsuspension mit leicht geöffnetem Deckel in einem Inkubator auf 37 ° C und 5 % CO2 in der Nähe von dem Mikroskop gesetzt.
- Fügen Sie 1 mL vorgewärmt AA-mittlere bis untere Glasschale und stellen es in die Halterung des vorgewärmten Mikroskops (siehe nächster Abschnitt).
2. Live imaging
- Starten Sie die Umwelt Kontrolle des Mikroskops eine stabile 37 ° C, 5 % CO2 und feuchter Atmosphäre zu erreichen.
Hinweis: Hier wurde eine kleine Bühne Top Inkubation Kammer verwendet, dass zulässige stabile Einstellungen innerhalb von ca. 15 min. größere Inkubatoren mehr Zeit benötigen, um stabile Verhältnisse zu erreichen. - Alle Einstellungen der Übernahme am Mikroskop zu beheben, bevor die Zellsuspension angewendet wird:
- Legen Sie das Zeitintervall auf 30 s und einer Dauer von 60-90 min. aktivieren die Autofokus-Funktion des Hardware-basierte Auto-Focus für jeden Zeitpunkt (Wert "1").
- Passen Sie die Belichtung der Kamera sowie Gewinn und die Laserleistung für jeden Kanal. Hohe Ebenen gewinnen, geringe Belichtungszeit und niedrige Laserleistung sind empfehlenswert, Phototoxizität zu reduzieren.
Hinweis: Die hier vorgestellten Daten wurde mit 200 ms Exposition erworben, gain Level 500 und 20 % Laserleistung, die Anregung Intensität von 0.5 W/cm ² für 488 entspricht nm und 1 W/cm ² für 561 nm, beziehungsweise. - Festlegen des Z-Stacks für die Spinning-Disk-Kanäle bis 10 µm mit 0,4 µm-Abstand. De-aktivieren Sie Z-Stacks für die TIRF-Kanäle. Satz der unteren-Offset auf "0", d.h. der niedrigsten Ebene werden die Fokuslage des Hardware-Autofokus.
- Aktivieren Sie die Multi-Punkt-Funktion "Bühne Positionen".
Hinweis: Bis zu 3 Positionen können in 30 s Zeit aufgezeichnet werden.
- Die fluoreszierenden Perlen mit Epi-fluoreszierende Beleuchtung zu finden, an das Okular oder auf dem Computerbildschirm dann ein TIRF Kanal zu aktivieren und den Beleuchtungswinkel auf einen Wert eingestellt, der TIRF Beleuchtung bezeichnet. Aktivieren Sie den Autofokus durch Drücken des Knopfes auf dem Mikroskop-Panel und stellen Sie den Fokus mit dem Offset-Rad. Eine 2-Farben-Dataset, d.h. TIRF-488 und TIRF-561, für nachfolgende Wulst-basiertes Abbild Registrierung erwerben (siehe Punkt 3.1).
- Optional: Um TIRF Beleuchtung sicherzustellen, fügen ein paar Mikroliter der frei schwebenden fluoreszierende multicolor Perlen Suspension (siehe Punkt 1.3.2.). Aktivieren Sie die live-Ansicht eines TIRF-Kanals und erhöhen Sie den Beleuchtungswinkel. Die nicht-Anhänger Perlen verschwinden jenseits der Grenzwinkel, gewährleisten eine korrekte TIRF Beleuchtung8.
- Die Zellsuspension wieder durch Umdrehen der geschlossenen Rohr 2 - 3 Mal mischen und 1 mL der Zellen für die bildgebende Gericht gelten.
- Doppel-transfizierten Zellen mit niedrigem Niveau Epi-fluoreszierende Beleuchtung schnell zu finden. Zentrieren Sie die Zellen in der live-Kamera-Vorschau mit Hellfeld-Beleuchtung und markieren Sie die Position. Finden Sie eine weitere 1 bis 2 Punkte von Interesse zu und speichern Sie sie in der Liste der Positionen.
Hinweis: Am Anfang, die Zellen leicht können abnehmen durch Bewegung, daher 4-5 Positionen eingestellt und überprüfen Sie alle vor dem Start der Bildaufnahme. Danach entsorgen Sie 1-2 Positionen. - Starten Sie die Datenerfassung durch Anklicken des Buttons "Sequence".
3. Bild-Nachbearbeitung in ImageJ
- Um eine Anmeldung kostenlos Hyperstack in Fidschi15generieren, wurde ein Makro namens "SD-TIRF_helper" geschrieben, die auf 2 bis 4 Kanal SD-TIRF Timelapse Datasets angewendet werden kann. Speichern Sie die Datei "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" in der Fidschi-Inseln Unterordner "Makros" und führen Sie das Makro, indem Sie auf den Menübefehl "Plugins > Makros > laufen...".
- Wenn die Farbkanäle Anmeldung Korrektur benötigen, wählen Sie die Option und erstellen Sie eine neue Perle-basierte Anmeldung Referenz (Wahrzeichen Datei) oder verwenden Sie eine vorhandene Datei, die zuvor erstellt wurde.
Hinweis: Das Turboreg-Plugin-16 wird auf Fluoreszenz Perlen Referenzbilder angewendet werden. Installieren Sie das Plugin in Fidschi-Software nach den allgemeinen Richtlinien für Plugin-Installationen. - Importieren Sie die Daten mit dem Bio-Formate-Importeur und wählen Sie Hyperstack als eine Anzeigeoption aus. Laden Sie das Bild-Dataset zu, wählen Sie die SD-Serie in den ersten Schritt und der TIRF-Serie im zweiten Schritt. Fidschi wird zeigen die Daten sortiert nach Kanal und Bühne Position, d. h. , die normalerweise alle SD-Kanäle und alle TIRF-Kanäle als ein Hyperstack für jede Stufe Stelle auftauchen, die ausgewählt wurde.
Hinweis: Daten-Import ist möglich aus verschiedenen Dateitypen, z. B.-Typen wie z. B. TIFF-Serie oder Plattform-abhängige Datei * Endekennug. Der Dateityp werden nicht erkannt, nur dann, wenn es nicht durch die Software zur Datenerfassung als unabhängige, Kompression-Less TIFF-Format exportiert wurde. - Wenden Sie die Registrierung-Korrektur auf die jeweiligen Kanäle durch Laden der vorbestimmten Wahrzeichen Datei an
- Wählen Sie die Wunschfarbe Look-up-Tabelle (LUT) für jeden Kanal SD und TIRF und verschmelzen sie zu einer einzigen, Multi-dimensionale Hyperstack.
Hinweis: Bei der Verarbeitung der TIRF Kanäle sind eine Reihe von Z-Ebenen mit Nullwerten Intensität auf der unteren Ebene hinzugefügt, die mit der Anzahl der Z-Flugzeuge in das SD-Dataset entspricht. Dieser Schritt ist wichtig für die Visualisierung von der endgültigen Hyperstack. Diese Methode ist korrekt, da die Tiefe der TIRF Beleuchtung (weniger als 200nm7) ist kleiner als die Z-Schrittweite des Stapels SD (400 nm).
- Wenn die Farbkanäle Anmeldung Korrektur benötigen, wählen Sie die Option und erstellen Sie eine neue Perle-basierte Anmeldung Referenz (Wahrzeichen Datei) oder verwenden Sie eine vorhandene Datei, die zuvor erstellt wurde.
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Representative Results
Um dem Potenzial des SD-TIRF Imaging, zeigen ein Assay entwickelt wurde zeigen sollte, die räumlich-zeitliche Organisation der Zelle-Matrix-Haftung-komplexe und deren Wechselwirkung mit dem Zytoskelett während zellulare Adhäsion. Daher Anhänger HeLa oder alternativ NIH3T3, die Zellen mit YFP-Vinkulin und RFP-Lifeact für 18-24 h, transfiziert wurden trypsiniert und auf Fibronektin-beschichtete Unterseite Glasschalen ausgesät. Diese Zell-Linien wurden für ihre starke Zellskelett und höhere Robustheit in live imaging-Experimente im Gegensatz zu, zum Beispiel Primärzellen gewählt. Die könnte nicht standhalten, imaging in sehr empfindlichen Zustand wie sie nach der Trypsin-Behandlung sind. Unter dem Mikroskop YFP/RFP-Ausdruck Zellen wurden ausgewählt und der Klebevorgang beobachtet während 60 Minuten Zeitraffer (Abbildung 2 und Filme 1 und 2). Diese spezifischen Assay wurde in der Literatur17,18selten und nicht eindeutig beschrieben. Darüber hinaus ist Adhäsion Bildung meist in z.B. Migration Zellen19,20untersucht worden. Somit mussten wir diese Methode (Zelllinie, Beschichtung, Medium, Komposition) zur Durchführung der Experimente, die in diesem Dokument beschriebenen anzupassen.
Wie erwartet, Zellen wurden Runden am Anfang und nur schwach haftend, während Membran Vorsprünge waren sensing die Umwelt und machen Kontakt mit dem Substrat. Zellmatrix Kontakte schnell verstärkt auf Bildung von sogenannten entstehende Verwachsungen20,21 (Abbildung 2A, TIRF-488-Kanal, mal Punkte 0-4,5 min). Letztere sind vor Ort-Like, Vinkulin-positiven Strukturen an der ventralen Seite der Zelle. Die Strukturen wurden in die TIRF Bilder deutlich sichtbar. Am Anfang der Adhäsion Bildung Aktin verteilte sich gleichmäßig in der Zelle und nicht zu diesen frühen komplexen (Abb. 2A, SD-561-Kanal) lokalisiert. Im Laufe der Zeit Adhäsion komplexe vergrößert und gereift, fokale Adhäsionen (Abbildung 2). Diese länglichen Strukturen waren überwiegend erkennbar an der Peripherie der Zelle (Figuren 2A + B) und resultierte aus Kräfte, die durch Acto-Myosin-Fasern ausgeübt wurden. Diese Fasern begonnen, die Adhäsion komplexe, damit ziehen sie in Richtung der Mitte der Zelle und induzieren, die Stärkung der Zellmatrix Verwachsungen, sowie die Bündelung von Aktin Fasern21herstellen. Die Zelle abgeflacht offenbar auch durch Aktin Netzwerkbildung (Abb. 2A, XZ-Ansicht). SD-Bildgebung geprüft um die Methode der Wahl, hier zu sein, da es erlaubt, diesen Prozess zu visualisieren, mit hoher Empfindlichkeit, räumliche Auflösung und aus Sicht der komplette. In einem früheren Bericht17ließen TIRF allein nur die spekulieren über den Ursprung des peripheren Verwachsungen, SD-TIRF Bildgebung deutlich seine Assoziation mit Filopodien (Abbildung 2 b, Zeitpunkt 17 min, weiße Pfeilspitze) ergeben. In der Tat wurde Aktin Fasern entstehende centripetally fokalen Adhäsionen nach 27 min (Abb. 2 b, gelbe Pfeilspitze) sichtbar.
Die Übernahme-Einstellungen von diesen Experimenten, d.h. Erwerb Geschwindigkeit, Anregung Intensität und Detektor zu gewinnen, müssen jedoch sorgfältig geprüft werden. Das Intervall von 30 s/Timepoint, ermöglicht Multi-Punkt-Erwerb, scheint ideal, während die Intensität der Strahlung des Lasers Erregung (zwischen 0,5-1 W/cm ²) kritisch geprüft werden muss. Abb. 2D zeigt eine Zelle an eine andere Position im gleichen Experiment, das nicht auf dem Untergrund zu befestigen. Es ist möglich, dass phototoxische Effekte die Biologie der Zelle, führte schließlich beeinflusst in die Membran sprudeln nach ca. 60 min, wahrscheinlich ähnlich Apoptose (Film 2). Dies wieder klar wie empfindliche Zellen reagieren auf Phototoxizität und ist es wichtig finden Sie eine gute Balance zwischen der Menge an Licht hinein und den Informationen wird herausgenommen. Reduzieren die Laserleistung, die Anzahl von Bildern in ein Z-Stack oder Erhöhung der Verstärkung möglicherweise die richtige Strategie zur Verringerung der Phototoxizität. Alle diese Einstellungen sollten jedoch angepasst werden auf einem Niveau, das noch erlaubt genügend Auflösung und Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen ermöglicht quantitative Informationsextraktion aus den aufgezeichneten Zeitraffer.
Abbildung 1: schematische Zeichnung des SD-TIRF-Setups. A. SD-bildgebenden Modus: 6 verschiedene Laser-Linien (405/445/488/515/561/640nm, grüne Linien) sind in der konfokalen Abtasteinheit (CSU), vorbei an der SD (Stellung "IN") und einen leeren Filter Cube im Mikroskop Körper (MIC) gekoppelt. Fluoreszenz-Emission aus der Probe (SPEC) wird durch die Nadelstiche die SD und Split von verschiedenen dichroitischen spiegeln, z. B. für grün/rot oder gelb/Cyan simultane Erfassung auf zwei verschiedenen EM-CCD-Kameras (C1 und C2) projiziert. Fluoreszenz-Filter befinden sich vor der Kamera (nicht dargestellt). B. TIRF imaging-Modus: die Laser-Linien sind in den TIRF-Scanner (TIRF) gekoppelt. Ein mehrzeilige Strahlteiler im MIC leitet den Strahl auf die Probe und die Emission Licht umgeht der SD ("OUT") für maximale Übertragung. Fluoreszenz wird durch die gleichen Kameras erkannt und Emission Filter beschrieben A. Diese Zahl wurde von Zobiak Et al.modifiziert. 7 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: repräsentative Ergebnisse der Zellbildung verbreiten und Haftung mit SD-TIRF-Mikroskopie. A. Doppel-transfizierten HeLa-Zelle Ausdruck RFP-Lifeact (rot, SD-561-Kanal) und YFP-Vinkulin (grün, TIRF-488-Kanal) wurden trypsiniert und neu ausgesät auf Fibronektin-beschichteten Glasdeckgläser. Adhäsion Bildung wird gut sichtbar, beginnend mit kleinen entstehende Verwachsungen (Vinkulin-positiven Flecken) bei 0 Minuten, die in größeren fokalen Adhäsionen nach ca. 5 Minuten zu entwickeln. Kortikale Aktin ergibt sich nach ca. 10 Minuten und erstreckt sich an der Peripherie der Zellen (siehe Bilder 12 und 24,5 Minuten). B. die vergrößerte Ansicht die boxed Region in einem (45 min) zeigt Zelle verbreiten und den Übergang von der im Entstehen begriffenen, fokale Adhäsionen und Filopodien verbundenen Verwachsungen (weiße Pfeilspitze) sowie Stress Faser Bildung (siehe Rahmen mit 27 Minuten gelbe Pfeilspitze). C. Glomeruli der gestrichelte gelbe Linie in A. D. (Photo-) Toxische Wirkungen auf Zellen oder sonst ungesunde Zellen können sie nicht auf dem Untergrund befestigen lassen. Bildgebung Bedingungen müssen kritisch beurteilt werden, um Phototoxizität auszuschließen. Maßstabsleiste = 5 µm (a und D) und 2 µm (in B und C). Die XZ-Ansichten in A und D sind die orthogonale Projektionen aus weißen Striche gezeichnet darin extrahiert (unten = Substrat). Bilder wurden linear Kontrast verbessert und mit einem 3 x 3-Kernel Median gefiltert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Movie 1: 3D-Rekonstruktion der Zeitraffer-Sequenz in Abb. 2A. Die Bildsequenz wurde mit 3D gerendert imaging-Software. Dauer: 42,5 min. Erfassungsrate: 2 Zweikanal-SD-TIRF Stapel pro Minute (56 Bilder insgesamt) erworben wurden. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Movie 2: Film die Zeitraffer-Sequenz in Abb. 2 C. Dauer: 60 min. Erfassungsrate: 2 Zweikanal-SD-TIRF Stapel pro Minute (56 Bilder insgesamt) erworben wurden. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
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Discussion
In diesem Papier wurde die erste erfolgreiche Implementierung von SD und TIRF-Mikroskopie in einer Konfiguration für experimentieren live Cell imaging, d.h. hohe Erfassungsraten wie 2 SD-TIRF Bild Stapel pro Minute bei 3 verschiedenen Bühne vorgestellt. Positionen, entsprechend insgesamt 168 Rahmen (ca. 3 Bilder pro Sekunde), erworben wurden. Die paar SD-TIRF-Mikroskope, die zuvor beschriebenen12,13, vor allem fehlende ausreichend Highspeed imaging, zelluläre Prozesse in 3D, in denen zu folgen eine Zeitauflösung von weniger als 2 s pro Bildstapel ist oft notwendig. Die vorgestellte Setup erreichen bildgebenden Raten von bis zu 0,78 Bild Stapel pro Sekunde, sondern Raten von 3,5 s pro Stapel "großes Bild" im live-Experimenten untersuchen 3D Vesikel Dynamik wurden7gezeigt. Darüber hinaus hatte früheren SD-TIRF Mikroskope nur ein Melder pro imaging-Modus, die Geschwindigkeit für Multi-Channel-Akquisitionen weiter reduziert. Technisch, in diesen Systemen, die eine geteilten Ansicht-Konfiguration implementiert werden könnte erlaubt, die auch simultane zweifarbige Erwerb mit einer einzigen Kamera. Dies würde jedoch Bildgebung von nur der Hälfte das Sichtfeld ermöglichen. Andere Methoden zur mehrdimensionalen Datasets mit hoher räumlich-zeitliche Auflösung zu produzieren, wie Weitfeld Bildgebung kombiniert mit Dekonvolution oder 3D Super-Auflösung Mikroskopie, d.h. 3D SIM oder Gitter leicht Blatt Mikroskopie22, 23, möglicherweise brauchbare Alternativen. Dekonvolution-basierte Bildverarbeitung kann jedoch leicht einführen Bildartefakte bei niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis Übernahmen (wie es oft der Fall bei live-imaging-Anwendungen), und super-Resolution 3D live Imaging ist noch ein technisch angedeuteten und anspruchsvolle Aufgabe. Bei der vorgestellten Realisierung eine erweiterte SD-TIRF Setup7wurde eine SD-Einheit genutzt, die ermöglicht die Dual-Scheibe innerhalb und außerhalb der Erkennung Pfad verschieben. Diese Konfiguration bietet zwei wesentliche Vorteile: Erstens können die gleichen beiden Kameras zur Erkennung der SD und TIRF signalisieren, wodurch eine hochpräzise Überschneidung dieser beiden Kanäle verwendet werden. Zweitens die Nadelstiche der drehenden Scheibe nicht blockieren Licht Emission beim Betrieb im TIRF Akquisitionsmodus (für weitere Details, siehe Abbildung 1 b), wodurch sich die Abscheideleistung für High-Sensitive live Bildgebung wichtig. Diese optische Konfiguration ist daher günstig für jede Art von TIRF-Mikroskopie (z. B. Variablen oder festen Winkel Beleuchtung) in vorhandenen SD-Mikroskope, die es ermöglichen, unter Umgehung der SD-Einheit umzusetzen. Darüber hinaus verwendete TIRF-Scanner kann ausgeführt werden in sog. Time-sharing-Modus, wo zwei TIRF Kanäle gleichzeitig aufgenommen werden (siehe Zobiak Et Al. 7), Beschleunigung weiter oben den Erwerb von Multi-Channel-Daten.
Einer der größten Vorteile von TIRF beschäftigt ist, dass mit dieser Methodik es möglich ist, das Signal von der Zellmembran während einer Leben-Zelle imaging Experiment mit höchster Präzision zu lokalisieren. In der Tat, während eine Methodik wie SIM-Karte bietet eine bessere z schneiden und somit bessere Isolierung der Zellmembran in fixiert Proben in live Cell imaging Experimente der exponentielle Erhöhung/Senkung der Fluoreszenz-Signals von Organellen nähert sich / verlassen die TIRF-Schnittstelle erlaubt spezifische und präzise Lokalisierung der Zellmembran. Die Genauigkeit der Lokalisierung, obwohl nicht noch quantifiziert, verspricht viele Falten, die kleiner als 150-200 nm, d. h. der räumliche Bereich des Feldes Evanescence.
Derzeit ist eine Einschränkung der Methode die notwendige Zeit, um den Lichtweg drehenden Festplatte Gerät entnehmen und starten die TIRF Erwerb, d. h. 0,5 s. Diese Verzögerung schränkt das minimale Zeitintervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden übernahmen. Technisch gesehen, sollte es möglich, diese Verzögerung durch die Scheibe mit z.B. Galvo-Spiegel zu umgehen und damit Verringerung des gesamten Erwerbs pro SD-TIRF Zyklus zu reduzieren. Auch können neuere Generation Kameras reduzierte Belichtungszeiten bei hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Daher kann die Gesamtleistung dieser Einrichtung noch einschlägig verbessert werden, durch ein Upgrade der Hardware-Komponenten. Aus Sicht der Bildgebung sind jedoch mehrere andere Möglichkeiten zur Minimierung der Erwerb Zeit (in absteigender Reihenfolge): vermeiden Sie mehrere Positionen, verringern Sie die Z-Stapel-Höhe, erhöhen den Z-Abstand zu minimieren Belichtungszeit (Erhöhung zu gewinnen und eventuell zu benutzen Binning), verringern Sie den Abstand zwischen Erwerb Positionen, aktivieren Sie die automatische Scharfstellung nur jeden n-ten Zeitpunkt (n > 1). Trotz tatsächlichen Einschränkungen wenn diese Parameter sorgfältig ausgewertet werden, ist es möglich, verwenden Sie SD-TIRF imaging für die Überwachung und Lokalisierung von schnelllebigen zellulären Vesikel in Zobiak Et Al. vorgestellt 7.
Darüber hinaus präsentierte sich in diesem Papier ein Protokoll, das den Erwerb beschreibt Routine eines einkanaligen SD-TIRF Datasets. Mit dem zur Verfügung gestellten Makro, können raw-Daten in einer TIFF-Datei enthält alle SD und TIRF Kanäle exportiert werden. Bild-Registrierung ist per se nicht notwendig; Es ist jedoch wichtig, dass beide Kameras exakt zueinander ausgerichtet sind. Verbleibende Pixel Verschiebungen (Translation und Rotation) kann erkannt und innerhalb der zur Verfügung gestellten Makro korrigiert werden. Die Korrektur-Algorithmus nutzt ein Mehrkanal Referenzbild fluoreszierende Kügelchen, die kurz vor Beginn des Experiments eingetragen werden muss. In der resultierenden Datei befindet sich die TIRF-Ebene am niedrigsten, gefolgt von einer Zahl von Null Intensität-Flugzeuge, die die Dimensionalität des SD-Kanals übereinstimmen. Daher ist es wichtig, die Daten zu erwerben wie im Protokoll beschrieben wo die abgebildete TIRF Flugzeug ähnelt das untere Ende der Z-Stack für den SD-Kanal eingestellt.
Schließlich könnte das System möglicherweise um ein SIM-Modul oder die kürzlich eingeführte Multi-Angle TIRFM24,25 weiter zu steigern die räumliche Auflösung verlängert werden. Jedoch kann Erhöhung der räumlichen Auflösung, entsprechend den aktuellen Stand der Technik, nur um den Preis einer langsamer bildgebenden Geschwindigkeit erreicht werden. Für alle die live Zelle imaging Experimente in die Strukturen auf der Plasmamembran zu lokalisieren, wenn auch hohen räumlichen Auflösung von zellulären Restvolumen Pflege entscheidend ist, ist das hier beschriebene SD-TIRF Setup ein einfach zu integrieren, leicht zugänglich Lösung.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken sehr die wissenschaftliche Gemeinschaft von des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf unterstützt uns mit Proben zur Auswertung. Nämlich, wir danken Sabine Windhorst für NIH3T3 Zellen, Andrea Mordhorst für YFP-Vinkulin und Maren Rudolph für RFP-Lifeact.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
References
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
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