Summary
우리 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 감염 분석 호스트 인코딩 요인의 활동을 분석 하는 데 사용할 수 있습니다 설명 합니다.
Abstract
세균성 병원 체 생존 하 고 한 번 진 핵 세포 안에 증식 고용 전략의 다양 한이 있다. 소위 'cytosolic' 병원 균 (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, 그리고 리케차 종)에 의해 감염 된 세포 cytosol에 액세스 육체적으로 그리고 효소 저하 기본 vacuolar 막. 일단, cytosol에서이 균 모두 증식 뿐 아니라 새로운 세포를 감염 하기 위하여 주인 세포의 원형질 막에 침투 하는 충분 한 기계적인 힘을 생성. 여기, 우리 보여 어떻게 L. monocytogenes (Lm)의 세포 감염 주기의이 터미널 단계 식민지 형성 단위 분석 및 cytometry 양이 정해질 수 있다이 어떻게 모두 병원 체 및 호스트 인코딩된 요인 영향의 예를 들 프로세스입니다. 우리 또한 보여 쥐에서 파생 된 간 세포의 감염 및 배양된 세포의 Lm 감염 역학의 가까운 통신 감염 생체 외에서 vivo에서. 이러한 함수 기반 분석 실험은 상대적으로 간단 하 고 변조기의 진 핵 세포의 기능에 대 한 높은 처리 화면 검색 기반 쉽게 확장 될 수 있습니다.
Introduction
감염-기반 실험 모델은 호스트와 병원 체, 다양 한 병원 체 감염 전략, 그리고 병원 체 및 호스트-기반 프로세스를 할당의 어려움의 시작 상태 조건에 그들의 의존 때문에 본질적으로 도전 결과 기반으로 합니다. Listeria monocytogenes (Lm) 박테리아의 유전과 미생물의 추적성, 그것의 급속 하 고 processive 세포 감염 전략 및 상대적으로 분명 호스트 방어 응답을 이상적인 병원 체 되고있다 그것의 휴대 organismic-수준 감염 고기 사이의 관계. Lm 의 세포 감염 4 가지 단계1를 통해 진행: (i) 세포 침공 Lm 공포; 포함 되 고로 종결 (ii) Lm-공포 막의 해체 그리고 cytosol;에 Lm 의 릴리스 감독 (iii) intracytosolic 복제; 그리고 (iv)는 플라즈마 막 직접 인접 한 세포 (상피 시트 등)의 감염 또는, 독방 세포, extracellular 환경으로 Lm 의 출시의 물리적 침투. 이러한 단계의 각 특정 Lm에 의해 추진 됩니다-인코딩된 요소 ('독성 요인' 라고도 함), 삭제, 감염 결함 세포 및 동물 모델에서 발생할. 이 일반적인 감염 전략은 독립적으로 진화 되었습니다 아니라 소위 'cytosolic' 병원 체2의 숫자에 의해.
콜로 니 형성 단위 (CFU) 분석 실험 둘 다 생체 외에서 평가를 널리 고용 됩니다 (즉, 셀룰러) 뿐으로 vivo에서 (즉, organismic) 감염 결과. Vivo에서 감염에 대 한 특히 그들의 높은 감도 뿐만 아니라 분석 실험 CFU 병원 체 침입 및 세포내 생존/확산에 대 한 명확한 판독을 제공합니다. CFU 분석 광범위 하 게 영향을 미치는 감염 Lm 및 호스트 셀 결정 요인 분석에 사용 되었습니다. 이러한 사전 연구 분석 세포 침입과 intracytosolic 복제 하 왔다 유익한, CFU 분석 사용 되지 않은, 우리의 지식의 최선을 Lm 감염 과정의 4 단계를 추적 하: 셀룰러 탈출. 여기, 우리는 상대적으로 간단한 CFU 분석 결과 (물론 cytometry) ('출현' 라 함)는 어떻게 세포 탈출 수단을 모니터링할 수 있습니다 및 어떻게 두 병원 체 및 호스트 인코딩된 요소의 표시 예 규제 Lm의이 단계 설명 감염 주기. 세포질 Lm 감염 사이클의 터미널 단계 분석 추가 병원 체 및 호스트 세포 감염 관련 요인 및 활동 파악 가능 할 수 있습니다.
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Protocol
마우스는 치료에 대 한 모든 적절 한 정부 지침에 따라 고통 없이 치료 했다 하 고 사용의 실험실의 동물 건강의 국가 학회 및 그들의 사용 마이애미 대학 기관 동물 관리가 전체 연구에 대 한 승인 했다 그리고 사용 위원회 (프로토콜 16-053).
1. 감염에 대 한 셀을 준비합니다.
- 마우스 대 식 세포와 같은 세포 선 RAW 264.7 DMEM 조직 문화 미디어 10% 태아 종 아리 혈 청 (이제부터 DMEM/FCS 라고도 함)와 보완에 전파 125 mL 플라스 크 및 37 °C/5% CO2에서 유지 관리 하는 조직 문화 인큐베이터를 사용 하 여.
- 감염, 전날 확장 플라스 크에서 셀을 제거 하 고 15 mL 원뿔 튜브를 나사 모자에 수집을 셀 스 크레이 퍼를 사용 합니다. 800 x g 10 분에 세포를 원심, 상쾌한 가만히 따르다 (항생제) 없이 DMEM/FCS의 1 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단 하 고 titer를 hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 결정.
-
2 x 106 셀/ml titer를 조정 하 고 48-잘 조직 배양 접시의 우물을 0.10 mL (2 x 105 셀) 추가. 세포 현 탁 액 우물의 전체 표면을 커버를 확인 합니다.
- 바른된 미디어의 최신 소스에 대 한 추가 스 판 셀. 또한 '더 셀 컨트롤'로 3 개의 추가 스 DMEM/FCS의 0.10 mL를 놓습니다.
- 37 °C/5% CO2조직 문화 인큐베이터에서 밤새 품 어. 다음 날, 박테리아 inoculum 준비 하 고 사용할 준비가 될 때까지 인큐베이터에서 제거 하지 마십시오.
2. 감염 Listeria monocytogenes (Lm) 준비
- 갓 줄무늬 천 배지에서 단일 식민지와 두뇌 심 혼 주입 (BHI)의 2 개 mL를 접종 (< 2 일) Lm 의 130 회전/분 떨고와 37 ° C에서 밤새 품 어 고.
- 다음 날, 하룻밤 문화 2 mL를 0.10 mL 미리 BHI를 예 열 하 고 광학 밀도 (OD600)는 0.4 ~ 0.6까지 떨고와 37 ° C에서 배양을 계속 추가 합니다.
- 대략적인 세균성 titer를 실험적으로 파생 된 변환 수식을 사용 하 여 결정 합니다. 우리 실험실에서 BHI에 기 하 급수적으로 성장 Lm 문화는 약 1.3 x 109 콜로 니 형성 단위 (CFU) /OD600. 세균성 문화는 실내 온도에 노출 되는 시간을 최소화 합니다.
- 방금 전에 감염 titer 5 x 107 CFU/mL 희석 액으로 미리 데워 DMEM/FCS를 사용 하 여 조정 합니다.
3입니다. 감염
- 20 µ L을 추가 신속 하 고 정확 하 게, 작업 (1 x 106 CFU, 감염, 나의 다양성 = 5)는 갓 Lm inoculum (2.4 위의 단계)으로 접시를 약간 기울이기 조심 스럽게 피펫으로 팁 overlying 미디어;에서 웰 스의
참고: 피펫으로 팁과 우물의 벽을 만지지 마십시오. - 부드럽게 피펫으로 되도록 각의 내용을 완료 혼합; 동요 하지 또는 우물의 벽에 Lm 를 확산 것이 접시를 크게 기울. 37 °C/5% CO2 배양 기에 세포 배양 접시를 반환 합니다.
- 희석제로 감염 되지 않은 우물에서 바른된 미디어를 사용 하 여 10 µ g/mL gentamicin 솔루션을 준비 합니다.
- 30 분에 감염 (mpi) 게시물, 신중 하 게 37 °C/5% CO2 인큐베이터에 gentamicin 솔루션 (최종 농도 2.5 µ g/mL)와 부드럽게 피펫으로 30 µ L 뿐만 아니라 전에 반환 셀 문화 접시의 내용을 추가.
- (아래 섹션에서 설명한 대로 4 및 5, 각각) 60 mpi에서 CFU 분석 결과 (60 mpi 시간 포인트) 또는 FCM 분석에 대 한 적절 한 우물을 수확.
- 나머지 우물에 대 한 다양 한 시간 그 후에 수확 셀 또는 전에, Lm 출현 분석 결과, 전적으로 우물에서 미디어를 제거 하 고 바른 미디어 gentamicin 무료 150 µ L를 바꿉니다.
4. 샘플링 처리 및 CFU 분석 결과 의해 세포내 및 응급 Lm 의 분석
- 수확, 약간 기울기는 요리 하 고 우물에서 전체 미디어를 조심 스럽게 제거 합니다. 우물에 멸 균 증류수 (dsH2O) 0.50 mL를 추가 합니다. 30 후 s, lysate 결과 물 전송 (100) 1.5 mL microcentrifuge 튜브 및 10에 대 한 적극적으로 소용돌이 s.
- 10-1 과 10-2 희석 및 추가 하 여도 4.5 µ L 또는 lysate dsH2O 450 µ L를 물 50 µ L 짧게 소용돌이 철저 하 게 혼합 되도록 준비 합니다.
- 확산은 10의 50 µ L0, 10-1 / lysogeny (파운드) 국물 한 접시에 10-2 샘플.
- 응급 Lm (단계 위의 3.6)에 대 한 분석 결과, 입히는 미디어의 10 µ L을 제거 하 고 두 5 µ L aliquots로 그것을 분할 하: 한 약 수에 5 µ L DMEM/FCS의와 두 번째 약 수를 포함 하는 5 µ g/mL gentamicin DMEM/FCS의 5 µ L 추가 추가. 후자의 제어 extracellular Lm (민감한 gentamicin)를 구분 하 고 세포내 Lm (gentamicin 저항) 후속 CFU에서 시험.
- 실 온에서 5 분, 후 파운드 한 천 배지에서 dsH2O, 10 s에 대 한 적극적으로 소용돌이의 90 µ L 및 확산 50 µ L를 추가 합니다.
- Lm 식민지 파운드 한 천 배지는 37 ° c.에 외피의 2 일 다음에 열거
5. 샘플링 처리 및 Cytometry (FCM)에 의해 세포내 및 응급 Lm 의 분석
- 1.1-4 단계에 설명 된 대로 RAW 264.7 세포를 준비 합니다. 1 x 106 셀/mL로 세포를 조정 하 고 6 잘 조직 배양 접시의 우물 1 mL (1 x 106 셀) 추가.
- 2.1-2.3 단계에서 설명한 대로 박테리아 inoculum을 준비 하 고 볼륨 inoculum 해당 50 (5 x 107 CFU)의 나 하의 세포를 감염.
- 1.5 시간 게시물 감염 (hpi)에서 웰 스의 첫 번째 집합에서 미디어를 수집 하 고 모든 우물 처리 된 때까지 microcentrifuge 튜브 1.5 mL 500 µ L의 4 %paraformaldehyde (PFA)와 얼음에 장소에에서 장소.
- 세포내 Lm를 수집 하려면 dsH2O의 1 mL에 추가 잘 60 후 s, 4%의 500 µ L 1.5 mL microcentrifuge 튜브 lysate 결과 물 전송 PFA. 10 s와 모든 우물이 처리 될 때까지 얼음에 대 한 적극적으로 소용돌이. (샘플 처리 단계 5.8 아래에 설명 되어 있습니다.)
- 나머지 우물에 대 한 미디어를 제거 하 고 extracellular Lm 를 죽 일 셀 인큐베이터에 즉시 반환을 5 µ g/mL gentamicin와 DMEM/FCS의 1 mL를 바꿉니다.
- 30 분 (2 hpi) 후 미디어를 제거 하 고 gentamicin 없이 DMEM/FCS를 바꿉니다.
- 2, 4 h (4 및 6 hpi) 후 두 번째 고 3 단계 5.3 및 5.4로 미디어와 lysates 수집 하 여 포인트를 시간.
- 10000 x g 방해 펠 릿 없이 7 분 제거 상쾌한에 튜브 원심
- 4%의 50 µ L의 칵테일을 얼룩에 각 펠 릿 중단 PFA와 phalloidin의 15 µ L. 20 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 튜브를 품 어.
- 부 화 후 각 튜브를 위아래를 섞어 피 펫 FACS 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.
- 10000 x g 방해 펠 릿 없이 7 분 제거 상쾌한에 튜브를 회전 합니다.
- 즉각적인 사용을 위해 FACS 버퍼의 400 µ L 또는 FACS 버퍼의 200 µ L와 4%의 200 µ L 각 펠 릿을 중단 PFA 나중에 분석을 위해 저장 하는 경우.
- cytometry에 샘플을 실행 하 고 수집 된 데이터를 분석.
6. 샘플링 처리 및 Lm 식민과에 호스트 응답의 분석
- 2.1-2.3 단계에서 설명한 대로 감염에 대 한 Lm 를 준비 합니다.
- 3 x 106 CFU/mL의 원하는 titer에 대 한 2 차 배양의 필요한 금액을 계산 합니다.
- 감염 직전 계산 된 박테리아와 미리 데워 진된 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 1 mL의 최종 볼륨에서의 양을 희석. 이것은 마우스에 주입 입력된 inoculum 이다.
- 28 G½ 100U 인슐린 주사기를 사용 하 여 입력된 inoculum의 100 µ L (3 x 105 CFU) 그리고 어떤 눈에 보이는 기포를 제거.
- 지주 구속으로 (스트레인 C57BL/6, 6, 12 주 오래 된 사이 남성) 마우스를 배치 하 고 따뜻한 물 (이상의 45 ° C)를 사용 하 여 꼬리 정 맥을 팽창 다음 입력된 inoculum을 정 맥에 주입.
- 10-2 와 파운드 agar 10bcm 접시에 입력된 inoculum의 10-3 희석 하십시오 고 실제 입력된 복용량을 결정 하기 위해 37 ° C에서 밤새 품 어.
- 18 hpi에서 고통 없이 안락사 마우스 (CO2 질 뒤에 자 궁 경부 전위)를 사용 하 여 멸 균가 위로 잘라 오픈 마우스 복 막의 내부와 외부에 대 한 별도 쌍의 핀셋과가 위를 사용 하 여 간 전 두 엽을 수집 마우스입니다. 간 6 cm 얼음에 페 트리 접시에에서 놓습니다.
- 간 작은 조각으로 잘라 고 자기 저 어 바와 유리 병 합니다. 2 mg/mL 콜라 D FCS 없이 DMEM 재구성의 2 개 mL를 추가 합니다. 30−45 분 자력에 37 ° C에서 튜브를 품 어. 일단 조직 무 균 DMEM/FCS는 콜라를 비활성화 하려면 3 mL를 추가 합니다.
- 필요한 경우 더 많은 DMEM/FCS를 추가 원뿔 관으로 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 셀을 필터링 합니다.
- 셀을 10 분 동안 4 ° C에 작은, 상쾌한 붉은 혈액 세포를 lyse ACK 버퍼의 500 µ L에 셀 펠 릿을 중단 800 x g 에서 원심
- ACK 버퍼에 5 분 동안 실내 온도에 세포를 품 어. DMEM/FCS의 1 mL에 셀을 일시 중단 합니다.
- 셀을 10 분 동안 4 ° C에 작은, 상쾌한 DMEM/FCS의 1 mL에 중단 800 x g 에서 원심 그런 다음는 hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
- 1.5 mL microcentrifuge 튜브와 작은 스핀을 1 x 106 셀을 전송 합니다. DsH2O 및 세포를 lyse에 소용돌이의 1 mL에 다음 일시 중단 합니다. 타지에서 파운드 접시에 50 µ L와 10-2 희석 하십시오 그리고 Lm CFU 분석에 대 한 열거를 37 ° C에서 품 어.
- FACS 튜브 셀 개수에 따라 각 조직 샘플에 대 한 1 x 106 셀을 전송 및 FACS 버퍼의 1 mL로 씻어.
- 10 분 동안 4 ° C에서 작은 고 상쾌한 제거 800 x g 에서 셀 원심
- 각 항 체와 FACS 버퍼에 대 한 권장된 농도에 따라 관심의 항 체를 포함 하는 항 체 칵테일을 준비 합니다. 분석에 사용 하는 권장된 금액에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
- 항 체 칵테일의 100 µ L에 펠 릿을 일시 중단 하 고 30 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 튜브를 품 어.
- 부 화, 후 각 튜브를 FACS 버퍼의 2 개 mL를 추가 하 고 셀을 일시 중단.
- 셀 4 ° C에서 펠 렛을 삭제는 상쾌한 800 x g 에서 원심 다음 400 µ L의 즉각적인 사용을 위해 FACS 버퍼 또는 FACS 버퍼의 200 µ L와 4%의 200 µ L에 펠 릿을 중단 PFA 나중을 위해 저장 하는 경우.
- Cytometry 세포 분석 (단계 5.13 참조).
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Representative Results
병원 체와 세포 감염에 영향을 미치는 호스트 인코딩된 요인의 역할 평가
위에서 설명한 감염 조건 사용 하 여, 입력된 야생-타입 Lm 의 0.15%는 배양된 세포 (그림 1A)를 가진 공동 외피의 1.5 h 후 복구 됩니다. 공동 보육 (3 h 게시물 감염, hpi)의 후속 1.5 h에서 가능한 Lm 의 복구에 4-fold 증가 하 고 3 ~ 6 hpi 가능한 Lm의 복구에 추가 7.5-fold 증가 했다. 이후 셀 스며들 지 않는 항생제 gentamicin extracellular Lm제거 1 hpi에서 공동 문화에 추가 됩니다, 1.5와 6 hpi 사이 가능한 Lm 수준에 30-fold 증가 독점적으로 세포내 확산을 나타냅니다.
Lm 는 급속 하 게 진 핵 세포 ( 소개참조) 내에서 국제화에 따라 cytosol에 대 한 액세스를 얻는다. Cytosolic Lm 어떤 방법으로 플라즈마 막 관통 능력 자체 추진 말라 합 기계와 연결 합니다. 생체 외에서 감염의 분석 결과에 gentamicin 6 hpi에서 우물에서 제거 되 면, 위에서 설명한, extracellular Lm 검출 될 수 있다 쉽게 1 시간 후 (7 hpi) overlying 미디어 (그림 1B). 아무 CFUs 제어 웰 스는 대 식 세포와 시드되지 않습니다 했다 하지만 그 그렇지 않으면 동일 하 게 그로 인하여 extracellular Lm 의 외관은 대 식 세포의 존재에 전적으로 의존을 보여주는 시드 웰 스도 치료에서 회복 했다 고 하지 (표시 되지 않음) 불완전 한 항생제 살인의 결과입니다.
생존과 증식 침 Lm 의 능력은 유전자 인 식의 제품군에 주로 의존 녹음 방송 요인 긍정적인 규제 요소에 의해 제어 (PrfA)1. 처음에 야생-타입 Lm 긴장과 Lm 돌연변이 스트레인이이 팩터 (ΔprfA)에 대 한 삭제의 비교 복구 (그림 1A). 그러나, 거기는 장기간된 공동 부 화 후 ΔprfA 긴장의 복구에 후속 감소 6 hpi에서 복구 3-fold 보다 작은지 1.5 hpi에서 복구. Relatedly 및 expectedly, ΔprfA 박테리아 했다 7 hpi (그림 1B)에서 overlying 미디어 감지 되지 않았습니다.
PrfA의 활동은 여러 수준에서 통제 된다. Constitutively 활성 PrfA 변종 악성 하이퍼 prfA * 대립 유전자, 인코딩 수 고립 된3되었습니다. 소지는 prfA * Lm 스트레인 1.5와 3 hpi (그림 1A)에서 isogenic 야생-타입 스트레인에 비해 초기 감염 프로필이 있다. 그러나, 사이 3 및 6 hpi, prfA * 스트레인의 배 증가 크게 야생-타입 스트레인의 달랐다. 다시, relatedly 및 expectedly, prfA * 스트레인 크게 야생-타입 Lm 스트레인 (그림 1B)에 대 한 관찰을 초과 하는 수준에서 7 hpi에서 overlying 미디어에서 쉽게 발견 되었다.
cytosol로 그것의 방출 다음 Lm 생산 말라도 덮여 되 고 박테리아에서 셀룰러 말라 합 기계와 연결 합니다. 확인 하 고 extracellular Lm 감염 된 주인 세포의 말라 풍부한 cytosol에서 파생 된 것입니다, 대 식 세포 되었고 감염 또는 GFP 표현 prfA * 긴장으로 감염 된 왼쪽 overlying 미디어 1.5, 4, 및 6 hpi에서 수집 된 생산 말라 바인딩하고 cytometry에 의해 분석 하는 phalloidin와 스테인드. 그러나 감염 및 감염 된 대 식 세포를 오버레이 미디어 포함 빛 산란 박테리아 크기의 미 립 자 물질 (그림 2A), 감염 된 세포에서 유일한 미디어 게이팅이 크기 내에서 GFP-긍정적인 신호를 소유 하는, (그림 2B; 왼쪽된 패널). Phalloidin-긍정적인 감염 오버레이 미디어에서 Lm 세포 (그림 2B, 오른쪽 3 패널)의 모습에 시간에 따라 증가 했다. Phalloidin-긍정적인 GFP 표현 Lm lysates 감염 된 대 식 세포 (그림 2C; 왼쪽된 패널)에서 준비 또한 감지 했다. 그러나, 아무 phalloidin 양성 Lm lysates 세포 독성 요인 ActA 말라 합 기계를 모집 하는 데 필요한 부족 GFP 표현 Lm 돌연변이 스트레인와 감염에서 준비에서 검색 되었습니다. 에 Lm cytosol (그림 2C, 오른쪽 패널)에 출시 된 다음의 외부 표면. 이러한 데이터 지원 시나리오를 생체 외에서 감염 '응급' extracellular Lm 모델 감염된 셀 cytosol에서 파생 됩니다.
Lm외-인코딩 요소, 다양 한 호스트 요소 되었습니다 발견 그 영향 Lm 세포 감염 ( 내용참조). 최근, 호스트 요소 Perforin-2 (P2) 표시 되었습니다 될 다양 한 세균성 병원 체에 대 한 셀 수준의 방어의 중요 한 구성 요소. 복 막 exudate 세포 (PEMs) 야생-타입에서 격리 (P2+ +) P2-/- 생쥐는 처음 comparably Lm CFU 분석 결과 1 hpi(그림 3)에 의해 측정 된에 의해 감염. P2에서+ + CFUs 수 6 hpi에서 복구 PEMs 10 배 더 큰 비교 1 hpi에서 회복 하는 수준에. P2에서 이전에 게시 결과 비슷합니다-/- PEMs CFUs 수 6 hpi에서 복구 는/80-fold 큰 1 hpi4에서 회복 하는 수준에 비해. 향상 된 Lm P2-/- PEMs 세포내 확산 가능한 Lm P2에서 감지 하는 수준에 비해 overlying 미디어에서 검색의 높은 수준을 동반 되었다+ + PEMs ( 그림 3B). 이러한 데이터 표시 체 외 분석 결과에 응급 extracellular Lm 의 모양을 보고할 수 있습니다 또한 호스트 요소에 그 영향 감염.
Vivo에서 감염 및 간 분석
위에서 설명한 체 외 감염 분석 실험 이외에 야생-타입, 감쇠, 그리고 하이퍼-악성 임 종자의 상대 infectivity vivo에서 감염 분석 실험에 의해 평가 수 있습니다. 마우스 정 맥 공동 감염 야생-타입의 동등한 혼합물 및 ΔprfALm 긴장 및 나중에 18 h 했다 고통 없이 안락사, 간은 삭제, 그리고 단일 셀 준비 되었다. 격리 된 간세포 lysed 했다 고 결과 lysates CFU 분석 결과 야생 형 및 ΔprfALm 긴장 사이 구별할 수 있는 대상이. 원래 inoculum ('입력')에서이 두 종자의 1:1 비율에 비해, 18 hpi ('출력')에서 ΔprfA/wild type 비율은 단결 보다 상당히 적은 (6 쥐에 대 한 범위 0.001 0.330; 0.100 의미) (그림 4). 반면, 마우스 공동에 감염 된 야생-타입의 동등한 혼합물 및 prfA * Lm 변종 prfA */wild type 비율 2.4에서 10.2 (7.1 의미)에 배열 했다. 이 실험은 이러한 3 Lm 변종 (야생 유형, ΔprfA및 prfA *) 본래 유기 체에서의 상대 infectivity 감염 생체 외 분석 실험에서 관찰 하는 유사한 보여준다.
호스트 또한 infectivity 야생-타입, ΔprfA및 prfA * 긴장의 다양 한 수준의 타고 난 면역 반응의 해당 변화 연결 인지 확인 하기 위해 모니터링할 수 있습니다. 이전 그것은 보였다 그 주민 대 식 세포 (Küpffer 세포)와 염증 monocytes 및 Lm 감염5,6, 동안 간 보호에 호 중구 플레이 중요 하 고 상호 역할을 침투 7,8. 감염 되지 않은 쥐와 쥐 18 h GFP 표현 야생-타입 Lm 긴장으로 감염에서 준비 셀 셀 유형 전용 표식으로 물 이었고 cytometry에 의해 분석. 비 면역 세포 (예를 들어, hepatocytes 및 내 피 세포) 간, 측면 감염 및 감염 된 쥐 사이 감지 차이가 있었다. 대조적으로, 긍정적으로 얼룩진 백혈구 공통 항 원 CD45에 대 한 면역 세포의 비율의 점에서 간에 주목할 만한 감염 관련 변경 사항은(그림 5). 특히, 감염 된 야생 형 및 prfA*Lm 변종 쥐 했다 CD45의 상당히 높은 수준의+ 세포 간 반면에 감염 되지 않은 쥐에 비해 CD45 수준의+ 감염 된 쥐에 있는 간 세포 감쇠 ΔprfALm 긴장으로 감염 되지 않은 쥐에서 관찰 하는 수준 보다 현저 하 게 다른 되지 않았습니다. 두 거주자 및 침투 면역 세포 인구, CD45 하 더+ 세포를 furthered 수 있습니다 subtyped. 감염을 가진 주목할 만한 교대 (CD11b중반 F4/80에에서+) 주민 Küpffer 세포의 거의 완전 한 실종 이며 CD11b의 명백한 인구 수 반하는 모습9다른 사람에 의해 관찰,안녕 호 중구 침투 나타내는 세포 (그림 5B; 낮은 중간 패널). 또한 18 hpi에 간에 나타나는, 나타내는, 때문에 그들은 또한 Ly6C안녕하세요, 염증 monocytes (그림 5B; 낮은 중간과 오른쪽 패널) 침투 CD11b- F4/80 셀중간 표시 있습니다. 감염 된 쥐에이 후자의 세포는 유일한 세포는 감지할 GFP 신호 감염 (그림 5C)의 18 hs 다음 검색 되었습니다. 이 후자의 찾는 비슷합니다 최근 존스와 쥐, Lm 주로와 관련 된 Ly6C안녕하세요 monocytes 식품을 매개로 감염10다음 용기에 침투 하는 보여주었다 D'Orazio에 의해 보고. CD45안녕하세요 간세포 Lm ΔprfA 긴장으로 감염 된 쥐의 프로필 닮은 감염 되지 않은 쥐의 하이퍼 악성 LmprfA * 긴장으로 감염 된 쥐의 레벨을 강화 겸손 했다 반면 호 중구 그리고 감염 된 야생-타입 Lm 스트레인 (데이터 표시 되지 않음)는 마우스에 비해 염증 monocytes 침투.
그림 1 : Listeria monocytogenes (Lm)에 의해 경작 된 세포의 감염. 마우스 대 식 세포 세포 선 RAW 264.7 어느 야생-타입으로 생체 외에서 감염 되었다 Lm (wt; 채워진된 원형), 감쇠 Lm (ΔprfA; 오픈 원), 또는 악성 하이퍼 (prfA *; 사각형 열) Lm 긴장 (자세한 내용은 텍스트를 참조 하십시오). (A) 1.5, 3, 및 6 시간 게시물 감염 (hpi), 대 식 세포 lysed 했다 및 세포질 내용 콜로 니 형성 단위 (CFU) 분석 결과 의해 분석 되었다. (B) 감염 된 대 식 세포 내 면 비 Lm 를 제거 하는 항생제 gentamicin로 간단히 치료 했다 고 6 hpi에서 입히는 미디어 수집 CFU 분석 결과 분석. 점선의 분석 결과 검출 한계를 나타냅니다. 각 데이터 요소는 독립적인 잘/감염 나타내고 P 값은 학생의 t 시험에 의해 결정 되었다. 표시는 단일 대표 실험의 결과 수행 세 번 비슷한 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 말라 바인딩된 Lm cytometry에 의해 분석. 마우스 대 식 세포 세포 라인 RAW 264.7 남았다도 감염 되지 않은 또는 감염 GFP 표현 Lm와 생체 외에서. Overlying 미디어 제거, centrifuged, 그리고 수집 된 자료 물 걸 바인딩 phalloidin. 스테인드 소재 cytometry로 분석 되었고 빛 분산 플롯 (A) 나타내는 게이팅의 extracellular GFP 및 phalloidin 관련 된 수준에 대 한 사용 표시 (즉, 미디어-파생) Lm (B)에 표시 된. (B) 표시 된 지역 GFP/걸 이중 긍정적인 Lm 및 빛 산란 게이트 내 총 이벤트의 비율으로 그들의 풍부를 나타냅니다. (C) 마우스 대 식 세포 감염 되었습니다 GFP 표현 Lm 또는 호스트 셀의 말라 합 기계 신병 ActA (ΔactA) 인코딩 유전자 부족 GFP 표현 Lm 스트레인에서 Lm 세포 표면입니다. 6 hpi, 감염 된 세포 lysed 했다 고 발표 세포, 세포내 Lm를 포함 하 여 했다 걸에 대 한 스테인드 내용과 cytometry에 의해 분석. 표시는 단일 대표 실험의 결과 수행 세 번 비슷한 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 야생-타입의 Lm여 Perforin 2 녹아웃 세포 감염. 야생-타입 중에서 고립 된 복 막 대 식 세포 (P2+ +; 동그라미 가득) 또는 녹아웃 (P2-/-; 점선된 원) Lm와 생체 외에서 감염 되었다. (A)에 1과 6 hpi, 대 식 세포 lysed 했다 고 CFU 분석 결과 의해 세포 내용 분석. (B) 감염 복 막 대 식 세포는 항생제 gentamicin로 간단히 치료 했다 고 2.5와 6 hpi에서 입히는 미디어 수집 CFU 분석 결과 분석. 각 데이터 요소는 독립적인 잘/감염 나타내고 P 값은 학생의 t 시험에 의해 결정 되었다. 표시는 단일 대표 실험의 결과 수행 세 번 비슷한 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: Lm 마우스의 감염. 6 마우스의 그룹 중 하나는 야생-타입 Lm (wt)의 동등한 혼합물으로 감염 되었다 고 감쇠 Lm (ΔprfA) 긴장 또는 야생-타입 Lm 및 하이퍼 악성 (prfA *) 긴장의 동등한 혼합물. 18 hpi 쥐 Lm 에서 간에서 부담 CFU 분석 결과 의해 결정 되었다. 이 실험에서 야생-타입 Lm 스트레인 항생제에 민감한 Lm 돌연변이 체 긴장에서 구별 될 수 있는 항생제 저항 유전자를 소유한 다. 간 homogenates 모두 항생제 포함에 도금 했다 하 고 항생제-무료 미디어와 돌연변이 및 야생-타입 Lm 의 비율 표시 했다. 점선은 감염 복용량의 돌연변이/야생-타입 나타냅니다. 마우스의 두 동료에 야생-타입 Lm 의 절대 수준 각각 12과 15 CFU/106 간 세포를 했다. 표시는 단일 대표 실험의 결과 수행 두 번 비슷한 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 마우스에 Lm 감염에 면역 반응. 쥐 간은의 18 헤 단일 셀 준비에 대 한 어느 감염 또는 체계적으로 감염 2 x 105 CFU의 GFP 표현 Lm 긴장 면역 골수성-특정 마커 표현 위한 cytometry에 의해 분석 되었다 했다. (A) 세포의 백분율 얼룩에 대 한 긍정적인 면역 관련 세포 표면 마커 CD45+ 당 106 절연 총 라이브 간세포 감염 되지 않은 쥐와 쥐 중 하나는 야생-타입 (wt Lm), 감염에 대 한 표시 감쇠 (ΔprfA), 또는 악성 하이퍼 (prfA *) Lm 긴장. 플롯 당 그룹 3 쥐의 평균 이며, P 값은 학생의 t 시험에 의해 결정 되었다. (B) 표시는 왼쪽된 패널에는 개별 감염된 마우스 (위)와는 개별 wt Lm-감염 (아래쪽)에서 세포 간 CD45 얼룩 얼룩 프로필 중간 패널에 CD11b 및 f 4/80는 CD45의 골수성 특정 마커의 식 레벨 표시 됩니다+ 세포; 그리고 오른쪽 패널에 표시 된 문이 셀의 Ly6C 식 레벨 표시 됩니다. 맨 오른쪽 패널에는 Ly6C의 오버레이 표시 됩니다+ 는 CD11b의 비율 및 평균 형광 강도 (MFI)를 포함 한 감염 및 감염 된 쥐에서 세포+ F4/80- 표시 Ly6C 게이트에 대 한 긍정적인 세포. 표시 그룹 당 3 쥐에서 대표 마우스가입니다. (C) Ly6C+ 감염 및 감염 된 쥐의 간은에서 파생 된 셀 ((B) 설명; 중간과 오른쪽 패널) cytometry GFP 식에 대 한 분석 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
그것의 급속 하 고 processive 세포 감염 프로그램 Lm 은 감염에 영향을 주는 세포 활동을 조사 하는 이상적인 병원 체. 호스트 요인의 수는 긍정적으로 또는 부정적으로 영향을 미칠 Lm 세포 감염11,12,,1314확인 되었습니다. 두 같은 Perforin 2와 헤 규제 억제제 우리의 실험실에서 특징 요소 호스트 (P2와 안녕), Lm 감염 프로세스의 고유 기능을 조절. 그림 3에서 보듯이 P2 결핍 세포는 Lm 에 매우 취약 그리고이 향상 된 민감도 또한 P2 녹아웃 쥐4의 사실 이다. 표현 하는 P2 및 P2 불충분 한 세포의 상세한 비교 연구 보여주었다 후자의 셀 매우 산성화 Lm형성-독성 유전자 발현을 향상 된 결과 phagosomes를 포함 하. 가설 차동 독성 유전자 발현 P2 불충분 한 대 식 세포의 향상 된 민감도에 기여 하는 하이퍼 악성 prfA * 스트레인,으로 앞에서 언급 한, 표현 독성 발견에 의해 지원 되었다 constitutively 높은 수준에서 유전자 감염 P2 표현 하 고 P2 불충분 한 세포는 동일 하 게4잘. 따라서, 하이퍼 악성 Lm 긴장의 가용성 P2 호스트 요소 부정적으로 병원 체의 독성 요소 배포를 규제 하는 가설을 테스트 하는 게 가능 했다. 안녕하세요, 우리가 보여준이 호스트 요소에 대 한 규제는 감염 된 세포에서 그것의 출현은 제한; Lm 의 세포내 매매 이 세포 활동은 아마 Lm 감염15,16안녕하세요 불충분 한 쥐의 향상 된 민감도 대 한 기초 이다.
연구에서 감염의 분 이내에 발생 하는 세포 활동을 문서화 하는, 그것은 그 이전에 그들의 공동 화, 박테리아와 호스트 세포는 지나치게 노출 변동 온도 또는 다른 환경에 중요 한 조건 하 오버랩 (혼동) 감염 유발 활동 스트레스 응답을 활성화 수 있습니다. 위에서 설명한 연구, 대 한 감염을 시작 직전 Lm 의 처리 시간을 최소화로 이러한 겉보기에 간단한 포인트 포함 됩니다. 예를 들어 세균성 문화를 떨고 37 ° C 배양 기에서 제거 하 고 벤치 위에 앉아 허용 하는 경우 온도 및 산소 가용성 (많은 가운데에)의 변화에 적응 하는 후속의 초기 단계에 영향을 미칠 수 있습니다 활성화 됩니다. 호스트 세포와 상호 작용입니다. 마찬가지로 호스트 셀 초기 감염 응답에 영향을 미칠 수 있습니다 온도 미디어 변화에 민감한 있습니다. 실제로 그것은 아니지만 수 완전히 모든 변동 박테리아에 제거 하 고 가능한 만큼 많이 그들을 감소 하 고 표준 운영 계획, 실험 사이 변이 확립 하 여 조건, 경작 하는 주인 세포를 최소화 됩니다.
추가 변수, 즉 우리의 의견의 중요성은 또한 받는, 셀 문화 감염 모델에서 항생제의 사용의. 그것은 상대적으로 진 핵 세포 원형질 막에 융 화 때문에 gentamicin 종종 선택의 항생제입니다. 이전 및 현재 문학, 그것은 일반적으로 사용 되 50 µ g/mL에서 죽 일 세포 외 (즉, 비-내 면) 박테리아. 최근에 그것은 직접 증명 되었습니다 25 µ g/mL에서 존재 하는 경우는 gentamicin의 충분 한 보급을 세포내 Lm17죽 진 핵 막에 걸쳐. 우리의 경험에 gentamicin의이 수준은 죽이고 Lm 즉시 접촉, 시 많은 낮은 레벨, 2 ~ 5 µ g/mL 범위 죽에 반면 > 99.9% 미만 5 분4에 Lm . 로렌츠와 동료는 나타났습니다 25-50 µ g/mL의 널리 사용 gentamicin 농도 또한 세포내 페스트 균을 죽 일 충분 한18. 흥미롭게도,이 그룹 또한 gentamicin permeabilization는 최적의 조건을 강조의 점에서 종류 각 병원 체-호스트 셀 쌍에 대 한 결정 되어야 하는 셀 사이의 상당한 차이 보였다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS - Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28 G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
References
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