אינדוקציה של מעיים שתל – מול – מארח מחלות והערכה מיני-אנדוסקופית שלה בעכברים בשידור חי
Summary
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מתאר השתלת תא גזע allogeneic hematopoietic ומאפשרת חוזרות הערכות מיני-אנדוסקופית של המעי הגס דיסטלי באתרו נוכחות, מאפיינים של חומרת דלקת מעי בתוך בשידור חי עכברים הסובלים מעיים שתל – מול – מארח מחלות.
Abstract
חריפה שתל – מול – מארח מחלות (GvHD) מייצג סיבוך חמור ביותר כי חולים שעברו בעבר גזע allogeneic התא hematopoietic (מאפשר-של HCT) השתלת הפנים, קשורה לעיתים קרובות עם תוצאה קליניים עניים. למשל, GvHD ביטויים של העור הם בדרך כלל מגיבים טיפולים מדכאים חיסונית הוקמה ותוך, לפיכך, לא לוקח קורס קטלנית, הנוכחות, האינטנסיביות של GvHD מעיים, במיוחד חלקים באמצע להתחתון של הבטן, משפיעים מאוד על התוצאה, באופן כללי ההישרדות של חולים עם חריפה GvHD. טיפולית אפשרויות מוגבלות בעיקרו הסוכנים מדכאים חיסונית קלאסי מניבים רק מתון מקלים-מחלת אפקטים. לפיכך, ידע מפורט על המפל רקמות תושב המערכת החיסונית, שינויים microbiota מעיים, התגובה סטרומה לפני, בעת ואחרי תחילת GvHD מעיים נחוצים בדחיפות כדי להבין את האירועים ובמנגנונים שבבסיס שלה הפתוגנזה לפתח אפשרויות טיפוליות חדשניות. מודלים מאתר של GvHD מועסקים לעיתים קרובות כדי לזהות ולהעריך באופן פונקציונלי מולקולות מסלולים putatively נהיגה GvHD מעיים. עם זאת, אומר במפורש לפקח ולהעריך דלקת מעיים לאורך זמן חסרים בעצם מאז הוקמה ציונים כדי להעריך כיתה GvHD אקוטי באופן שגרתי מורכבות של פרמטרים שונים המשקפים מעדיף GvHD מערכתית ביטויים. הערכה מפורטת של GvHD מעיים הוגבלה ללימודים שימוש בעכברים לאללה, ובכך למעשה למעט האורך (קרי, קינטי) ניתוחים של תא שטיפת המעי הגס תחת תנאי הניסוי (למשל, נוגדן בתיווך המצור ציטוקינים proinflammatory) בעכברים בשידור חי (קרי, in vivo). ההערכה באתרו מיני-אנדוסקופית של המעי הגס דיסטלי של מאפשר של HCT-מטופלים עכברים המתוארים כאן מאפשר a) הערכה מאקרוסקופית מפורט של היבטים שונים של דלקת מעיים ו- b) את האפשרות לאסוף דגימות רקמה עבור ניתוחים במורד הזרם- נקודות זמן שונות במהלך תקופת תצפית. באופן כללי, הגישה מיני-אנדוסקופית מספק התקדמות גדולה ב פרה לא פולשנית ניטור והערכה של GvHD מעיים.
Introduction
Hematopoietic ממאירות הנובעת ישירות מן התא בתאי גזע hematopoietic בלתי מבוקרת, מתקדם במהירות, הפרעות קשות בתיווך החיסונית לעתים קרובות אינדיקציות לביצוע מאפשר-של HCT1,2. עם זאת, למרות החשבונאי המופע של התגובה שתל-נגד-גידול prognostic מועיל, התורם לימפוציטים הם לעתים קרובות גרימת וקידום התקפה בתיווך החיסון לא רצויים של רקמה בריאה רכיבים בתוך המטופל מאפשר-של HCT , תהליך זה נקרא שתל – מול – מארח מחלות3. ביטויים בבטן, GvHD מעיים, כביכול מייצגים הסיבוך המפחיד ביותר של GvHD אקוטי, צורות חמורות אשר קשורים באופן שגרתי עם תמותה גבוהה1,2,4.
באופן כללי, מאתר דגמי מאפשר-של HCT הופיעו כלי יקר ערך לזהות וללמוד מנגנוני החיסון בתיווך שבבסיס בפתוגנזה של GvHD5. עם זאת, ההערכה קינטי, למשל, ההשפעות המיטיבות של התערבויות טיפוליות הרומן לאורך זמן בעכברים בשידור חי באופן שגרתי מבוסס על הקביעה של GvHD קליניים ציונים6. בעוד אלה ציונים מתאימים לשקף, למשל, המחלה הנטל הכולל (קרי, מערכתית GvHD), קליניים ציונים חוסר הרגישות באופן אמין לשקף ביטויים ייחודיים (למשל, בבטן). לפיכך, מסקנות, למשל בכל הנוגע תופעות בטן-מגן של התערבות טיפולית נתון, בהתבסס על אלה הבקיע מערכות בדרך כלל נופל קצר.
למרות התקדמות גדולה דרך ההמצאה של הרומן לכל הגוף הדמיה שיטות בשילוב עם השימוש של עכבר גנטי זוהרים או פלורסנט דגמי7,8, מתודולוגיות ישירות, במיוחד להעריך את המעי ביטוי של GvHD בעכברים בשידור חי חסרים. ומכאן, הרציונל מאחורי הפרוטוקול של הערכת אנדוסקופי פנוטיפ GvHD מעיים המתוארים בסעיף הבא הוא כדי להתגבר על מכשול זה. יתר על כן, המוטיבציה היא גם לצמצם מספרים עכברים ניסיוני מאז, עד כה, הערכה מפורטת של המאפיינים הסלולר, מורפולוגיים מולקולרית (למשל, על ידי histopathology או ביולוגיה מולקולרית) של GvHD מעיים ביטוי דרש בסופו של דבר את ההקרבה של העכבר ניסיוני.
המוסד שלנו דיווח בעבר על המתודולוגיה של הערכה מיני-אנדוסקופית של המעי הגס הגילויים במהלך syngeneic קוליטיס מודלים9. בפרוטוקול המובאת כאן, יש מעודן ואנו הותאם colonoscopic את הניקוד מטריקס עבור מונחי-alloresponse קוליטיס בעכברים בשידור חי עם מעיים GvHD על השתלת של alloreactive של HCT ושל התורמים לימפוציטים מחלקה MHC מלא תואמים הגדרה . זיהינו ארבעה פרמטרים מתאימים לשקף נגעים חוקן הקשורות GvHD מעיים. יתר על כן, הקמנו מערכת המאפשרת מכויל לדירוג של כל דטרמיננטה יחידה, וכתוצאה מכך ניקוד חדש המודיעה בקלות לקורא חומרת מעיים GvHD נוכח עכבר נתון בנקודת זמן נתונה. ניתוחים histopathological אישר כי ניקוד אנדוסקופי מעל לסף מסוים הוא אמין חיזוי דלקת ברקמות כיתה בינונית-גבוהה. לפיכך, מיני-אנדוסקופית להערכה מופיעה כדי לייצג תחליף עובד histopathology תקן זהב הדורש באופן שגרתי את ההקרבה של העכברים ניסיוני. חשוב, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כמעט בכל נקודת זמן נתון, ניתן להשתמש שוב ושוב במהלך המחלה10,11. יתר על כן, בניגוד השימוש ביולומינסנציה תלוית גישות, אין אמצעי העבודה רגשניים ולגזול כמו intercrossing גנטית שונה עכברים נדרשים, לפיכך, המתודולוגיה יכול להיות מיושם על העכבר כמעט בכל תחום ריבית.
יחדיו, בהתחשב ההיבט הקליני מזיקה מחולי מאפשר-של HCT GvHD מעיים חמורה, התקדמות מדעית מהירה, תובנה רבה יותר המנגנונים המולקולריים שבבסיס בפתוגנזה המערכת החיסונית הם צורך דחוף. באופן דומה, שיקולים חשובים, אתי דורשים כי הרווח של הידע צריך להיות מושגת עם הקישורים של מספר מינימלי של עכברים ניסיוני. לפיכך, שניהם מזוהה טענות על קהילת המחקר חקר GvHD מעיים ניתן מתקדמים על-ידי יישום הערכות טורי מיני-אנדוסקופית של המעי הגס בשרשרת עבודה ניסויית כדי לפקח, כיתה GvHD מעיים עכבר ניסיוני בשידור חי מודלים, כמו שמתואר המאומת בפרוטוקול המוצג כאן.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול מתאר את המתודולוגיה של אינדוקציה ובחינת מיני-אנדוסקופית פנוטיפ חוקן נצפתה במהלך GvHD מעיים. היא מגישה את מטרת הרחב מאפשר למדענים ללמוד GvHD מעיים longitudinally ו noninvasively במהלך המחלה כולו (כלומר, מתוך תחילתה של ביטוי חוקן והתקדמות עד פעילות המחלה מקסימלי).
עם זאת, ישנם כמה של?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי שיתופי מחקר מרכזי (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; פרוייקט B03) (כדי בעדותה) 1181 בדיקת יתירות מחזורית (CRC-DFG, פרוייקט B05) (כדי בעדותה), שניהם במימון פתוח (DFG, קרן מחקר גרמני).
Materials
| BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator | Gamma-Service Meical GmbH | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS ) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D8662-6x500ML | |
| Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
| Hypodermic needle (26G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
| 1 mL syring | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
| 50 mL tube | Sarstedt Ag & Co.KG | 62,547,254 | |
| Cell strainer with a 40 µm mesh screen | BD Falcon | 352340 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Merck KGaA | 1,048,540,500 | ingredient of ACK lysing buffer |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells |
| Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | magnet cell separation to isolate splenic T cells |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
| Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
| FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
| APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
| Filtrated bovine serum | Pan Biotec | P40-47500 | ingredient of FACS buffer |
| 96-well polystyrene V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651201 | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) | Falcon | 352052 | |
| BD LSRFortessa II flow cytometer | BD Bioscience Co. | ||
| Insulin syringe with sterile interior (30G) | BD | 324826 | |
| Oxy Vet Oxymat 3 | Eickemeyer | oxygen concentrator for anesthesia | |
| NarkoVet | Eickemeyer | 213062 | |
| Plexiglass chamber | Eickemeyer | 214620 | |
| Straight Forward Telescope | KARL STORZ SE &Co KG | 64301 AA | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Protection and Examination Sheath | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 C | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Examination Sheath with working channel | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 D | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Biopsy Forceps | KARL STORZ SE &Co KG | 61071 ZJ | part of the experimental setup for colonoscopy |
| 175 Watt SCB XenonLight Source | KARL STORZ SE &Co KG | 20132120 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Fiber Optic Light Cable | KARL STORZ SE &Co KG | 495 NL | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 S3 Camera Head | KARL STORZ SE &Co KG | 22220030 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 SCB Camera Control Unit | KARL STORZ SE &Co KG | 22200020 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| LCD monitor | Olympus | OEV181H | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Forane / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
| Formaldehyde solution 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
| 5,0 mL Dispenser tip | Eppendorf AG | 30089456 |
Riferimenti
- Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. Graft-versus-host disease. The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).
- Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease. British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).
- Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. Acute GvHD: pathogenesis and classification. Bone Marrow Transplantation. 41, 58-64 (2008).
- Naymagon, S., et al. Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14, 711-726 (2017).
- Zeiser, R., Blazar, B. R. Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation. Blood. 127, 3117-3126 (2016).
- Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
- Anthony, B. A., Hadley, G. A. Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model. Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).
- Beilhack, A., et al. Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs. Blood. 111, 2919-2928 (2008).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).
- Buchele, V., et al. Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis. Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).
- Ullrich, E., et al. BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).
- Kaplan, D. H., et al. Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype. Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).
