Her presenterer vi en protokoll som beskriver allogene blodkreft stilk cellen transplantasjon, og lar repeterende mini-endoskopisk evalueringer av distale kolon i stedet for tilstedeværelse, egenskaper og alvorlighetsgraden av colonic betennelser i live mus lider av intestinal graft – versus – host sykdom.
Akutt graft – versus – host sykdom (GvHD) representerer de mest alvorlige komplikasjon at pasienter som gjennomgår tidligere allogene blodkreft stilk cellen transplantasjon (allo-HCT) ansikt og er ofte assosiert med en dårlig kliniske utfall. Stund, for eksempel GvHD manifestasjoner av huden er vanligvis lydhør overfor etablerte immun-undertrykkende terapier og er derfor ikke tar en dødelig kurs, tilstedeværelse og intensiteten av intestinal GvHD, spesielt av midt-til-nedre deler av tarmen, påvirke sterkt utfallet total overlevelse av pasienter med akutt GvHD. behandlingsalternativer er i hovedsak begrenset til klassiske immun-undertrykkende agenter gir bare moderat sykdom-begrensende effekter. Derfor detaljert kunnskap om vev-resident immun cascade, endringer i tarmen bakterieflora og stromal svaret før, på, og etter intestinal GvHD utbruddet er presserende nødvendig å forstå hendelser og mekanismene bak sin patogenesen og å utvikle nyskapende behandlingsalternativer. Murine modeller av GvHD brukes ofte til å identifisere og funksjonelt vurdere molekyler og trasé åpenbart kjører intestinal GvHD. Men er betyr å spesielt overvåke og evaluere intestinale betennelsen over tid egentlig mangler siden etablerte score å vurdere og Vurder akutt GvHD rutinemessig består av ulike parametere som heller gjenspeile systemisk GvHD manifestasjoner. Detaljert evaluering av intestinal GvHD er begrenset til studier med euthanized mus, og dermed egentlig unntatt langsgående (dvs. kinetic) analyser av colonic kupé under en gitt eksperimentelle tilstand (f.eks antistoff-mediert blokade av en proinflammatory cytokin) i levende mus (dvs. i vivo). Mini-endoskopisk i situ vurdering av distale kolon allo HCT-behandlet mus beskrevet her kan a) en detaljert makroskopisk evaluering av ulike aspekter av intestinal betennelser og b) muligheten til å samle vevsprøver for nedstrøms analyser på ulike tidspunkt i løpet av perioden som observasjon. Total, mini-endoskopisk tilnærmingen gir et stort fremskritt i preklinisk noninvasive kartlegging og vurdering av intestinal GvHD.
Blodkreft malignitet direkte som oppstår fra blodkreft stamcelletransplantasjon rommet og ukontrollert, er raskt utvikler seg, og alvorlige immun-mediert lidelser ofte indikasjoner for å utføre allo-HCT1,2. Selv regnskap for forekomsten av prognostiske gunstig graft-versus-tumor respons, er donor lymfocytter imidlertid ofte inducing og fremme et uønsket immun-mediert angrep sunt vev komponenter i Tillat-HCT mottakeren , en prosess som kalles graft – versus – host sykdom3. Manifestasjoner i tarmen, den såkalte intestinal GvHD, representerer den mest fryktede komplikasjonen av akutt GvHD, alvorlige former som er rutinemessig forbundet med en høy dødelighet1,2,4.
Samlet, murine modeller av allo-HCT har dukket opp som uvurderlig verktøy for å identifisere og studere immun-mediert mekanismene bak patogenesen av GvHD5. Men kinetic vurdering av, for eksempel gunstige effekter av romanen terapeutisk intervensjon over tid i levende mus er rutinemessig basert på fastsettelse av klinisk GvHD score6. Mens disse resultatene er egnet til å reflektere, for eksempel generelle sykdom byrden (dvs. systemisk GvHD), klinisk score mangel følsomheten til pålitelig speile organ-spesifikke manifestasjoner (f.eks, i tarmen). Derfor bommer konklusjoner, for eksempel med hensyn til gut-beskyttende effekten av en gitt terapeutisk intervensjon, som er basert på disse scoring systemer vanligvis.
Til tross for store fremskritt gjennom oppfinnelsen av romanen hele kroppen imaging modaliteter i kombinasjon med bruk av enten bioluminescent eller fluorescerende genetisk musen modeller7,8, metoder til direkte og spesielt vurdere den intestinal manifestasjon av GvHD i levende mus mangler. Derfor er begrunnelsen bak protokollen for endoskopisk vurdering av intestinal GvHD fenotypen beskrevet i neste del å overvinne denne hindringen. Videre motivasjon er også redusere eksperimentelle mus numbers siden, så langt, en detaljert vurdering av mobilnettet morfologiske og molekylære egenskaper (f.eks, av histopatologi eller molekylærbiologi) av intestinal GvHD manifestasjon slutt kreves ofringen av eksperimentelle musen.
Våre institusjon har tidligere rapportert på metoder for en mini-endoskopisk vurdering av colonic manifestasjoner i syngeneic kolitt modeller9. I protokollen presenteres her, vi har raffinert og tilpasset den colonoscopic scoret matrise for alloresponse-drevet kolitt i levende mus med intestinal GvHD på transplantasjon av alloreactive HCT og donor lymfocytter i en MHC, klasse jeg fullt feil innstilling . Vi identifisert fire parameterne egnet gjenspeiler tarm GvHD-relaterte colonic lesjoner. Videre etablerte vi en system det innrømmer en finjustert gradering av enhver enkelt determinant, noe som resulterer i en ny poengsum som lett informerer leseren om alvorlighetsgraden av intestinal GvHD i en gitt mus på et gitt tidspunkt. Histopathological analyser bekreftet at en endoskopisk score over en bestemt dørterskel er pålitelig forutsi moderat til høy klasse vev betennelse. Derfor synes mini-endoskopisk evaluering å representere arbeider erstatning for gullstandarden histopatologi som rutinemessig krever ofringen av eksperimentelle musene. Viktigst, denne protokollen kan brukes til nesten enhver tid og kan brukes flere ganger i løpet av sykdommen10,11. Videre, i motsetning til bruk av bioluminescens-avhengige, ingen arbeid-intens og tidkrevende tiltak som intercrossing genetisk endret mus er nødvendig, og derfor metodikken kan brukes på nesten alle mus-linje interesse.
Til sammen har gitt skadelig klinisk perspektiv allo-HCT pasienter med alvorlig intestinal GvHD, er rask vitenskapelig fremgang og mer innsikt i molekylære mekanismer bak immun patogenesen sterkt behov. Tilsvarende krever viktig, etiske betraktninger at gevinsten av kunnskap skal oppnås med bruk av minimal antall eksperimentelle mus. Derfor anerkjent både krav på forskningen fellesskapet å utforske intestinal GvHD kan være avansert ved å implementere serielle mini-endoskopisk evalueringer av kolon i eksperimentelt arbeid kjeden å overvåke og Vurder intestinal GvHD i live eksperimentelle mus modeller, som beskrevet og validert i protokollen presenteres her.
Protokollen beskriver metoder for induksjon og mini-endoskopisk vurdering av colonic fenotypen observert i løpet av intestinal GvHD. Det serverer bredere hensikten slik at forskerne kan studere intestinal GvHD langs- og noninvasively gjennom hele sykdom (dvs. fra utbruddet av colonic manifestasjon og progresjon til maksimal sykdomsaktivitet).
Det er imidlertid noen viktige trinn og viktige begrensninger iboende til presentert metodikkene eksperimentator må være klar over før du installerer…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av samarbeidende forskning sentre (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634, prosjektet B03) (å grunnlegge Vennskapelighetsstiftelsen) og CRC 1181 (CRC-DFG, prosjektet B05) (å grunnlegge Vennskapelighetsstiftelsen), begge finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, tysk Research Foundation).
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator | Gamma-Service Meical GmbH | ||
Phosphate-buffered saline (PBS ) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D8662-6x500ML | |
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
Hypodermic needle (26G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
1 mL syring | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
50 mL tube | Sarstedt Ag & Co.KG | 62,547,254 | |
Cell strainer with a 40 µm mesh screen | BD Falcon | 352340 | |
Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | ingredient of ACK lysing buffer |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | ingredient of ACK lysing buffer |
Potassium bicarbonate (KHCO3) | Merck KGaA | 1,048,540,500 | ingredient of ACK lysing buffer |
CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells |
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | magnet cell separation to isolate splenic T cells |
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
Filtrated bovine serum | Pan Biotec | P40-47500 | ingredient of FACS buffer |
96-well polystyrene V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651201 | |
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) | Falcon | 352052 | |
BD LSRFortessa II flow cytometer | BD Bioscience Co. | ||
Insulin syringe with sterile interior (30G) | BD | 324826 | |
Oxy Vet Oxymat 3 | Eickemeyer | oxygen concentrator for anesthesia | |
NarkoVet | Eickemeyer | 213062 | |
Plexiglass chamber | Eickemeyer | 214620 | |
Straight Forward Telescope | KARL STORZ SE &Co KG | 64301 AA | part of the experimental setup for colonoscopy |
Protection and Examination Sheath | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 C | part of the experimental setup for colonoscopy |
Examination Sheath with working channel | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 D | part of the experimental setup for colonoscopy |
Biopsy Forceps | KARL STORZ SE &Co KG | 61071 ZJ | part of the experimental setup for colonoscopy |
175 Watt SCB XenonLight Source | KARL STORZ SE &Co KG | 20132120 | part of the experimental setup for colonoscopy |
Fiber Optic Light Cable | KARL STORZ SE &Co KG | 495 NL | part of the experimental setup for colonoscopy |
Image 1 S3 Camera Head | KARL STORZ SE &Co KG | 22220030 | part of the experimental setup for colonoscopy |
Image 1 SCB Camera Control Unit | KARL STORZ SE &Co KG | 22200020 | part of the experimental setup for colonoscopy |
LCD monitor | Olympus | OEV181H | part of the experimental setup for colonoscopy |
Forane / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
Formaldehyde solution 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
5,0 mL Dispenser tip | Eppendorf AG | 30089456 |