Summary
Ce protocole vise à démontrer comment combiner in vitro les baies de la microélectrode avec dispositifs microfluidiques pour étudier la transmission du potentiel d’action dans les cultures de neurones. Analyse des données, à savoir la détection et la caractérisation des potentiels d’action, de la multiplication est effectuée en utilisant une nouvelle avancée, pourtant facile à utiliser et disponible gratuitement, outil de calcul.
Abstract
Matrices de Microélectrodes (AME) sont largement utilisés pour étudier la fonction neuronale in vitro. Ces dispositifs vont permettre simultanée non invasif enregistrement/stimulation de l’activité électrophysiologique pendant de longues périodes. Toutefois, la propriété de détection des signaux de toutes les sources autour de chaque microélectrode peut devenir défavorable en essayant de comprendre la communication et de propagation dans les circuits neuronaux de signaux. Dans un réseau neuronal, plusieurs neurones peuvent être activés simultanément et peuvent générer des potentiels d’action qui se chevauchent, rendant difficile de discriminer et de suivre la propagation du signal. Compte tenu de cette limitation, nous avons établi une configuration en vitro axée sur l’évaluation électrophysiologique communication, qui est capable d’isoler et d’amplifier les signaux axonales avec une haute résolution spatiale et temporelle. En interfaçant dispositifs microfluidiques et l’ame, nous sommes capables à compartimenter les cultures de neurones avec un alignement bien contrôlé des axones et des Microélectrodes. Cette configuration permet aux enregistrements de la propagation de pointe avec un rapport signal sur bruit élevé au cours de plusieurs semaines. Combiné avec des algorithmes d’analyse de données spécialisées, il fournit quantification détaillée de plusieurs communication associés à des propriétés telles que la vitesse de propagation, défaut de conduction, taux de décharge, antérograde des pointes et des mécanismes de codage.
Ce protocole montre comment créer une configuration neuronale compartimentée de la culture sur substrat intégré ame, comment la culture de neurones dans cette configuration et comment correctement enregistrer, analyser et interpréter les résultats de ces expériences. Ici, nous montrons comment la configuration établie simplifie la compréhension de la communication neuronale et de propagation des signaux axonale. Ces plates-formes ouvrent la voie à nouveaux modèles in vitro avec topographies de réseau neuronal machiné et contrôlables. Il peuvent être utilisés dans le contexte des cultures de neurones homogènes, ou avec des configurations de culture mixte où, par exemple, la communication entre les neurones sensoriels et autres types de cellules est surveillée et évaluée. Cette configuration offre des conditions très intéressantes à étudier, par exemple, les troubles du développement neurologique, des circuits neuronaux, information de codage, approches neurodégénérescence et neurorégénération.
Introduction
Comprendre la communication électrique dans les circuits neuronaux est une étape fondamentale pour révéler une fonction normale et élaborer des stratégies thérapeutiques pour traiter la dysfonction. Neurones, intègrent, calculer et relayer les potentiels d’action (PA) qui se propagent le long de leur axone mince. Techniques électrophysiologiques traditionnelles (p. ex., patch clamp de) sont des techniques puissantes pour étudier l’activité neuronale, mais ne se limitent souvent à plus grandes structures cellulaires, tels que le soma ou les dendrites. Techniques d’imagerie offrent une alternative pour étudier les signaux axonales avec haute résolution spatiale, mais ils sont techniquement difficiles à réaliser et ne permettent pas de mesures à long terme1. Dans ce contexte, la combinaison de la microélectrode tableaux (AME) et microfluidique peut apporter une contribution puissante en révélant les propriétés fondamentales des neuron´s transmission de signal et de l’activité au sein de réseaux de neurones in vitro2 , 3.
AME technologie repose sur des enregistrements extracellulaires des cultures de neurones. Les principaux avantages de cette méthodologie électrophysiologique sont sa capacité à supporter une stimulation à long terme, simultanée et enregistrement sur plusieurs sites et un moyen non invasif3. Ame est faits de Microélectrodes conductrices et résistant à la corrosion biocompatibles, hautes incorporées dans un support de plaquette de verre. Ils sont compatibles avec la culture cellulaire conventionnel bio-revêtements, qui, en promouvant l’adhésion cellulaire significativement augmentent la résistance à l’étanchéité entre le substrat et cellules3,4. En outre, ils sont polyvalents dans la conception et peuvent varier en taille de Microélectrodes, la géométrie et la densité. Dans l’ensemble, ame fonctionne comme les récipients de culture de cellules classiques avec l’avantage de permettre la stimulation/enregistrements live-imagerie et électrophysiologique simultanée.
L’utilisation de la technologie de la MEA a contribué à l’étude des caractéristiques importantes des réseaux neuronaux5. Cependant, il y a des caractéristiques intrinsèques qui limitent les performances des ame pour l’étude de communication et propagation de l’APs dans un circuit neuronal. Ame permettre des enregistrements de cellules individuelles et même subcellulaires structures telles que les axones, mais par rapport aux signaux somal, axonales signaux ont un très faible rapport signal-bruit (RSB)6. En outre, la caractéristique de détection des potentiels de domaine extracellulaire de toutes provenances autour de chaque microélectrode entrave le suivi de la propagation des signaux dans un circuit neuronal.
Toutefois, des études récentes ont démontré que les meilleures conditions d’enregistrement est possible en ayant les Microélectrodes alignés dans l’étroit microcanaux dans lesquels les axones peuvent se développer. Cette configuration permet une augmentation significative de la SNR, tel que la multiplication des signaux axonales peut être facilement détecté7,8,9,10,11,12, 13. La stratégie d’alliant dispositifs microfluidiques avec technologie MEA crée un micro-environnement isolé électriquement adapté pour amplifier les signaux axonale11. En outre, la présence de multiples Microélectrodes télédétection le long d’un microsillon est fondamentale pour la détection et la caractérisation de la propagation des signaux axonale.
Ces plates-formes in vitro avec topographies de réseau neuronal très contrôlable peuvent être adaptés à beaucoup de questions de recherche14. Ces plates-formes sont apte à être utilisé dans le contexte des cultures de neurones, mais peuvent être étendus pour l’ingénieur de configurations de culture mixte, où la communication entre les neurones et d’autres types de cellules peut être surveillée et évaluée. Cette configuration fournit donc des conditions très intéressantes d’explorer un certain nombre d’études neural liées telles que le développement neurologique, circuits neuronaux, codage de l’information, la neurodégénérescence et neurorégénération. En outre, sa combinaison avec les modèles émergents de15,des cellules souches humaines pluripotentes induites16 peut ouvrir de nouvelles avenues dans le développement de traitements potentiels pour les maladies humaines qui affectent le système nerveux.
Notre laboratoire utilise cette plate-forme alliant Microélectrodes microfluidics (µEF) pour comprendre les processus neuronaux au niveau cellulaire et réseau et leur implication dans la physio - et pathologique du système nerveux. Compte tenu de la valeur de cette plateforme dans le domaine des neurosciences, le but du présent protocole est de démontrer comment créer une culture de neurones compartimentée sur substrat intégré ame, comment les neurones de la culture dans cette plateforme et comment faire pour enregistrer avec succès, analyser et interpréter les résultats de ces expériences. Ce protocole va certainement enrichir la boîte à outils expérimentaux pour les cultures de neurones dans l’étude de la communication neuronale.
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Protocol
Toutes les procédures impliquant des animaux ont été réalisés selon l’Union européenne (UE) Directive 2010/63/UE (transposée à la législation portugaise par le Decreto-Lei 113/2013). Le protocole expérimental (0421/000/000/2017) a été approuvé par le Comité d’éthique de l’autorité officielle portugaise sur le bien-être des animaux et l’expérimentation (Direção-Geral de Alimentação e Veterinária - DGAV) et de l’Institution d’accueil.
1. préparation des milieux de Culture et d’autres Solutions
NOTE : Fraîchement préparer les solutions de revêtement sur le jour de son utilisation. Les solutions d’enrobage inutilisés et les milieux de culture peuvent être conservés à-20 ° C ou 4 ° C, comme détaillé ci-dessous.
- Préparer 10 mL d’un 0,05 % (v/v) Poly(ethylene imine) (PEI) solution de travail.
- Préparer 20 mL de solution mère de 0,25 % (p/v) PEI en dissolvant purifiée PEI (voir la Table des matières) dans de l’eau stérile.
- Diluer 2 mL de solution mère de PEI de 0,25 % (p/v) dans 8 mL d’eau distillée stérile. Bien mélanger et utiliser. Solution non utilisée peut être conservée à 4 ° C.
- Préparer 1 mL d’une solution de laminine 5 µg/mL.
- Diluer 5 µL de solution mère de laminin 1 mg/mL en 995 µL de milieu de base (voir la Table des matières). Bien mélanger et utiliser. Solution non utilisée peut être stockée congelés à-20 ° C pendant 1 à 2 semaines.
- Préparer 1 L de Solution saline équilibrée de tampon HEPES Hank (H-HBSS).
- Préparer la solution HEPES 1 M en dissolvant 11,9 g de poudre HEPES dans 50 mL d’eau ultrapure. Ajuster le pH à 7,2.
- Préparer la solution de H-HBSS (sans calcium et magnésium) par dissolution de chlorure de potassium de 5,33 mM, 0,44 mM de phosphate de potassium monobasique, 138 mM chlorure de sodium, phosphate dibasique de sodium 0,3 mM et 5,6 mM de glucose dans 800 mL d’eau ultrapure.
- Ajouter 15 mL de la solution 1 M HEPES (concentration finale de 15 mM).
- Ajuster le pH à 0,2-0,3 unités inférieures à pH désiré 7,4 en utilisant 1 N HCl ou NaOH N 1. Ajouter de l’eau ultrapure pour compenser le volume de la solution finale.
Notez le pH a tendance à augmenter au cours de la filtration. - Stériliser par filtration à l’aide d’une membrane de poly(ether sulfone) (PES) 0,22 µm porosité.
- Préparer 10 mL d’H-HBSS contenant 10 % inactivés par la chaleur (hiFBS) de sérum de veau fœtal.
- Diluer 1 mL de hiFBS dans 9 mL de H-HBSS. Bien mélanger et utiliser. Solution non utilisée peut être conservée à 4 ° C pendant 3 à 4 semaines.
- Préparation de 5 mL de 1,5 mg/mL solution de trypsine.
- Immédiatement avant l’utilisation, dissoudre 7,5 mg de trypsine dans 5 mL d’H-HBSS. Stériliser par filtration à l’aide d’une membrane PES de porosité de 0,22 µm.
- Préparer 50 mL de milieu supplémenté.
- Dans un tube conique de 50 mL, mélanger 48,5 mL de milieu de base (voir Table des matières), 2 % (v/v) supplément de B-27, 1 % et 0,5 mM de L-glutamine Pen/Strep (10 000 U/mL de pénicilline et 10 000 µg/mL de streptomycine). Milieu supplémenté peut être stocké à 4 ° C pendant 3 à 4 semaines.
2. microfluidique et préparation de dispositifs MEA
Remarque : Effectuez des opérations 2.1-2.11 le jour avant l’ensemencement de la cellule.
- Nettoyer les dispositifs microfluidiques pour enlever la fabrication et autres débris à l’aide de ruban adhésif en vinyle. Appuyez doucement sur le ruban adhésif contre l’appareil pour atteindre toutes les zones de l’appareil.
- L’air plasma-nettoyer la MEA pendant 3 min (0,3 mbar) pour nettoyer la surface et la rendre plus hydrophiles.
- Brièvement submerger les dispositifs microfluidiques dans l’éthanol à 70 % et laissez-les sécher à l’air à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire.
- Placer chaque MEA dans un stérile 90 mm boîte de Pétri et les stériliser par 15 min d’exposition à la lumière ultraviolette (UV).
- Enduire la surface centrale de MEA en incubant avec 500 µL de solution PEI 0,05 % (v/v) pendant au moins 1 h à 37 ° C.
Remarque : Comme décrit par d’autres17, revêtement PEI d’ame entraîne moins cellule clustering qu’avec un revêtement poly(lysine). - Aspirer la solution de revêtement PEI de la surface de la MEA et laver ame 4 x 1 ml de stérile de l’eau distillée. Veillez à ne pas toucher la surface de la MEA au cours d’étapes de lavage, car cela pourrait endommager les électrodes.
- Guidé par un stéréomicroscope à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire, centrez la puce MEA et ajouter 1 mL d’eau stérile dans la zone centrale de la MEA.
- Placer le dispositif microfluidique sur le dessus de la surface de la MEA.
- Alignez soigneusement les micro-rainures de dispositif microfluidique avec la grille de la microélectrode de l’ame.
- Lorsque correctement aligné, aspirer soigneusement l’excédent d’eau sans toucher la MEA ou du dispositif microfluidique.
- Incuber le µEFs une nuit à 37 ° C, sécher et permettre l’attachement complet. Pour faciliter le branchement, appuyez doucement sur le dispositif microfluidique contre la MEA.
Remarque : Exécutez l’étape 2.12 le jour de la cellule l’ensemencement. - Une fois que les µEFs sont complètement secs, chargez les puits microfluidique avec 150 µL de solution de revêtement de 5 µg/mL laminine et incuber à 37 ° C pendant au moins 2 h avant l’ensemencement de la cellule.
Remarque : Lors du chargement de µEF avec la solution de la laminine, veiller à ce que la solution remplit les micro-rainures. Utilisez un aspirateur pour enlever toute bulle d’air qui peut-être être présente dans les micro-rainures.
3. préfrontale de Cortex Dissection
- Préparer la zone de dissection pour l’élimination de l’embryon.
- Désinfecter la surface de travail et les instruments chirurgicaux, éthanol à 70 %.
Remarque : Si cette dissection n’est pas une procédure stérile, désinfection contribue à réduire les risques de contamination. - Une couche propre jetable permet de limiter la zone de dissection et étalez les instruments chirurgicaux pour l’élimination de l’embryon.
- Préparer 4 plats de pétri de 90 mm rempli de H-HBSS froide et placez-les sur un plateau avec de la glace près de la zone de dissection.
- Désinfecter la surface de travail et les instruments chirurgicaux, éthanol à 70 %.
- Euthanasier un rat Wistar temps-enceintes de E-18 par inhalation de dioxyde de carbone (CO2).
- Une fois la procédure terminée, retirer l’animal de la chambre de CO2 et confirmer le décès par une méthode secondaire de l’euthanasie, comme exsanguination.
- Placer l’animale face ventrale vers le haut sur les couches jetables, vaporiser le bas-ventre avec l’éthanol à 70 % et, avec l’aide de pinces et ciseaux, faire une forme en U de couper à travers la peau pour exposer l’utérus.
- Soigneusement retirer l’utérus les embryons en coupant tout tissu conjonctif et les placer dans un des plats Petri avec froid H-HBSS.
- Retirez chaque embryon de son sac embryonnaire et, avec l’aide de pinces et ciseaux, décapiter l’embryon.
- Déposer la tête d’embryo´s dans un deuxième pétri rempli de froid H-HBSS.
- Répétez les étapes 3,6 à 3,7 pour chaque embryon.
- Disséquer le cortex préfrontal.
- Transférer une tête d’embryo´s à une troisième boîte de pétri.
- Utiliser une paire de pinces pour exposer le cerveau.
- Retirer le cerveau de sa cavité et couvrez-la de froid H-HBSS.
- Le cas échéant, retirez et jetez les bulbes olfactifs. Disséquer le cortex préfrontal et supprimer les méninges.
- Déposer les fragments du cortex préfrontal dans un quatrième pétri rempli de froid H-HBSS.
- Répétez les étapes 3.9.1 - 3.9.5 pour chaque embryon.
4. cortical neurones Dissociation et la Culture sur µEF
Remarque : Les procédures suivantes ont été effectuées à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire a 15 min pour le cycle de stérilisation UV. Travail superficie ainsi que tous les matériaux placés à l’intérieur de la hotte devrait être désinfecté auparavant avec l’éthanol à 70 %.
- Comme indiqué au point 1.5, dissoudre la trypsine précédemment pondérée dans 5 mL d’H-HBSS et filtrer la solution.
- Collecter les pièces de cortex préalablement disséqués un total de 5 mL de H-HBSS. Transférez-les sur un tube conique stérile de 15 mL.
- Ajouter 2,3 mL de solution de trypsine fraîchement préparée 1,5 mg/mL dans le tube contenant les fragments de cortex.
- Mélanger la suspension et incuber à 37 ° C pendant 15 min (brièvement agiter toutes les 5 min).
- Arrêter la digestion de tissu et laver par la trypsine.
- Jeter le surnageant contenant de la trypsine. Ajouter 5 mL de H-HBSS contenant 10 % hiFBS pour inactiver la trypsine restante ; agiter doucement.
- Laissez les fragments de cortex s’installent et puis jeter le surnageant.
- Ajouter 5 mL de H-HBSS afin d’éliminer les résidus de hiFBS. Laissez les fragments de cortex s’installent et éliminer le surnageant.
- Laver à nouveau les fragments de cortex avec 5 mL de H-HBSS.
- Laissez les fragments de cortex s’installent et éliminer le surnageant. Ajouter 5 mL de milieu neuronal complétée.
- Mécaniquement de se dissocier des fragments de cortex avec une pipette sérologique de 5 mL en pipettant également lentement de haut en bas pour 10 à 15 fois. Si nécessaire, répétez la procédure à l’aide d’une pipette de petit calibre jusqu'à ce que la suspension de cellules deviennent homogènes.
- Jeter les autres tissus non dissociés en filtrant la fosse de suspension cellulaire une passoire de cellule 40 µm.
- Compter les cellules viables et déterminer la densité cellulaire.
- Dans un microtube, ajouter 20 µL de 0,4 % (p/v) : le bleu Trypan à une suspension de cellules 20 µL. Mélanger bien à l’homogénat de la solution et transférer 10 µL dans un Neubauer chambre de comptage.
- Compter les cellules viables et déterminer la densité cellulaire de cellules viables.
- Ajuster la densité des cellules à 3,6 x 107 cellules/mL (le cas échéant, centrifuger la suspension cellulaire).
- Immédiatement avant la cellule ensemencement, retirez laminine revêtement de toutes les loges de la µEF. Distribuer 50 µL de milieu supplémenté dans chaque puits du compartiment axonal µEF.
- Graines de 5 µL de suspension cellulaire dans le compartiment de somal µEF. Incuber à 37 ° C pendant 1 h, pour permettre la fixation des cellules au substrat.
- Remplir doucement chaque puits de µEF avec milieu supplémenté chauffée. Transférer les µEF dans un incubateur à 37 ° C, livré avec 5 % de CO2d’humidificateur.
Remarque : Pour éviter l’évaporation de milieu de culture rapide, placer un microtube ouvert rempli d’eau à l’intérieur de la boîte de pétri transportant le µEF. - Maintenir les cultures pour la période requise en remplaçant 50 % de milieu de culture tous les deuxième et troisième jours de culture.
Remarque : Après les expériences, la microfluidique peut être détachée d’ame en immergeant le µEF dans l’eau pendant la nuit. Le cas échéant, délicatement éplucher la microfluidique avec l’aide de pinces. Ame peut être nettoyés par une nuit d’incubation avec un détergent enzymatique commercial de 1 % (v/v) (voir la Table des matières).
5. enregistrement de l’activité neuronale spontanée
NOTE : Cultures de neurones corticaux embryonnaires sur ame présentent généralement l’activité spontanée dès 7 jours in vitro (DIV), mais prendre 2-3 semaines (14-21 DIV) à maturité et pièce stable activité. Il incombe à l’expérimentateur de décider quand commencer les mesures électrophysiologiques, fondées sur les objectifs de l’étude. Dans ce protocole, l’enregistrement de l’activité neuronale de µEF est démontrée en utilisant un système d’enregistrement commercial (voir Table des matières pour les détails du matériel), avec un module de chauffage incorporé. Pour effectuer des enregistrements, nous avons utilisé un logiciel disponible gratuitement (voir Table des matières pour plus de détails de logiciel).
- Allumez la MEA à l’enregistrement de système et le contrôleur de température et laissez la plaque base chauffée du préamplificateur pour atteindre 37 ° C.
Remarque : pour les enregistrements à long terme (> 30 min à une heure) on devrait également avoir un système qui maintient une atmosphère de CO2 . - Placez le µEF sur le préamplificateur (préamplificateur).
Remarque : Vérifiez que la puce de la MEA est correctement alignée avec le numéro de référence dans le coin supérieur gauche. La puce MEA que nous utilisons est cône d’éclairage symétrique, mais cet alignement correspond à l’orientation correcte de la disposition des broches des électrodes et l’ID de matériel. - Fermez et verrouillez le couvercle du préamplificateur.
- Pour enregistrer, ouvrez le logiciel d’enregistrement et de définir les paramètres d’enregistrement et le chemin d’accès du flux de données enregistrées (voir le manuel du logiciel pour plus d’informations sur la façon de mettre en place un régime d’enregistrement).
NOTE : Une acquisition avec une fréquence d’échantillonnage de 20 kHz est suffisant pour la plupart des applications. Une plus grande fréquence d’échantillonnage est conseillée si plus de précision est nécessaire dans les horaires de pointe. Si on entend seulement les pointes Records, définissez un filtre passe-haut à 300 Hz, qui atténueront les composantes de basse fréquence du signal. Si les données brutes et filtrées sont enregistrées en même temps, cela augmentera considérablement la taille de fichier de données. Il est toujours possible d’effectuer un filtrage en mode hors connexion des données brutes. Afin de réduire les données taille de fichier, on peut également limiter Microélectrodes d'où à enregistrement (par exemple, seuls des Microélectrodes dans les micro-rainures). - Cliquez sur Démarrer DAQ pour démarrer l’acquisition de données. Vérifiez si l’affichage indique des traces en cours d’exécution de l’activité et démarrer l’enregistrement.
Remarque : Le niveau sonore est généralement légèrement plus élevé dans les correspondant pour les micro-rainures des Microélectrodes. Si le niveau sonore est trop élevé (amplitude crête à crête > 50 µV) ou instable dans plusieurs des Microélectrodes, ça pourrait être à cause de la saleté, empêchant un bon contact avec le clavier. Ce problème est généralement résolu en nettoyant délicatement les plots de contact MEA et les goupilles de préamplificateur à l’aide d’un coton-tige imbibé d’éthanol à 70 %. - Ouvrez le fichier enregistré dans le logiciel d’analyse (voir Table des matières) pour explorer rapidement les données.
6. analyse de données
Remarque : Les étapes suivantes indiquent comment utiliser le logiciel µSpikeHunter, un outil de calcul, développé au laboratoire de Aguiar (disponible gratuitement sur demande par courriel à pauloaguiar@ineb.up.pt), pour analyser les données enregistrées avec µEF. Une interface utilisateur graphique (Figure 2) est utilisée pour charger les données, identifier la propagation des ondes de spike, déterminer la direction (antérograde ou rétrograde) et estimer les vitesses de propagation. µSpikeHunter est compatible avec les fichiers HDF5 générés à partir d’enregistrements obtenus à l’aide de systèmes de la famille MEA2100, qui peuvent être utilisés en conjonction avec 60, 120 et 256-électrode ame. Les enregistrements obtenus à l’aide de l’expérimentateur de canaux multiples peuvent être facilement convertis aux fichiers HDF5 en utilisant le logiciel disponible gratuitement (voir Table des matières).
- Cliquez sur parcourir pour sélectionner le fichier d’enregistrement. Puis, cliquez sur le bouton informations sur le fichier pour afficher la fréquence d’échantillonnage, la durée d’enregistrement ainsi que la liste des flux de données enregistrées (par exemple, les données brutes, les données filtrées).
Remarque : Pour des estimations de vitesse de propagation vrai, il est recommandé de sélectionner le flux de données brutes pour l’analyse. - Sélectionnez Microélectrodes (seule ligne ou colonne associée microsillons) pour analyse et définir la valeur de seuil de détection de spike (phase positive ou négative) à 6 x l’écart-type (SD) du bruit de signal. Cliquez sur Lire les données pour appliquer le détecteur d’événement et obtenir les séquences identifiées de propagation.
Remarque : Si les critères sont remplis, une liste de séquences détectées propagation remplira le panneau d’analyse. L’utilisateur peut alors afficher et interagir avec plusieurs outils d’analyse de la séquence de propagation, notamment des traces de tension Microélectrodes inter corrélations croisées, vitesses de propagation de single-séquence, un kymographes et un outil de lecture audio. Bien que l’estimation de la vitesse de propagation peut être obtenue pour toute paire de Microélectrodes ou la moyenne des prévisions pour toutes les paires, cette estimation est plus fiable si la paire plus éloignée est sélectionnée. - Répétez l’étape précédente pour les ensembles de la microélectrode d’intérêt. Chaque fois, cliquez sur Enregistrer tous les événements pour sauver le temps et l’amplitude des pointes (sur chacun de des Microélectrodes) pour toutes les séquences de propagation identifiés dans un fichier CSV.
- Importez les fichiers CSV aux environnements d’analyse de données pour une analyse plus approfondie des modèles d’activité de la culture (p. ex., taux, intervalles inter-spike).
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Representative Results
Utilisant le protocole décrit ici, les neurones corticaux rat E-18 ensemencées sur µEF sont capables de développer et de rester en bonne santé dans ces conditions de culture pendant plus d’un mois. Dès que 3 à 5 jours de culture, les neurones corticaux poussent leurs axones grâce à micro-rainures vers le compartiment axonal de µEF (Figure 1). Après 15 jours de culture, les neurones corticaux cultivés sur µEF sont censés affichent des taux d’activité stables et propagation des potentiels d’action le long les micro-rainures est attendue. Les cultures plus âgées (> 14 DIV) ont tendance à être dominé par éclatement des activité comme conventionnel MEA enregistrements18,19.
Analyse de données et des enregistrements
Analyse des données brutes avec µSpikeHunter (Figure 2) permet la détection et l’extraction de multiplication spike vagues le long des ensembles de 4 Microélectrodes (au sein des micro-sillons). La figure 3 affiche l’un de ces événements. µSpikeHunter autorisés pour l’estimation des vitesses de propagation, basée sur les corrélations croisées entre les formes d’onde de tension de certaines paires de Microélectrodes (offrant un temps de retard) et la distance d’inter-électrode connue associée.
Les données extraites a été analysées plus loin en utilisant un code conçu dans MATLAB. Une parcelle de raster représentatifs de la multiplication spike vagues le long de 11 (sur 16) micro-rainures est montré dans la Figure 4 a. Le taux de décharge instantanée pour une forte et une faible activité microsillons est illustré à la Figure 4 b.
Enregistrements µEF présentent différents niveaux d’activité par Microélectrodes. Souvent, plusieurs Microélectrodes dans le compartiment somal sont « silencieuses ». Cependant, la plupart des Microélectrodes dans les micro-rainures ont tendance à être active (Figure 5 a). Il est bien décrit que les micro-rainures fonctionnent comme des amplificateurs de signal8. L’amplitude d’un signal enregistré repose non seulement sur la taille des courants source, mais aussi sur la résistivité des médias environnants. La résistance le long d’un microsillon est particulièrement élevée, ce qui augmente considérablement l’amplitude des signaux mesurés par rapport à ceux des Microélectrodes dans le compartiment somal (Figure 5 b).
Figure 1 . Neurones corticaux rat embryonnaires cultivées sur µEF. (a) photo de µEF. Echelle : 1 cm. (b) une image représentative des neurones corticaux cultivés dans le µEF pendant 5 jours, montrant plusieurs axones traversant les micro-rainures et atteindre le compartiment axonal (flèches). Echelle : 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Capture d’écran de l’interface utilisateur graphique principal de µSpikeHunter. L’utilisateur peut charger les données enregistrées avec µEF, identifier la propagation des ondes de spike, déterminer la direction (antérograde ou rétrograde) et estimer les vitesses de propagation. Un outil de kymographes permet à l’utilisateur d’estimer manuellement la vitesse de propagation basée sur une ligne tracée sur le kymographes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Antérograde multiplication pointes ondes captée par 4 Microélectrodes (E8-E11) au sein d’un microsillon. Chaque trace représente un enregistrement raw microélectrode durant 3 ms après analyse avec µSpikeHunter, la corrélation croisée entre les Microélectrodes plus éloignés (E8 et E11) permet le calcul d’une vitesse de propagation de 0,52 m/s. s’il vous plaît cliquer ici pour obtenir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Barrage d’informations à travers les micro-rainures. a tracé raster représentant de 2 minutes de l’activité spontanée enregistrements le long des 11 micro-rainures. Chaque point représente une multiplication pointes ondes (unité) captée par 4 Microélectrodes et identifié par le biais de l’analyse avec µSpikeHunter. Un élevé et une faible activité microsillons sont surlignés en jaune et rouge, respectivement. (b) Evolution du taux de mise à feu instantanée (comme dans le codage) pour les micro-rainures mis en évidence deux le long de 10 minutes. Appareils de reproduction ou de multiplication seulement ont été considérés pour le calcul de la vitesse de tir. Remarque la synchronisation de l’activité, malgré les différents taux de déclenchement. Le taux de décharge instantanée a été calculé à convolution les événements de pointe avec un noyau gaussien avec un écart de 100 ms. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Qualité des enregistrements extracellulaires dans µEF. (a) la fenêtre de temps (1 seconde) d’un enregistrement µEF (neurones corticaux rat à 15 jours en vitro) avec une fréquence d’échantillonnage de 20 kHz et un filtre passe-haut à 300 Hz électrode rangs 1 à 7 correspondent aux lignes 8 à 11 pour les micro-rainures et compartiment somal. (b) (pics détectés en utilisant une méthode de seuil, avec une phase négative seulement, mis à l’écart de 6 x) de tracé en boîte et moustaches de la gamme complète des amplitudes de spike extrait les lignes spécifiées (durée totale d’enregistrement de 10 minutes). Les amplitudes des pointes sont nettement plus larges dans les Microélectrodes dans les micro-rainures (lignes 8-11 ; 16 micro-rainures), comparativement à des Microélectrodes du compartiment somal (lignes 1-7 ; 16 Microélectrodes actives). ANOVA à, Dunn de multiples tests de comparaison, ***p < 0,0001. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole présenté ici montre comment assembler un µEF, composé d’un dispositif microfluidique et un MEA avec des conceptions standards disponible dans le commerce et analyser les données enregistrées.
Lorsque vous concevez une expérience, les chercheurs doivent tenir compte du fait que le modèle in vitro est limité par la grille fixe MEA, qui contraint les arrangements de microsillons. L’utilisation d’un particulier microfluidique ou conception MEA dépendra des besoins expérimentaux spécifiques mais, en général, les mêmes étapes de la procédure devraient s’appliquer aux configurations différentes µEF.
Une décision critique soit faite avant l’Assemblée µEF est si l’utilisateur a l’intention de réutiliser le µEF assemblé à l’avenir des expériences. Traitement par plasma d’oxygène sur les deux surfaces peut être fait pour liaison covalente dispositifs microfluidiques à ame20. Cependant, cette étanchéité souvent fait les puces MEA inutilisable pour d’autres expériences, comme le retrait du dispositif microfluidique irréversiblement endommage la couche de passivation. Pour contourner ce problème, des groupes de recherche ont tendance à réutiliser la montée µEF, malgré les inconvénients possibles (p. ex., des débris provenant des expériences antérieures). En suivant scrupuleusement les étapes décrites dans le présent protocole, de l’expérience à l’expérience, on peut en toute sécurité attachent et détachement des dispositifs microfluidiques sans endommager la MEA.
L’utilisation de µEF permet l’isolement d’un ensemble des axones dans les micro-rainures. Le temps requis pour un nombre raisonnable d’axones à traverser les micro-rainures dépendra largement de la cellule à l’ensemencement de la procédure, à savoir la densité des cellules ensemencées. En utilisant la densité indiquée dans le présent protocole, les neurones utilisent pour traverser les microsillons ensemble au sein de 3 à 5 DIV.
Selon le milieu de culture (p. ex., incubateur et taux d’humidité), il peut être nécessaire de remplacer les médias tous les 2 à 3 jours de culture. Lors du renouvellement des médias, retirez le support du puits µEF tout en conservant des médias dans les principaux canaux. Puis, doucement ajouter des médias dans les puits µEF lui permettant de s’écouler lentement à travers les principaux canaux avant de remplir les puits avec le volume final de médias. Suite à ces recommandations, nous sommes en mesure de maintenir ces cultures dans des conditions saines au moins un mois.
Un avantage majeur de cette plateforme est la possibilité d’isoler, de mesurer et de suivre les signaux axonales. Bien que l’enregistrement de µEF est simple, la grande quantité de données qui peuvent être générées est lourde à gérer et nécessite de bonnes connaissances de l’analyse des données. Le logiciel d’analyse utilisé ici, µSpikeHunter21, est une avancée encore l’outil de calcul intuitif, qui permet la quantification détaillée de plusieurs mesures (p. ex., multiplication des événements, la vitesse de propagation etc.) relatives à a quelques pas. Bien que l’analyse des données n’est pas l’objet du présent protocole, les informations fournies ici déjà permettent l’extraction de données significatives d’un enregistrement µEF. Cependant, il est important de noter que l’isolation fiable d’un seul axone par microsillons reste impraticable. Ainsi, signaux spike très complexe (en raison de plusieurs axones en passant par les microsillons) peuvent surgir et affectent les timings de spike et calculs de la vitesse de propagation. Cette limitation peut être atténuée en utilisant les micro-rainures très étroit (moins de 5 µm)13 et/ou par l’entremise de spike tri techniques21, qui aident à distinguer les sources de signaux différents.
Même si in vitro de cultures ne peuvent récapituler la complexité complète en vivo , leur combinaison avec µEF permet des approches ascendantes bien contrôlée. Nous espérons que ce protocole aidera les débutants et les utilisateurs MEA compétents établissant des modèles nouveaux et fiables pour l’étude électrophysiologique communication dans les circuits neuronaux.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le FEDER - Fundo Europeu de Desenvolvimento fonds régionaux par le biais de la COMPETE 2020 - finance les Operacional de Programme pour la compétitivité et l’Internationalisation (POCI), Portugal 2020 et par les portugais à FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia / Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior dans le cadre du projet PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus a été appuyée par la CFPI (PD/BD/135491/2018). Paulo Aguiar a été appuyée par Programa Ciência - Humano de Potencial de Programa Operacional (POPH) - Promotion de l’emploi scientifique, du FSE et MCTES et programme Investigador FCT, POPH et Fundo Social Europeu. Les dispositifs microfluidiques ont été fabriqués à l’INESC - microsystèmes et Nanotechnologies (Portugal), sous la supervision de João Pedro Conde et Virginia Chu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60x40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
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