Summary
Detta protokoll syftar till att demonstrera hur man kombinerar i vitro mikroelektrod matriser med mikroflödessystem enheter för att studera potentiella åtgärder överföring i neuronala kulturer. Dataanalys, nämligen upptäckt och karakterisering av förökningsmaterial handlingspänningar, är utförda med en ny avancerad, men ändå användarvänliga och fritt tillgängliga, computational verktyg.
Abstract
Mikroelektrod matriser (MEAs) används allmänt att studera nervcellernas funktion i vitro. Dessa enheter kan samtidiga icke-invasiv inspelning/stimulering av elektrofysiologiska aktivitet under långa perioder. Egenskapen för avkänning signaler från alla källor runt varje mikroelektrod kan dock bli unfavorable när man försöker förstå kommunikation och signalen förökning i neuronala kretsar. I ett neuronala nätverk, flera nervceller kan aktiveras samtidigt och kan skapa överlappande handlingspänningar, vilket gör det svårt att diskriminera och spåra signalen förökning. Med tanke på denna begränsning, har vi etablerat en in vitro- setup inriktad på att bedöma elektrofysiologiska kommunikation, som kunna isolera och förstärka axonal signaler med hög rumsliga och temporal upplösning. Av gränssnitt mikroflödessystem enheter och multilaterala miljöavtal, kan vi kategoriserar neuronala kulturer med en väl kontrollerad anpassning av axoner och mikroelektroder. Denna inställning tillåter inspelningar av spike förökning med högt signal-brus-förhållande under loppet av flera veckor. Kombinerat med specialiserade data analys algoritmer, det ger detaljerad kvantifiering av flera kommunikation relaterade egenskaper såsom förökning velocity, överledning misslyckande, eldhastighet, anterograd spikar och kodning mekanismer.
Detta protokoll visar hur man skapar en konkurrensbetingat neuronala kultur setup över substrat-integrerade åtgärder, hur kultur nervceller i den här installationen och hur man framgångsrikt registrera, analysera och tolka resultaten från sådana experiment. Här visar vi hur den etablerade setup förenklar förståelsen av neuronal kommunikation och axonal signalen förökning. Dessa plattformar bana väg för nya in vitro- modeller med konstruerade och kontrollerbar neuronala nätverk kretsmönster. De kan användas i samband med homogena neuronala kulturer, eller med samtidig kultur konfigurationer där, till exempel kommunikation mellan sensoriska neuroner och andra celltyper är övervakas och bedömas. Denna inställning ger mycket intressant förutsättningar att studera, till exempel nervsystemets utveckling, neuronala kretsar, information kodning, neurodegeneration och neuroregeneration strategier.
Introduction
Förstå elektrisk kommunikation i neuronala kretsar är ett grundläggande steg för att avslöja normala funktion, och utforma terapeutiska strategier för att hantera dysfunktion. Nervceller integrera, beräkna och relä handlingspänningar (APs) som sprids längs deras tunna axoner. Traditionella elektrofysiologiska tekniker (t.ex. patch clamp) är kraftfulla tekniker för att studera neuronal aktivitet men är ofta begränsade till de största cellulära strukturerna, såsom soma eller dendriter. Imaging tekniker erbjuder ett alternativ för att studera axonal signaler med hög rumslig upplösning, men de är tekniskt svåra att utföra och inte tillåter långsiktiga mätningar1. I detta sammanhang kan kombinationen av mikroelektrod matriser (åtgärder) och mikrofluidik göra ett kraftfullt bidrag i att avslöja de grundläggande egenskaperna för neuron´s aktivitet och signalerar överföringen inom neuronala nätverk in vitro-2 , 3.
MEA teknik bygger på extracellulära inspelningar av neuronala kulturer. De främsta fördelarna med denna Elektrofysiologisk metodik är dess förmåga att stödja långsiktiga, samtidig stimulering och inspelning på flera platser och i en icke-invasiv sätt3. Mätningar är gjorda av biokompatibel, hög konduktiv och korrosionsbeständig mikroelektroder inbäddade i ett glassubstrat wafer. De är kompatibla med konventionella cell kultur bio-beläggningar, som genom att främja celladhesion avsevärt ökar tätning motståndet mellan substratet och celler3,4. Dessutom, de är mångsidiga i design och kan variera i mikroelektroder storlek, geometri och densitet. Sammantaget arbetar MEAs som konventionella cell odlingskärl med fördelen av att samtidiga live-imaging och elektrofysiologiska recordings/stimulering.
Användningen av MEA-teknik har bidragit till studiet av viktiga funktioner av neurala nätverk5. Dock finns det inneboende funktioner som begränsar prestanda för åtgärder för att studera kommunikation och APs förökning i en neuronal krets. MEAs aktivera inspelningar från enstaka celler och även subcellulära strukturer som axoner, men jämfört med somal signaler, axonal signaler har en mycket låg signal-brus-förhållande (SNR)6. Dessutom hämmar kännetecken av avkänning extracellulära fältet potentialer från alla källor runt varje mikroelektrod spårning av signalen förökning i en neuronal krets.
Nyligen genomförda studier har visat, dock att bättre inspelning villkor kan uppnås genom att ha de mikroelektroder linje inom smala mikrokanaler som axoner kan växa. Den här konfigurationen ger en betydande ökning av SNR så att förökningsmaterial axonal signaler kan vara enkelt upptäckt7,8,9,10,11,12, 13. Strategin att förena mikroflödessystem enheter med MEA teknik skapar ett elektriskt isolerad närmiljön lämpar sig att förstärka axonal signaler11. Dessutom, närvaron av flera fjärranalys mikroelektroder längs en microgroove är grundläggande för identifiering och karakterisering av axonal signalen förökning.
Sådana in vitro- plattformar med mycket kontrollerbar neuronala nätverk kretsmönster kan anpassas till många forskning frågor14. Dessa plattformar är lämplig att användas i samband med neuronala kulturer men kan utökas för att ingenjör samtidig kultur konfigurationer, där kommunikationen mellan nervceller och andra celltyper kan övervakas och bedömas. Denna inställning ger således mycket intressant förutsättningar att utforska ett antal neurala-relaterade studier såsom neuroutvecklingssjukdomar, neuronala kretsar, Informationskodning, neurodegeneration och neuroregeneration. Dessutom kan dess kombination med nya modeller av mänsklig inducerade pluripotenta stamceller15,16 öppna nya vägar i utvecklingen av potentiella behandlingar för mänskliga sjukdomar som påverkar nervsystemet.
Vårt labb använder denna plattform som kombinerar mikroelektroder med mikrofluidik (µEF) för att förstå neurologiska processer på cellulär och nätverk och deras implikation i FYSIO- och patologisk nervsystemet. Med tanke på värdet av sådan plattform inom neurovetenskap, syftet med detta protokoll är att demonstrera hur att skapa en konkurrensbetingat neuronala kultur över substrat-integrerade åtgärder, hur man kultur nervceller i denna plattform och hur man framgångsrikt rekord, analysera och tolka resultaten från sådana experiment. Detta protokoll kommer säkerligen att berika experimentella verktygslådan för neuronala kulturer i studien av neural kommunikation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som involverar djur utfördes enligt det Europeiska unionen (EU) direktiv 2010/63/EU (transponeras till portugisiska lagstiftningen genom Decreto-Lei 113/2013). Det experimentellt protokollet (0421/000/000/2017) godkändes av den etiska kommittén av båda den portugisiska officiella myndigheten om djurskydd och experiment (Direção-Geral de Alimentação e Veterinária - DGAV) och mottagande Institution.
1. beredning av kultur Media och andra lösningar
Obs: Förbereda färska beläggning lösningarna på dagen för dess användning. De oanvända beläggningslösningar och kultur media kan förvaras vid-20 ° C eller 4 ° C enligt nedan.
- Förbereda 10 mL av en 0,05% (v/v) Poly(ethylene imine) (PEI) fungerande lösning.
- Förbereda 20 mL av stamlösningen 0,25% (w/v) PEI genom upplösning renat PEI (se Tabell för material) i sterilt vatten.
- Späd 2 mL av 0,25% (w/v) PEI stamlösning i 8 mL sterilt destillerat vatten. Blanda väl och Använd. Oanvänd lösning kan förvaras vid 4 ° C.
- Laga 1 mL en 5 µg/mL laminin lösning.
- Späd 5 µL av 1 mg/mL stamlösning laminin i 995 µL av basala medium (se Tabell för material). Blanda väl och Använd. Oanvänd lösning kan förvaras fryst vid-20 ° C i upp till 1-2 veckor.
- Laga 1 L av HEPES-buffrat Hanks balanserad saltlösning (H-HBSS).
- Bered 1 M HEPES genom upplösning 11,9 g HEPES pulver i 50 mL av ultrarent vatten. Justera pH-värdet till 7,2.
- Förbereda H-HBSS lösning (utan kalcium och magnesium) genom upplösning 5,33 mM kaliumklorid, 0,44 mM kalium fosfatbuffert monobasiskt, 138 mM natriumklorid, 0,3 mM natriumfosfat dibasisk och 5,6 mM glukos i 800 mL ultrarent vatten.
- Tillsätt 15 mL 1 M HEPES lösning (slutlig koncentration på 15 mM).
- Justera pH till 0,2-0,3 enheter nedan önskat pH 7,4 använder 1 N HCl eller 1 N NaOH. Tillsätt ultrarent vatten för att kompensera den slutliga lösning volymen.
Notera pH tenderar att stiga under filtreringen. - Sterilisera genom filtrering med hjälp av ett 0,22 µm porositet poly(ether sulfone) (PES) membran.
- Förbereda 10 mL av H-HBSS innehållande 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint Serum (hiFBS).
- Späd 1 mL hiFBS i 9 mL H-HBSS. Blanda väl och Använd. Oanvänd lösning kan förvaras vid 4 ° C i 3-4 veckor.
- Bered 1,5 mg/mL 5 mL trypsin.
- Lös upp 7,5 mg av trypsin i 5 mL H-HBSS omedelbart före användning. Sterilisera genom filtrering med hjälp av ett 0,22 µm porositet PES membran.
- Förbereda 50 mL kompletterade medium.
- I en 50 mL konisk tub, blanda 48,5 mL basala medium (se Tabell för material), 2% (v/v) B-27 tillägg, 0,5 mM L-glutamin och 1% penna/Strep (10 000 E/mL penicillin och 10 000 µg/mL streptomycin). Kompletterade medium kan lagras vid 4 ° C i 3-4 veckor.
2. mikroflödessystem och MEA enheter beredning
Obs: Utför steg 2.1-2.11 dagen före cellen sådd.
- Ren mikroflödessystem enheter att ta bort fabrication och annat skräp med vinyltejp. Tryck försiktigt tejpen mot enheten att nå alla delar av enheten.
- Air plasma-ren MEA för 3 min (0.3 mbar) för att rengöra ytan och göra det mer hydrofil.
- Kort dränka mikroflödessystem enheter i 70% etanol och låt dem lufttorka inuti en LAF.
- Placera varje MEA i en steril 90 mm petriskål och sterilisera dem i 15 min av ultraviolett (UV) ljus exponering.
- Coat MEA centrala ytan genom inkubation med 500 µL 0,05% (v/v) PEI lösning för minst 1 h vid 37 ° C.
Obs: Som beskrivs av andra17, PEI beläggning av MEAs resulterar i mindre cell klustring än att använda poly(lysine) beläggning. - Aspirera PEI beläggning lösningen från MEA ytan och tvätta MEAs 4 x med 1 mL sterilt destillerat vatten. Var noga med att inte röra vid MEA ytan under tvätt steg eftersom detta kan skada elektroderna.
- Vägledas av ett stereomikroskop inuti en LAF, centrum MEA chip och tillsätt 1 mL sterilt vatten till centralområdet av MEA.
- Placera mikroflödessystem enheten ovanpå MEA ytan.
- Noggrant justera microgrooves av mikrofabricerade enhet med mikroelektrod rutnätet av MEA.
- När korrekt justerade, aspirera försiktigt överflödigt vatten utan att röra MEA eller mikroflödessystem enheten.
- Inkubera i µEFs över natten vid 37 ° C torr och tillåta fullständig bifogad fil. För att underlätta fastsättning, tryck försiktigt mikroflödessystem enheten mot MEA.
Obs: Utföra steg 2.12 på dagen för cell sådd. - När µEFs har torkat helt, Fyll mikroflödessystem brunnarna med 150 µL 5 µg/mL laminin beläggning lösning och inkubera vid 37 ° C i minst 2 h innan cellen sådd.
Obs: När du laddar µEF med laminin lösning, se till att lösningen fyller microgrooves. Använd en att ta bort eventuella luftbubblor som kan förekomma inom microgrooves.
3. prefrontala Cortex dissektion
- Förbereda området dissektion för embryo borttagning.
- Desinficera arbetsytor och de kirurgiska instrument med 70% etanol.
Obs: Desinfektion även denna dissektion inte är ett sterilt förfarande, hjälper till att minska risken för kontaminering. - Använd en ren disponibel blöja att begränsa området dissektion och lägga ut de kirurgiska instrument för borttagning av embryo.
- Förbered 4 90 mm petriskålar fylld med kall H-HBSS och placera dem på en bricka med is nära området dissektion.
- Desinficera arbetsytor och de kirurgiska instrument med 70% etanol.
- Avliva en SW-18 tid-dräktiga Wistar råttor av koldioxid (CO2) inandning.
- Efter slutförandet av förfarandet, ta bort djuret från CO2 kammaren och bekräfta död genom en sekundär metod för dödshjälp, såsom exsanguination.
- Placera den animaliska ventral Sidan upp på disponibel blöja, spraya nedre delen av buken med 70% etanol och, med hjälp av pincett och sax, gör en U-form som skär igenom huden att exponera livmodern.
- Försiktigt bort embryon från livmodern genom att skära bort eventuella bindväv och placera dem i en av Petriskålarna med kall H-HBSS.
- Ta bort varje embryo från dess embryonala sac och, med hjälp av pincett och sax, halshugga embryot.
- Överföra embryo´s huvudet till en andra petriskål fylld med kall H-HBSS.
- Upprepa steg 3.6-3.7 för varje embryo.
- Dissekera prefrontala cortex.
- Överför en embryo´s huvud till en tredje petriskål.
- Använd ett par pincett för att exponera hjärnan.
- Ta bort hjärnan från dess hålighet och täck den med kall H-HBSS.
- I förekommande fall, ta bort och kassera luktsinnet lökarna. Dissekera prefrontala cortex och ta bort hjärnhinnorna.
- Överföra de prefrontala cortex fragment till en fjärde petriskål fylld med kall H-HBSS.
- Upprepa stegen 3.9.1 - 3.9.5 för varje embryo.
4. kortikala nervceller Dissociation och kultur på µEF
Obs: Följande procedurer utfördes inuti en LAF efter en 15 min cykel av UV sterilisering. Arbetar yta samt allt material placeras inuti huven bör tidigare desinficeras med 70% etanol.
- Som beskrivs i steg 1,5, lös den tidigare viktade trypsin i 5 mL H-HBSS och filtrera lösningen.
- Samla cortex bitar tidigare dissekeras i sammanlagt 5 mL H-HBSS. Överföra dem till en steril 15 mL koniska rör.
- Lägg till 2,3 mL nyberedd 1,5 mg/mL trypsin lösning till röret som innehåller cortex fragment.
- Blanda fjädringen och inkubera vid 37 ° C i 15 min (kort agitera varje 5 min).
- Stoppa vävnad matsmältningen och tvätta ur trypsin.
- Kassera supernatanten innehållande trypsin. Tillsätt 5 mL av H-HBSS innehållande 10% hiFBS att inaktivera de återstående trypsin; skaka försiktigt.
- Låt cortex fragment bosätta sig och sedan Kassera supernatanten.
- Tillsätt 5 mL av H-HBSS att ta bort de hiFBS resterna. Låt cortex fragment bosätta sig och kasta bort supernatanten.
- Tvätta igen cortex fragment med 5 mL H-HBSS.
- Låt cortex fragment bosätta sig och kasta bort supernatanten. Tillsätt 5 mL av kompletterade neuronala medium.
- Mekaniskt separera cortex fragment med 5 mL serologic pipett av pipettering långsamt upp och ner för 10 - 15 gånger. Om nödvändigt, upprepa proceduren med finkalibrig pipett tills cellsuspensionen blir homogen.
- Kassera återstående undissociated vävnader genom filtrering i cell suspension tråg en 40 µm cell SIL.
- Räkna viabla celler och bestämma cell densiteten.
- I ett mikrorör, tillsätt 20 µL av 0,4% (w/v) Trypan blå till en 20 µL cellsuspension. Blanda väl till Homogenatet lösningen och överföra 10 µL till en Neubauer räknar kammare.
- Räkna viabla celler och bestämma den cell densiteten av viabla celler.
- Justera cell densiteten till 3,6 x 107 celler/mL (om det behövs, Centrifugera cellsuspension).
- Omedelbart före cellen sådd, ta bort laminin beläggning från alla brunnar i µEF. Överför med pipett 50 μl av kompletterade medium till varje brunn µEF axonal facket.
- Utsäde 5 µL cellsuspension i µEF somal facket. Inkubera vid 37 ° C i 1 h, så att celler fastsättning till substratet.
- Försiktigt fylla varje väl av µEF med värmde kompletterade medium. Överföra µEF till en luftfuktare inkubator vid 37 ° C levereras med 5% CO2.
Obs: För att undvika snabb odlingsmedium avdunstning, placera en öppnade mikrorör fylld med vatten inuti petriskål bär µEF. - Upprätthålla kulturer under tid som krävs genom att ersätta 50% av odlingsmedium varje sekund till tredje dag av kultur.
Obs: Efter experiment, mikrofluidik kan tas loss från MEAs genom att sänka ner µEF i vatten över natten. Om det behövs, dra försiktigt mikrofluidik med hjälp av tången. MEAs kan rengöras genom natten inkubation med 1% (v/v) kommersiella enzymatisk tvättmedel (se Tabell för material).
5. spela in spontana Neuronal aktivitet
Obs: Embryonala kortikala neuron kulturer på MEAs uppvisar vanligtvis spontan aktivitet så snart 7 dagar in vitro-(DIV), men ta 2-3 veckor (14-21 DIV) att mogna och uppvisar stabil verksamhet. Det är upp till de experimenter bestämma när börja elektrofysiologiska mätningar baserat på syftet med studien. I detta protokoll, inspelning av neuronal aktivitet från µEF demonstreras genom att använda en kommersiell inspelningssystem (se Tabell av material för maskinvara Detaljer), med en värme modul ingår. För att utföra inspelningar, vi använde en fritt tillgänglig programvara (se Tabell av material för programvara information).
- Slå på MEA inspelning system och tempereringsaggregatet och tillåter uppvärmd bottenplattan av den förförstärkare till 37 ° C.
Obs: för långsiktiga inspelningar (> 30 min i taget) man bör också ha ett system som upprätthåller en CO2 atmosfär. - Placera µEF på förförstärkare (headstage).
Observera: Kontrollera att MEA chipet är korrekt anpassad referensnumret i det övre vänstra kant. MEA chip vi använder är rotationssymmetrisk, men denna anpassning matchar rätt orientering av pin layout elektroderna och maskinvaru-ID. - Stänger du och låser förförstärkare locket.
- För att registrera, öppna inspelningsprogrammet och definiera parametrarna inspelning och sökvägen till inspelade dataströmmar (se programvara manualen för detaljer om hur skapar en inspelning system).
Obs: Ett förvärv med en samplingsfrekvens på 20 kHz är i allmänhet tillräckligt för de flesta tillämpningar. En högre samplingsfrekvens är tillrådligt om mer precision krävs i spike timings. Om man avser att endast spela in spikar, ange ett högpassfilter på 300 Hz, vilket kommer att dämpa de lägre frekvens komponenterna av signalen. Om rå och filtrerade data registreras samtidigt, kommer detta avsevärt öka datastorleken. Det är alltid möjligt att göra offline filtrering av rådata. För att minska data kan filstorlek en också begränsa mikroelektroder som till post (t.ex. bara mikroelektroder inom microgrooves). - Klicka på Starta DAQ starta datainsamling. Kontrollera att displayen visar kör spår av aktivitet och starta inspelning.
Obs: Ljudnivån är vanligtvis något högre i de mikroelektroder som motsvarar microgrooves. Om ljudnivån är för hög (peak-to-peak amplitud > 50 µV) eller ostadig i flera mikroelektroder, kan det bero på smuts som hindrar en bra pin-pad-kontakt. Detta problem löses vanligtvis genom att försiktigt rengöra MEA kontakt kuddar och förförstärkare stiften med en bomullstopp fuktad med 70% etanol. - Öppna den inspelade filen i programvaran analys (se Tabell för material) för att snabbt utforska data.
6. dataanalys
Obs: Följande steg visar hur du använder programvaran µSpikeHunter, en computational verktyg utvecklat vid Aguiar's lab (fritt tillgänglig på e-begäran till pauloaguiar@ineb.up.pt), för att analysera data som spelats in med µEF. Ett grafiskt användargränssnitt (figur 2) används för att läsa in data, identifiera förökningsmaterial spike waves, bestämma deras riktning (anterograd eller retrograd) och uppskatta förökning hastigheter. µSpikeHunter är kompatibel med HDF5-filer som genereras från inspelningar som erhållits med MEA2100-familjens system, som kan användas i samband med 60-, 120- och 256-elektrod MEAs. De inspelningar som erhållits med den Multi-Channel försöksledaren kan lätt kan omvandlas till HDF5 filer med fritt tillgänglig programvara (se Tabell för material).
- Klicka på Bläddra och välj inspelningsfilen. Klicka på filen Info-knappen för att lista samplingsfrekvens, inspelningstid samt en lista över inspelade dataströmmar (t.ex. rå data, filtrerade data).
Obs: För sann förökning velocity anseende, det rekommenderas att välja raw dataströmmen för analys. - Välj mikroelektroder (enskild rad eller kolumn som är associerad med microgroove) för analys och ange spike upptäckt tröskelvärdet (positiv eller negativ fas) på 6 x standardavvikelsen (SD) för det signal-bruset. Klicka på Läsa Data för att tillämpa händelse detektorn och erhålla de identifiera förökning sekvenserna.
Obs: Om kriterierna är uppfyllda, en lista över upptäckta förökning sekvenser befolkar med panelen analys. Användaren kan sedan Visa och interagera med flera analysverktyg för förökning sekvensen, inklusive spänning spår, Inter mikroelektrod cross-korrelationer, singel-sekvens förökning hastigheter, en kymograph och ett verktyg för ljuduppspelning. Även om förökningen hastighet uppskattningen kan erhållas för varje par av mikroelektroder eller som ett genomsnitt av uppskattningar för alla par, är denna uppskattning mer tillförlitligt om paret längst är markerad. - Upprepa föregående steg för mikroelektrod uppsättningar av intresse. Varje gång klickar på Spara alla händelser för att spara tid och amplitud av spikar (på varje mikroelektroder) för alla identifierade förökning sekvenser till en CSV-fil.
- Importera CSV-filer till data analys miljöer för vidare analys av mönster av aktivitet av kulturen (t.ex. eldhastighet, mellan spike intervall).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av protokollet som beskrivs här, ska SW-18 rat kortikala nervceller seedade på µEF kunna utvecklas och förbli friska i dessa odlingsbetingelser för över en månad. Så snart som 3 till 5 dagar i kultur, växa kortikala nervceller sina axoner genom microgrooves mot axonal facket av µEF (figur 1). Efter 15 dagar i kultur, kortikala nervceller odlade på µEF förväntas uppvisa stadig nivåer av aktivitet och förökning av handlingspänningar längs microgrooves förväntas. Äldre kulturer (> 14 DIV) tenderar att domineras av spricker aktivitet som i konventionella MEA inspelningar18,19.
Inspelningar och dataanalys
RAW-dataanalys med µSpikeHunter (figur 2) tillåtet att upptäcka och extraktion av förökningsmaterial spike vågor längs uppsättningar av 4 mikroelektroder (inom microgrooves). Figur 3 visar en av dessa händelser. µSpikeHunter tillåtna för skattning av förökningen hastigheter, baserat på cross-korrelationerna mellan spänningsvågformer av valda parar av mikroelektroder (förutsatt att en tidsfördröjning) och associerade kända mellan elektrod avståndet.
Den extraherade data analyserades ytterligare med hjälp av anpassade utformade kod i MATLAB. En representativ raster tomt det förökningsmaterial spike vågor längs 11 (av 16) microgrooves visas i figur 4a. Den momentan eldhastighet för en hög- och ett lågaktivt microgroove visas i figur 4b.
µEF recordings uppvisar varierande grad av aktivitet per mikroelektrod. Ofta, är flera mikroelektroder i somal kupén ”tyst”. Men de flesta mikroelektroder inom microgrooves tenderar att vara aktiv (figur 5a). Det är väl beskrivet att microgrooves fungera som signal förstärkare8. Amplituden på en inspelad signalen beror inte bara på storleken på källan strömmarna, men också på resistivitet omgivande medier. Motståndet längs en microgroove är särskilt höga, vilket kraftigt ökar amplituden av de uppmätta signalerna i jämförelse med de av mikroelektroder i somal facket (Figur 5b).
Figur 1 . Embryonala råtta kortikala neuroner odlade på µEF. (a) fotografi av µEF. Skalstapeln: 1 cm. (b) representativ bild av kortikala nervceller odlade i µEF för 5 dagar, visar flera axoner korsar microgrooves och nå axonal facket (pilar). Skalstapeln: 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 . Skärmdump av µSpikeHunter främsta grafiska användargränssnittet. Användaren kan läsa in data som spelats in med µEF, identifiera förökningsmaterial spike waves, bestämma deras riktning (anterograd eller retrograd) och uppskatta förökning hastigheter. Ett kymograph verktyg tillåter användaren att manuellt beräkna förökning hastigheten baserat på en linje på kymograph. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Anterograd förökningsmaterial spike wave kände av 4 mikroelektroder (E8-E11) inom en microgrooven. Varje trace representerar en mikroelektrod råa inspelningen för 3 ms. efter analys med µSpikeHunter, cross-korrelationen mellan de bortersta mikroelektroder (E8 och E11) tillåtet vid beräkningen av en förökning hastighet av 0.52 m/s. Klicka vänligen här för att Visa en större version av denna siffra.
Figur 4 . Information störtflod igenom microgrooves. (a) representant raster tomt på 2 minuter av spontan aktivitet registreras längs 11 microgrooves. Varje prick representerar en förökningsmaterial spike wave (enhet) kände av 4 mikroelektroder och identifieras genom analys med µSpikeHunter. En hög- och ett lågaktivt microgroove markeras i gult och rött, respektive. (b) utveckling av den momentan eldhastighet (som i takt-kodning) för de två markerade microgrooves längs 10 minuter. Endast förökningsmaterial enheter ansågs för beräkning av eldhastighet. Obs aktivitet synkronisering, trots de olika bränning kurs nivåer. Den momentan eldhastighet beräknades convolving spike händelserna med en Gaussisk kärna med en standardavvikelse på 100 ms. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 . Kvaliteten på extracellulära inspelningar i µEF. (a) tidsfönster (1 sekund) en µEF inspelning (råtta kortikala nervceller på 15 dagar i vitro) med en samplingsfrekvens på 20 kHz och ett högpassfilter på 300 Hz. elektrod rader 1-7 motsvarar somal fack och rader 8-11 till microgrooves. (b) Box och morrhår tomt på hela skalan av spike amplituder extraheras (spikar upptäckt med en tröskel metod, med negativa fas endast, inställd på 6 x standardavvikelsen) från den angivna rader (total inspelningstid för 10 minuter). Spikes' amplituder är betydligt större i mikroelektroder inom microgrooves (rader 8-11, 16 microgrooves), jämfört med mikroelektroder från somal facket (rad 1-7; 16 aktiva mikroelektroder). Envägs ANOVA, Dunn's flera jämförelsetester, ***p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som presenteras här visar hur man monterar en µEF, består av en mikroflödessystem enhet och en MEA med kommersiellt tillgängliga standardutföranden, och hur man analyserar de registrerade uppgifterna.
När du utformar ett experiment, måste forskare beakta att in vitro- modellen begränsas av MEA fast rutnätet som begränsar microgroove arrangemang. Användningen av en viss mikroflödessystem eller MEA design kommer att bero på de experimentella behov men generellt samma förfarande steg bör gälla olika µEF konfigurationer.
Ett kritiskt beslut göras innan µEF församlingen är huruvida användaren avser att återanvända den sammansatta µEF i framtiden experiment. Behandling med syrgas plasma på båda ytorna kan göras för att kovalent bond mikroflödessystem enheter till MEAs20. Denna tätning ofta gör dock MEA marker oanvändbar för ytterligare experiment, som du lossar mikroflödessystem enheten irreversibelt skadar det passivering lagret. För att kringgå detta problem, tenderar forskargrupper att återanvända den monterade µEF, trots de möjliga nackdelarna (t.ex. skräp från tidigare experiment). Genom att noggrant följa stegen som beskrivs i detta protokoll, från experiment att experimentera, man kan säkert fästa och lossa mikroflödessystem enheter utan att skada MEA.
Användningen av µEF kan isolering av en uppsättning av axoner i microgrooves. Den tid som krävs för ett rimligt antal axoner att korsa microgrooves kommer att kraftigt beror på den cell som seedning förfarande, nämligen seedade cell densiteten. Med den täthet som anges i detta protokoll, nervceller använda att korsa den hela microgrooven inom 3 till 5 DIV.
Beroende på kultur miljön (dvs, inkubator och luftfuktigheten), kan det krävas att ersätta media varje 2 till 3 dagar av kultur. När du förnyar media, ta bort materialet från µEF wells bibehållen media inom de största kanalerna. Sedan försiktigt lägga till media till µEF brunnarna så att det långsamt rinna genom större kanaler innan du fyller upp brunnarna med slutliga media volym. Efter dessa rekommendationer nu vi kunna upprätthålla dessa kulturer i sunda förhållanden för minst en månad.
En viktig fördel med denna plattform är möjligheten att isolera, mäta och spåra axonal signaler. Även om µEF inspelningen är enkel, den stora mängden data som kan genereras är besvärligt att hantera och kräver goda kunskaper i analys av data. Analys programvara som används här, µSpikeHunter21, är en avancerad men ändå intuitivt computational verktyg, vilket möjliggör detaljerad kvantifiering av flera relaterade åtgärder (t.ex. förökningsmaterial händelser, förökning velocity etc.) i några steg. Men analys av data inte är i fokus för detta protokoll, tillåter informationen här redan utvinning av meningsfulla data från en µEF inspelning. Det är dock viktigt att notera att tillförlitlig isolering av en enda axon per microgroove förblir praktiskt ogenomförbart. Således mycket komplexa spike vågformer (på grund av flera axoner som passerar genom microgrooven) uppstå och påverka spike timings och förökning velocity beräkningar. Denna begränsning kan dämpas med hjälp av mycket smala microgrooves (under 5 µm)13 och/eller genom spike sortering tekniker21, som hjälper att skilja olika signalkällor.
Även om in vitro- kulturer inte kan sammanfatta full i vivo komplexitet, gör deras kombinationen med µEF välkontrollerade underifrån forskningsansatser. Vi hoppas att detta protokoll hjälper både nybörjare och skickliga MEA användare upprätta nya och tillförlitliga modeller för att studera elektrofysiologiska kommunikation i neuronala kretsar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av FEDER - Fundo Europeu de skattemyndigheten regionala fonder genom den tävla 2020 - Operacional programmet för konkurrenskraft och internationalisering (POCI), Portugal 2020, och av portugisiska medel genom FCT - Fundação para en Ciência e en Tecnologia / Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior inom ramen för projektet PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus stöddes av FCT (PD/BD/135491/2018). Paulo Aguiar stöddes av Programa Ciência - Programa Operacional Potencial Humano (POPH) - främjande av vetenskaplig sysselsättning, ESF och MCTES och program Investigador FCT, POPH och Fundo Social Europeu. Mikroflödessystem enheterna var fabricerade på INESC - Microsystems och nanoteknik, Portugal, under överinseende av João Pedro Conde och Virginia Chu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60x40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M.
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
- Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
- Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
- Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181 (2013).
- Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
- Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W.
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
- Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
- Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
- Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514 (2015).
- Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868 (2017).
- Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
- Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11 (2006).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Heiney, K., et al. μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).
