Een RVS Protocol voor hoge kwaliteit RNA isolatie van Laser vangen Microdissected Purkinje cellen in het menselijke Post Mortem Cerebellum

Summary

Dit protocol maakt gebruik van een vlek-vrije benadering om te visualiseren en te isoleren Purkinje cellen in vers bevroren weefsel van menselijke post mortem cerebellum via laser vangt microdissection. Het doel van dit protocol is het genereren van voldoende hoeveelheden van hoogwaardige RNA voor RNA-sequencing.

Abstract

Laser vangt microdissection (LCM) is een voordelig hulpmiddel waarmee voor de collectie van cytologically en/of fenotypische relevante cellen of gebieden uit heterogene weefsels. Opgenomen product kan worden gebruikt in een verscheidenheid van moleculaire methoden voor eiwitten, DNA of RNA isolatie. Behoud van RNA van menselijke postmortem hersenweefsel is echter vooral een uitdaging. Standaard visualisatietechnieken voor LCM vereisen histologische of immunohistochemische kleuring procedures die verder kunnen degraderen RNA. Dus, we ontwierpen een RVS protocol voor visualisatie in LCM met het beoogde doel van het behoud van de integriteit van het RNA in post mortem menselijk hersenweefsel. Het Purkinje-cel van het cerebellum is een goede kandidaat voor RVS visualisatie, vanwege zijn omvang en karakteristieke locatie. De cerebellaire cortex heeft duidelijke lagen die in celdichtheid verschillen, waardoor ze een goede archetype te identificeren onder hoge vergroting microscopie. Purkinje cellen zijn grote neuronen, gelegen tussen de submodule cellaag, oftewel een dichtbevolkte cellulair netwerk van kleine neuronen, en de moleculaire laag, die is schaars in cel organen. Vanwege deze architectuur is het gebruik van roestvast staal visualisatie haalbaar. Andere orgaan of cel systemen die dit fenotype na te bootsen zou ook geschikt. Het RVS protocol is ontworpen voor vers bevroren weefsel herstellen met ethanol en verwijderen van lipiden met xyleen voor verbeterde morfologische visualisatie onder de lichte microscopie van hoge vergroting. Dit protocol houdt geen rekening met andere methoden fixatie en is speciaal ontworpen voor vers bevroren weefselsteekproeven gevangen met behulp van een ultraviolet (UV)-LCM systeem. Hier presenteren we een volledige protocol voor segmenteren en tot vaststelling van vers bevroren post mortem menselijk cerebellaire weefsel en zuivering van RNA van Purkinje cellen geïsoleerd door UV-LCM, met behoud van RNA kwaliteit voor latere RNA-sequencing. In onze handen, dit protocol uitzonderlijke niveau van cellulaire visualisatie zonder de noodzaak voor kleurstoffen produceert en levert RNA met hoge RNA integriteit nummers (≥8) zo nodig voor transcriptionele profiling experimenten.

Introduction

Laser vangt microdissection (LCM) is een waardevolle onderzoeksinstrument waarmee de scheiding van pathologisch relevante cellen voor moleculair gedreven evaluatie achteraf. Het gebruik van moleculaire analyses in deze specimens van heterogene weefsel en de correlatie met pathologische en klinische gegevens is een noodzakelijke stap bij de beoordeling van de translationeel betekenis van biologisch onderzoek¹. Bij het analyseren van gen expressie gegevens uit RNA, het gebruik van bevroren weefselsecties wordt sterk aanbevolen omdat het zorgt voor uitstekende kwaliteit van RNA evenals hoeveelheid²gemaximaliseerd. Het is goed opgezet dat hoge kwaliteit en kwantiteit van RNA essentieel voor zinvolle gegevens van RNA sequencing^{3 zijn}. Wanneer met RNA uit vers bevroren post mortem weefsel voor LCM, is aantasting van het RNA echter een grote uitdaging, aangezien het vindt onmiddellijk plaats bij overlijden en de omvang ervan is bemiddeld door verschillende factoren die samenhangen met het weefsel collectie methode^4,5 . Bovendien is de aantasting van het RNA verergerd wanneer kleuring technieken nodig zijn om te herkennen van de histologische details en identificatie van de cel. Gespecialiseerd kleuring technieken, zoals de haematoxyline en eosine, Nissl vlek, immunofluorescentie en immunohistochemistry zijn behulpzaam bij het differentiëren van cellen van omliggende stroma maar hebben aangetoond dat degraderen van RNA en transcript expressie wijzigen profielen⁶. Ons laboratorium heeft daarom een RVS protocol specifiek ontworpen om te bewaren van RNA in post mortem menselijk cerebellum voor de toepassing van RNA sequencing na LCM Purkinje neuronen Isolatievan gemaakt.

Bij de verwerking van vers bevroren weefsel voor LCM, kan de methode fixatie variabel beïnvloeden zowel RNA en weefsel integriteit. Formaline fixatie is standaard voor morfologische behoud, maar oorzaken die dwarsbinding kunnen fragment van RNA en interfereren met RNA amplificatie⁷. Ethanol fixatie is een beter alternatief voor RNA isolatie, want het is een coagulative fixatief die niet toe cross-linking^{1 brengt er}. Ter verhoging van de visualisatie van weefsel morfologie, is xyleen de beste keuze, zoals het lipiden uit het weefsel verwijdert. Echter, er zijn bekende beperkingen wanneer met behulp van xyleen in LCM, zoals de weefsels kunnen uitdrogen en broos waardoor weefsel fragmentatie op laser vastleggen⁷geworden. Xyleen is ook een vluchtige toxine en correct moet worden behandeld in een zuurkast. Xyleen heeft echter aangetoond dat weefsel visualisatie ook behoud van RNA integriteit⁸verbeteren. Daarom is ons protocol gecentreerd rond het gebruik van 70% ethanol fixatie en ethanol uitdroging, gevolgd door xyleen broedtijd morfologische duidelijkheid.

Het is belangrijk op te merken van de verschillende soorten microdissection laser gebaseerde systemen, zoals ze verschillen in snelheid, precisie en kwaliteit van RNA is gebleken. De infrarood (IR) laser vastleggen van microdissection en het ultraviolette (UV) microbeam microdissection lasersystemen waren beide roman LCM-platforms die ontstaan bijna gelijktijdig⁸. De IR-LCM-systeem maakt gebruik van een "contact systeem" met behulp van een transparante kunststof film rechtstreeks op de weefselsectie geplaatst, en cellen van belang zich selectief aan de film door gerichte pulsen van een IR-laser. U kunt ook is de UV-LCM-systeem een "contactloze systeem" waarbij een gerichte laserstraal weg de cellen of de regio's van belang in het weefsel snijdt; afhankelijk van de configuratie in twee momenteel beschikbare commerciële platforms die gebruik maken van ofwel een omgekeerde of rechtop Microscoop ontwerp, weefsel is verworven in een collectie apparaat door een laser-geïnduceerde druk golf die het tegen de zwaartekracht katapulten of weefsel is verzameld door de zwaartekracht, respectievelijk. Belangrijke voordelen van het UV-LCM-systeem zijn snellere cel acquisitie, verontreiniging-gratis-collectie met de contactloze aanpak en nauwkeuriger dissectie als gevolg van een veel kleinere laser beam diameter⁹. Dit protocol werd speciaal ontworpen voor een UV-LCM-systeem en is niet getest in een IR-LCM-systeem. In het ontwerp van het systeem van beide UV-LCM, wanneer accumuleren cellen in het GLB van de verzameling, het gebruik van een dekglaasje aan die verbetert de is cellulaire duidelijkheid tijdens microscopie niet geschikt, zoals de cellen zou kunnen aangaan van het GLB van de collectie. Daarom, om weefsel visualisatie te verbeteren, we testten het gebruik voor dekkende verzameling caps, die zijn ontworpen om te fungeren als een dekglaasje aan voor microscopische visualisatie in UV-LCM systemen, tegen vloeistof gevulde collectie caps. Vloeistof gevulde collectie caps kunnen lastig zijn, als de vloeistof onderworpen aan verdamping is en moet regelmatig worden vervangen terwijl het werken bij en met de Microscoop. Tijd wordt een belangrijke factor voor de stabiliteit van het RNA, zoals het vastgelegde weefsel onmiddellijk^{7 lost}.

Ons laboratorium studies de postmortem neuropathologic veranderingen in het cerebellum van patiënten met essentiële tremor (ET) en verwante neurodegeneratieve aandoeningen van het cerebellum. We hebben bewezen morfologische veranderingen gecentreerd op Purkinje-cellen die het onderscheiden van ET gevallen ten opzichte van de besturingselementen, met inbegrip van een verminderd aantal Purkinje cellen, verhoogd dendritische regressie en een verscheidenheid van axonale veranderingen, leidt ons om te postuleren dat Purkinje cel degeneratie is een biologische functie van de kern in ET pathogenese^10,11,12,13. Transcriptionele profilering is gebruikt in vele neurologische ziekten te verkennen van de onderliggende moleculaire basis van degeneratieve cellulaire veranderingen. Echter transcriptionele profielen uit heterogene monsters, zoals weefsel hersengebieden, kunnen effectually maskeren de uitdrukking van lage overvloed transcripten en/of verminderen de detectie van moleculaire veranderingen die alleen in een kleine populatie van waarin dit probleem optreedt optreden cellen, zoals Purkinje cellen in de cerebellaire cortex. Bijvoorbeeld, Purkinje cellen zijn enorm in de minderheid door de overvloedige submodule cellen in de cerebellaire cortex door ongeveer 1:3000; dus effectief richten vereist hun transcriptome specifieke isolatie van deze neuronen. De cerebellaire cortex is afgebakend door verschillende lagen die in de celdichtheid en celgrootte verschillen. Deze cellulaire architectuur is ideaal om te visualiseren in een monster van de vers bevroren weefsel zonder kleurstof bevattende kleuring reagentia. In theorie kan dit protocol ook worden toegepast op andere weefseltypes (HLA) die soortgelijke onderscheidend weefsel hebben organisatie.

Dit protocol werd ontworpen om werk speciaal voor Purkinje cel visualisatie in het cerebellum van menselijke post-mortem. Er zijn talrijke protocollen voor de fixatie, visualisatie en RNA behoud van vele soorten weefsels ten behoeve van zowel IR - en UV-LCM kleuring. Wanneer overweegt een proefopzet voor UV-LCM, moeten individuen hun protocol om het beste passen bij de behoeften en eisen van de begin- en einddatum van de materialen op maat. Hier combineren we vele aspecten van verschillende LCM protocollen om te zorgen voor een verbeterde methode voor het visualiseren van Purkinje cellen in het post mortem menselijk cerebellum zonder de noodzaak van kleurstof bevattende kleuring reagentia voor te bereiden op kwalitatief hoogwaardige RNA transcriptome sequencing.

Protocol

Alle menselijke specimens die in dit protocol wordt gebruikt met geïnformeerde toestemming hebben verkregen en zijn goedgekeurd door de interne Review Board (IRB) aan Columbia University en aan Yale University.

Opmerking: Het geheel van dit protocol moet volgen strikte RNA behandeling richtlijnen, waarbij een gehandschoende hand altijd wordt gebruikt, alle oppervlakken worden gereinigd met een RNase waterbasis en alle werken materialen RNA/DNA/Nuclease gratis zijn.

1. test RNA integriteit van weefsel voorafgaand aan het starten van LCM

Opmerking: Testen van RNA kwaliteit kunnen worden gedaan op vele manieren. Zorgen ervoor dat RNA van de gehele sectie is getest om een representatieve RNA integriteit nummer (RIN) voor het monster.

1. Selecteer zorgvuldig weefselmonsters voor opneming die binnen de parameter van de proefopzet past. Als snijden op de cryostaat, verplaatst naar stap 1.2. Als dat niet het geval is, het weefsel dienovereenkomstig te verwerken en verplaats naar stap 1.11.
2. Krijgen twee containers van droogijs. De grootte zal afhangen van het aantal monsters.
   1. De eerste container van droogijs, plaats een lege, gelabelde 2 mL-buis met de code van de weefsels.
      Opmerking: Het duurt 10 min voor de buizen te bevriezen. Buizen moeten worden bevroren, voorafgaand aan het plaatsen van het weefsel in hen; anders zal het weefsel op het oppervlak van de buis smelten.
   2. Een tweede container van droogijs, plaats in het weefsel van een vriezer-80 ° C waarvoor RNA selectievakje.
3. Reinig de cryostaat. Zie stap 4.7 voor gedetailleerde reinigingsprocedure.
4. Verwijder van het weefsel van droogijs en snijd een stukje weefsel met een scheermesje RNase ontsmet. Weefsel moet ongeveer 1 cm x 1 cm groot.
5. Een ongeveer 3 mm hoge heuvel van optimale scherpe temperatuur (OCT) samengestelde plaats op een cryostaat 'chuck' en laat het gedeeltelijk bevriezen. Dan, plaats het weefsel op de top van de LGO — niet duwen in OCT, gewoon laten rusten op de top.
6. Zodra OCT verhardt, plaats u de chuck met het gekoppelde weefsel in de cryostaat snijden arm en de houding tegenover de cryostaat blade.
7. Trim op 30 μm secties totdat het weefsel zelfs is.
8. Snij 300 μm van het weefsel en de plaats in een bevroren 2 mL-buis. Plaats de buis terug in droog ijs.
9. Verwijder het weefsel uit de 'chuck' en plaats terug in droog ijs tot klaar om weg te zetten.
10. Herhaal stap 1.4 – 1,9 voor alle weefsels.
11. Als alle monsters voltooid zijn, pak RNA met behulp van het RNA extractie kit geleverd (Tabel of Materials #15). Een gedetailleerd protocol is voorzien van het RNA extractie kit. Volg alle instructies met inbegrip van de optionele stap om te drogen de collectie buis membraan en de optionele stap voor DNase spijsvertering (Tabel of Materials #16).
12. Test de integriteit van uitgepakte RNA via een kwaliteit beoordeling bioanalyzer¹⁴.

2. voorbereiden vóór het starten afdelen LCM

1. Reinig de houders van de dia's vóór elke ronde van het weefsel segmenteren voor LCM. De schoonmaak procedure uitvoeren de dag vóór gebruik om volledige 's nachts drogen.
   Opmerking: dia houders worden gebruikt voor weefsel sectie fixatie in ethanol en clearing in xyleen.
   1. Dia houder reinigingsprocedure: spoel met RNase waterbasis gevolgd door diethyl pyrocarbonate behandeld (DEPC) water. Laat droog 's nachts ondersteboven op een vrij oppervlak van RNA/DNA/Nuclease, stof of andere lucht besmetting te voorkomen.
      Let op: DEPC is zeer giftig en moeten worden behandeld en verwijderd met behulp van EH & S standaard gevaarlijke chemische stoffen-protocol.
2. Schoon de borstels voor afdelen met RNase decontaminator en laat droog 's nachts. Vermijd stof en andere verontreinigingen.
3. Plaats het membraan glijdt onder UV-licht gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Doen niet bloot die de dia's UV-meer dan 1-2 dagen voorafgaand aan gebruik. Dit vergroot de binding van het weefsel aan de dia membraan.
   Opmerking: Stap 2.3 kan worden gecombineerd met stap 4, die het mogelijk voor dia UV behandeling maakt plaatsvinden op dezelfde dag als weefsel vectorafbeeldingsbestanden (zie stap 4.4).

3. fixatie oplossingen met RNase gratis Water en kwalitatief hoogwaardige Ethanol te bereiden

Opmerking: Alle oplossingen zijn voor elk experiment vers bereid. Te waarborgen dat de dia houder, schoonmaak procedure vanaf stap 1.1 is voltooid. Alle oplossingen zijn bereid in dia houders.

1. 30 mL ethanol 100% in één dia houder plaatsen.
2. Verdunde ethanol met RNase/DNase/Nuclease gratis water. Plaats 30 mL 95% ethanol in een dia houder en zet op ijs.
3. Verdunde ethanol met RNase/DNase/Nuclease gratis water. Plaats 30 mL 70% ethanol in een dia houder en zet op ijs.
4. Plaats 30 mL 100% xyleen in twee afzonderlijke dia houders en label hen als #1 en #2.

4. voorbereiding van de cryostaat voor weefsel segmenteren

1. Krijg een emmer ijs voor ethanol oplossingen en een container met droogijs voor het weefsel.
   Let op: Droogijs is extreem koude, dus het gebruik van beschermende handschoenen. Zet geen ijs en droog ijs in dezelfde container. Verschillende temperaturen in het ijs en droog ijs zullen ze aan formulier samen op een onbepaalde temperatuur.
2. Verwijder het weefsel uit de diepvries-80 ° C en de plaats op droog ijs voor vervoer naar de cryostaat.
3. Cryostaat instellingen:
   1. Stel in de sectie dikte op 14 μm.
   2. Stel de trim dikte op 30 μm voor het behoud van de hoeveelheid weefsel.
   3. Voor cryostaten met dubbele kamer en specimen temperaturen te houden, stelt u de kamer temperatuur (CT) op-18 ° C. Voor cryostaten met één instelling, de temperatuur instellen tot-17 ° C.
   4. Voor cryostaten met dubbele kamer en model houden van de temperatuur, Steldetemperatuur object (OT) tot-16 ° C.
      Opmerking: Het OT moet worden warmer dan de CT om ervoor te zorgen zelfs snijden. Als het weefsel is nog steeds het verscheuren, de OT kan worden verhoogd tot-15 ° C en de CT kan worden verhoogd tot-18 ° C.
4. Plaats het weefsel in de cryostaat voor ten minste 20 min. te staan om te komen tot de optimale temperatuur.
   Opmerking: Als het weefsel niet op optimale temperatuur, zal het versnipperen op snijden. Plaats niet het weefsel op-20 ° C de avond tevoren om RNA integriteit te behouden en ijs kristal vorming te voorkomen. Toestaan van het weefsel zo veel tijd als dit nodig is om equilibreer om optimale temperatuur te snijden soepel. Facultatieve uitvoering van dia incubatie onder UV-licht kan hier optreden (zie stap 1.3).
5. Plaats de 'chuck' in de cryostaat gedurende ten minste 20 minuten om naar beneden te komen tot de temperatuur van de cryostaat.
6. Plaats de schone borstels in de cryostaat gedurende ten minste 20 minuten om naar beneden te komen tot de temperatuur van de cryostaat.
7. Reinigen van de cryostaat
   1. Reinig het podium met een 1:1-mengsel van RNase waterbasis en 70% ethanol verdund met RNA/DNA/Nuclease gratis water ter voorkoming van bevriezing op het podium.
   2. Schoon een nieuw wegwerp cryostaat mes met RNase waterbasis en plaats in de meshouder in het werkgebied. Ten minste 20 min. van het mes van de cryostaat om te komen tot de temperatuur van de cryostaat toestaan.
   3. Reinigen van de anti-roll plaat met RNase waterbasis en hechten aan het werkgebied. Minstens 20 min voor de anti-roll plaat om te komen tot de temperatuur van de cryostaat toestaan.
      Opmerking: Een anti-roll plaat is niet vereist voor snijden maar is ten zeerste aangeraden. Als een anti-roll plaat niet beschikbaar is, werkt een schoongemaakte borstel als alternatief. Als de anti-roll plaat niet op de juiste temperatuur is, zal het weefsel smelten of stok op snijden.

5. het segmenteren van weefsel

1. Snij een klein stukje van het weefsel (~ 1 x 1 cm) voor het segmenteren. Het resterende weefsel naar droogijs /-80 ° C vriezer retourneren
   Opmerking: Zorg ervoor dat de weefselsectie ~ 95% cerebellaire cortex, waar hij cellen zich bevinden.
2. Plaats een ongeveer 3 mm hoge heuvel van LGO ter dekking van de 'chuck'. Start door het bouwen van de lagen op de top in een langzame, cirkelvormige beweging, totdat er een kleine heuvel.
3. Zodra OCT is gedeeltelijk bevroren, maar er nog wat vloeistof in het midden is, plaats het weefsel op de top van OCT. Duw geen het weefsel diep in oktober toestaan het weefsel te zitten op de top van OCT tot volledig bevroren. Dit duurt 1-2 min.
4. Plaats de 'chuck' met bevroren LGO en het weefsel in de arm van de cryostaat snijden. Pas het weefsel zo het spoelen met maaimes.
5. Het toestaan van het weefsel te zitten in de arm snijden gedurende 15-20 minuten aan te passen aan de nieuwe temperatuur.
   Opmerking: Afhankelijk van de dikte van het weefsel, is tijd nodig voor temperatuur acclimatisering. Het toestaan van het weefsel zo lang als nodig is om te snijden netjes zitten. OT en CT om te helpen met weefsel temperatuur acclimatisering aanpassen.
6. Langzaam het weefsel dichter naar de blade. Zodra het weefsel het blad bereikt, kunt u de trim starten. Trim dikte moet worden ingesteld op 30 μm.
7. Trim 2 – 3 x totdat de vezellaag lagen zichtbaar zijn.
8. Plaatsen en uitlijnen van de anti-roll plaat net boven het blad van de cryostaat.
   Opmerking: Een zilveren lijn zal verschijnen van het licht in de cryostaat op het raakvlak van het mes en de anti-roll plaat. Dit geeft aan dat de anti-roll plaat is direct boven de rand van het blad.
9. Begin met het knippen van de secties op 14 μm. Goed gesneden secties zullen vlak onder de plaat van de anti-roll.
   Opmerking: Als het weefsel vastzit, ervoor zorgen dat de anti-roll plaat koud genoeg is. Indien nodig, het plaatsen van een stuk van droog ijs op de buiten (kant niet aanraken van het werkgebied) wil snel koelen de anti-roll-plaat.
10. Knip 4 – 6 secties en ze horizontaal over de cryostaat werkgebied uitlijnen.
11. Vissen van de dia, pick-up alle stukken van het weefsel op een bepaald moment.
    Opmerking: Met behulp van de borstels, til de uiteinden van het weefsel voor de dia op pick-up gemakkelijker beschikbaar te zijn. Niet halen één sectie tegelijk. Blootstelling aan kamertemperatuur lucht zal degraderen RNA integriteit.
    Let op: Laat niet het aanraken van de fase van de cryostaat membraan. Als het membraan het podium raakt, het zal beginnen met het loskoppelen van het glasplaatje en zal leiden tot fouten wanneer u probeert de LCM.
12. Onmiddellijk naar stap 6 gaan. De fixatie niet vertragen.

6. vaststelling van weefsel/vlek-minder visualisatie

1. Onmiddellijk bewegen bij het protocol van de fixatie ethanol
2. Plaats van de dia in de dia houder met 70% ethanol voor 2 min — op ijs.
3. Plaats van de dia in de dia houder met 95% ethanol voor 45 s — op ijs.
4. Plaats van de dia in de dia houder met 100% ethanol voor 2 min — op RT.
5. Dompel de dia 3 keer in de dia houder met xyleen 1 — op RT.
6. Plaats van de dia in de dia houder met xyleen 2 voor 5 min — op RT.
7. Laten drogen in een schone omgeving voor ten minste 30 min. langere droge tijden kiezen: optimal, omhoog naar 60 min zijn.
   Let op: Dia's voor het drogen in een zuurkast opkomen. Xyleen is vluchtig. Legdatum dia's plat zal veroorzaken xyleen pool in de weefselsectie, waardoor weefsel te zijn te donker.

7. optioneel — Dia-opslag

1. Plaats gedroogde dia's in afzonderlijke 50 mL tubes (één dia per buis) en plaats in de vriezer-80 ° C voor maximaal 7 dagen.
   Opmerking: Dia's moet droog zijn voordat het plaatsen in de vriezer-80 ° C zijn. Gebruik geen droogmiddel in de buis als deeltjes in het weefsel en membraan insluiten zal. Zorgen dat het GLB buis krap is; Als dat niet het geval is, condensatie op de dia treedt bij ontdooien voor gebruik.
   Let op: RNA integrity vermindert na 7 dagen, evenals de kwaliteit van weefsel visualisatie.

8. ontdooien opgeslagen dia's voor gebruik

1. Verwijder de buis met een enkele dia uit de diepvries-80 ° C 1 uur voorafgaand aan het beoogde gebruik.
2. Niet onmiddellijk openen de buis. Het toestaan van de buis om te komen tot kamertemperatuur. Condensatie zal aan de buitenkant van de buis alleen optreden.
3. Zodra de buis is gekomen tot kamertemperatuur en alle condensatie is gegaan (ongeveer 30-40 min), verwijder de dop en bloot de dia aan de kamertemperatuur lucht.
4. Laat de dia om te acclimatiseren op kamertemperatuur voor 15-20 min. laat de dia binnen de buis met het GLB verwijderd.
   Opmerking: Dia is nu klaar voor LCM.

9. de laser vangt Microdissection Purkinje cellen:

Opmerking: Dit gedeelte van het protocol zal alleen bijzonderheden aan het vastleggen van Purkinje cellen voor latere RNA sequencing gerelateerde bespreken. In dit gedeelte wordt ervan uitgegaan dat de gebruiker bekend bent met de UV-laser capture-Microscoop en de gelieerde software.

1. Schoon het stadium van de Microscoop en de GLB-collectie arm met RNase waterbasis.
2. Met gehandschoende handen, de dia op de Microscoop en 500 μL ondoorzichtige cap in de collectie arm te plaatsen.
   Opmerking: Altijd juiste RNA techniek zorgen door het reinigen van het werkgebied met RNase waterbasis en gebruik gehandschoende handen terwijl het aanraken van de dia of ondoorzichtig GLB. Handschoenen kunnen worden verwijderd zodra de dia en het GLB ingevoerd worden en laser opname is begonnen.
3. Uitlijnen op lage vergroting, het ondoorzichtige GLB over de cerebellaire weefsel, ervoor te zorgen dat het GLB betrekking heeft op het hele gebied in het oog stuk gevisualiseerd.
   Opmerking: Alleen het oog stuk van de Microscoop zal tonen als het ondoorzichtige GLB is gecentreerd. De camera wordt niet weergegeven als het GLB is gecentreerd over het weefsel. Afhankelijk van de laser vangt toepassingsgebied ontwerp zullen de visualisatie via het ondoorzichtige GLB ofwel in het oog stuk enige of gevisualiseerde in zowel het oog stuk en de camera.
4. Visualiseer de cerebellaire lagen met 5 x - 10 x objectief en plaats de cursor boven de sectie waar moleculaire laag en submodule cellaag elkaar snijden (het Purkinje cellaag).
5. Ga naar 40 X en visualiseren Purkinje cellen.
   Opmerking: Zie Figuur 1 en Figuur 2 voor voorbeeld visualisaties.
6. Begin vastleggen Purkinje cellen.
   Opmerking: Voor het uitvoeren van RNA-sequencing, ten minste 5 ng van RNA is vereist. Ongeveer 1600-2000 Purkinje cellen resulteren in genoeg RNA-materiaal voor het rangschikken. RNA zullen stabiel gedurende maximaal 8 uur op de Microscoop. Test UV energie en UV focus vóór verzamelen om niveaus kloppen. Na verloop van tijd het weefsel blijft uitdrogen en de UV energie en UV focus moet mogelijk worden verwisseld.

10. RNA collectie post LCM

1. Voorbereiden van de lysis van de cel buffer (bereiden verse telkens)
   1. 2-mercaptoethanol in lysis-buffermengsel op 1:100 te verdunnen (10 mL van de μL:1, respectievelijk). Lysisbuffermengsel (RLT) is beschikbaar in de Tabel van materialen (#14 en #15).
2. Voeg 50 μl van lysis van de cel buffer het ondoorzichtige GLB, met het GLB naar boven. Sluit de buis zorgvuldig over het GLB.
3. Laat de buis ondersteboven voor 1 min.
4. Vortex de buis voor 30 s en snel draaien de lysis-buffermengsel naar de onderkant van de buis.
5. De buis opnieuw en herhaal stap 10.2-10.4.
6. Plaats de buis met 100 μl van lysis-buffermengsel en RNA uit de diepvries-80 ° C, totdat alle monsters afgewerkt en klaar voor RNA extractie (Tabel of Materials #14 zijn).

Representative Results

Dit protocol detailleert de stappen voor het voorbereiden van vers bevroren post mortem menselijk hersenweefsel voor UV-LCM. Grondig specificaties en aantekeningen worden gegeven voor het snijden van de cryostaat, als het kan moeilijk zijn om te snijden vers bevroren hersenweefsel met een hoge mate van precisie. Het belangrijkste punt om te overwegen is dat vers bevroren weefsel extreem koude is en vereist een aanzienlijke hoeveelheid tijd om te acclimatiseren aan de warmere temperatuur van een cryostaat. Deze stap kan niet worden gehaast, en het kan niet overschatten hoe centraal deze stap is in het succes of de mislukking van dit protocol. Als het weefsel is niet goed voorbereid op de cryostaat, zullen alle daaropvolgende pogingen tot het identificeren van cellen of gebieden van belang zeer moeilijk, zo niet onmogelijk zijn.

Na de cryostaat segmenteren en drogen spreektijd is het weefsel klaar voor de LCM. Bij het visualiseren van het weefsel onder de Microscoop, zijn de cellulaire lagen van het cerebellum gemakkelijk zichtbaar met 5 X en 10 X objectieven. Figuur 1 toont representatieve beelden van weefsel in ethanol alleen (Figuur 1A) en weefsel opgelost geïncubeerd in xyleen aanleiding van ethanol fixatie (Figuur 1B). Wij aan strenge tests onderworpen ethanol en xyleen incubatie meermaals / temperaturen op de mogelijkheid om beide te bevestigen en visualiseren van het weefsel. Als het weefsel is niet lang genoeg in xyleen geïncubeerd, de resulterende afbeelding zal nauwer lijken op Figuur 1A, in plaats van Figuur 1B. Xyleen incubatie oorzaken het weefsel te worden donkerder en betere bakent cellulaire lagen dan doet ethanol alleen. Wanneer het snijden op de laser vangt Microscoop, is de 40 X-objectief nodig om te vangen alleen Purkinje cellen, en niet het omringende weefsel. Incubation in xyleen produceert een hoge kwaliteit, morfologisch intact beeld (Figuur 1D) vergeleken met ethanol fixatie alleen (Figuur 1C).

Om de visualisatie van onze weefsel verder te verbeteren, testten we het dekglaasje aan vermogen van een ondoorzichtig cap. Andere UV-LCM protocollen maken gebruik van een vloeistof gevulde cap van 200-500 μL buis van Eustachius het weefsel op contact lost. Vloeistof gevulde caps kunnen verminderen weefsel visualization, waardoor het resulterende beeld korrelig en iriserende onder de Microscoop(Figuur 2). De visualisatie van het weefsel door de ondoorzichtige GLB (Figuur 2B) resultaten in een weefsel egaliseren verschijning die is zachter en scherper in vorm. Met name voorziet het ondoorzichtige GLB collectie tot 8 h zonder naar de nood voor vervanging. Representatieve beelden van verwijderde Purkinje cellen op laag vermogen (Figuur 2C) en op hoog vermogen (Figuur 2D, E) tonen precieze verwijdering van alleen het Purkinje cel lichaam. Ter vergelijking, Figuur 2F toont een Luxol snel blauw / haematoxyline en eosine (LH & E) gekleurd cerebellaire cortex, waarin specifiek wordt gewezen op de verschillende lagen van het cerebellum en de plaatsing van het Purkinje-cellen bij de moleculaire laag en submodule cel laag nevenschikking.

Het doel van dit protocol is te verkrijgen van hoge kwaliteit RNA voor latere RNA sequencing. We testten onze protocol betreffende zes verschillende post-mortem menselijk hersenen monsters, die elk drie dagen van LCM voor het verzamelen van 1500-2000 cellen voor RNA extractie onderging. Ongeveer 6 – 8 h bij de Microscoop geproduceerd 500-700 cellen, die vervolgens werden gecombineerd met de vorige dagen LCM producten vóór RNA extractie. Monsters onderging RNA extractie en geresuspendeerde waren in 14 μL van RNAse-gratis water (Tabel of Materials #14). Alle zes monsters geproduceerd RNA van hoge kwaliteit, met RNA integriteit nummers (RINs) ≥8 (Figuur 3A-F). Deze procedure resulteerde in RNA hoeveelheden van 11,5 ng (Figuur 3A), 8.3 ng (Figuur 3B), 13,6 ng (Figuur 3C), 11,5 ng (Figuur 3D), 14,9 ng (Figuur 3E) en 26,9 ng (Figuur 3F). Van belang is dat alle post mortem menselijk hersenen monsters werden getest voor RNA kwaliteit vóór LCM (tabel 1). Als het monster van oorsprong de aantasting van het RNA heeft, zal LCM alleen maar verder degraderen zijn integriteit.

Figuur 1 : Cerebellaire lagen en Purkinje cel visualisatie met en zonder behandeling van xyleen. Representatieve beelden met en zonder xyleen aanleiding van ethanol fixatie en uitdroging. De moleculaire laag (ML) en de submodule cellaag (GCL) worden aangeduid. Purkinje cellen zijn gemarkeerd met pijlen. (A) 5 X vertegenwoordiging van cerebellaire laag visualisatie zonder xyleen. Schaal bar: 10 µm. (B) 5 X vertegenwoordiging van cerebellaire laag visualisatie met xyleen. Schaal bar: 10 µm. (C) 40 X vertegenwoordiging van cerebellaire laag visualisatie zonder xyleen. Schaal bar: 1 µm. (D) 40 X vertegenwoordiging van cerebellaire laag visualisatie met xyleen. Schaal bar: 1 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Purkinje cel Visualization vóór en na de LCM. Representatieve beelden op 40 X met xyleen aanleiding van ethanol fixatie en uitdroging. De ML en GCL worden aangeduid. Purkinje cellen zijn gemarkeerd met pijlen. (A) visualisatie op de Microscoop onder vloeistof gevuld GLB op 40 x. Schaal bar: 1 µm. (B) visualisatie op de Microscoop onder dekkende verzameling van het GLB op 40 X. Schaal bar: 1 µm. (C) 5 X visualisatie van de cerebellaire cortex tonen de verwijderde Purkinje-cellen tussen de ML en GCL. Schaal bar: 10 µm. (D) 40 X visualisatie van een cel Purkinje vóór excisie. Schaal bar: 1 µm. (E) 40 X visualisatie van succesvolle Purkinje cel vastleggen. Schaal bar: 1 µm. (F) 20 X vertegenwoordiger LH & E gekleurd cerebellum weergegeven: Purkinje cel organen met gemarkeerde pijlen. Schaal bar: 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : RNA kwaliteitscontrole Bioanalyzer resultaten van LCM monsters. Panelen A-F Toon representatieve RNA kwaliteitscontrole uitlezingen. Elk paneel is een verschillende steekproef die onderging hetzelfde LCM proces van bevestiging en visualisatie met ethanol en xyleen alleen. RNA integrity nummers (RINs) zijn alle > 8.0. Representatieve concentraties [] resultaat in een rendement van ten minste 5 ng van totale RNA. Alle monsters zijn geëlueerd in 14 µL van RNAse-gratis water. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Monster	RIN - sectie Prep	RIN - KGV	[RNA] - KGV	PMI-bevroren
A	9.2	8.6	822 pg/µL	450 min
B	9.8	8	598 pg/µL	550 min
C	9.1	8.5	976 pg/µL	455 min
D	9.8	8.2	823 pg/µL	463 min
E	9.8	9.1	1069 pg/µL	1139 min
F	9.6	8.3	1923 pg/µL	1080 min

Tabel 1: Samenvatting van RNA integriteit . Monster getallen komen overeen met de resultaten van de bioanalyzer gepresenteerd in Figuur 3. Sectie preparaten worden uitgevoerd voordat de LCM om ervoor te zorgen dat vanaf weefsel van goede kwaliteit is. Weergegeven zijn het oorspronkelijke weefsel RINs uit sectie preps, LCM RINs en concentratie van RNA van LCM, evenals het post mortem-intervallen om bevroren (PMI-bevroren) voor de weefsels.

Discussion

Het protocol hier gepresenteerd is speciaal aangepast om een RVS aanpak in het visualiseren van morfologisch verschillende weefsels voor UV-LCM. Deze methode is ontworpen om te maximaliseren RNA integriteit voor latere directe RNA sequencing, met behoud van een hoger beveiligingsniveau van weefsel visualisatie. Het vermogen om te onderscheiden van de verschillende soorten cellen voor het vastleggen, maken de zuiverste bevolking van cellen mogelijk, is van essentieel belang voor het begrijpen van de verschillende Moleculaire profielen in menselijke weefsels¹⁵. In het kader van dit protocol, weefsel selectie staat voorop, als het gebruik van antigeen of kleurstof specifieke reagentia worden niet gebruikt en is daarom niet geschikt voor studies waarvoor dergelijke differentiatie. Terwijl dit een beperking van dit protocol is, de resulterende weefsel visualisatie en RNA integriteit zijn heel superieur en onderhouden van nut kunnen zijn bij andere experimentele designs. Er zijn vele andere protocollen die ook gebruik maken van alternatieve kleuring methoden specifiek voor UV - en IR-LCM met de bedoeling van behoud RNA. Echter, de meeste andere methoden bevatten ten minste één kleuring of antigeen specifieke reagens^6,16,17, zijn ontworpen om een cel of orgaan type (die geen menselijke autopsie weefsel)^{18,19, 20}, of vereisen gespecialiseerde RNA-seq kits aan het verbeteren van de integriteit²¹. Cresyl violet (Nissl) kleuring is een populaire kleurstof bevattende reagens gebruikt in vele protocollen, zoals het vlekken kernen in neuronen in de hersenen en de minste hoeveelheid RNA afbraak^{6 veroorzaakt}. De grotere kern van de cel Purkinje is echter niet goed gekleurd door cresyl violet, geen aanzienlijk voordeel bieden voor het visualiseren van Purkinje cellen. Nog belangrijker is, vastgesteld wij slechts één LCM studie in de literatuur die de collectie van menselijke Purkinje-cellen, die van aanzienlijk belang voor de studie van cerebellaire degeneratieve en ontwikkelings-stoornissen beschreven. Deze studie bevroren weefsels met cresyl violet gekleurd en geïsoleerd Purkinje cellen met een IR-LCM-systeem; proef RINs zo laag als 5 werden gebruikt maar voor microarray analyse²²aanvaardbaar geacht. Daarom is dit de eerste protocol-studie, die speciaal voor kwalitatief hoogwaardige RNA van Purkinje cellen in het post mortem menselijk cerebellum weggesneden via UV-LCM ontworpen is.

De stabiliteit van RNA in post mortem menselijk weefsel is een bekende hindernis, zoals RNA moleculen binnen de cellen heel natuurlijk verval na dood gelden. Specifiek, is mRNA aangetoond dat het meest gevoelig zijn voor nucleolytic afbraak⁵. Controle van het postmortem-interval (PMI) is tijd om te bevriezen (PMI-bevroren) een metrische dat heeft aangetoond enkele correlatie met de aantasting van het RNA in sommige studies^23,24,25. Tabel 1 toont echter onze PMI-bevroren intervallen voor de zes monsters afgebeeld in Figuur 3, waarin geen relatieve correlatie met PMI waarden en RNA kwaliteit. Daarom is het noodzakelijk om te voeren zorgvuldigheid bij het controleren van RNA integriteit vóór het starten van een laser vastleggen-project. Als de RNA-integriteit van het eerste monster van lage kwaliteit is, zullen de daaruit voortvloeiende RNA van een product van de LCM van nog lagere kwaliteit. Wanneer lage RNA integriteit kan niet worden vermeden, kunnen andere methoden voor verbetering RNA voor het rangschikken worden gebruikt naast dit protocol²¹. Met name kan lage-input of aangetaste RNA leiden tot gedempte complexiteit en suboptimaal resultaten die vaak extra versterking stappen noodzakelijk maken. De toevoeging van PCR cycli voor versterking is aangetoond dat sequenties ongelijk versterken, evenals het Lees dupliceren op^26,27te rangschikken. Daarom is gebruik van kwalitatief hoogwaardige RNA van LCM monsters voor het rangschikken zeer voordelig.

De methode van de visualisatie dienst in dit protocol sterk afhankelijk is van de gebruiker de expertise wanneer het snijden van vers bevroren weefsel op een cryostaat. Het protocol gaat in uitgebreide informatie over het best voorbereiden op het weefsel afdelen en het weefsel op de dia te plaatsen. Dit zijn ongetwijfeld de twee meest kritische stappen van dit protocol. Als het weefsel is niet gewend aan de temperatuur van de cryostaat, zal Shredder optreden, die aanzienlijk belemmert de morfologische kwaliteit van het weefsel. Shredder is het resultaat van een paar potentiële problemen; oplossen van problemen met de mogelijkheden omvatten wachten langer voor het weefsel om te komen tot de temperatuur of het wijzigen van de cryostaat OT en/of CT naar een warmere bereik. Zodra het weefsel is met succes knippen en in het werkgebied geplaatst, het is belangrijk om het weefsel te oriënteren en de dia goed om alle weefselinstellingen past binnen het membraan en kan nauwkeurig worden opgepikt uit het werkgebied. Wanneer u probeert op te halen van het weefsel van de cryostaat fase, het weefsel moet koud, en de dia moet worden warm. Alternatieve protocollen bestaan die adviseren om te relaxen van de dia vóór het oppakken van het weefsel en opgewarmd met een vinger over het gebied van weefsel plaatsing²⁸; echter in onze handen, dit biedt geen enkel voordeel hebben en vaak veroorzaakt problemen in het oppakken van het weefsel en de buitensporige weefsel plooien. Met een dia bij kamertemperatuur smelt het weefsel onmiddellijk bij contact met de dia. Om ervoor te zorgen een schone pick-up, is het noodzakelijk om de hoek van de dia, zodat het komt in aanraking met het weefsel op het membraan gebied maar doet niet zo ver gaan raken het podium zelf. Het membraan zal beginnen met het loskoppelen van het glasplaatje als het raakt de etappe, die schadelijk is voor het membraan en maakt laser opname moeilijk. Als dit gebeurt, zal het merkbaar worden zodra het LCM is begonnen en kan niet ongedaan worden gemaakt. Probleemoplossing opties zijn beperkt; Als op elk gewenst moment het dacht de membraan of de dia is geknoeid dat is, is het verstandig om te negeren. Het is aanbevolen om de praktijk vers bevroren weefsel afdelen voorafgaand aan het starten van een project of met behulp van een pathologie kern die hoogwaardige weefsel segmenteren produceren kan. Echter, als een kern-service gebruikt, zorgen ervoor dat juiste RNA techniek wordt gevolgd om te voorkomen dat RNase besmetting. Aantasting van het RNA kan gemakkelijk optreden wanneer verkeerde techniek is gebruikt.

Wij hebben hier een complete methode voor RVS visualisatie van Purkinje cellen in het post mortem menselijk cerebellum gepresenteerd ten behoeve van UV-LCM. We hebben ook opgenomen juiste RNA behoud methoden en technieken om te zorgen voor een hoog niveau van RNA integriteit. Dit protocol is niet per se specifiek voor elke één cel of weefseltype maar doet het handhaven van de eis dat de regio/cel van belang morfologisch te onderscheiden van de omringende stroma zonder de noodzaak van antigeen of kleurstof specifieke erkenning is.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.
Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 μm	Leica Biosystems	14041933980	Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'.
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.