Ein Edelstahl-Protokoll für hochwertige RNA Isolation aus Laser Capture Microdissected Purkinje-Zellen im menschlichen Post-Mortem Kleinhirn

Summary

Dieses Protokoll verwendet einen fleckenfreie Ansatz zu visualisieren und Purkinje-Zellen im Tiefkühlfrische Gewebe von Post-Mortem-menschlichen Kleinhirn per Laser Capture Microdissection zu isolieren. Der Zweck dieses Protokolls ist, ausreichende Mengen an qualitativ hochwertigen RNA für die RNA-Sequenzierung zu generieren.

Abstract

Laser Capture Microdissection (LCM) ist ein Vorteil, die für die Sammlung von zytologisch und/oder phänotypisch relevanten Zellen oder Regionen von heterogenen Gewebe ermöglicht. Erfasste Produkt kann verwendet werden, in einer Vielzahl von molekularen Methoden für Protein, DNA oder RNA isoliert. Erhaltung der RNA aus Post-mortem Gehirngewebe ist jedoch eine besondere Herausforderung. Immunhistochemische Färbung Verfahren, die weiter verschlechtern RNA oder Standard Visualisierungstechniken für LCM erfordern histologische. Daher haben wir ein Edelstahl-Protokoll zur Visualisierung in LCM mit dem Verwendungszweck der Erhaltung der Integrität der RNA in Post-Mortem Gehirngewebe entwickelt. Die Purkinje-Zelle des Kleinhirns ist ein guter Kandidat für Edelstahl-Visualisierung, aufgrund seiner Größe und charakteristischen Lage. Die zerebelläre Kortex besteht aus unterschiedlichen Schichten, die sich in Zelldichte unterscheiden, so dass sie eine gute Archetyp, unter starker Vergrößerung Mikroskopieren zu identifizieren. Purkinje-Zellen sind große Neuronen liegt zwischen Granulat Zellschicht, die dicht Mobilfunknetz kleinen Neuronen, und die molekulare Schicht, die in Zellkörpern spärlich ist. Wegen dieser Architektur ist der Einsatz von Edelstahl Visualisierung möglich. Geeignet wäre auch andere Organ oder eine Zelle Systeme, die diesen Phänotyp zu imitieren. Das Edelstahl-Protokoll soll fix Tiefkühlfrische Gewebe mit Ethanol und Lipide mit Xylol für verbesserte morphologische Visualisierung unter hoher Vergrößerung Lichtmikroskopie zu entfernen. Dieses Protokoll nicht für andere Fixierung Methoden berücksichtigt und ist speziell für Tiefkühlfrische Gewebeproben mit einer ultravioletten (UV) erfasst-LCM-System. Hier präsentieren wir Ihnen eine vollständige Protokoll für schneiden und Festsetzung von frisch gefrorenen Post-Mortem-zerebelläre Gewebe und Reinigung der RNA von Purkinje-Zellen, die durch UV-LCM, unter Beibehaltung der RNS-Qualität für die anschließende RNA-Sequenzierung isoliert. In unseren Händen dieses Protokoll produziert außergewöhnliches Maß an zellulären Visualisierung ohne Reagenzien Färbung und RNA mit hoher RNA Integrität Zahlen (≥8) ergibt, Bedarf für transkriptionelle Profilerstellung Experimente.

Introduction

Laser Capture Microdissection (LCM) ist eine wertvolle Recherche-Tool, die die Trennung der pathologisch relevanten Zellen für Molekular angetriebenen Folgebewertung ermöglicht. Die Verwendung von molekularen Analysen in dieser heterogenen Gewebeproben und die Korrelation mit pathologischen und klinischen Daten ist ein notwendiger Schritt bei der Bewertung der translationalen Bedeutung der biologischen Forschung¹. Bei der Analyse der Genexpressionsdaten aus RNA die Verwendung von gefrorenen Gewebeschnitte wird dringend empfohlen, denn es ermöglicht eine ausgezeichnete Qualität der RNA sowie Menge²maximiert. Es wurde auch festgestellt, dass hohe Qualität und Quantität der RNA Voraussetzung für aussagekräftige Daten aus RNA Sequenzierung^{3 sind}. Jedoch ist bei Verwendung von RNA aus frisch gefrorenen Post Mortem Gewebe für LCM RNA-Abbau eine große Herausforderung, da es sofort nach Tod tritt und seine Ausdehnung wird durch verschiedene Faktoren im Zusammenhang mit dem Gewebe Sammlung Methode^{4,5 vermittelt} . Darüber hinaus ist RNA-Abbau noch verschärft, wenn befleckenden Techniken erforderlich sind, um histologische Details und Zelle Identifikation zu erkennen. Spezialisiert, Färbetechniken wie Hämatoxylin und Eosin, Nissl Fleck, Immunfluoreszenz und Immunohistochemistry sind hilfreich bei der Differenzierung von Zellen aus umgebenden Stroma aber haben gezeigt, dass RNA abgebaut und Protokoll-Ausdruck ändern Profile-⁶. Daher hat unser Labor ein Edelstahl Protokoll speziell für RNA in Post-Mortem-menschlichen Kleinhirn für die Zwecke der RNA Sequenzierung nach LCM Isolierung des Purkinje Neuronen erhalten erstellt.

Bei der Verarbeitung von frischen gefrorenen Gewebes für LCM, beeinflussen die Befestigungsmethode variabel RNA und Gewebe Integrität. Formalin-Fixierung ist standard für morphologische Erhaltung, aber Ursachen Vernetzung, die möglicherweise fragment RNA und RNA Amplifikation⁷stören. Ethanol-Fixierung ist eine bessere Alternative zur RNA-Isolierung, wie es ein coagulative Fixiermittel, die nicht vernetzende¹induziert wird. Um die Darstellung der Morphologie der Gewebe zu erhöhen, ist Xylol die beste Wahl, da es Fette aus dem Gewebe entfernt. Allerdings gibt es Grenzen bekannte bei Xylol in LCM, wie das Gewebe können austrocknen und spröde verursacht Gewebe Fragmentierung auf Laser Capture⁷geworden. Xylol ist auch ein flüchtiger Toxin und muss in einer Dampfhaube richtig behandelt werden. Xylol ist dennoch nachweislich um Gewebe Visualisierung Beibehaltung auch RNA Integrität⁸zu verbessern. Daher konzentriert sich unser Protokoll auf die Verwendung von 70 % Ethanol Fixierung und Ethanol Dehydrierung, gefolgt von Xylol Inkubation für morphologische Klarheit.

Es ist wichtig, die verschiedenen Arten von lasergestützten Mikrodissektion Systeme, beachten, wie sie gezeigt haben, unterscheiden sich in Geschwindigkeit, Präzision und RNS-Qualität. Infrarot (IR) Laser capture Mikrodissektion und ultravioletten (UV) Laser Microbeam Microdissection Systeme waren beide neuartigen LCM-Plattformen, die fast gleichzeitig⁸entstanden. Die IR-LCM-System nutzt eine "Kontakte-System" mit einer transparenten thermoplastischen Folie direkt auf das Gewebe-Abschnitt platziert, und Zellen von Interesse gezielt einhalten des Films durch gezielte Impulse aus einem IR-Laser. Alternativ ist das UV-LCM-System ein "non-Contact-System", wobei ein fokussierten Laserstrahl entfernt die Zellen oder Regions of Interest im Gewebe schneidet; abhängig von der Konfiguration in zwei derzeit verfügbaren kommerziellen Plattformen, die entweder eine invertierte oder aufrechte Mikroskop-Design verwenden, Gewebe wird in einer Sammelvorrichtung durch eine Laser-induzierte Druckwelle, die es gegen die Schwerkraft katapultiert erworben oder Gewebe ist gesammelt durch die Schwerkraft, beziehungsweise. Wesentliche Vorteile des UV-LCM-Systems zählt schneller Zelle Erwerb, kontaminationsfrei Sammlung mit dem berührungslosen Ansatz und genauere Zergliederung durch eine viel kleinere Laser Beam Durchmesser⁹. Dieses Protokoll wurde speziell für ein UV-LCM-System und nicht in einem IR-LCM-System getestet wurde. In beiden UV-LCM-System-Design wenn Anhäufung Zellen in die Sammlung-Kappe, die Verwendung von einem Deckgläschen, die verbessert ist zellulären Klarheit während Mikroskopie nicht geeignet, da die Zellen nicht in der Lage, die Sammlung GAP einzugehen wäre. Daher haben wir getestet um Gewebe Visualisierung zu erhöhen, die Verwendung von undurchsichtigen Sammlung Caps, die als ein Deckglas für mikroskopische Visualisierung in UV-LCM-Systeme gegen Flüssigkeit gefüllte Sammlung Kappen dienen sollen. Flüssigkeit gefüllten Sammlung Kappen können schwierig sein, da die Flüssigkeit unterliegt der Verdunstung und häufig während der Arbeit am Mikroskop ausgewechselt werden. Zeit ist ein wichtiger Faktor für RNA-Stabilität, wie das aufgenommene Gewebe sofort⁷auflöst.

Unser Labor untersucht die Post-mortem neuropathischem Änderungen in das Kleinhirn von Patienten mit essentiellem Tremor (ET) und verwandte neurodegenerativen Erkrankungen des Kleinhirns. Wir haben gezeigt, dass morphologische Veränderungen auf Purkinje-Zellen, die ET Fällen im Vergleich zu Kontrollen, einschließlich einer reduzierten Anzahl von Purkinje-Zellen unterscheiden zentriert dendritischen Regression und eine Vielzahl von axonale Veränderungen führt uns zu postulieren, dass Purkinje Zelldegeneration ist eine biologische Kernfunktion ET Pathogenese^10,11,12,13. Transkriptionelle Profilierung wurde in viele neurologische Erkrankungen eingesetzt, um die zugrunde liegenden molekulare Grundlagen der degenerativen Zellveränderungen zu erkunden. Doch transcriptional Profile aus heterogenen Proben, wie Gewebe Hirnregionen, können wirksam Maske den Ausdruck der niedrigen Fülle Transkripte und/oder vermindern die Erkennung von molekularen Veränderungen, die nur in eine kleine Population von betroffenen auftreten Zellen, wie Purkinje-Zellen im Kleinhirn Kortex. Beispielsweise sind der Purkinje-Zellen erheblich durch die reichlich Granulat-Zellen im Kleinhirn Cortex von ca. 1:3000 Unterzahl; so effektiv auf erfordert ihre Transkriptom spezielle Isolierung dieser Neuronen. Zerebelläre Kortex ist durch unterschiedliche Schichten abgegrenzt, die in Zelle Dichte und Größe der Zellen unterscheiden. Diese zellulären Architektur ist ideal, um in eine Tiefkühlfrische Gewebeprobe ohne Farbstoff-haltigen Färbung Reagenzien zu visualisieren. In der Theorie könnte dieses Protokoll auch angewendet werden, auf anderen Gewebetypen, die ähnlich markanten Gewebe haben Organisation.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um speziell für Purkinje Zelle Visualisierung im Post-Mortem-menschlichen Kleinhirn zu arbeiten. Zahlreiche Protokolle gibt es für die Befestigung, Visualisierung und RNA Erhaltung vieler Arten von Geweben für die Zwecke der beiden IR und UV-LCM Färbung. Wenn ein experimentelles Design für UV-LCM erwägen, sollten Einzelpersonen ihr Protokoll passen am besten die Bedürfnisse und Anforderungen von beginnend und endend Materialien anpassen. Hier verbinden wir viele Aspekte der verschiedenen LCM-Protokolle ermöglichen eine verbesserte Methode zur Visualisierung von Purkinje-Zellen im menschlichen Kleinhirn Post-Mortem-ohne die Notwendigkeit des Farbstoffes mit Färbung Reagenzien, qualitativ hochwertige RNA Transkriptom vorzubereiten Sequenzierung.

Protocol

Alle humanen Proben, die in diesem Protokoll genutzt mit Einwilligung gewonnen wurden und durch die internen Review Board (IRB) an der Columbia University und der Yale University genehmigt worden.

Hinweis: Die Gesamtheit dieses Protokolls sollte folgen strengen RNA Umgang mit Richtlinien, wobei eine behandschuhte Hand wird immer verwendet, alle Flächen mit einer RNase Dekontaminator gereinigt werden und alle Arbeitsmaterialien RNA/DNA/Nuklease frei sind.

1. Test RNA Integrität des Gewebes vor Beginn LCM

Hinweis: Qualitätsprüfung der RNA kann durch viele Methoden erfolgen. Sicherstellen Sie, dass RNA aus dem gesamten Bereich getestet wird, um eine repräsentative RNA-Integrität-Anzahl (RIN) der Stichprobe.

1. Wählen Sie sorgfältig Gewebeproben für die Aufnahme, die innerhalb der Parameter des experimentellen Designs passen. Wenn bei der Kryostat schneiden, wechseln Sie zur Schritt 1.2. Ist dies nicht der Fall, das Gewebe entsprechend zu verarbeiten und zu Schritt 1.11 bewegen.
2. Zwei Container von Trockeneis zu bekommen. Die Größe hängt von der Anzahl der Stichproben.
   1. Legen Sie im ersten Behälter von Trockeneis eine leere, beschriftete 2 mL-Tube mit dem Gewebe-Code.
      Hinweis: Es dauert 10 min für die Rohre einfrieren. Rohre müssen vor dem Einbau des Gewebes hinein eingefroren werden; Andernfalls wird das Gewebe auf die Rohroberfläche schmelzen.
   2. Legen Sie in einen zweiten Behälter mit Trockeneis das Gewebe aus einem-80 ° C Gefrierschrank, der RNA Prüfung erfordert.
3. Reinigen Sie den Kryostaten. Siehe Schritt 4.7, für detaillierte Reinigungsprozedur.
4. Entfernen Sie das Gewebe aus Trockeneis und schneiden Sie einen kleinen Ausschnitt des Gewebes mit einer Rasierklinge RNase dekontaminiert. Gewebe sollte ca. 1 cm x 1 cm groß sein.
5. Ein ca. 3 mm hohen Hügel der optimale Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung auf einem Kryostat "Chuck" und erlauben Sie es, teilweise einzufrieren. Legen Sie das Gewebe auf das Office-Anpassungstool — nicht in OCT schieben, einfach lassen Sie es an der Spitze liegen.
6. Sobald OCT härtet, legen Sie das Futter mit dem montierten Gewebe in der Kryostat schneiden Arm und Position vor der Kryostat-Klinge.
7. Schneiden Sie bei 30 μm Abschnitte, bis das Gewebe selbst ist.
8. Schneiden Sie 300 μm über Gewebe und Ort in einem gefrorenen 2 mL-Tube. Setzen Sie den Schlauch wieder in Trockeneis.
9. Entfernen Sie das Gewebe aus dem "Futter" und setzen Sie wieder in Trockeneis erst unmittelbar vor dem einlagern.
10. Wiederholen Sie die Schritte 1,4 – 1,9 für alle Gewebe.
11. Sobald alle Proben abgeschlossen sind, entpacken Sie RNA mit dem RNA-Extraktion Kit zur Verfügung gestellt (Table of Materials #15). Ein detailliertes Protokoll ist mit dem RNA-Extraktion-Kit zur Verfügung gestellt. Befolgen Sie alle Anweisungen einschließlich der optionalen Schritt die Sammlung Rohr Membran und der optionalen Schritt für DNase Verdauung (Table of Materials #16) trocknen lassen.
12. Testen Sie die Integrität der extrahierten RNA über eine Qualität Bewertung Bioanalyzer¹⁴.

2. bereiten Sie vor dem Start-Schnitt für LCM

1. Reinigen Sie die Folien-Inhaber vor jeder Runde von Gewebe schneiden für LCM. Führen Sie die Reinigung am Vortag verwenden, um komplette über Nacht trocknen lassen.
   Hinweis: Objekthalter dienen zum Gewebe Abschnitt Fixierung in Ethanol und Clearing in Xylol.
   1. Schieben Sie Halter Reinigungsverfahren: mit RNase Dekontaminator gefolgt von Diethyl Pyrocarbonate behandelt (DEPC) Wasser nachspülen. Lassen Sie über Nacht trocknen kopfüber auf eine RNA/DNA/Nuklease freien Oberfläche, Staub oder andere Verunreinigungen in der Luft zu vermeiden.
      Vorsicht: DEPC ist hochgiftig und sollten behandelt und entsorgt EH & S standard gefährliche Chemikalien-Protokoll verwenden.
2. Reinigen der Bürsten für mit RNase decontaminator und über Nacht trocknen lassen. Vermeiden Sie Staub und andere Verunreinigungen.
3. Ort der Membran gleitet unter UV-Licht für 30 min bei Raumtemperatur. Tun Sie nicht aussetzen verwendeten Folien UV-mehr als 1 – 2 Tage vor. Dies erhöht die Bindung des Gewebes auf die Membran Folie.
   Hinweis: Schritt 2.3 kombinierbar mit Schritt 4, wodurch für Folie UV-Behandlung am gleichen Tag wie Gewebe Stationspunkte (siehe Schritt 4.4) auftreten.

3. bereiten Sie Fixierung Lösungen mit RNase freies Wasser und qualitativ hochwertigen Ethanol

Hinweis: Alle Lösungen sind für jedes Experiment frisch zubereitet. Sicherstellen Sie, dass der Diahalter Reinigungsverfahren aus Schritt 1.1 abgeschlossen ist. Alle Lösungen sind im Objekthalter bereit.

1. 30 mL 100 % Ethanol in einem Diahalter zu platzieren.
2. Ethanol mit DNase/RNase/Nuklease freies Wasser zu verdünnen. Platz 30 mL 95 % Ethanol in einem Halter schieben und auf Eis gelegt.
3. Ethanol mit DNase/RNase/Nuklease freies Wasser zu verdünnen. Platz 30 mL 70 % Ethanol in einem Halter schieben und auf Eis gelegt.
4. Platz 30 mL 100 % Xylol in zwei separate Objekthalter und beschriften Sie sie als #1 und #2.

4. bereiten Sie Kryostaten für Gewebe schneiden

1. Holen Sie sich einen Eimer mit Eis für Ethanol Lösungen und einem Behälter mit Trockeneis für das Gewebe.
   Vorsicht: Trockeneis ist extrem kalt, also tragen Sie Schutzhandschuhe. Platzieren Sie Eis und Trockeneis nicht in demselben Container. Unterschiedlichen Temperaturen in Eis und Trockeneis werden zu bilden zusammen mit einer unbestimmten Temperatur führen.
2. Entfernen Sie das Gewebe von-80 ° C Gefrierschrank und auf Trockeneis für den Transport zu den Kryostaten.
3. Kryostat-Einstellungen:
   1. Legen Sie die Schnittdicke auf 14 μm.
   2. Legen Sie die trim Dicke auf 30 μm, Gewebe-Menge zu erhalten.
   3. Setzen Sie für Kryostaten mit dual Kammer und Probe halten Temperaturen Kammertemperatur (CT) auf-18 ° C. Stellen Sie die Temperatur für Kryostaten mit einer Einstellung bis-17 ° C.
   4. Für Kryostaten mit dual Kammer und Probe Haltetemperatur gesetzt die Objekttemperatur (OT) bis-16 ° C.
      Hinweis: OT muss wärmer als die CT sogar schneiden sicherzustellen. Wenn das Gewebe noch Schreddern, OT kann auf-15 ° C erhöht werden und die CT kann erhöht werden, bis-18 ° C.
4. Legen Sie das Gewebe in den Kryostaten für mindestens 20 Minuten optimale Temperatur zu ermöglichen.
   Hinweis: Wenn das Gewebe nicht optimale Temperatur erreicht hat, wird es beim Schneiden zerkleinern. Stellen Sie nicht das Gewebe bei-20 ° C am Vorabend um RNA Integrität zu bewahren und Kristall Eisbildung zu verhindern. Lassen Sie das Gewebe so viel Zeit wie nötig, um optimale Temperatur glatt schneiden equilibrate. Optionale Implementierung der Folie Inkubation unter UV-kann hier auftreten (siehe Schritt 1.3).
5. Legen Sie das "Futter" in Kryostaten für mindestens 20 min zu ermöglichen, die Temperatur des Kryostaten herunter zu kommen.
6. Legen Sie die sauberen Pinsel in Kryostaten für mindestens 20 min zu ermöglichen, die Temperatur des Kryostaten herunter zu kommen.
7. Reinigen Sie den Kryostaten
   1. Reinigen Sie die Bühne mit einer 1:1 Mischung von RNase Dekontaminator und 70 % Ethanol verdünnt mit RNA/DNA/Nuklease freies Wasser Einfrieren auf der Bühne zu verhindern.
   2. Reinigen Sie eine neue Einweg-Kryostat-Klinge mit RNase Dekontaminator und in den Klingenhalter auf der Bühne. Lassen Sie mindestens 20 Minuten für den Kryostaten Klinge auf die Temperatur des Kryostaten kommen.
   3. Reinigen Sie die Anti-Rolle-Platte mit RNase Dekontaminator und legen auf der Bühne. Lassen Sie mindestens 20 Minuten für die Anti-Roll-Platte, auf die Temperatur des Kryostaten zu kommen.
      Hinweis: Eine Anti-Rolle-Platte ist nicht erforderlich für den Schnitt aber wird dringend empfohlen. Wenn eine Anti-Rolle-Platte nicht verfügbar ist, funktioniert ein gereinigter Pinsel als Alternative. Wenn die Anti-Rolle-Platte nicht richtig temperiert ist, wird das Gewebe schmelzen oder bleiben beim Schneiden.

5. Schneiden von Gewebe

1. Schneiden Sie ein kleines Stück des Gewebes (~ 1 cm x 1 cm) für Schnitt. Das restliche Gewebe Trockeneis/80 ° C Gefrierschrank zurück.
   Hinweis: Sicherstellen Sie, dass die Gewebe-Abschnitt ~ 95 % zerebelläre Kortex, wo Purkinje-Zellen befinden.
2. Legen Sie eine ca. 3 mm hohen Hügel Okt. um das "Futter" zu decken. Starten Sie durch den Aufbau der Schichten an der Spitze in langsamen, kreisenden Bewegungen, bis gibt es ein kleiner Hügel.
3. Sobald OCT ist teilweise gefroren, aber es noch etwas Flüssigkeit in der Mitte gibt, legen Sie das Gewebe auf OCT. Schieben Sie das Gewebe nicht tief in Okt. zulassen das Gewebe auf OCT bis vollständig gefroren zu sitzen. Dies dauert 1 – 2 Minuten.
4. Legen Sie die "Chuck" mit gefrorenen OCT und das Gewebe in der Kryostat schneiden Arm. Stellen Sie das Gewebe, so es mit Messer abschließt.
5. Lassen Sie das Gewebe in den Arm schneiden für 15-20 min zur Anpassung an neue Temperatur zu sitzen.
   Hinweis: Abhängig von der Dicke des Gewebes wird Zeit für Temperatur Akklimatisierung benötigt. Lassen Sie das Gewebe zu sitzen, so lange wie nötig zu sauber geschnitten. Passen Sie OT und CT mit Gewebe Temperatur Akklimatisierung zu unterstützen.
6. Bewegen Sie langsam das Gewebe näher an der Klinge. Sobald das Gewebe die Klinge erreicht hat, starten Sie die trim. Trim Dicke sollte 30 μm betragen.
7. Schneiden Sie 2 – 3 X, bis die Rinde Layer sichtbar sind.
8. Platzieren und Ausrichten der Anti-Rollen-Platte oberhalb der Kryostat-Klinge.
   Hinweis: Eine silberne Linie erscheint das Licht in den Kryostaten an der Schnittstelle zwischen der Klinge und Anti-Roll-Platte. Dies bedeutet, dass die Anti-Rolle-Platte direkt über den Rand des Blattes ist.
9. Beginnen Sie die Querschnitte bei 14 μm. Richtig Zuschnitte werden flach unter der Anti-Roll-Platte.
   Hinweis: Wenn das Gewebe fest ist, sicherzustellen Sie, dass die Anti-Rolle-Platte kalt genug ist. Wenn nötig, Platzierung eines Stückes trocken auf der Außenseite (Seite die Bühne nicht berühren) wird schnell Eis kühlen Sie die Anti-Rolle-Platte.
10. Schneiden Sie 4 – 6 Abschnitte und richten Sie sie horizontal über die Kryostat-Bühne.
11. Angeln die Folie, holen Sie alle Stücke des Gewebes gleichzeitig.
    Hinweis: Mit den Malwerkzeugen, heben Sie die Enden des Gewebes für die Folie bei Abholung leichter verfügbar sein. Einen Abschnitt zu einem Zeitpunkt nicht abholen. Raumtemperatur Luftkontakt wird RNA Integrität beeinträchtigt.
    Vorsicht: Lassen Sie sich nicht die Membran, tippen Sie auf die Bühne des Kryostaten. Wenn die Membran die Bühne berührt, fangen an, von der Glas-Folie zu lösen und zu Fehlern führen, wenn Sie LCM versuchen.
12. Verschieben Sie sofort zu Schritt 6. Verzögern Sie Fixierung nicht.

6. Befestigung Gewebe/Fleck-weniger Visualisierung

1. Sofort einziehen des Protokolls zur Fixierung von ethanol
2. Legen Sie die Folie in den Diahalter mit 70 % Ethanol 2 min. lang – auf dem Eis.
3. Legen Sie die Folie in den Diahalter mit 95 % Ethanol 45 s – auf dem Eis.
4. Legen Sie die Folie in den Diahalter mit 100 % Ethanol 2 min. lang — bei RT
5. Tauchen Sie die Folie 3 Mal in den Diahalter mit Xylol 1 — bei RT
6. Legen Sie die Folie in den Diahalter mit Xylol 2 für 5 min – bei RT
7. In einem sauberen Bereich, für mindestens 30 min. längeren Durststrecke optimal, bis zu 60 min. sind trocknen lassen.
   Vorsicht: Folien für die Trocknung in einer Dampfhaube aufzustehen. Xylol ist flüchtig. Flach liegende Folien verursacht Xylol zum Pool im Abschnitt Gewebe die Gewebe zu dunkel wird.

7. optional – Folie Lagerung

1. Platzieren Sie getrocknete Folien in individuelle 50 mL Röhrchen (eine Folie pro Rohr) und Platz in den-80 ° C Gefrierschrank für bis zu 7 Tage.
   Hinweis: Folien müssen vor dem Einlegen in den Gefrierraum-80 ° C trocken sein. Verwenden Sie Trockenmittel im Inneren des Rohres nicht, da Partikel in das Gewebe und die Membran eingebettet werden. Sicherstellen Sie, dass die Röhre Kappe fest; ist dies nicht der Fall, Kondenswasser wird auf der Folie auftreten, wenn für den Gebrauch auftauen.
   Vorsicht: Integrität der RNA sinkt nach 7 Tagen, ebenso wie die Qualität der Gewebe Visualisierung.

(8) Auftauen Folien zur Verwendung gespeichert

1. Entfernen Sie das Rohr mit einer Folie aus der Tiefkühltruhe-80 ° C 1 h vor der beabsichtigten Verwendung.
2. Öffnen Sie das Rohr nicht sofort. Lassen Sie das Rohr auf Raumtemperatur kommen. Kondensation tritt auf der Außenseite des Rohres nur.
3. Sobald das Rohr gekommen auf Raumtemperatur und alle Kondensation ist verschwunden (ca. 30-40 min), entfernen Sie die Kappe und die Folie, um die Raumtemperatur Luft aussetzen.
4. Lassen Sie die Folie auf Raumtemperatur für 15 – 20 min. verlassen akklimatisieren die Folie im Inneren des Rohres mit der Kappe entfernt.
   Hinweis: Folie ist nun bereit für LCM.

(9) Laser Capture Microdissection von Purkinje-Zellen:

Hinweis: In diesem Abschnitt des Protokolls werden nur Besonderheiten im Zusammenhang mit der Erfassung von Purkinje-Zellen für die anschließende RNA Sequenzierung diskutieren. In diesem Abschnitt wird davon ausgegangen, dass der Benutzer mit dem UV Laser Capture Mikroskop und die angeschlossene Software vertraut ist.

1. Saubere arm Mikroskoptisch und der GAP-Sammlung mit RNase Dekontaminator.
2. Legen Sie mit behandschuhten Händen die Folie auf dem Mikroskop und 500 μL opaken Kappe im Studienarm mit Auflistung.
   Hinweis: Immer richtige RNA-Technik durch den Arbeitsbereich mit RNase Dekontaminator Reinigung zu gewährleisten und behandschuhten Hände beim Berühren der Folie oder opaken Kappe verwenden. Handschuhe können entfernt werden, sobald die Folie und Deckel vorhanden sind und Laser Capture hat begonnen.
3. Richten Sie bei kleiner Vergrößerung die opake Kappe über das Kleinhirn Gewebe, um sicherzustellen, dass die Kappe das gesamte Gebiet in das Okular visualisiert deckt.
   Hinweis: Nur das Okular des Mikroskops wird zeigen, ob die opake Kappe zentriert ist. Die Kamera wird nicht angezeigt, wenn die Kappe über das Gewebe zentriert ist. Bauartbedingt Laser Capture Umfang werden die Visualisierung durch die opaken Kappe in das Okular nur oder in das Okular und Kamera visualisiert.
4. Visualisieren Sie die zerebelläre Schichten mit 5 x - 10 X-Objektiv und platzieren Sie den Cursor über den Abschnitt an molekularen Schicht und Granulat Zellschicht (die Purkinje-Zellschicht) schneiden.
5. Nach 40 X und visualisieren Sie Purkinje-Zellen zu.
   Hinweis: Siehe Abbildung 1 und Abbildung 2 Beispiel Visualisierungen.
6. Mit der beginnen Sie Erfassung von Purkinje-Zellen.
   Hinweis: Auszuführenden RNA-Sequenzierung, mindestens 5 ng RNA ist erforderlich. Ca. 1600-2000 Purkinje-Zellen führen genug RNA-Material für die Sequenzierung. RNA wird für bis zu 8 h am Mikroskop stabil sein. Test UV-Energie und UV Konzentration vor der Entnahme zu gewährleisten sind korrekt. Im Laufe der Zeit das Gewebe wird weiterhin austrocknen und die UV-Energie und UV-Fokus können geändert werden müssen.

10. RNA Sammlung Post LCM

1. Vorbereiten den Zelle Lysis Puffer (bereiten frisch jedes Mal)
   1. Verdünnen Sie 2-Mercaptoethanol in Lyse Puffer bei 1: 100 (10 mL μL:1, beziehungsweise). Lyse (RLT) Puffer ist in Tabelle von Materialien (#14 und #15) zur Verfügung gestellt.
2. Die opaken Kappe, mit der Kappe nach oben fügen Sie 50 μL der Zelle Lysis Puffer hinzu. Schließen Sie den Schlauch vorsichtig über die Kappe.
3. Lassen Sie das Rohr auf dem Kopf stehend für 1 min.
4. Wirbel der Röhre für 30 s und schnell drehen den Lyse-Puffer an der Unterseite des Rohres.
5. Öffnen Sie das Rohr und wiederholen Sie die Schritte 10.2-10.4.
6. Legen Sie die Röhrchen mit 100 μL der Lyse Puffer und RNA aus dem-80 ° C Gefrierschrank, bis alle Muster fertig und bereit für die RNA-Extraktion (Table of Materials #14 sind).

Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte für die Zubereitung von frisch gefrorenen Post-Mortem-menschlichen Hirngewebe für UV-LCM. Gründliche technische Daten und Anmerkungen sind für Kryostat schneiden, angegeben, da es frisch gefrorenen Hirngewebe mit einem hohen Maß an Präzision schneiden schwierig sein kann. Der wichtigste Punkt ist, dass frisches gefrorenes Gewebe extrem kalt ist und eine erhebliche Menge an Zeit erfordert, um auf die wärmere Temperatur von einem Kryostat zu akklimatisieren. Dieser Schritt kann nicht überstürzt werden, und es kann nicht überbewertet werden, wie zentrale dieser Schritt für den Erfolg oder Misserfolg dieses Protokolls ist. Wenn das Gewebe nicht richtig an den Kryostaten vorbereitet wird, werden alle nachfolgenden Versuche auf die Identifizierung von Zellen oder Regionen von Interesse sehr schwierig, wenn nicht gar unmöglich.

Das Gewebe ist nach Kryostat schneiden und trocknen Redezeit bereit für LCM. Wenn das Gewebe unter dem Mikroskop zu visualisieren, sind die zellulären Ebenen des Kleinhirns mit 5 X und 10 X Objektive leicht sichtbar. Abbildung 1 zeigt repräsentative Bilder des Gewebes in Ethanol nur (Abb. 1A) und Gewebe fixiert inkubiert in Xylol nach Ethanol Fixierung (Abbildung 1B). Wir rigoros getestet verschiedenen Ethanol und Xylol Inkubationszeiten / Temperaturen auf die Fähigkeit, sowohl zu beheben und das Gewebe zu visualisieren. Wenn das Gewebe nicht lange genug in Xylol ausgebrütet wird, wird das resultierende Bild Abbildung 1A, anstatt Abbildung 1Bstärker ähneln. Xylol Inkubation bewirkt, dass das Gewebe, dunkler und besser zu werden zelluläre Ebenen als skizziert hat Ethanol allein. Beim Schneiden am Laser Capture Mikroskop ist das 40 X Objektiv erforderlich, um sicherzustellen, Erfassung nur Purkinje-Zellen, und nicht das umliegende Gewebe. Inkubation in Xylol ergibt eine hohe Qualität, morphologisch intakt Bild (Abbildung 1D) im Vergleich zu Ethanol Fixierung allein (Abbildung 1C).

Zur weiteren Verbesserung die Visualisierung unserer Gewebe, testeten wir die Deckglas Fähigkeit eine undurchsichtige GAP. Andere UV-LCM-Protokolle nutzen eine Flüssigkeit gefüllte Kappe einer 200 – 500 μL Röhre, die das Gewebe auf Kontakt löst sich. Flüssigkeit gefüllte Kappen können Gewebe Visualisierung, verursacht das resultierende Bild körnig und schillernden unter dem Mikroskop (Abb. 2A) zu reduzieren. Gewebe-Visualisierung durch die opaken Kappe (Abbildung 2B) Ergebnisse in einem gespachtelten Gewebe auftritt, der weicher und schärfer in Form ist. Insbesondere ermöglicht die opake Kappe Kollektion bis zu 8 h ohne Ersatz. Repräsentative Bilder von ausgeschnittenen Purkinje-Zellen mit niedriger Leistung (Abbildung 2C) und mit hoher Leistung (Abbildung 2D, E) zeigen präzise Entfernung nur den Purkinje Zelle Körper. Als Referenz, zeigt Abbildung 2F eine Luxol Fast blau / Hämatoxylin und Eosin (LH & E) gebeizt zerebelläre Kortex, die speziell die verschiedenen Schichten des Kleinhirns und der Platzierung von den Purkinje-Zellen bei der molekularen highlights Schicht und Granulat Zelle Schicht nebeneinander.

Dieses Protokoll soll hochwertige RNA für die anschließende RNA Sequenzierung zu erhalten. Wir testeten unser Protokoll auf sechs verschiedenen Post-Mortem menschliche Gehirn Proben, die jeweils drei Tage von LCM 1500 – 2000 Zellen für die RNA-Extraktion gesammelt wurde. Ca. 6 – 8 h am Mikroskop produziert 500 – 700 Zellen, die dann mit den Vortagen LCM Produkte vor RNA-Extraktion kombiniert wurden. Proben wurde RNA-Extraktion und wurden in 14 μl RNAse-freies Wasser (Table of Materials #14) Nukleinsäuretablette. Alle sechs Proben produziert qualitativ hochwertige RNA mit RNA Integrität Zahlen (RINs) ≥8 (Abbildung 3A-F). Dieses Verfahren führte in RNA-Mengen von 11,5 ng(Abbildung 3),8,3 ng (Abbildung 3B), 13,6 ng (Abb. 3C), 11,5 ng (Abbildung 3D), 14,9 ng (Abbildung 3E) und 26,9 NG (Abbildung 3F). Bemerkenswert ist, dass alle Post-Mortem Gehirn Proben für RNS-Qualität vor LCM (Tabelle 1) getestet wurden. Wenn die Probe Herkunft RNA-Abbau ist, wird LCM seine Integrität nur weiter verschlechtern.

Abbildung 1 : Zerebelläre Schichten und Purkinje Zelle Visualisierung mit und ohne Xylol Behandlung. Repräsentative Bilder mit und ohne Xylol nach Ethanol Fixierung und Austrocknung. Die molekulare Schicht (ML) und Granulat Zellschicht (GCL) beschriftet sind. Purkinje-Zellen sind mit Pfeilen gekennzeichnet. (A) 5 X Darstellung der zerebelläre Schicht Visualisierung ohne Xylol. Maßstab: 10 µm. (B) X 5 Darstellung der zerebelläre Schicht Visualisierung mit Xylol. Maßstab: 10 µm (C) 40 X Vertretung der zerebelläre Schicht Visualisierung ohne Xylol. Maßstab: 1 µm. (D) 40 X Darstellung der zerebelläre Schicht Visualisierung mit Xylol. Maßstab: 1 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Purkinje Zelle Visualisierung vor und nach der LCM. Repräsentative Bilder bei 40 X mit Xylol nach Ethanol Fixierung und Austrocknung. ML und GCL sind beschriftet. Purkinje-Zellen sind mit Pfeilen gekennzeichnet. (A) Visualisierung am Mikroskop unter Flüssigkeit gefüllt GAP bei 40 X. Maßstab: 1 µm. (B) Visualisierung am Mikroskop unter undurchsichtigen Sammlung cap bei 40 X. Maßstab: 1 µm. (C) 5 X Visualisierung des zerebelläre Cortex zeigt die ausgeschnittenen Purkinje-Zellen zwischen ML und GCL. Maßstab: 10 µm. (D) 40 X Visualisierung einer Purkinje Zelle vor der Ausrottung. Maßstab: 1 µm. (E) 40 X Visualisierung des erfolgreichen Purkinje Zelle erfassen. Maßstab: 1 µm. (F) 20 X Vertreter LH & E gefärbt Kleinhirn zeigt Purkinje Zelle Körper mit Pfeilen markiert. Maßstab: 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : RNA Qualitätskontrolle Bioanalyzer Ergebnisse der LCM Proben. Paneele A-F zeigen repräsentative RNA Qualitätskontrolle auslesen. Jede Platte ist ein anderes Sample, das den gleichen LCM-Prozess der Fixierung und Visualisierung mit Ethanol und Xylol nur unterzogen. RNA-Integrität-Nummern (RINs) sind alle > 8.0. Repräsentative Konzentrationen [] Ergebnis eine Rendite von mindestens 5 ng von Gesamt-RNS. Alle Proben wurden in 14 µL RNAse-freies Wasser eluiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Probe	RIN - Abschnitt Prep	RIN - LCM	[RNA] - LCM	PMI-gefroren
A	9.2	8.6	822 Pg/µL	450 min.
B	9.8	8	598 Pg/µL	550 min
C	9.1	8.5	976 Pg/µL	455 min.
D	9.8	8.2	823 Pg/µL	463 min
E	9.8	9.1	1069 Pg/µL	1139 min
F	9.6	8.3	1923 Pg/µL	1080 min.

Tabelle 1: Zusammenfassung der RNA-Integrität . Probennummern entsprechen die Bioanalyzer Ergebnisse in Abbildung 3dargestellt. Abschnitt Vorbereitungen sind vor der LCM um sicherzustellen, dass Gewebe von guter Qualität ist. Gezeigt werden das ursprüngliche Gewebe RINs von Abschnitt Preps, LCM RINs und Konzentration der RNA von LCM, sowie der Post-Mortem-Intervalle (PMI-gefroren) für das Gewebe eingefroren.

Discussion

Die hier vorgestellten Protokoll ist speziell geändert, um einen rostfreien Ansatz bei der Visualisierung von morphologisch unterschiedlichen Gewebes für UV-LCM. Diese Methode soll die Integrität der RNA für die anschließende direkte RNA Sequenzierung, unter Beibehaltung einer Steigerung des Niveaus der Gewebe Visualisierung zu maximieren. Die Fähigkeit, verschiedene Zelltypen für Erfassung, erstellen die reinste Population von Zellen möglich ist, zu unterscheiden ist wichtig für das Verständnis der unterschiedlicher molekularen Profilen in menschlichen Geweben¹⁵. Im Rahmen dieses Protokolls Gewebe Auswahl ist von größter Bedeutung, da die Verwendung des Antigens oder Farbstoff spezifischen Reagenzien werden nicht genutzt und ist daher nicht geeignet für Studien, die solche Differenzierung erforderlich. Dies ist zwar eine Einschränkung dieses Protokolls, das resultierende Gewebe Visualisierungs- und RNA Integrität sind ganz überlegen und Relevanz in anderen experimentellen Designs zu erhalten. Viele andere Protokolle vorhanden, die auch alternative Färbung Methoden speziell für UV - und IR-LCM mit der Absicht der Erhaltung RNA zu nutzen. Aber die meisten anderen Methoden enthalten mindestens eine Färbung oder Antigen spezifischen Reagenz^6,16,17, sind entworfen, um eine Zelle oder das Organ Art (die nicht menschlichen Autopsie Gewebe)^{18,19, 20}, oder erfordern spezielle RNA-Seq-Kits zur Integrität²¹zu verbessern. Cresyl violett (Nissl) Färbung ist ein beliebter Farbstoff mit Reagenz in viele Protokolle verwendet, da es Kerne in den Neuronen im Gehirn Flecken und die geringste Menge an RNA-Abbau-^{6 verursacht}. Die größeren Kern der Purkinje Zelle ist jedoch nicht gut durch Cresyl violett, bietet keinen signifikanten Vorteil für die Visualisierung von Purkinje-Zellen befleckt. Wichtig ist, haben wir nur eine LCM-Studie in der Literatur, die die Sammlung von menschlichen Purkinje-Zellen beschrieben, die von großem Interesse für die Untersuchung von zerebelläre degenerative und Entwicklungs-Störungen sind identifiziert. Diese Studie gefrorenes Gewebe mit Cresyl violett gefärbt und isoliert Purkinje-Zellen mit einem IR-LCM-System; Probieren Sie so niedrig wie 5 verwendet wurden, aber als akzeptabel für Microarray Analyse²²RINs. Daher ist dies die erste Protokoll-Studie, die speziell für qualitativ hochwertige RNS von Purkinje-Zellen im Post-Mortem-menschlichen Kleinhirn über UV-LCM herausgeschnitten werden soll.

Die Stabilität der RNA in Post-Mortem-menschliches Gewebe ist ein bekannter Hindernis als RNA-Moleküle innerhalb der Zellen ganz natürlichen Zerfall nach dem Tod unterliegen. Insbesondere hat sich mRNA, die besonders anfällig für Nucleolytic Abbau⁵werden gezeigt. Überwachung des Post-Mortem-Intervalls (PMI) ist an der Zeit zum Einfrieren (PMI-gefroren) eine Metrik, die eine Korrelation zu RNA-Abbau in einigen Studien^23,24,25gezeigt hat. Tabelle 1 zeigt jedoch unsere PMI eingefroren Intervalle für die sechs Proben, dargestellt in Abbildung 3, die keine relative Korrelation mit PMI Werten und RNS-Qualität weist. Daher ist es notwendig, Sorgfalt bei der Prüfung der Integrität der RNA vor Beginn einer Laser-Capture-Projekt. Wenn die RNA-Integrität der Ausgangspunkt Probe von schlechter Qualität ist, werden die daraus resultierenden RNA von einem LCM-Produkt noch niedriger Qualität. Wenn niedriger Integrität der RNA nicht vermieden werden kann, konnten andere Methoden zur Verbesserung RNA Sequenzierung neben diesem Protokoll²¹eingestellt werden. Vor allem kann Low-Eingang oder degradierten RNA zu gedämpften Komplexität und suboptimale Ergebnisse, die oft zusätzliche Verstärkung Schritte erfordern führen. Die Zugabe von PCR-Zyklen für Verstärkung nachweislich Sequenzen ungleich zu verstärken, als auch lesen Sie Duplikate auf^26,27-Sequenzierung. Daher ist die Nutzung von qualitativ hochwertigen RNS von LCM-Proben für die Sequenzierung sehr vorteilhaft.

Die Visualisierungsmethode angestellt in diesem Protokoll stark beruht auf der Benutzer ist Know-how beim Schneiden von frischem Gewebe auf einem Kryostat gefroren. Das Protokoll geht in umfangreiche Details auf wie man am besten das Gewebe vorbereiten, schneiden und legen Sie das Gewebe auf der Folie. Das sind zweifellos die beiden kritischsten Schritte dieses Protokolls. Wenn das Gewebe nicht auf den Kryostaten Temperatur gewöhnt ist, wird Schreddern auftreten, die behindert deutlich der morphologische Qualität des Gewebes. Schreddern ist das Ergebnis von ein paar potenzielle Probleme; Möglichkeiten zur Fehlerbehebung gehören Wartezeiten länger dauern, bis das Gewebe auf Temperatur zu kommen oder die Änderung der Kryostat OT und/oder CT auf einen wärmeren Bereich. Sobald das Gewebe erfolgreich geschnitten und auf der Bühne platziert wurde, es ist wichtig, das Gewebe zu orientieren und die Folie richtig darauf alle Gewebe innerhalb der Membran passt und kann genau von der Bühne abgeholt werden. Beim Versuch, das Gewebe von der Kryostat Bühne abholen, das Gewebe muss kalt sein, und die Folie sollte warm sein. Alternative Protokolle existieren, die die Folie vor der Abholung des Gewebes entspannen empfehlen und erwärmt mit einem Finger über die Fläche des Gewebes Platzierung²⁸; jedoch in unseren Händen, dies bietet keinen Vorteil und führt oft zu Schwierigkeiten bei der Abholung der Gewebe und übermäßige Gewebe Falten. Mit einer Folie bei Raumtemperatur schmilzt das Gewebe sofort bei Kontakt mit der Folie. Um eine saubere Abholung zu gewährleisten, ist es notwendig, die Folie Winkel, so dass es in Kontakt mit der Gewebe im Bereich Membran kommt aber nicht so weit geht, die Bühne selbst berühren. Die Membran startet von der Glas-Folie zu lösen, wenn es berührt die Bühne, die die Membran beschädigt und macht Erfassung schwierig Laser. In diesem Fall wird es spürbar, sobald LCM begonnen hat und kann nicht rückgängig gemacht werden. Optionen zur Fehlerbehebung sind begrenzt; Wenn zu jeder Zeit dachte, es ist die Membran oder Folie kompromittiert wurden, ist es ratsam, zu verwerfen. Es wird empfohlen, Praxis frisch gefrorenes Gewebe schneiden vor Beginn eines Projekts oder mit einem Pathologie-Kern, der qualitativ hochwertige Gewebe schneiden erzeugen kann. Jedoch wenn einen Kerndienst verwenden, sicherzustellen Sie, dass richtige RNA-Technik um RNase-Kontamination zu verhindern. RNA-Abbau kann leicht auftreten, wenn falsche Technik verwendet wird.

Wir haben hier eine komplette Methode für Edelstahl Visualisierung von Purkinje-Zellen im menschlichen Kleinhirn Post-Mortem-für die Zwecke der UV-LCM vorgestellt. Wir haben auch richtige RNA-Bewahrung-Methoden und Techniken, um hohe Integrität der RNA enthalten. Dieses Protokoll ist nicht unbedingt spezifisch für jede eine Zelle oder Gewebetyp jedoch die Anforderung, dass die Region/Zelle von Interesse morphologisch unterscheidbar von der umgebenden Stroma ohne die Notwendigkeit für Antigen oder Farbstoff besondere Anerkennung ist zu erhalten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.
Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 μm	Leica Biosystems	14041933980	Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'.
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.