Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو التسمية، وإثراء، وتحديد ركائز للبروتين كيناز CK2 من عينة بيولوجية معقدة مثل خلية ليستي أو هوموجيناتي الأنسجة. هذا الأسلوب روافع الجوانب الفريدة للبيولوجيا CK2 لهذا الغرض.
Abstract
من الضروري دراسة العلاقات كيناز-الركيزة للحصول على فهم كامل لوظائف هذه الإنزيمات وأهدافها النهائية في الدول الفسيولوجية والمرضية على حد سواء. CK2 كيناز تقحم مصانة سيرين/ثريونين مع قائمة متزايدة من مئات ركائز المتورطين في العمليات الخلوية متعددة. بسبب خصائصه بليوتروبيك، تحديد ووصف مجموعة شاملة من ركائز CK2 كان يشكل تحديا كبيرا ولا يزال عقبة في دراسة هذا الإنزيم هام. ولمواجهة هذا التحدي، وضعنا استراتيجية تجريبية متعددة الاستخدامات التي تمكن من إثراء المستهدفة وتحديد ركائز CK2 المفترضة. هذا البروتوكول يستفيد من خصوصية فريدة الركازة المشارك المزدوج CK2 السماح ثيوفوسفوريليشن محددة من ركائز لها في خلية أو نسيج ليستي. هذه البروتينات الركازة يتم في وقت لاحق يؤلكل، إيمونوبريسيبيتاتيد، وحددها السائل اللوني/جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS). وقد استخدمنا سابقا هذا النهج بنجاح تحديد ركائز CK2 من المبايض المورفولوجية وهنا نعرب عن تطبيق هذا البروتوكول على خلايا جليوبلاستوما البشرية، التي توضح قدرة التكيف مع هذا الأسلوب للتحقيق الأدوار البيولوجية لهذا كيناز في نموذج الكائنات ونظم تجريبية مختلفة.
Introduction
مؤنزم البروتين هي المكونات الرئيسية لتوصيل إشارة الشلالات. يتسبب الفسفرة من الركازة البروتينات بهذه الإنزيمات الاستجابات البيولوجية التي تنظم الأحداث الحرجة التحكم في انقسام الخلايا والايض والتمايز، بين أمور أخرى. CK2 كيناز acidophilic، وأعربت عن أوبيكويتوسلي سيرين/ثريونين التي حفظت من الخميرة للبشر والتي تلعب أدواراً هامة في العديد من العمليات الخلوية التي تتراوح بين تنظيم النسخي تقدم دورة الخلية للمبرمج1 ،،من23. الإنزيم هيتيروتيترامير يتألف من اثنين α حفاز (أو α ') مفارز واثنين من مفارز β التنظيمية4. بالإضافة إلى كونها شديدة بليوتروبيك، يسلك CK2 اثنين غير عادية الخصائص الأخرى التي تؤدي إلى تعقيد تحليله، هما النشاط التأسيسي5 والركيزة المشارك المزدوج خصوصية6. هذه الخاصية الأخيرة يمنح CK2 مع القدرة على استخدام غتب فضلا عن ATP الفسفرة بروتينات الركازة.
يؤدي حذف الوراثية لمفارز حفاز أو تنظيمية من CK2 في الفئران الجنينية الفتك مشيراً إلى أنها تلعب أدواراً حاسمة خلال التنمية و7،أورجانوجينيسيس8. CK2 هو أوفيريكسبريسيد أيضا في عدة أنواع من السرطان، ومما يمثل10،9،11هدف علاجية واعدة. وفي الواقع، مثبطات محددة هذا النشاط كيناز CK2 المستهدف حاليا قيد التحقيق لهذا الغرض12،،من1314. وفي حين يتم تثبيط CK2 خياراً قابلاً للتطبيق، نظراً لطبيعته بليوتروبيك، بديل وربما سيكون نهج أكثر عقلانية لاستهداف ركائز CK2 الهامة التي تكمن وراء التقدم لأنواع معينة من السرطان. ولذلك، ستكون شاملة تحديد وتوصيف CK2 الركازة البروتينات ذات فائدة كبيرة لتوضيح الدالة محددة من هذا كيناز داخل نوع معين من الأنسجة أو الورم.
هنا، يمكننا وصف أسلوب بيوكيميائية تنوعاً لتحديد ركائز CK2 من عينة بيولوجية معقدة مثل خلية أو نسيج ليساتي. هذا البروتوكول يستفيد من خصوصية الركازة المشارك المزدوج CK2 باستخدام التناظرية غتب GTPγS (جانسين 5'-[γ-thio]triphosphate) التي لا يمكن استخدام مؤنزم الذاتية الأخرى. يسمح هذا فعالية كيناز "تسمية" ركائز لها داخل هذه العينة لعزل اللاحقة وتحديد الهوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تأكد من أن المواد المطلوبة متاحة ومعدة بشكل صحيح (انظر الجدول للمواد).
1-إعداد
- ميكانيكيا عينة الأنسجة (1-2 مغ أنسجة في 100 ميليلتر من تحلل العازلة، الجدول 1) أو استزراع الخلايا (10 سم اللوحة التي روافد 80-90 ٪ في 350 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت)، مع أن الهدف جمع ما مجموعة 900 ميكروليتر من عينة للتجربة. لاحظ أن هذا المجلد في فائض طفيف لما هو مطلوب لهذه التجربة هو موضح أدناه.
- تدور أسفل العينات باستخدام الطرد المركزي في 17,500 س ز لمدة 3 دقائق على 4 درجة مئوية. عند الانتهاء، نقل 270 ميليلتر من المادة طافية على كل من ثلاثة أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.7 مل جديدة. سيكون هناك ما يقرب من 90 ميليلتر المتبقية. إزالة 40 ميليلتر لاستخدامها كعنصر تحكم "الإدخال" والمكان في أنبوب جديد. ضع جميع العينات على الجليد.
2-كيناز المقايسة: ثيوفوسفوريليشن والالكله
- تسمية الأنابيب الثلاثة التي تحتوي على 270 في كل ميليلتر كما يلي: "ركسن كيناز"، "GTPγS فقط"، و "بنبم (فنيتروبيزيل mesylate) فقط". إعداد ردود فعل كيناز.
- للأنبوب "ركسن كيناز"، إضافة 2.7 ميليلتر (ما يعادل 1,350 U) من CK2، ثم إضافة ميليلتر 2.7 من 2.5 مم GTPγS.
- للأنبوب "GTPγS فقط"، أضف ميليلتر 2.7 من 2.5 مم GTPγS ثم قم بإضافة ميليلتر 2.7 من تحلل المخزن المؤقت.
- للأنبوب "بنبم فقط"، قم بإضافة 5.4 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل. نفض الغبار جميع الأنابيب المزيج ومن ثم ضع فورا على الجليد.
- احتضان جميع الأنابيب الثلاثة لمدة 1 دقيقة في حمام مائي 30 درجة مئوية. بعد التفريخ، إضافة ميليلتر 13.5 12 مغ/مل بنبم إلى جميع الأنابيب الثلاثة. عكس لخلط العينات. احتضان هذه العينات في درجة حرارة الغرفة ح 1.
- بعد البدء في الحضانة في الخطوة 2، 2، إعداد الأعمدة ديسالتينج، في أقرب وقت ممكن كما العملية تستغرق حوالي 45 دقيقة.
3-إعداد الملحي الأعمدة
- في البداية إعداد الأعمدة (3 لهذه التجربة مثال) بعكس كل عمود عدة مرات لإعادة تعليق Sephadex G-25 الراتنج في المخزن المؤقت لتخزين. تسمح الراتنج بتسوية بإرفاق كل عمود إلى موقف المشبك والسماح لها الجلوس دون عائق لمدة 5 دقائق تقريبا.
- عقب تسوية الراتنج Sephadex G-25، إزالة القبعات من كل من أعلى وأسفل العمود للسماح بتخزين المخزن المؤقت لاستنزاف بالجاذبية، وأنبوب توضع أدناه فتح أسفل لجمع خلال التدفق لتجاهل.
- مجرد نفاد المخزن المؤقت لتخزين، إضافة حوالي 2.7 مل تحلل المخزن المؤقت لأجل حجته الأعمدة. جمع-التدفق عبر وتجاهل. كرر 3 مرات. وبعد الموازنة النهائية، الأعمدة جاهزة للخطوة 4.1.
4-إزالة بنبم
- بعد حضانة ح 1 (الخطوة 2، 2) وعمود يتم إعداد (الخطوة 3) كاملة، وتطبيق النماذج للأعمدة. قم بتسمية كل عمود كما يلي: "ركسن كيناز" و "GTPγS" و "بنبم فقط". تحميل جميع كل عينة على العمود به كل منهما. جمع وتجاهل في التدفق من خلال.
- تغسل العينات عن طريق إضافة ميليلتر 420 من المخزن المؤقت لتحلل لكل عمود. تسمح تحلل المخزن المؤقت لتصفية من خلال العمود وجمع خلال التدفق لتجاهل. بعد هذه الخطوة الغسيل، وضع الأنابيب في موضع لجمع العينات.
- الوت عينات بإضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل لكل عمود. جمع في التدفق من خلال يحتوي الآن على ثيوفوسفوريلاتيد ويؤلكل CK2 ركائز.
5-إيمونوبريسيبيتيشن: الجزء الأول
- إعداد العينات إيمونوبريسيبيتيشن بأول ميليلتر 80 إزالة لنموذج "شطف الإدخال في عنصر تحكم" من كل من التيونس كل منها ("ركسن كيناز" و "GTPγS" و "بنبم فقط") التي تم جمعها في الخطوة 4، 3. وبعد إزالة 80 ميليلتر من كل عينة، سيكون هناك حوالي 420 ميليلتر المتبقية كل عينة.
- تقسيم كل عينة إلى أنابيب 2 يحتوي على كل 200 ميليلتر. قم بتسمية كل أنبوبة منها: "إستر ثيوفوسفاتي مكافحة ركسن كيناز" "ركسن كيناز IgG"، "إستر ثيوفوسفاتي مكافحة GTPγS"، "مفتش GTPγS"، "إستر ثيوفوسفاتي مكافحة بنبم" و "مفتش بنبم".
- إضافة 2.8 ميكروغرام من جسم إستر ثيوفوسفاتي المضادة لكل من الأنابيب المسماة إستر ثيوفوسفاتي المضادة و 2.8 ميكروغرام من جسم التحكم ايستب لكل من الأنابيب المسماة مفتش. وضع أنابيب على دوار عند 4 درجة مئوية عن ح 2.
- البدء في إعداد البروتين A/G حبة خلال 15 دقيقة الأخيرة للاحتضان ح 2 في الخطوة 5، 2.
6-البروتين إعداد حبة [اغروس] A/G
- باختصار دوامة أنبوب التخزين لضمان الخرز تماما إعادة تعليق. قطع نهاية P200 نصيحة ماصة باستخدام شفرة حلاقة نظيفة من أجل زيادة قياس الحجم. بيبيت 100 ميليلتر الملاط حبة كل إيمونوبريسيبيتيشن في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.7 جديدة. على سبيل المثال، هناك حاجة إلى ما مجموعة 6 أنابيب.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب في س 17,500 ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية وتجاهل. إعادة تعليق الخرز في 200 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل ودوامه بإيجاز. كرر تدور وتغسل الخطوات 3 مرات.
- عقب الغسيل النهائي، وضع الخرز على الجليد حتى تكتمل الحضانة في الخطوة 5، 2.
7-إيمونوبريسيبيتيشن: الجزء الثاني
- وبعد تفريخ ح 2 من الخطوة 5، 2، تدور أسفل العينات في س 17,500 ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. عقب الطرد المركزي إضافة 200 ميليلتر من كل عينة للأنابيب مع الخرز غسلها. وضع الأنابيب على دوار عند 4 درجة مئوية عن ح 1.
- وبعد تفريخ ح 1، الطرد المركزي هذه الأنابيب في س 17,500 ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية. المقبل إزالة 40 ميليلتر من المادة طافية من كل عينة وحفظ كعنصر "تحكم استنفاد" (مجموع 6 أنابيب). قم بإزالة ما تبقى من المادة طافية وتجاهل. الحرص على عدم الإخلال بالخرز.
- تغسل العينات بإضافة 200 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل وفورتيكسينج بإيجاز. ثم الطرد المركزي في س 17,500 ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية وتجاهل. تكرار الغسيل وتدور الخطوات 3 مرات. الحرص على عدم تعكير الخرز خلال هذه الخطوات.
- بعد إكمال الخطوات الغسيل، إضافة 50 ميليلتر من المخزن المؤقت للعينة x 2 لكل عينة تحتوي على خرز. بالنسبة لجميع العينات الأخرى، إضافة 8 ميليلتر من 6 × عينة المخزن المؤقت: "عنصر تحكم الإدخال"، "شطف عناصر تحكم الإدخال"، وعناصر "استنفاد".
- حالما تتم إضافة العازلة للأنابيب، بيبيت صعودا وهبوطاً لمزيج، وتسخين جميع العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل المتابعة مع الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.
8-تحليل/التحقق من النتائج
- التحقق من نجاح CK2-تعتمد على ثيوفوسفوريليشن والالكله.
- لتحديد كفاءة ثيوفوسفوريليشن CK2 بوساطة في الخطوة 2، 2، أداء الحزب الديمقراطي الصربي صفحة والنشاف الغربية عن طريق تشغيل 15-20 ميليلتر شطف "الضوابط" التي تم جمعها في الخطوة 5، 1 في جل polyacrylamide 12.5% الإدخال.
- التحقيق الأغشية مع الأضداد التالية: مكافحة ثيوفوسفاتي إستر، مكافحة--CK2α، ومكافحة جابده (أو عنصر تحكم آخر تحميل المناسبة). إذا كانت هذه الخطوة ناجحة، ينبغي أن تكون إشارة إستر ثيوفوسفاتي مكافحة زيادة واضحة في حارة "ركسن كيناز" مقارنة بمسارين الأخرى (الشكل 2).
- تصور المخصب ركائز المفترضة من CK2 وتحديد هوية البروتين.
- لتقييم ما إذا كانت الخطوات إيمونوبريسيبيتيشن التي كانت ناجحة، قم بتشغيل 25-30 ميليلتر من عينات التيد من الخرز في الخطوة 7، 4 في جل polyacrylamide 12.5% منفصلة. التأكد من أن جميع المعدات نظيفة وارتداء القفازات في جميع الأوقات أثناء هذه الخطوة للحد من التلوث.
- وصمة عار للهلام مع أخذ الأزرق أن تصور البروتينات المخصب من مراحل مختلفة من البروتوكول التجريبي (الشكل 3). باستخدام رازوربلاديس الجديد، المكوس بعناية فريدة من نوعها العصابات موجودة في حارة "كيناز ركسن ثيوفوسفاتي مكافحة إستر الملكية الفكرية"، مشيراً إلى أوزانها الجزيئية التقريبية.
- يقدم هذه العصابات لتحديد البروتين بالسائل اللوني/جنبا إلى جنب الكتلي (LC-MS/MS) (الشكل 4). إذا كانت تتوفر الأجسام المضادة الموجهة ضد البروتينات التي تم تحديدها، تأكيد نتائج الطيف الكتلي بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة وإيمونوبلوتينج من المدخلات، والنضوب، وكسور الملكية الفكرية التي تم جمعها خلال بروتوكول (الشكل 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد رسم تخطيطي للإجراءات التجريبية في الشكل 1. الأساس الكامنة وراء هذا الأسلوب هو القدرة غير عادية CK2 لاستخدام أنشئ لنقل الفريق فوسفوريل. ويؤدي إضافة خارجية holoenzyme CK2 جنبا إلى جنب مع التناظرية غتب، GTPγS، إلى خلية ليستي ثيوفوسفوريليشن ركائز CK2 الذاتية. المعاملة اللاحقة من مع فكاشف الكيلاتينج-نيتروبينزيل mesylate (بنبم) يولد مجموعة إستر ثيوفوسفاتي على هذه البروتينات الركازة محددة التي يمكن بعد ذلك استخدام جسم إستر مكافحة--ثيوفوسفاتي إيمونوبريسيبيتاتيد وفي نهاية المطاف حددتها الكتلي. ويبين الشكل 2 نتيجة إيجابية بعد إضافة CK2 و GTPγS وبنبم ثم إلى T98G (جليوبلاستوما) خلية ليساتي. هذه النتائج تثبت أن ثيوفوسفوريليشن تعتمد على CK2 والالكله اللاحقة كانت ناجحة. كما هو متوقع، يلاحظ إشارة إستر ثيوفوسفاتي المضادة معززة من النشاف الغربية فقط في الحارة التي تحتوي على رد فعل كيناز كاملة ولا GTPγS فقط-وعينات بنبم معاملة فقط. هو مبين في الشكل 3 هلام الملون الأزرق أخذ إيمونوبريسيبيتاتيد والبروتينات التيد استخدام التحكم ايستب مفتش أو الأجسام المضادة ثيوفوسفاتي إستر في وجود أو غياب CK2 الزائدة و/أو GTPγS. كما تثبت هذه البيانات نتيجة إيجابية كما العصابات فريدة متعددة تتجلى فقط في مكافحة ثيوفوسفاتي إستر IP لين فيه ليساتي كان المحتضنة مع خارجية CK2 و GTPγS. الفرقة نجمية اقتطعت من الجل والمقدمة لتحديد البروتين من الطيف الكتلي. ويبين الشكل 4 الممثل البيانات التي تم الحصول عليها عن طريق التحليل والمطيافيه الشامل بما في ذلك تحديد البروتين ونسبة التغطية، وعدد من الببتيدات فريدة من نوعها وحدد كل البروتين داخل الفرقة. يظهر هي يضرب العشرة الأوائل من الفرقة المقدمة (الشكل 3)، ومعلومات بشأن ما إذا كان البروتين حددت سابقا كركيزة CK215،،من1617. وأكد هوية واحدة من ركائز المعروفة إيمونوبريسيبيتاتيد CK2، نوكليولين15، الحزب الديمقراطي الصربي صفحة و immunoblotting للكسور المشار إليها باستخدام جسم مضاد نوكليولين مكافحة.
رقم 1: رسم تخطيطي لاستراتيجية تجريبية. أنشئ التناظرية، أنشئγS، جنبا إلى جنب مع المؤتلف الزائدة CK2 holoenzyme يتم إضافة خلية أو نسيج ليستي ويسمح ثيوفوسفوريليشن ركائز CK2 ولكن ليس بغيرها مؤنزم الذاتية. ثيوفوسفوريلاتيد ركائز هي التالية يؤلكل مع بنبم، توليد مجموعة إستر ثيوفوسفاتي في هذه البروتينات، والتي يتم التقاطها ثم عبر إيمونوبريسيبيتيشن (IP) لتحديد اللاحقة بالترادف اللوني السائل الطيف الكتلي ( LC-MS/MS). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التحقق ثيوفوسفوريليشن CK2-تعتمد في كل خلية ليستي. كانت المحتضنة ليساتيس خلية كله إعداد من الخلايا T98G مع غتبγS في الوجود (رد فعل كيناز) أو غياب خارجية holoenzyme CK2 المؤتلف (أنشئγS فقط). بنبم أضيفت لاحقاً إلى ردود الفعل المشار إليها، وتم حل عينات من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تليها إيمونوبلوتينج مع الأجسام المضادة المشار إليها. وترد في كاتشين علامات البروتين الوزن الجزيئي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: إيمونوبريسيبيتيشن بروتينات الركيزة CK2 المفترضة. تخصيب اليورانيوم والتصور من ركائز CK2 المفترضة (الثالثة لين) يتجلى كعصابات فريدة متعددة بعد إيمونوبريسيبيتيشن مع الأجسام المضادة ثيوفوسفاتي إستر. وحلت إيمونوبريسيبيتاتيس من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة والهلام كانت ملطخة بأخذ الأزرق. الفرقة علامة نجمية اقتطعت من الجل والمقدمة لتحديد البروتين من الطيف الكتلي. وترد في كاتشين علامات البروتين الوزن الجزيئي. IP = إيمونوبريسيبيتيشن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تحديد وتأكيد من البروتينات كركائز ل CK2 في المختبر. البيانات التي تم الحصول عليها من الطيف الكتلي يوضح أن المعروفة سابقا15،،من1617 فضلا عن ركائز CK2 رواية المفترضة تم تحديد استخدام هذا النهج التجريبي. يظهر هي أعلى عشر البروتينات تحدد من الفرقة قصت (أعلى). وأكد هوية نوكليولين، ركيزة CK2 معروفة، إيمونوبلوتينج للكسور المشار إليها باستخدام جسم مضاد نوكليولين المضادة (أسفل). وترد في كاتشين علامات البروتين الوزن الجزيئي. IP = إيمونوبريسيبيتيشن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| كاشف تركيز المخزون | كاشف التركيز النهائي | مثال على إضافة وحدات تركيزات الأسهم على أساس |
| 1 م تريس الأس الهيدروجيني 7.4 | 20.0 ملم | 200 ميليلتر |
| م 4 كلوريد الصوديوم | 20.0 ملم | 50 ميليلتر |
| 20% Triton X-100 | 0.50% | 250 ميليلتر |
| مجكل م 12 | 10.0 ملم | 100 ميليلتر |
| DTT م 1 | 0.5 مم | 5 ميليلتر |
| مم 200 غ3فو4 | 1.0 مم | 50 ميليلتر |
| 500 ملم NaF | 10.0 ملم | 200 ميليلتر |
| فوسفات β-والغليسيرول 500 مم | 10.0 ملم | 200 ميليلتر |
| ح2س | مل 8.945 | |
| + ميني كاملة 1 علامة التبويب/10 مل | قرص 1 |
الجدول 1. تحلل المخزن المؤقت وصفه (10 مل، 1 X).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، يمكننا وصف أسلوب بيوكيميائية بسيط نسبيا لتحديد ركائز للبروتين كيناز CK2 من عينة بيولوجية معقدة. تستند إلى الخصائص غير عادية الانزيمية CK2 الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول وتشمل ثيوفوسفوريليشن CK2-تعتمد على البروتينات الركازة محددة باستخدام غتبγS وإيمونوبريسيبيتيشن اللاحقة وتحديد هويتها. مع هذه النتائج، وقد أثبتنا فائدة وبراعة في هذا النهج كما نحن الآن تطبيق هذه الاستراتيجية في كل من الخلايا جليوبلاستوما البشرية و المورفولوجية المبايض18.
عدد من الدراسات المنشورة سابقا باستخدام النهج الكمي فوسفوبروتيوميكس الواقع أثبتت نجاحها في تحديد رواية CK2 ركائز19،،من2021،22، 23. ومع ذلك، بعض من هذه الاستراتيجيات جعل استخدام صفائف الركازة المعطل تداولها، وأنه من الممكن أن تكيف البروتين المعطل تداولها قد تجعل موقع الفسفرة محتملة غير قابلة للوصول كيناز. الأسلوب الموصوفة هنا تصاريح الفسفرة داخل بيئة أكثر فسيولوجية أو الأصلية (أي خلية ليستي)، وبالتالي الحد من احتمال عدم إمكانية الوصول إلى الموقع. فائدة أخرى لهذه الاستراتيجية أن مجرد تحديد البروتين يحددها الكتلي، بسهولة يمكن أن يكون إجراء التحقق من صحة ركائز CK2 المفترضة على العينات التي تم جمعها أثناء الإجراء إذا كانت الأجسام المضادة الموجهة ضد الركازة وتتوفر protein(s) للفائدة. على سبيل المثال، باستخدام النشاف الغربية القياسية، ينبغي أن يلاحظ المرء انخفاضا في مستوى البروتين ذات الصلة في عينات المنضب (وظيفة-IP) ووجودها في إيمونوبريسيبيتاتيس إستر ثيوفوسفاتي المضادة كما أثبتنا ل CK2 المعروفة نوكليولين الركازة (الشكل 4).
حد ملحوظة لهذا الأسلوب أن الخطوة النهائية من الإجراءات قبل التحليل بالطيف الكتلي يعتمد على القدرة على تمييز الاختلافات المنفصلة في النطاقات نمط على جل. وبالتالي، فمن الممكن بالتأكيد أن ركائز CK2 محددة قد تضيع إذا كانوا من وفرة منخفضة وذلك الحد الأدنى للكشف البصري. إذا كان أحد تشعر بالقلق إزاء هذا الاحتمال، يمكن استخدام أسلوب أكثر حساسية مثل تلطيخ الفضية لتصور هذه البروتينات بدلاً من استخدام أخذ الأزرق. أحد الاعتبارات إضافية التي ينبغي الاعتراف بأن تحديد عدد من ركائز CK2 قد لا يكون استخدام هذه الاستراتيجية نظراً للمواقع ذات الصلة فسيولوجيا ستكون بالفعل فوسفوريلاتيد في فيفو. وهذا يكاد يكون من المؤكد أن تكون القضية نظراً لنشاط CK2 التأسيسي. وأخيراً، تجدر الإشارة أيضا إلى أن هذه المنهجية تحدد فقط البروتينات كركائز المفترضة من CK2 في المختبر. الاختبارات اللاحقة للتحقق من أن هذه ركائز ذات الصلة فسيولوجيا من CK2 في فيفو مطلوبة، وينبغي أن يستتبع تحديد مواقع الفسفرة تعتمد على CK2 وتقييم إذا الفسفرة من هذه المخلفات خاصة تغيير في استجابة للتلاعب بالنشاط كيناز CK2.
وباختصار، ستيسر هذه الاستراتيجية مقرونة مع النهج التجريبي المصب (تعيين موقع الفسفرة بتحليل الاقتطاع/الحذف، الطفرات توجه الموقع، فحوصات في المختبر و في فيفو الوظيفية، إلخ) الدراسة لهذا كيناز غير عادية وستزيد من فهمنا لمختلف الأدوار التي CK2 يلعب في العديد من النظم البيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان تدعمها جزئيا منحة "رابطة تعزيز البحوث العالمية" من "وزارة الصحة ولاية بنسلفانيا" إلى T.I.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
References
- Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
- Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
- Meggio, F., Pinna, L. A.
- Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
- Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
- Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
- Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
- Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
- Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
- Tawfic, S., et al.
- Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
- Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).
- Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).
- Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
- Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).
- Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
- Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
- McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
- Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
- Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).
- Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460 (2013).
- Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
- Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).
