Summary
이 프로토콜의 목적은 레이블, 풍부, 및 단백질 키 니 아 CK2 세포 lysate 또는 조직 homogenate 같은 복잡 한 생물학 견본에서의 기판 확인 하는 것 이다. 이 메서드는이 목적을 위해 CK2 생물학의 독특한 측면을 활용합니다.
Abstract
키 기판 관계의 연구는 이러한 효소와 생리 및 병 적인 상태에서 그들의 다운스트림 목표의 기능에 대 한 완전 한 이해를 얻기 위해 필수적 이다. CK2 여러 세포질 과정에서 포함 된 기판의 수백의 성장 목록을 진화론 보존된 떠들고/트레오닌 키 니 아 제 이다. 다 면 발현 성 속성으로 인해 식별 및 CK2 기판의 종합 세트 특히 도전 하고있다 고이 중요 한 효소의 연구에서 장애물을 남아 있다. 이 문제를 해결 하려면 우리 대상된 농축 및 상 상속 CK2 기판의 식별을 가능 하 게 하는 다양 한 실험적인 전략을 고안 했다. 이 프로토콜은 lysate 셀 또는 조직에는 기판의 특정 thiophosphorylation에 대 한 허용 CK2의 독특한 듀얼 공동 기질 특이성을 활용 합니다. 이러한 기판 단백질은 이후에 alkylated, immunoprecipitated, 및 액체 크로마토그래피/탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS)에 의해 식별. 우리는 이전 CK2 기판 초파리 난소에서 성공적으로 식별 하이 접근을 사용 하 고 여기 우리가 조사를이 방법의 적응성을 보여주는 인간 세포종 세포에이 프로토콜의 응용 프로그램을 확장 합니다 다양 한 모형 유기 체 및 실험적인 시스템에이 키의 생물학 역할.
Introduction
단백질 kinases는 신호 변환 폭포의 핵심 요소입니다. 이 효소에 의해 기질 단백질의 인 산화는 세포 분열, 물질 대사, 및 다른 사람의 사이에서 분화 하는 중요 한 이벤트를 규제 하는 생물학 응답 elicits. CK2 편 표현, acidophilic 떠들고/트레오닌 키 니 아 하이 인 간에 게 효 모에서 보존 하 고는 transcriptional 규칙에서 apoptosis1 세포 주기 진행에 이르기까지 많은 세포질 과정에 중요 한 역할은 2,3. 효소는 2 개의 촉매 α의 구성 하는 heterotetramer (또는 α') 소 단위 및 2 개의 규제 β 소 단위4. 매우 다 면 발현 성 덧붙여 CK2 두 다른 특이 한 특성의 분석을 복잡 하 게 하는 즉 제정 활동5 와 듀얼 공동 기질 특이성6전시 한다. 이 후자의 속성 기질 단백질의 인 산화에 대 한 ATP로 서 GTP를 사용 하는 기능 CK2 endows.
쥐에서 CK2의 촉매 또는 규제 subunits의 유전 삭제 결과 그것은 개발 및 organogenesis7,8동안 중요 한 역할을 재생을 나타내는 배아 치 사 율. CK2 또한 여러 가지 유형의 암 overexpressed 고 따라서 유망 치료 대상9,,1011를 나타냅니다. 실제로, 특정 억제제 대상 CK2 키 니 아 제 활동은 현재이 목적12,,1314에 대 한 조사를 받고. 동안 억제 CK2의 가능한 옵션을 주어진 다 면 발현 성 자연, 대안 이며 아마도 더 합리적인 접근의 특정 암 진행의 기반이 되는 중요 한 CK2 기판 대상 하는 것. 따라서, 포괄적인 신분증과 CK2 기질 단백질의 특정 조직이 나 종양 유형 내에서이 키의 특정 함수를 elucidating 상당한 이점 될 것 이다.
여기, 우리는 셀 또는 조직 lysate 복잡 한 생물학 견본에서 CK2 기판 식별에 대 한 다양 한 생 화 확 적인 방법 설명. 이 프로토콜은 GTP 아날로그 (guanosine 5'-[γ-thio]triphosphate) 다른 생 kinases 사용할 수 없습니다 GTPγS의 사용에 의해 CK2의 듀얼 공동 기질 특이성을 이용. 효과적으로 "레이블" 후속 격리 및 식별에 대 한이 예제 내에서 기판 하 니 수 있습니다.
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Protocol
참고: 필요한 자료 사용 가능 하 고 제대로 준비 되는지 확인 ( 재료의 표참조).
1입니다. 준비
- 기계적 조직 샘플 (조직 세포의 용 해 버퍼, 표 1의 100 µ L에 1-2 mg) lyse 세포 (세포의 용 해 버퍼의 350 µ L에서 80-90% 합칠 즉는 10 cm 접시) 실험에 대 한 샘플의 900 µ L의 총 수집 되 고 목표와 교양 또는. 이 볼륨의 아래에서 설명 하는 실험에 필요한 약간의 초과에서 note.
- 4 ° c.에 3 분 동안 17500 x g 에서 원심 분리 하 여 샘플 다운 스핀 완료 되 면, 각각 3 개의 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브는 상쾌한의 270 µ L을 전송. 약 90 µ L 남아 있을 것입니다. "입력된 컨트롤" 및 새로운 튜브에 장소 사용할 수 40 µ L을 제거 합니다. 얼음에 모든 샘플을 놓습니다.
2. 키 분석 결과: thiophosphorylation 및 알
- 270 µ L를 포함 하는 것은 다음과 같이 3 개의 튜브 라벨: "니 rxn", "GTPγS만", 및 "PNBM (p nitrobezyl mesylate)만". 니 반응 준비.
- "니 rxn" 튜브를 CK2의 (1350 U에 해당) 2.7 µ L을 추가 다음 2.5 mM GTPγS의 2.7 µ L를 추가 합니다.
- "GTPγS만" 튜브 2.5 m m GTPγS, 2.7 µ L을 추가 하 고 세포의 용 해 버퍼의 2.7 µ L를 추가 합니다.
- "PNBM만" 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 5.4 µ L를 추가 합니다. 모든 튜브 믹스 하 고 다음 즉시 얼음에 장소를 터치 합니다.
- 30 ° C 물 욕조에 1 분에 대 한 모든 3 개의 튜브를 품 어. 부 화, 다음 모든 3 개의 튜브를 12 mg/mL PNBM의 13.5 µ L를 추가 합니다. 샘플 혼합 반전입니다. 1 시간에 대 한 실 온에서이 샘플을 품 어.
- 시작 후는 인큐베이션 단계 2.2에서에서, 빨리 과정 약 45 분 소요 가능한 염 열을 준비 합니다.
3입니다. 열 담의 준비
- 처음 반전 저장 버퍼에 다시 Sephadex G-25 중단 수 지를 여러 번 각 열에 의해 열 (이 예에서는 실험 3)를 준비 합니다. 수 지 클램프 스탠드에 각 열을 연결 하 고 약 5 분 동안 그대로 앉아 시키는 하 여 정착을 허용 합니다.
- 맨 아래 하단 개방 폐기에 대 한 흐름을 통해 수집 하는 튜브를 중력에 의해 배수 저장 버퍼 수 있도록 열 아래쪽에서 뚜껑을 제거 Sephadex G-25 수 지의 정착에 따라.
- 일단 저장소 버퍼 고갈 열 equilibrate 위해 세포의 용 해 버퍼의 약 2.7 mL를 추가 합니다. 흐름을 통해 수집 하 고 삭제. 3 회 반복 한다. 최종 평형에 따라 열 단계 4.1에 대 한 준비가.입니다.
4입니다. PNBM의 제거
- 1 h 인큐베이션 (2.2 단계) 및 열 준비 (3 단계) 완료 되 면 샘플 열에 적용 됩니다. 각 열을 다음과 같이 레이블: "니 rxn", "GTPγS만", 및 "PNBM만". 각각의 열에 각 샘플의 모든 로드. 수집 하 고 흐름을 통해 삭제.
- 각 열에 세포의 용 해 버퍼의 420 µ L을 추가 하 여 샘플을 씻으십시오. 세포의 용 해 버퍼 필터링 하는 열을 통해 고 폐기를 위해 흐름 통해 수집을 허용 합니다. 이 세척 단계 튜브 샘플의 컬렉션에 대 한 위치에 배치 합니다.
- 각 열에 세포의 용 해 버퍼의 500 µ L을 추가 하 여 샘플을 elute. 지금 포함 alkylated CK2 기판 및 thiophosphorylated 흐름-통해 수집 합니다.
5. Immunoprecipitation: 1 부
- 각각 elutions ("니 rxn", "GTPγS만", 및 "PNBM만")의 각 단계 4.3에서에서 수집에서 "차입 입력 제어" 샘플에 대 한 첫 번째 제거 80 µ L에 의해 immunoprecipitation에 대 한 샘플을 준비 합니다. 각 샘플에서 80 µ L의 제거, 다음 약 420 µ L 샘플 당 남아 있을 것입니다.
- 200 µ L을 포함 하는 2 관으로 각 샘플을 분할. 각 각 튜브 라벨: "니 rxn 안티 thiophosphate 에스테 르", "니 rxn IgG", "GTPγS 안티 thiophosphate 에스테 르", "GTPγS IgG", "PNBM 안티 thiophosphate 에스테 르", 및 "PNBM IgG".
- 안티 thiophosphate 에스테 르 항 체 안티 thiophosphate 에스테 르 레이블 튜브의 각의 2.8 µ g와 2.8 µ g isotype 제어 항 체 IgG 라는 튜브의 각의 추가 합니다. 2 h 4 ° C에서 회전자에 튜브를 놓습니다.
- 5.2 단계에서 2 h 외피의 마지막 15 분 동안 단백질 A/G 구슬의 준비를 시작 합니다.
6. 단백질 A/G agarose 구슬 준비
- 짧게 소용돌이 구슬 되도록 저장 튜브는 완전히 다시 일시 중단. p 200의 끝을 잘라 피 펫 팁을 증가 하기 위하여 깨끗 한 면도날을 사용 하 여 표시기 크기. 피펫으로 100 µ L 당 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브에 immunoprecipitation 구슬 슬러리의. 이 예제에서는 6 튜브의 총 필요 합니다.
- 17500 x g 4 ° c.에 1 분 동안에 관을 원심 상쾌한을 제거 하 고 삭제. 세포의 용 해 버퍼와 짧게 소용돌이의 200 µ L에 다시 구슬을 일시 중단 합니다. 스핀을 반복 하 고 단계 3 번 세척.
- 5.2 단계에서 부 화 완료 될 때까지 최종 세척 후 얼음에 비즈를 놓습니다.
7. Immunoprecipitation: 부 II
- 단계 5.2에서에서 2 h 부 화 후 4 ° c.에 3 분에 17500 x g 에서 샘플 다운 스핀 원심 분리 후 세척된 구슬 튜브를 사용 각 샘플에서 200 µ L을 추가 합니다. 1 시간에 4 ° C에서 회전자에 튜브를 놓습니다.
- 1 h 부 화에 따라 원심 17500 x g 4 ° c.에 1 분 동안에 관 다음 각 예제에서 상쾌한의 40 µ L을 제거 하 고 "고갈 제어"로 저장 (총 6 관). 상쾌한 및 폐기의 나머지 부분을 제거 합니다. 알아서 하지 구슬을 방해.
- 세포의 용 해 버퍼 및 vortexing의 200 µ L를 간단히 추가 하 여 샘플을 씻으십시오. 다음 4 ° c.에 1 분 동안 17500 x g 에서 원심 상쾌한을 제거 하 고 삭제. 세척을 반복 하 고 단계 3 번 회전. 알아서 하지 다음이 단계 동안 구슬을 방해.
- 세척 단계를 완료 한 후 구슬을 포함 하는 각 샘플에 2 x 샘플 버퍼의 50 µ L를 추가 합니다. 다른 모든 샘플에 대 한 샘플 버퍼 x 6의 8 µ L를 추가: "입력된 컨트롤", "차입 입력된 컨트롤" 및 "고갈 컨트롤".
- 일단 버퍼 튜브, 피펫으로 위쪽 및 아래쪽을 혼합, SDS 페이지를 진행 하기 전에 5 분 동안 95 ° C에서 모든 샘플을 열에 추가 됩니다.
8입니다. 결과의 분석/검증
- 성공적인 CK2 종속 thiophosphorylation 알을 확인 합니다.
- 2.2 단계에서 thiophosphorylation CK2 중재의 효능을 확인 하려면 SDS 페이지와 15-20 µ L "차입 입력 컨트롤" 12.5 %polyacrylamide 젤에 단계 5.1에서에서 수집을 실행 하 여 서 부 럽을 수행 합니다.
- 다음 항 체와 세포 막 프로브: 안티-thiophosphate 에스테 르, 안티-CK2α, 및 안티-GAPDH (또는 다른 적절 한 로드 제어). 이 단계에 성공 하면 향상 된 안티-thiophosphate 에스테 르 신호 다른 두 레인 (그림 2)에 비해 "니 rxn" 차선에서 해야 합니다.
- 시각화 CK2의 풍부한 putative 기판 고 단백질 정체성을 결정 합니다.
- Immunoprecipitation 단계 성공한 경우 평가, 별도 12.5 %polyacrylamide 젤에 7.4 단계에서 구슬에서 eluted 샘플의 25-30 µ L를 실행 합니다. 모든 장비는 깨끗 한 장갑을 착용 항상이 단계 동안 오염 최소화를 확인 합니다.
- 실험 프로토콜 (그림 3)의 다양 한 단계에서 농축된 단백질을 시각화 하기 위해 블루 Coomassie와 젤 얼룩. 새로운 razorblades를 사용 하 여 신중 하 게 소비 세 독특한 밴드에에서 존재 "니 rxn 안티 thiophosphate 에스테 르 IP" 레인, 그들의 대략 분자 무게를 지적.
- 액체 크로마토그래피/탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) (그림 4)에 의해 단백질 식별이 밴드를 제출 합니다. 확인 된 단백질에 대하여 지시 하는 항 체를 사용할 수 있는 경우 입력, 고갈, SDS 페이지 질량 분석의 결과의 immunoblotting 확인 하 고 IP 분수 수집 프로토콜 (그림 4)의 과정 동안.
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Representative Results
실험 절차의 회로도 그림 1에 제공 됩니다. 기술의 기본으로 phosphoryl 그룹 전송을 위한 GTP를 사용 하 여 CK2의 특이 한 능력 이다. 에 세포 lysate thiophosphorylation 생 CK2 기판의 GTP 아날로그, GTPγS, 함께 exogenous CK2 holoenzyme의 추가. 안티 thiophosphate 에스테 르 항 체를 사용 하 여 immunoprecipitated 수 다음이 특정 기질 단백질에 thiophosphate 에스테 르 moiety를 생성 하는 alkylating 시 약 p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)와 lysate의 후속 처리 그리고 궁극적으로 질량 분석에 의해 확인 된. T98G CK2와 GTPγS 그리고 PNBM의 추가 다음과 같은 긍정적인 결과 묘사 하는 그림 2 (세포종) 세포 lysate. 이 결과 CK2 종속 thiophosphorylation 및 후속 알 성공 했다 보여줍니다. 예상 했던 대로, 포함 하는 완전 한 니 반응 하는 레인에서 서만 그리고 GTPγS 전용-및 PNBM만 처리 샘플 서쪽 blotting에 의해 향상 된 안티-thiophosphate 에스테 르 신호 관찰 됩니다. 그림 3은 immunoprecipitated 및 eluted 단백질 과잉 CK2 GTPγS의 유무에 isotype 제어 IgG 또는 안티-thiophosphate 에스테 르 항 체를 사용 하 여 Coomassie 파란 얼룩이 젤. 여러 독특한 밴드는 분명 안티 thiophosphate 에스테 르 IP 레인에는 lysate 했다 incubated exogenous CK2와 GTPγS에만 이러한 데이터 또한 긍정적인 결과 보여 줍니다. 별표 표시 된 밴드 젤에서 excised 되었고 질량 분석에 의해 단백질 식별에 대 한 제출. 그림 4 는 단백질 식별, 백분율 범위, 및 고유 펩 티 드 단백질 밴드 내에서 당 식별 번호를 포함 하 여 대량 spectrometric 분석 하 여 얻은 대표 데이터를 보여 줍니다. 제출된 밴드 (그림 3)에서 상위 10 안타는 표시 여부는 단백질 이전 발견 되었습니다 CK215,,1617의 기판에 대 한 정보. 알려진된 immunoprecipitated CK2 기판, nucleolin15, 중의 신분은 SDS 페이지 및 안티-nucleolin 항 체를 사용 하 여 지정 된 분수의 immunoblotting에 의해 확인 됐다.
그림 1: 실험적인 전략의 회로도. GTP 아날로그 GTPγS, 초과 재조합 CK2 holoenzyme 함께 lysate 조직 또는 셀에 추가 되 고 다른 내 생 kinases 아니라 CK2에 의해 기판의 thiophosphorylation에 대 한 수 있습니다. Thiophosphorylated 기판은 PNBM, immunoprecipitation (IP)를 통해 캡처한 다음이 단백질에 thiophosphate 에스테 르 moiety 후속 식별 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (생성 된 alkylated 다음 LC-MS/MS). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 전체 세포 lysate CK2 종속 thiophosphorylation의 유효성 검사. 전체 세포 lysates T98G 세포에서 준비 했다 (키 니 아 제 반응) 유무 (GTPγS만) 외 인 재조합 CK2 holoenzyme의에 GTPγS와 알을 품을. PNBM 이후에 표시 된 반응에 추가 했다 고 샘플 SDS 페이지 뒤에 표시 된 항 체와 immunoblotting 해결 했다. KDa 단백질 분자량 마커 표시 되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 상 상속 CK2 기질 단백질의 Immunoprecipitation. 농축 및 상 상속 CK2 기판의 시각화 (3 차선) 여러 독특한 밴드 안티 thiophosphate 에스테 르 항 체와 immunoprecipitation 다음으로 분명 하다. Immunoprecipitates SDS 페이지에 의해 해결 하 고 젤 Coomassie 파란 물 했다. 표시 된 밴드는 젤에서 excised 되었고 질량 분석에 의해 단백질 식별에 대 한 제출. KDa 단백질 분자량 마커 표시 되어 있습니다. IP = immunoprecipitation. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 신분증과 CK2에서 생체 외에서의 기판으로 단백질의 확인. 질량 분석에 의해 얻어진 데이터 이전 알려진된15,,1617 뿐만 아니라 상 상속 소설 CK2 기판이 실험 방법을 사용 하 여 식별 된 보여 줍니다. 톱 10 단백질 삭제 밴드 (맨 위)에서 식별은입니다. Nucleolin, 알려진된 CK2 기판의 정체성 immunoblotting 안티-nucleolin 항 체 (아래)를 사용 하 여 지정 된 분수의 의해 확인 됐다. KDa 단백질 분자량 마커 표시 되어 있습니다. IP = immunoprecipitation. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 시 약 재고 농도 | 시 약 최종 농도 | 볼륨에 따라 재고 농도 추가 하는 예제 |
| 1 M Tris pH 7.4 | 20.0 m m | 200 Μ L |
| 4 M NaCl | 20.0 m m | 50 Μ L |
| 20% 트라이 톤 X-100 | 0.50% | 250 Μ L |
| 1 M MgCl2 | 10.0 m m | 100 Μ L |
| 1 M DTT | 0.5 m m | 5 Μ L |
| 200 m m 나3보4 | 1.0 m m | 50 Μ L |
| 500 mM NaF | 10.0 m m | 200 Μ L |
| 500 m m β-글리세롤 인산 염 | 10.0 m m | 200 Μ L |
| H2O | 8.945 mL | |
| + 1 완전 한 미니 탭/10 mL | 1 태블릿 |
표 1입니다. 세포의 용 해 버퍼 조리법 (10ml, 1 X).
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Discussion
여기, 우리는 복잡 한 생물학 견본에서 단백질 키 니 아 제 CK2의 기질을 식별 하는 데 상대적으로 간단한 생 화 확 적인 방법 설명. 이 프로토콜의 중요 한 단계 CK2의 특이 한 효소 속성에 기반 하 고 GTPγS 및 후속 immunoprecipitation 식별을 사용 하 여 특정 기질 단백질의 CK2 종속 thiophosphorylation를 포함 합니다. 이러한 결과 함께 우리 시연 유틸리티와이 접근의 다양성으로 우리가 지금 인간의 세포종 세포에 초파리 난소18이 전략을 적용.
양적 phosphoproteomics 접근을 사용 하 여 이전에 게시 연구의 수 실제로 소설 CK2 기판19,20,,2122, 를 식별 성공 입증 그러나 23., 이러한 전략의 일부 고정된 기판 배열의 사용 하 고 고정된 단백질의 구조는 잠재적인 인 산화 사이트는 키에 액세스할 수 없게 렌더링 수 있습니다. 여기에 설명 된 기술을 허용 (즉, 셀 lysate), 더 많은 생리 적 또는 네이티브 환경 내에서 인 산화 함으로써 사이트 어려움의 확률을 감소. 이 전략의 또 다른 이점은 단백질 확인 질량 분석에 의해 결정 됩니다, 일단 putative CK2 기판의 유효성 검사 쉽게 수행할 수 있습니다 항 체는 기질에 대하여 지시 하는 경우 절차 동안 수집 된 샘플은 관심의 protein(s) 사용할 수 있습니다. 예를 들어 표준 서 부 럽을 사용 하 여, 하나 관찰 해야 고갈된 (게시물-IP) 샘플에 관련 된 단백질 및 안티 thiophosphate 에스테 르 immunoprecipitates에 그것의 존재의 수준에 있는 감소와 같이 우리는 알려진된 CK2에 대 한 기판 nucleolin (그림 4)
이 방법의 주목할 만한 한계 질량 분석에 의해 분석 이전 절차의 마지막 단계는 젤에 패턴 밴딩에 개별 차이 분별 하는 능력에 의존 이다. 따라서, 그것은 확실히 가능성이 낮은 풍부의 경우 특정 CK2 기판 놓칠 수 있습니다 따라서 비주얼 검색의 제한. 하나는이 가능성에 대해 우려 하고있다, 만약 실버 얼룩 같은 더 민감한 방법 Coomassie blue를 사용 하는 대신 이러한 단백질을 시각화 하기 위해 사용할 수 있습니다. 추가 고려 인정 해야 하는 다양 한 CK2 기판 하지 식별 될 수 있습니다 이후 순수 관련 사이트 phosphorylated 비보에이미 있을 것입니다이 전략을 사용 하 여 이다. 이것은 거의 확실히 CK2의 제정 활동을 주어진 경우 에입니다. 마지막으로, 그것은 또한 주목 해야한다는이 방법론만 식별 단백질 CK2에서 생체 외에서의 putative 기판. 이들은 CK2에서 vivo에서 의 순수 관련 기판 확인 하는 후속 분석이 필요 하 고 이러한 특정 잔류물의 인 산화는 경우 CK2 종속적 인 산화 사이트 및 평가 수반 한다 응답 CK2 키 니 아 제 활동의 조작으로 변경.
요약 하자면, 다운스트림 실험적인 접근 (인 산화 사이트 매핑 잘라내기/삭제 분석, 사이트 지시 된 mutagenesis, 기능성 생체 외에서 그리고 vivo에서 분석 실험, 등)과 함께이 전략 연구를 촉진 한다 이 특별 한 키의 CK2 여러 생물 학적 시스템에서 수행 하는 다양 한 역할에 대 한 우리의 이해를 증가 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 펜실베니아 보건에서 T.I.S.의 연방 보편적인 연구 향상 그랜트에 의해 부분적으로 지원
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
References
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