Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist zu beschriften, zu bereichern und Substrate der Proteinkinase CK2 aus einer komplexen biologischen Probe z. B. eine Zelle lysate oder Gewebe Homogenat zu identifizieren. Diese Methode nutzt die einzigartigen Aspekte der CK2 Biologie für diesen Zweck.
Abstract
Das Studium der Kinase-Substrat Beziehungen unbedingt ein vollständiges Verständnis der Funktionen von dieser Enzyme und ihre nachgelagerten Ziele in physiologische und pathologische Zustände zu gewinnen. CK2 ist ein evolutionär konservierte Serin/Threonin-Kinase mit einer wachsenden Liste von Hunderten von Substraten in mehreren zellulären Prozessen beteiligt. Aufgrund seiner pleiotropen Eigenschaften ist zu identifizieren und zu charakterisieren ein umfassendes Set an CK2 Substrate besonders anspruchsvoll und bleibt eine Hürde in der Studie dieses wichtigen Enzyms. Um dieser Herausforderung zu begegnen, haben wir eine vielseitige experimentelle Strategie entwickelt, die es die gezielte Anreicherung und Identifizierung von vermeintlichen CK2 Substrate ermöglicht. Dieses Protokoll nutzt die einzigartige dual Co Substratspezifität der CK2 zulassend bestimmte Thiophosphorylation der Substrate in einer Zelle oder eines Gewebes lysate. Diese Substrat Proteine werden im Anschluss alkyliert, Immunoprecipitated, und durch flüssige Chromatographie/Tandem Massenspektrometrie (LC-MS/MS) identifiziert. Wir haben früher dieser Ansatz erfolgreich CK2 Substrate von Drosophila Eierstöcken identifizieren und hier verlängern wir die Anwendung dieses Protokolls zu menschlichen Glioblastom-Zellen, illustrieren die Anpassungsfähigkeit dieser Methode zu untersuchen, die biologische Rollen dieser Kinase in verschiedenen Modellorganismen und experimentellen Systemen.
Introduction
Proteinkinasen sind Schlüsselkomponenten der Transduktion Signalkaskaden. Phosphorylierung von Proteinen Substrat durch diese Enzyme entlockt biologische Reaktionen, die kritische Ereignisse, die Kontrolle der Zellteilung, Stoffwechsel und Differenzierung, unter anderem zu regulieren. CK2 ist ein ubiquitär ausgedrückt, acidophilen Serin/Threonin-Kinase, die ist von Hefe für den Menschen erhalten und spielt eine wichtige Rolle in vielen zellulären Prozessen von transcriptional Regelung bis hin zu Zellzyklus Progression zu Apoptose1 ,2,3. Das Enzym ist ein Heterotetramer bestehend aus zwei katalytischen α (oder α') Untereinheiten und zwei regulatorischen β Untereinheiten4. Abgesehen davon, dass hoch pleiotrope, Exponate CK2 zwei andere ungewöhnlichen Eigenschaften, die ihre Analyse erschweren nämlich konstitutive Aktivität5 und dual Co Substrat Spezifität6. Diese letztere Eigenschaft verleiht CK2 mit der Fähigkeit, GTP sowie ATP für die Phosphorylierung von Proteinen Substrat verwenden.
Genetische Löschung der katalytischen oder regulatorischen Untereinheiten der CK2 bei Mäusen führt zu embryonalen Tödlichkeit darauf hinweist, dass es entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Organogenese7,8 spielt. CK2 ist auch in verschiedenen Arten von Krebs überexprimiert und stellt damit eine vielversprechende therapeutische Ziel9,10,11. In der Tat spezifische Inhibitoren dieses Ziel CK2-Kinase-Aktivität werden derzeit untersucht für diesen Zweck12,13,14. Während Hemmung der CK2 ist ein gangbarer Weg, angesichts seiner pleiotrope Natur, eine Alternative und rationaler Ansatz vielleicht wäre auf kritische CK2 Substrate, die das Fortschreiten bestimmter Krebsarten zugrunde liegen. Daher wäre die umfassende Identifizierung und Charakterisierung von CK2 Substrat Proteine von erheblichem Nutzen für die Aufklärung die spezifische Funktion(en) von dieser Kinase innerhalb eines bestimmten Gewebes oder Tumor-Typs.
Hier beschreiben wir eine vielseitige biochemische Methode zur Identifizierung CK2 Substrate aus einer komplexen biologischen Probe wie einer Zelle oder eines Gewebes lysate. Dieses Protokoll nutzt die dual Co Substratspezifität der CK2 durch Verwendung der GTP-Analogons GTPγS (Guanosin-5'-[γ-thio]triphosphate), die anderen endogenen Kinasen verwenden können. Dadurch können effektiv die Kinase, "seine Substrate innerhalb dieses Beispiel für nachträgliche Isolierung und Identifizierung zu kennzeichnen".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hinweis: Sicherstellen, dass die benötigten Materialien zur Verfügung und richtig vorbereitet sind (siehe Tabelle der Materialien).
1. Vorbereitung
- Mechanisch lösen Gewebeprobe (1-2 mg Gewebe in 100 µL der Lyse Puffer, Tabelle 1) oder kultivierten Zellen (10 cm-Platte, die 80-90 % Zusammenfluss in 350 µL Lyse Puffer ist), mit dem Ziel, insgesamt 900 µL Probe für das Experiment zu sammeln. Beachten Sie, dass dieses Volumen in leichten Überschuss ist an was für die nachfolgend beschriebenen Experiment benötigt wird.
- Spin-down der Proben durch Zentrifugation bei 17.500 X g für 3 Minuten bei 4 ° C. Übertragen Sie nach der Fertigstellung 270 µL des Überstands auf jedes der drei neuen 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Es werden ca. 90 µL bleiben. Entfernen Sie 40 µL als "Eingangskontrolle" und Platz in einen neuen Schlauch verwendet werden. Legen Sie alle Proben auf Eis.
(2) Kinase Assay: Thiophosphorylation und Alkylierung
- Die drei Röhrchen mit 270 µL wie folgt zu kennzeichnen: "Kinase Rxn", "GTPγS", und "PNBM (p-Nitrobezyl-Mesylat) nur". Bereiten Sie die Kinase-Reaktionen.
- Fügen Sie mit dem "Kinase Rxn" Rohr 2,7 µL (gleichbedeutend mit 1.350 U) CK2, dann 2,7 µL 2,5 mM GTPγS.
- Fügen Sie mit dem "Nur GTPγS" Rohr 2,7 µL 2,5 mM GTPγS hinzu, und fügen Sie 2,7 µL Lyse Puffer.
- Das "PNBM nur" Rohr fügen Sie 5.4 µL Lyse Puffer hinzu. Streichen Sie alle Röhren zu mischen und dann sofort auf Eis legen.
- Inkubieren Sie alle drei Röhren für 1 min in einem 30 ° C-Wasserbad. Fügen Sie nach Inkubation 13,5 µL von 12 mg/mL PNBM alle drei Röhren hinzu. Invertieren, Proben zu mischen. Inkubieren Sie diese Proben bei Raumtemperatur 1 h.
- Nach dem Start der Inkubation in Schritt 2.2, bereiten Sie die Entsalzung Spalten so bald wie möglich, wie der Prozess dauert etwa 45 Minuten.
3. Vorbereitung der Entsalzung Spalten
- Zunächst bereiten Sie Spalten (3 für dieses Beispiel-Experiment) durch invertieren jeder Spalte mehrmals erneut aussetzen der Sephadex G-25 Harz in den Puffer speichern. Das Harz zu begleichen, indem eine Klammer Stand jede Spalte zuweisen und lassen es ca. 5 min. lang ungestört sitzen zu ermöglichen.
- Nach Absetzen der Sephadex G-25 Harz, entfernen Sie die Kappen von oben und unten in der Spalte erlauben den Puffer speichern zu entleeren durch die Schwerkraft und haben eine Röhre unterhalb der unteren Öffnung der durchströmten verwerfen zu sammeln.
- Sobald Speicher Puffer aufgebraucht ist, fügen Sie hinzu, ca. 2,7 mL Lyse-Puffer um die Spalten equilibrate. Die Flow-through zu sammeln und entsorgen. Wiederholen Sie 3 Mal. Im Anschluss an die letzte Gleichgewichtherstellung sind die Spalten bereit für Schritt 4.1.
4. Entfernung von PNBM
- Nach 1 h Inkubation (Schritt 2.2) und Spalte Vorbereitung (Schritt 3) abgeschlossen sind, gelten Sie die Proben für die Spalten. Jede Spalte wie folgt zu kennzeichnen: "Kinase Rxn", "Nur GTPγS" und "Nur PNBM". Laden Sie alle jede Probe auf der jeweiligen Spalte. Sammeln Sie und entsorgen Sie den Durchfluss.
- Waschen Sie Proben, indem Sie jede Spalte 420 µL Lyse Puffer hinzufügen. Lyse Puffer durch die Spalte filtern und sammeln der durchströmten verwerfen zu ermöglichen. Im Anschluss an diese Waschschritt positionieren Sie Rohre für die Entnahme von Proben.
- Eluieren Sie Proben durch Zugabe von 500 µL Puffer Lyse zu jeder Spalte. Sammeln Sie die Durchströmung, die jetzt Thiophosphorylated und alkyliert CK2 Substrate enthält.
5. Immunopräzipitation: Teil I
- Bereiten Sie Proben für Immunopräzipitation, indem erste entfernen 80 µL für eine "Elution Eingabekontrolle" Probe von jedem der jeweiligen Elutions ("Kinase Rxn", "Nur GTPγS" und "Nur PNBM") in Schritt 4.3 gesammelt. Nach Entfernen der 80 µL von jeder Probe werden ca. 420 µL pro Probe bleiben.
- Jede Probe in 2 Röhrchen mit 200 µL aufgeteilt. Beschriften Sie jedes jeweiligen Rohr: "Kinase Rxn Anti-Thiophosphate Ester", "Kinase Rxn IgG", "GTPγS Anti-Thiophosphate Ester", "GTPγS IgG", "PNBM Anti-Thiophosphate Ester" und "PNBM IgG".
- 2.8 µg Anti-Thiophosphate Ester Antikörper gegen jedes Anti-Thiophosphate Ester beschriftet Rohre und 2,8 µg Isotype Kontrolle Antikörper zu jedem der IgG-Label Rohre hinzufügen. Ein Rotator bei 4 ° C für 2 h Rohre aufsetzen.
- Beginnen Sie Vorbereitung von Protein A/G Perle während den letzten 15 Minuten der 2 h Inkubation im Schritt 5.2.
(6) Protein A/G Agarose Bead Vorbereitung
- Kurz Wirbel der Lagerung Röhre um Perlen zu gewährleisten sind vollständig wieder ausgesetzt. Schneiden Sie das Ende einer P200 Pipettenspitze mit einer sauberen Rasierklinge Erhöhung messen Größe. Pipettieren 100 µL der Wulst Gülle pro Immunopräzipitation zu einem neuen 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch. In diesem Beispiel werden insgesamt 6 Rohre benötigt.
- Zentrifugieren Sie die Rohre bei 17.500 X g für 1 min bei 4 ° C. Den Überstand entfernen und entsorgen. Wieder aussetzen Sie, die Perlen in 200 µL kurz Lyse Puffer und Wirbel. Wiederholen Sie den Spin und waschen Sie Schritte zu 3-Mal.
- Legen Sie nach dem letzten Waschen die Perlen auf Eis, bis die Inkubation im Schritt 5.2 abgeschlossen ist.
(7) Immunopräzipitation: Teil II
- Nach den 2 h Inkubation von Schritt 5.2 spin-down der Proben bei 17.500 X g für 3 min bei 4 ° C. Fügen Sie nach Zentrifugation 200 µL von jeder Probe auf die Rohre mit den gewaschenen Perlen hinzu. Legen Sie die Röhren auf ein Rotator bei 4 ° C für 1 h.
- Im Anschluss an die 1 h Inkubation Zentrifugieren der Rohre bei 17.500 X g für 1 min bei 4 ° C. Als nächstes 40 µL des Überstands von jeder Probe zu entfernen und speichern Sie als eine "Erschöpfung Control" (insgesamt 6 Röhren). Entfernen Sie den Rest des Überstandes und entsorgen. Achten Sie darauf, nicht um die Perlen zu stören.
- Waschen Sie die Proben durch Zugabe von 200 µL Puffer lyse und vortexen kurz. Zentrifugieren Sie bei 17.500 X g für 1 min bei 4 ° C. Den Überstand entfernen und entsorgen. Wiederholen Sie das Waschen und Schleudern Sie Schritte 3 Mal. Achten Sie darauf, nicht um die Perlen während dieser Schritte zu stören.
- Fügen Sie nach Abschluss der Wäsche Schritte 50 µL 2 X Probenpuffer jede Probe mit Perlen hinzu. Für alle anderen Proben hinzufügen 8 µL 6 x Probenpuffer: "Eingangskontrolle", "Elution Eingabesteuerelemente" und "Erschöpfung Steuerelemente".
- Sobald der Puffer an den Rohren, Pipettieren rauf und runter zu mischen und erhitzen Sie alle Proben bei 95 ° C für 5 min bevor mit SDS-PAGE hinzugefügt wird.
8. Analyse/Bewertung der Ergebnisse
- Überprüfen Sie erfolgreiche CK2-abhängige Thiophosphorylation und Alkylierung.
- Um die Wirksamkeit von CK2-vermittelten Thiophosphorylation im Schritt 2.2 zu ermitteln, führen Sie SDS-PAGE und Western blotting durch Ausführen von 15-20 µL der "Elution Eingabesteuerelemente" gesammelt im Schritt 5.1 auf einem 12,5 % Polyacrylamid-Gel.
- Sonde Membranen mit den folgenden Antikörper: Anti-Thiophosphate Ester, Anti-CK2α und Anti-GAPDH (oder einem anderen geeigneten laden Steuerelement). Wenn dieser Schritt erfolgreich war, sollte eine verbesserte Anti-Thiophosphate-Ester-Signal in der "Kinase Rxn" Spur im Vergleich zu den anderen zwei Fahrspuren (Abbildung 2) ersichtlich sein.
- Angereicherte vermeintliche Substrate der CK2 visualisieren und Protein Identität zu bestimmen.
- Führen Sie aus, um festzustellen, ob die Immunopräzipitation Schritte erfolgreich waren, 25-30 µL der Proben aus den Perlen im Schritt 7.4 auf einem separaten 12,5 % Polyacrylamid-Gel eluiert. Stellen Sie sicher, dass alle Geräte sauber und Handschuhe tragen zu jeder Zeit während dieses Schrittes um Kontamination zu minimieren.
- Färben Sie das Gel mit Coomassie Blau angereichertes Proteine aus verschiedenen Phasen des experimentellen Protokolls (Abbildung 3) zu visualisieren. Mit neuen Rasierklingen, präsentieren sorgfältig Verbrauchsteuern einzigartige Bands auf der "Kinase Rxn Anti-Thiophosphate Ester IP" Spur und in Anbetracht ihrer ungefähren Molekulargewichten.
- Senden Sie diese Bands für Proteinidentifizierung durch flüssige Chromatographie/Tandem Massenspektrometrie (LC-MS/MS) (Abbildung 4). Wenn Antikörper gegen die identifizierte Proteine zur Verfügung stehen, bestätigen die Ergebnisse der Massenspektrometrie von SDS-PAGE und Immunoblotting von input, erschöpft und IP-Fraktionen gesammelt im Verlauf des Protokolls (Abbildung 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eine schematische Darstellung der Versuchsanordnung ist in Abbildung 1zur Verfügung gestellt. Die zugrunde liegende Basis der Technik ist die ungewöhnliche Fähigkeit der CK2, GTP für Phosphoryl-Gruppe Übertragung verwenden. Zugabe von exogenen CK2 Holoenzym sowie das GTP-Analogon, GTPγS, zu einer Zelle lysate führt zu Thiophosphorylation von endogenen CK2 Substraten. Nachbehandlung der lysate mit alkylierende Reagenz p- Nitrobenzyl-Mesylat (PNBM) erzeugt eine Thiophosphate Ester glyko-auf diese speziellen Substrat-Proteine, die dann Immunoprecipitated mit einem Anti-Thiophosphate Ester Antikörper werden können und letztlich durch Massenspektrometrie identifiziert. Abbildung 2 zeigt ein positives Ergebnis nach der Zugabe von CK2 und GTPγS und dann PNBM auf T98G (Glioblastom) Zelle lysate. Diese Ergebnisse zeigen, dass CK2-abhängige Thiophosphorylation und anschließende Alkylierung erfolgreich waren. Wie erwartet, ist eine erweiterte Anti-Thiophosphate Ester Signal durch westliche Beflecken nur auf der Spur, enthält die komplette Kinase-Reaktion und nicht in die GTPγS nur- und PNBM nur-behandelten Proben beobachtet. In Abbildung 3 dargestellt ist ein Coomassie Blau gefärbten Gel Immunoprecipitated und eluierten Proteine mit Isotype Kontrolle IgG oder Anti-Thiophosphate Ester Antikörper in das Vorhandensein oder Fehlen von überschüssigen CK2 und/oder GTPγS. Diese Daten zeigen auch ein positives Ergebnis, da mehrere einzigartige Bands zeigt sich nur in der Anti-Thiophosphate Ester IP-Spur sind in denen die lysate mit exogenen CK2 und GTPγS inkubiert wurde. Die Band, die mit einem Sternchen gekennzeichnet wurde aus dem Gel ausgeschnitten und Massenspektrometrie zur Proteinidentifikation vorgelegt. Abbildung 4 zeigt repräsentative Daten erhalten durch massenspektrometrische Analyse einschließlich Proteinidentifikation Prozent Abdeckung und Anzahl der einzigartigen Peptide identifiziert pro Protein innerhalb der Band. Dargestellt sind die Top-Ten-Hits aus den eingereichten Band (Abbildung 3) und Informationen über unabhängig davon, ob das Protein als Substrat der CK215,16,17zuvor identifiziert wurde. Die Identität eines der bekannten Immunoprecipitated CK2 Substrate, Nucleolin15, wurde durch SDS-PAGE und Immunoblotting der angegebenen Brüche mit einem Anti-Nucleolin-Antikörper bestätigt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der experimentellen Strategie. Die GTP-Analogon GTPγS, zusammen mit der überschüssigen rekombinante CK2 Holoenzym wird hinzugefügt, um eine Zelle oder eines Gewebes lysate und ermöglicht eine Thiophosphorylation der Substrate von CK2 aber nicht von anderen endogenen Kinasen. Thiophosphorylated Substrate sind als nächstes mit PNBM, erzeugen eine Thiophosphate Ester glyko-auf diese Proteine, die dann über Immunopräzipitation (IP) erfasst werden für spätere Identifikation durch flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (alkyliert LC-MS/MS). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Validierung von CK2-abhängigen Thiophosphorylation in ganze Zelle lysate. Ganze Zelle Lysates aus T98G Zellen vorbereitet wurden mit GTPγS in der Gegenwart (Kinase Reaktion) oder Abwesenheit (GTPγS nur) von exogenen rekombinante CK2 Holoenzym inkubiert. PNBM wurde nachträglich hinzugefügt, um die angegebenen Reaktionen, und Proben von SDS-PAGE, gefolgt von Immunoblotting mit der angegebenen Antikörper gelöst wurden. Protein Molekulargewicht Marker sind in kDa angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Immunopräzipitation der vermeintlichen CK2 Substrat Proteine. Bereicherung und Visualisierung von vermeintlichen CK2 Substrate (dritte Spur) ist offensichtlich als mehrere einzigartige Bänder nach Immunopräzipitation mit Anti-Thiophosphate Ester Antikörper. Immunoprecipitates wurden durch SDS-PAGE gelöst und das Gel war mit Coomassie Blau gefärbt. Die Band, die mit einem Sternchen gekennzeichnet wurde aus dem Gel ausgeschnitten und Massenspektrometrie zur Proteinidentifikation vorgelegt. Protein Molekulargewicht Marker sind in kDa angegeben. IP = Immunopräzipitation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Ermittlung und Bestätigung von Proteinen als Substrate der CK2 in-vitro-. Daten, die durch Massenspektrometrie zeigt, dass bisher bekannten15,16,17 sowie vermeintliche Roman CK2 Substrate identifiziert wurden mit diesem experimentellen Ansatz. Dargestellt sind die Top zehn Proteine aus den ausgeschnittenen Band (oben) identifiziert. Die Identität des Nucleolin, einem bekannten CK2 Substrat wurde durch Immunoblotting der angegebenen Brüche mit einem Anti-Nucleolin Antikörper (unten) bestätigt. Protein Molekulargewicht Marker sind in kDa angegeben. IP = Immunopräzipitation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Reagenz Lager Konzentration | Reagenz Endkonzentration | Beispiel-Volumes hinzugefügt basierende auf Lager Konzentrationen |
| 1 M Tris pH-Wert 7,4 | 20,0 mM | 200 ΜL |
| 4 M NaCl | 20,0 mM | 50 ΜL |
| 20 % Triton x-100 | 0,50 % | 250 ΜL |
| 1 M MgCl2 | 10,0 mM | 100 ΜL |
| 1 M DVB-T | 0,5 mM | 5 ΜL |
| 200 mM Na3VO4 | 1,0 mM | 50 ΜL |
| 500 mM NaF | 10,0 mM | 200 ΜL |
| 500 mM β-Glycerin Phosphat | 10,0 mM | 200 ΜL |
| H2O | 8,945 mL | |
| + 1 komplettes Mini Registerkarte/10 mL | 1 Tablette |
Tabelle 1. Lyse Puffer Rezept (10 mL, 1 X).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschreiben wir eine relativ einfache biochemische Methode zur Identifizierung Substrate der Proteinkinase CK2 aus einer komplexen biologischen Probe. Die entscheidenden Schritte dieses Protokolls basieren auf die ungewöhnlichen enzymatischen Eigenschaften von CK2 und beinhalten CK2-abhängige Thiophosphorylation von bestimmten Substrat Proteinen mit GTPγS und deren anschließende Immunopräzipitation und Identifikation. Mit diesen Ergebnissen haben wir den nutzen und die Vielseitigkeit dieses Ansatzes gezeigt, wie wir jetzt diese Strategie in menschlichen Glioblastom-Zellen und Drosophila Eierstöcke18angewendet haben.
Eine Reihe von bisher veröffentlichten Studien mit Hilfe quantitativer Phosphoproteomics Ansätze haben sich in der Tat bewährt bei der Identifizierung von neuartigen CK2 Substrate19,20,21,22, 23. jedoch einige dieser Strategien machen von immobilisierten Substrat Arrays verwenden, und es ist möglich, dass die Konformation eines immobilisierten Proteins eine potenzielle Phosphorylierung Website unzugänglich für die Kinase machen kann. Die hier beschriebene Technik erlaubt Phosphorylierung innerhalb einer physiologischen oder nativen Umgebung (z. B. eine Zelle lysate), dadurch Verringerung der Wahrscheinlichkeit der Unzugänglichkeit der Website. Ein weiterer Vorteil dieser Strategie ist, dass sobald Proteinidentifikation durch Massenspektrometrie bestimmt wird, Validierung von vermeintlichen CK2 Substraten leicht kann auf Proben während des Verfahrens durchgeführt werden, wenn Antikörper gegen das Substrat gerichtet benutzt von Interesse sind. Zum Beispiel sollten mit standard westliche Beflecken, man eine Absenkung des entsprechenden Proteins in den erschöpften (Post-IP) Proben und seine Präsenz in der Anti-Thiophosphate Ester Immunoprecipitates beobachten, wie wir, für die bekannte CK2 gezeigt haben Substrat-Nucleolin (Abbildung 4).
Eine wichtige Einschränkung dieser Methode ist, dass die letzte Schritt des Verfahrens vor der Analyse durch Massenspektrometrie stützt sich auf die Fähigkeit zu erkennen, diskrete Unterschiede in Streifen Muster auf einem Gel. So ist es durchaus möglich, dass bestimmte CK2 Substrate ausgelassen werden können, wenn sie von geringen Fülle sind und daher unter dem Grenzwert der visuellen Erkennung. Wenn man über diese Möglichkeit betrifft, kann eine empfindlichere Methode z. B. silberne Färbung verwendet werden, um diese Proteine anstelle von Coomassie Blau zu visualisieren. Eine weitere Überlegung, die anerkannt werden sollte ist, dass eine Reihe von CK2 Substrate mit dieser Strategie, denn die physiologisch relevanten Websites bereits phosphorylierten in Vivonicht bestimmbar sind. Dies ist fast sicher der Fall, die konstitutive Aktivität der CK2 gegeben sein. Zu guter Letzt sei auch darauf hingewiesen, dass diese Methode nur Proteine als vermeintliche Substrate der CK2 in Vitroidentifiziert. Nachfolgende Tests zu überprüfen, ob diese physiologisch relevanten Substraten von CK2 in Vivo sind sind erforderlich und sollten Identifizierung von CK2-abhängige Phosphorylierung Websites und Beurteilung nach sich ziehen, wenn Phosphorylierung dieser bestimmte Rückstände ist in Reaktion auf Manipulation von CK2-Kinase-Aktivität verändert.
Zusammenfassend lässt sich sagen wird diese Strategie gepaart mit nachgeschalteten experimentelle Ansätze (Phosphorylierung Standortskartierung durch Kürzung/Streichung Analyse, Site-verwiesene Mutagenese, funktionellen in Vitro und in Vivo -Tests, etc.) das Studium erleichtern. von diesem ungewöhnlichen Kinase und unser Verständnis für die verschiedenen Rollen, die CK2 in verschiedenen biologischen Systemen spielt zu erhöhen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen Zuschuss der Commonwealth Universal Forschung Verbesserung von Pennsylvania Department of Health, T.I.S unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
References
- Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
- Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
- Meggio, F., Pinna, L. A.
- Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
- Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
- Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
- Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
- Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
- Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
- Tawfic, S., et al.
- Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
- Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).
- Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).
- Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
- Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).
- Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
- Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
- McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
- Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
- Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).
- Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460 (2013).
- Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
- Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).
