Summary
Hier demonstreren we magnetische resonantie (MR)-geleide convectie verbeterde levering (CED) van virale vectoren in de cortex als een efficiënte en vereenvoudigde aanpak voor het bereiken van optogenetische expressie in grote corticale gebieden in de makaak hersenen.
Abstract
In niet-menselijke primaat (NHP) optogenetica, het infecteren van grote corticale gebieden met virale vectoren is vaak een moeilijke en tijdrovende taak. Hier tonen we het gebruik van magnetische resonantie (Mr) geleide convectie verbeterde levering (CED) van optogenetische virale vectoren in primaire somatosensorische (S1) en motor (M1) cortices van Makaken om een efficiënte, wijdverspreide corticale expressie van lichtgevoelige ionenkanalen. Adeno-geassocieerde virale (Aav) vectoren coderen van de rood-verplaatste opsin C1V1 gesmolten tot geel fluorescerende eiwit (eyfp) werden geïnjecteerd in de cortex van rhesus makaken onder leiding van de heer-geleide CED. Drie maanden na de infusie bevestigde epifluorescerende beeldvorming grote gebieden van optogenetische expressie (> 130 mm2) in M1 en S1 in twee macaques. Bovendien waren we in staat om betrouwbare licht-opgeroepen elektrofysiologie reacties op te nemen vanuit de uitschrijf gebieden met behulp van micro-elektrocorticografische arrays. Latere histologische analyse en immunokleuring tegen de reporter onthulde wijdverspreide en dichte optogenetische expressie in M1 en S1 overeenkomend met de verdeling aangegeven door epifluorescerende beeldvorming. Deze techniek stelt ons in staat om binnen een kortere periode uitdrukking te krijgen in grote delen van de cortex met minimale schade in vergelijking met de traditionele technieken en kan een optimale aanpak zijn voor optogenetische virale bezorging bij grote dieren zoals Nhp's. Deze aanpak toont een groot potentieel voor manipulatie op netwerkniveau van neurale circuits met cel-type specificiteit in diermodellen evolutionair dicht bij de mens.
Introduction
Optogenetics is een krachtige tool die het mogelijk maakt voor de manipulatie van neurale activiteit en de studie van netwerkverbindingen in de hersenen. Het implementeren van deze techniek in niet-menselijke primaten (Nhp's) heeft het potentieel om ons begrip van grootschalige neurale berekeningen, cognitie en gedrag in het primaat brein te verbeteren. Hoewel optogenetics met succes is geïmplementeerd in nhp's in de afgelopen jaren1,2,3,4,5,6,7, een uitdaging die onderzoekers worden geconfronteerd met het bereiken van hoge niveaus van expressie in grote hersengebieden in deze dieren. Hier bieden we een efficiënte en vereenvoudigde aanpak om hoge niveaus van optogenetische expressie te bereiken in grote gebieden van de cortex in macaques. Deze techniek heeft een groot potentieel om de huidige optogenetische studies bij deze dieren te verbeteren in combinatie met state-of-the-art opname van8,9 en optische stimulatie10 technologieën.
Convectie verbeterde levering (CED) is een vaste methode voor de levering van farmacologische agentia en andere grote moleculen, waaronder virale vectoren, aan het centrale zenuwstelsel11,12,13. Terwijl conventionele toedienings methoden betrekking hebben op meervoudige infusies met een laag volume verdeeld over kleine hersengebieden, kan CED een bredere en meer gelijkmatige verdeling van de middelen met minder infusies bereiken. Druk-gedreven bulk vloeistofstroom (convectie) tijdens de infusie zorgt voor een breder en uniform verdeelde transductie van het doelweefsel bij het leveren van virale vectoren met CED. In recente studies toonden we de transductie en daaropvolgende optogenetische expressie van grote delen van de primaire motor (M1) en somatosensorische (S1) cortices9 en thalamus14 met behulp van magnetische resonantie (Mr)-geleide CED.
Hier schetsen we het gebruik van CED om optogenetische expressie in grote corticale gebieden te bereiken met slechts een paar corticale injecties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures zijn goedgekeurd door de Universiteit van Californië, San Francisco institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) en zijn in overeenstemming met de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. De volgende procedure werd uitgevoerd met twee volwassen mannelijke rhesus-makaken van 8 en 7 jaar, die respectievelijk 17,5 kg en 16,5 kg (Monkey G en Monkey J) wogen.
Opmerking: gebruik standaard aseptische technieken voor alle chirurgische ingrepen.
1. Baseline Imaging
- Sedate en intuberen het dier en handhaven narcose onder Isofluraan (concentratie veranderd tussen 0 tot 5% indien nodig, afhankelijk van vitale functies zoals ademhalingsfrequentie en hartslag). Controleer de temperatuur van het dier, de hartslag, de zuurstofverzadiging, de elektrocardiografische responsen en de partiële getij druk van CO2 gedurende de hele procedure.
- Plaats het dier in een door de heer compatibel stereotaxsch frame (Zie de tabel met materialen) waarin het tijdens de gehele procedure zal blijven. Verbind het dier met een draagbare Mr-compatibele Isofluraan machine en Transporteer het naar de MRI-scanner (3 T).
- Verkrijg standaard T1 (Flip hoek = 9 °, herhalings tijd/ECHO tijd = 668,6, matrixgrootte = 192 x 192 x 80, segment dikte = 1 mm) en T2 (Flip hoek = 130 °, herhalings tijd/ECHO tijd = 52,5, matrixgrootte = 256 x 256 x 45, segment dikte = 1 mm) anatomische MR beelden als Baseline Referentie en voor chirurgische planning.
- Herstel het dier van de anesthesie en vervoer het naar de dieren huis gebied.
- Gebruik de verworven T1 en T2 beelden om te bepalen van de plaatsing van de craniotomie. De locatie van de craniotomie kan nauwkeurig worden bepaald door de corticale interesse van de heer te vergelijken met de makaak Brain Atlas (paxinos, Huang, petride, Toga 2ND Edition). Bovendien kunnen deze basislijn afbeeldingen een raming bieden voor de locaties van virale infusie. De corticale interessegebieden die hier worden gedemonstreerd zijn M1 en S1.
2. MR-compatibele kamer implantatie
- Sedate en intuberen het dier en handhaven narcose met standaard anestheticum monitoring zoals in 1,1.
- Plaats het dier in het door de heer compatibele stereotaxic-frame waarin het in de gehele kamer implantatie en de virale vector levering zal blijven. Verbind het dier met een draagbare Mr-compatibele Isofluraan machine.
- Maak een sagittale incisie ongeveer 2 cm van de middenlijn met een lengte van ongeveer 5 cm met een scalpel.
- Verwijder het onderliggende zachte weefsel van de schedel met liften (Zie tabel met materialen).
- Maak een circulaire craniotomie (2,5 cm diameter) om de vooraf geplande trajecten voor injecties te bedekken met behulp van een trefine (Zie tabel met materialen).
- Verlaag het Centreer punt van de trefine langs de rand van de trefine. Maak een inkeping in het midden van de geplande craniotomie voldoende diep in de schedel om de trefine te verankeren met behulp van het instelbare Centreer punt van de trefine. Wees voorzichtig om te voorkomen dat volledig doordringen door de diepte van de schedel, omdat dit schade aan het onderliggende zenuwweefsel kan veroorzaken.
- Spoel het gebied periodiek af met een zoutoplossing die nodig is om het weefselvocht gedurende de craniotomie te behouden.
- Zodra het centrum is gemaakt, verlaagt u de trefine op de schedel en draait u de trefine rechtsom en linksom terwijl u neerwaartse druk toepast totdat de botdop met een tang kan worden verwijderd. Wees voorzichtig om beschadiging van het onderliggende weefsel met de trefine te voorkomen.
- Rijg een fijne hechting (maat 6-0) door de Dura in het midden van de craniotomie en til de Dura op door zachtjes de hechting van het oppervlak van de hersenen te trekken en een tent te maken in het midden van de craniotomie.
- Vervolgens, prik de Dura dicht bij het midden van de tent met behulp van fijne oogheelkundige schaar om beschadiging van de hersenen te voorkomen. Snijd vervolgens de Dura van het middelpunt naar de rand van de craniotomie en ga verder langs de rand met een fijne opthalmische schaar.
- Monteer de cilindrische Custom-Made CED-kamer (Figuur 1; zie rubriek 4 voor productie-instructies) naar de schedel bovenop de craniotomie om canule ondersteuning te bieden tijdens de infusie van CED, zodat de kromming van de kamer flens wordt uitgelijnd goed met de kromming van de schedel.
- Bevestig de implantaten aan de schedel met behulp van plastic schroeven en tandheelkundige acryl of een paar Titanium schroeven.
3. virale vector levering
- Kort na het implanteren van de MR-compatibele kamer en het inbrengen van het canule injectie rooster (afbeelding 1a-B, aanvullend figuur 1) in de kamer, vult u het rooster met zoutoplossing (0,9% NaCl) voor het visualiseren van de injectie locaties via de heer anatomische beelden en Vul de kamer holten met natte steriele absorberende gelatine om het vocht van de hersenen te handhaven (Figuur 1f).
- Bedek de huid en de cilinder met een steriele antimicrobiële Engrave draperen om de steriliteit van de cilinders tijdens het transport en de heer infusies te behouden. Plaats een vitamine E-capsule om de bovenkant van het injectie raster te markeren voor positieve identificatie.
- Terwijl het dier geintubleerd blijft, maak de endotracheale buis los van het anesthesie circuit en bevestig het opnieuw aan een draagbare Mr-compatibele Isofluraan machine en transporleer het dier naar de MRI-scanner.
- Verkrijg T1-beelden (Flip hoek = 9 °, herhalings tijd/ECHO tijd = 668,6, matrixgrootte = 192 x 192, segment dikte = 1 mm, 80 segmenten) om de afstand vanaf de bovenkant van het injectie rooster en het corticale oppervlak te berekenen. De vitamine E-capsule is duidelijk zichtbaar in T1-beelden en moet worden gebruikt als een marker voor de bovenkant van het injectie rooster (Figuur 2a). Gebruik het liniaal gereedschap van de MR imaging-software om de afstand tussen de bovenkant van het injectie raster en het corticale oppervlak te meten.
- Verkrijg T2-afbeeldingen (Flip hoek = 130 °, herhalings tijd/ECHO tijd = 52,5, matrixgrootte = 256 x 256, segment dikte = 1 mm, 45 segmenten) om de optimale canule geleiders voor elke locatie te bepalen op basis van de beoogde infusieplaats (Figuur 2b-C). Zoals eerder vermeld, is de canule grid gevuld met zoutoplossing die het beste zichtbaar is in T2-beelden. Scroll met behulp van de MR imaging software door de coronale en sagittale vlakken om de doellocatie van de infusie te vinden.
- Na het ontdooien van de virale vector voor een paar uur bij kamertemperatuur, meng de virale vector met de MR contrast agent gadoteridol (ratio van 250:1; 2mM gd-DTPA, Zie tabel van materialen) door pipet of Vortex mengen.
Opmerking: De gepresenteerde techniek werd getest voor AAV-vectoren met een CamKIIa Promoter Driving expressie van C1V1 Fused to EYFP (AAV 2.5-CamKII-C1V1-EYFP, titer: 2,5 x 1012 virus moleculen/ml; Zie tabel met materialen). - Laad het gemengde virus in een Hogedruk buis van 0,2 mL (Zie tabel met materialen).
- Stel een steriel veld in buiten de heer scanner voor de bereiding van de virale infusielijn.
- Sluit met behulp van hogedruk-IV-buizen een lange Verleng lijn (ongeveer 3-5 meter, afhankelijk van de locatie van de infusiepomp met betrekking tot de MR-boring) aan op een MR-compatibele 3 mL spuit en Prime met zoutoplossing.
- Sluit het distale uiteinde van de lange Verleng lijn aan op het proximale uiteinde van de 0,2 mL IV-slang geladen met het virus en bevestig de reflux bestendige canule met een 1 mm getrapte punt (figuur 2D; zie rubriek 5 voor de productie-instructies van de canule) op het distale uiteinde van Deze montage met een klem stijl katheter connector (Zie tabel van de materialen) (figuur 2e).
- Tot slot, zet de spuit in een MR-compatibele pomp (Zie tabel van de materialen). Plaats de pompcontroller in de controlekamer van de scanner, omdat deze niet compatibel is met de heer.
- Met behulp van de baseline anatomische MR-beelden eerder verkregen, selecteer de canule injectie rooster locatie en de plaatsings diepte die nodig is om de doel infusieplaats te bereiken. Markeer de insertie diepte op de canule met behulp van steriele tape.
- Begin de infusie met een snelheid van 1 μL/min en valideer de vloeistof in de infuuslijn visueel door de ejectie van de vloeistof uit de canule tip te observeren.
- Plaats de canule handmatig via het injectie rooster op de doeldiepte terwijl u de stroom in de infuuslijn handhaaft, omdat dit het gepenetreerde weefsel verhindert om de canule tijdens het inbrengen te verstopt.
- Verkrijg snel (2 minuten) Flash T1 gewogen beelden (Flip hoek = 30 °, herhalings tijd/ECHO tijd = 3,05, matrixgrootte = 128 x 128, segment dikte = 1 mm, 64 segmenten) voor online monitoring van de virale vector infusie.
- Na infusie ~ 10 μL van de vector zodanig dat voldoende virus is geïnfundeerd om te detecteren in de heer scanner, verkrijgen van de heer afbeeldingen om te controleren of de juiste canule plaatsing zoals blijkt uit de waargenomen verspreiding van het virus. Als de diepte van de ingevoegde canule onjuist is, past u de diepte dienovereenkomstig aan of verwijdert u de canule langzaam en probeert u de invoeging opnieuw als in 3,12.
- Bewaak de infusie via begeleiding van online MR-beelden (Flash T1 gewogen) en verhoog de infusiesnelheid tot 5 μL/min met 1 μL/min stappen om de paar minuten (Figuur 3a).
- Na infusie ongeveer 40 μL van de virale vector, beginnen met het verminderen van de infusiesnelheid met 1 μL/min stappen en stop de infusie na ~ 50 μL wordt geïnjecteerd en laat de canule op zijn plaats voor 10 minuten.
- Verwijder langzaam de canule uit de hersenen en ga naar de volgende locatie. Herhaal de stappen 3,9 tot en met 3,19 voor elke locatie.
- Bedek de cilinder met een steriel draperen aan het einde van de injecties, vóór het vervoer van dieren. Vervoer het dier vervolgens terug naar de operatiekamer.
- Ofwel explant de MR-compatibele kamer en sluit de chirurgische incisie door de botflap en de bovenliggende spier te vervangen en de huid te voeden met behulp van standaard aseptische technieken of de kamer te vervangen door een titanium cilinder en kunstmatige Dura (Zie Yazdan-Shahmorad et al. 20169) voor neurale opname en stimulatie.
4. MR-compatibele kamer productie
- Fabriceren van het nylon canule injectie rooster (Figuur 1a-B) door bewerking volgens de gespecificeerde afmetingen (aanvullend figuur 1).
- 3D print de MR-compatibele cilinder uit acrylonitril butadieen styreen (ABS0 plastic (figuur 1c-E) (Zie aanvullend bestand 1 – 3; zie tabel met materialen voor 3D-printers en-materialen).
Opmerking: Eén ontwerp onderhoudt een vast canule-injectie rooster in de MR-compatibele cilinder (figuur 1c), terwijl een ander het raster kan roteren, waardoor het injectiegebied wordt verlengd (figuur 1d-E). - Rijg het injectie rooster van de canule in en tik op de corresponderende holte van de MR-compatibele kamer, zodat beide stukken hetzelfde draadsnijden vertonen.
Opmerking: Elk type draadsnijden kan worden gebruikt op voorwaarde dat beide componenten hetzelfde draadsnijden hebben. - Steek het nylon canule injectie rooster in het getapt gat van de MR-compatibele cilinder.
5. reflux bestendige productie van canule13
- Knip een 30 cm lange silica slang met 0,32 mm ID en 0,43 mm OD voor de binnenste silica slang (Zie tabel met materialen) met behulp van een scheermesje.
- Snijd een 7,5 cm lange en een 5 cm lange silica buis met 0,45 mm ID en 0,76 mm OD voor de buitenste silica slang (Zie tabel van de materialen).
- Hecht de buitenste slang van 7,5 cm aan de binnenslang van 30 cm met cyanoacrylaat, zodat de binnenbuis 1 mm buiten de buitenste buis schuift, waardoor de reflux bestendige stap (figuur 2D) wordt. Om ervoor te zorgen dat het cyanoacrylaat niet in de binnenkant van de binnenslang komt, plaatst u het cyanoacrylaat op de buitenkant van de binnenslang ver van de tip van de canule.
- Plak de 5 cm lange silica buis aan het andere uiteinde van de binnenslang voor bevestiging aan de klem stijl katheter connector (zie stap 3,10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Convectie verbeterde levering (CED) onder MRI-geleiding
De verspreiding van de virale vector werd gecontroleerd tijdens de infusie van CED onder leiding van online MR images (Figuur 3a). In deze studie werden S1 en M1 van twee apen getarget (Figuur 3b). De driedimensionale verdelings volumes werden geschat in een post-hoc analyse van de heer images (figuur 3c) zoals beschreven door yazdan-Shahmorad et al. 20169, waarin de dekking van grote gebieden van de cortex wordt bevestigd. De M1 infusies voor Monkey G werden gedaan zonder de heer guidance vanwege tijdsbeperkingen.
Validatie van virale expressie
Grote corticale optogenetische expressie werd bevestigd door epifluorescerende beeldvorming, elektrofysiologische opnames en histologische analyse zoals beschreven door Yazdan-Shahmorad et al. 20169. We controleerd optogenetische expressie door het oppervlak epifluorescentie beeldvorming van de fluorescerende reporter2,9 en geschat meer dan 130 mm2 van expressie langs het corticale oppervlak in M1 en S1 van twee Makaken van slechts drie corticale injecties9,15. Licht stimulatie (488 nm, 20 MW vermogen aan de punt; Zie Inhoudsopgave) leverde betrouwbare elektrofysiologische responsen op in de uitzet gebieden, gemeten door semi-transparante micro-elektrocorticografische arrays8,9 ,16 (Figuur 4).
De analyse van de heer images leverde naar schatting 233 mm3 en 433 mm3 van de vector spreiding in M1 en S1 van Monkey J, respectievelijk, en 317 mm3 in S1 van Monkey G9. We voerden histologische analyses uit op seriële coronale secties en observeerden grootschalige optogenetische expressie rond de infuusplaatsen in M1 en S1 (figuur 5c-I), met naar schatting 70-80% van de cellen die de opsin uitdrukken. De uit histologie waargenomen uitdrukking die is afgestemd op de geschatte expressie verdeling van epifluorescerende beeldvorming (figuur 5a-D). Een van de twee infusies uitgevoerd buiten de heer scanner in Monkey G was mislukt, waardoor er geen uitdrukking in de corresponderende regio (figuur 5d). De geschatte spreiding van de heer Imaging was volledig binnen de grenzen van zowel de epifluorescentie als de histologische maatregelen van virale verspreiding (figuur 5e-G). De uitbreiding van de epifluorescerende beeldvorming buiten de schattingen van de heer kan worden toegeschreven aan de verspreiding van virale deeltjes buiten het Advection-gebied. Bovendien verlengde de histologische raming verder dan de epifluorescentie schatting door een gebrek aan optische toegang buiten de craniotomie. De details van deze technieken zijn opgenomen in ons vorige artikel9.
Figuur 1: Mr-compatibele cilinder en canule injectie rooster. (A, B) opmaat ontworpen nylon injectie rooster. C) Mr-compatibele vaste cilinder. (D, E) Roterende MR-compatibele cilinder. F) Mr-compatibele infusie cilinder met vaste rooster positie. De pijlen wijzen naar de holten die zijn ontworpen om te worden gevuld met natte steriele absorbeerbare gelatine houden van het oppervlak van de hersenen vochtig voor de duur van de injectie. G) in het rooster geplaatste canule. Dit cijfer is gewijzigd van Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Baseline Mr Imaging en reflux resistente canule. A) T1-gewogen beeld van vitamine E dat aan de bovenkant van het injectie rooster is bevestigd, waarmee we de afstand tot het oppervlak van de hersenen kunnen meten (witte pijl). (B) T2-gewogen beeld van de hersenen helpt bij het plannen van de locatie van de injectie van de canule grid gevuld met zoutoplossing. C) de afbeelding van de infusiekamer en het met zout gevulde canule rooster. De orthogonale lijnen vertegenwoordigen de sagittale (gele) en coronale (paarse) vlakken. D) foto van de reflux bestendige injectie canule tip met de reflux bestendige stap (zwarte pijl). (E) infusielijnen. Dit cijfer is gewijzigd van Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: De heer Imaging tijdens de infusie en de geschatte verdeling. A) spreiding van 50 μL van de virale vector in coronale gedeelten van Monkey G voor één injectieplaats in S1 (afgebeeld met een pijl in B). B) MRI-oppervlakte weergave van het corticale oppervlak onder de cilinder voor apen G en J, respectievelijk. De infuus locaties van S1 worden blauw weergegeven, M1 locaties in het rood. C) Dhr. volume reconstructie van de verspreiding van virale vector na infusie met CED. Hersenen wordt weergegeven in lichtgrijs; De infusievolumes S1 en M1 worden respectievelijk in blauw en rood weergegeven. Geen MR volume reconstructie is beschikbaar voor de M1 infusies voor Monkey G omdat ze niet werden gedaan in de heer scanner. Dit cijfer is gewijzigd van Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Elektrofysiologische opnames van licht-Evoked activiteit. Micro-elektrocorticografie (μECoG) opnames traden op tijdens gepulseerde optische stimulatie. Opname traceringen waren van de dichtstbijzijnde elektrode naar de plaats van stimulatie voor voorbeelden van M1 (rood) en S1 (groen) stimulatie locaties. Gearceerde gebieden rond de traceringen vertegenwoordigen standaardfouten in 25 tests. De blauwe vierkantjes op de sporen tonen de timing van de stimulatie (1 MS). De volledige reeks stimulus-geactiveerde golfvormen voor beide monster paren van stimulatie-en opnamelocaties worden bovenop de gemiddelde golfvorm gelegd, zoals weergegeven aan de linkerkant van het paneel. Dit cijfer is gewijzigd van Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Histologische analyse. A) CORONALE Mr-afbeelding in Monkey G.B) verspreiding van contrastmiddel na de infusie voor hetzelfde coronale segment als in a.C) een gedeelte van coronale weefsels van ongeveer dezelfde plaats als in a en B; peroxidase kleuring weerspiegelt de uitdrukking van de EYFP-Reporter. D) er wordt een goede uitlijning waargenomen tussen het gebied van de eyfp-uitdrukking, gemeten met oppervlakte epiflourescentie (donkere groene gebieden) en met histologische kleuring (licht groene lijnen). Deze omvatten de regio van vector spread geschat van de heer images (witte lijn); witte stippen duiden op injectieplaatsen, en de hele zwarte regio vertegenwoordigt het gebied dat wordt blootgesteld door de craniotomie. De twee links de meeste injectie sites bevinden zich in M1, en de twee rechts de meeste sites bevinden zich in S1. (E) laag vergrotings beeld van de coronale sectie bevlekt met anti-GFP-antilichamen die het medio laterale aspect van yfp-expressie in de Somatosensorische cortex van Monkey J (gebieden 1, 2, 3) weergeven. De zwarte pijlpunt geeft de locatie van de canule track aan; het aangrenzende weefsel (zwart frame) wordt weergegeven in F, met een grotere vergroting om laminaire verdeling van de yfp-positieve cellen weer te geven. F) dichtbevolkte gebieden van yfp-positieve cellen bevinden zich voornamelijk in lagen II-III en V-VI, en vertonen ook typische piramidale morfologie (cellen in witte frames worden verder vergroot in panelen (G-I). Witte pijlpunten op onderpanelen G-I wijzen op typische piramidale cellen in lagen II-III (G); laag V (H); en laag VI (I). Schaal staven = 2 mm (E); 200 μm (F); 100 μm (G-I). Dit cijfer is gewijzigd van Yazdan-Shahmorad et al. 20169 en Yazdan-shahmorad et al. 201815. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1: het canule injectie rooster voorafgaand aan het draadsnijden. De lengte en diameter van het injectie rooster zijn respectievelijk 15,00 mm en 12,00 mm. Het injectie rasterpatroon bestaat uit 0,8 mm diameter gaten die drie concentrische cirkels vormen (diameter: 1,6, 3,2 en 4,8 mm) rond het midden van het rooster. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende bestanden. Klik hier om deze bestanden te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier schetsen we een haalbare en efficiënte techniek voor het bereiken van grootschalige optogenetische expressie in NHP primaire somatosensorische en motorische cortex door de heer-Guided CED. Het gebruik van de heer-geleide CED biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van traditionele methoden van virale infusie in het NHP brein. Een van die voordelen is het vermogen om expressie te bereiken over grote gebieden met minder vereiste infusies. Bijvoorbeeld, met conventionele methoden, meerdere injecties van 1-2 μL van de vector opbrengst expressie in een 2-3 mm diameter regio1,2,5,17. Hoewel eerdere pogingen tot het bereiken van grootschalige vector spread hebben opgeleverd expressie volumes van ongeveer 10 mm3 met meerdere injecties18, hier presenteren we een methode om expressie te bereiken over 200 mm3 met slechts een paar Infusies . Een enkelvoudige infusie van 50 μL per CED kan tot 10 mm van de injectieplaats vector spreiding bereiken voor corticale CED9 en volledige dekking van frontale corticale gebieden met thalame CED14.
Bovendien is aangetoond dat het gebruik van CED een homogenere verdeling van het geïnjecteerde agens kan bereiken12,19,20,21,22, wat leidt tot uniforme uitdrukkings niveaus rond de plaats van virale vector infusie, in vergelijking met traditionele micro injecties. In onze experimenten met CED hebben we uniforme hoge uitdrukkings niveaus waargenomen met ongeveer 70-80% van de neuronen die de opsin8,9 uitdrukken (Figuur 5). Conventionele injecties op basis van diffusie vertonen daarentegen gebieden met hoge expressie geconcentreerd in de buurt van injectieplaatsen, omhuld door verzwakking van de uitdrukkings niveaus4,5,17. De verminderde behoefte aan meervoudige injecties maakt CED Infusion een tijd efficiënte methode om grootschalige, uniforme optogenetische expressie te verkrijgen. Door het kleinere aantal injecties en de snellere infusiesnelheden konden we de virale vector onder leiding van MRI plannen en infunderen. Het gebruik van online MR images maakt nauwkeurige targeting van Infusies en het monitoren van de verspreiding van de virale vector tijdens de infusie mogelijk. Echter, als de initiële diepte van de ingevoegde canule onjuist is, dit kan expressie opleveren op ongewenste locaties als gevolg van de initiële geïnfundeerd ~ 10 μL nodig voor het visueel detecteren van de infusie via MR. alternatief, commerciële neurochirurgische navigatiesystemen gebruik van fiducial markers kan ook worden gebruikt in plaats van de heer Guidance. Bovendien kunnen de kosten van online beeldvorming worden omzeild door de gewenste diepte van inbrengen op de canule vóór het inbrengen te markeren en de volledige infusie via de infuuslijn visueel te bevestigen, hoewel de nauwkeurigheid van de plaatsing van de canule Verminderd. Zoals blijkt uit de mislukte injectie in M1 van Monkey G (figuur 5d), kan de heer guidance echter kritisch zijn om een geslaagde infusie te garanderen.
Eerdere studies hebben aangetoond dat de veiligheid van de CED Infusies van zowel niet-virale als virale deeltjes zonder waargenomen weefselbeschadiging buiten het canule tractus en geen gedrags tekorten9,11,12,13 ,14,15,20. Hier en in onze vorige publicaties9,14 rapporteren we vergelijkbare resultaten na CED infusie van optogenetische virale vectoren. Naast geen waargenomen gedrags tekorten na infusie, neun en Nissl9,14,15 kleuring onthulde neuronale celdood en gliose beperkt alleen tot het canule tractus, zoals is gemeld met diffusie-gebaseerde methoden5. Om de schade van de canule te minimaliseren, kunnen we mogelijk de diameter van de canule verminderen. Echter, verder onderzoek is nodig om te beoordelen van het effect van het verminderen van de grootte van de canule op het bereiken van grote gebieden van expressie. Bovendien, omdat hoge infusiesnelheden ook kunnen leiden tot weefselbeschadiging13, wordt aanbevolen om een infusiesnelheid te handhaven bij of onder 5 μL/min. Voor meer gedetailleerde informatie over de CED-techniek raadpleegt u onze vorige publicatie9.
Het gebruik van door de heer geleide CED voor het bereiken van brede gebieden van gerichte optogenetische expressie in de primaat cortex kan leiden tot verdere onderzoeken van grootschalige circuit dynamiek, Neurale plasticiteit en netwerkconnectiviteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
PNS heeft een financieel belang in Neuralink Corp., een bedrijf dat klinische therapieën ontwikkelt met behulp van hersenstimulatie.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door American Heart Association postdoctorale Fellowship (AY), Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) reorganisatie en plasticiteit om schade herstel te versnellen (reparatie; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, en door het UCSF Neuroscience Imaging Center. Dit werk werd ook gesteund door het Eunice Kennedy Shiver National Institute of Child Health & menselijke ontwikkeling van de National Institutes of Health onder Award Number K12HD073945, het Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), en het Center for Neuro Technology (CNT, een National Science Foundation Engineering Research Center onder subsidie EEC-1028725). We danken Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani en Blakely Andrews voor hun hulp bij de experimenten en Nan Tian, Jiwei he, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz en Toni Haun voor technische hulp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL High Pressure IV Tubing | Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA | 533640 | |
| 0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150027 | |
| 0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP | Penn Vector Core, University of Pennsylvania | ||
| ABS plastic | Stratasys, MN, USA | ABSplus-P430 | |
| Antimicrobial incise drape | 3M | 6650EZ | Ioban Drape |
| Dental Acrylic | Henry Schein, Inc. | 1013117 | Acrylic Bonding Agent |
| Elevators | VWR International, LLC. | 10196-564 | Langenbeck Elevator, Wide Tip |
| Fine suture | McKesson Medical-Surgical Inc. | 1034505 | |
| Gadoteridol | Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ | 0270-1111-04 | |
| Laser for light stimulation | Omicron-Laserage, Germany | PhoxX 488-60 | |
| MR compatible 3 cc syringe | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | 59-8377 | |
| MR Imaging Software | Pixmeo | OsiriX MD 10.0 | |
| MR-Compatible Pump | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | Harvard PHD 2000 | |
| MR-compatible stereotaxic frame | KOPF | 1430M MRI | |
| Perifix Clamp Style Catheter Connector | B-Braun, Bethlehem, PA, USA | N/A | |
| Plastic Screws | Plastics 1 | 0-80 x 1/8N | Nylon screws |
| Titanium screws | Crist Instrument Co., Inc. | 6-YCX-0312 | Self-tapping bone screws |
| Trephine | GerMedUSA Inc, | SKU:GV70-42 | |
| uPrinter SE 3D printer | Stratasys, MN, USA | N/A | |
| Vitamin E Capsule | Pure Encapsulations, LLC. | DE1 | |
| Wet sterile absorbable gelatin | Pfizer Inc. | AZL0009034201 | Gelfoam |
References
- Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).
- Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).
- Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).
- Gerits, A., et al. Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates. Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).
- Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1. Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).
- Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates. Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).
- Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).
- Ledochowitsch, P., et al. Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits. Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates. Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).
- Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates. PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).
- Bankiewicz, K. S., et al. Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach. Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).
- Kells, A. P., et al. Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).
- Krauze, M. T., et al. Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents. Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus. Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates. Elife. 7, (2018).
- Yazdan-Shahmorad, A., et al. Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates. SPIE BiOS. , (2015).
- Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain. Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).
- Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), E7297-E7306 (2016).
- Bobo, R. H., et al.
- Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion. Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).
- Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord. Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).
- Szerlip, N. J., et al. Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).
