Summary
Aquí, demostramos la convección guiada por resonancia magnética (RM) entrega mejorada (CED) de vectores virales en la corteza como un enfoque eficiente y simplificado para lograr la expresión optogenética a través de grandes áreas corticales en el cerebro macaco.
Abstract
En la optogenética de primates no humanos (NHP), infectar grandes áreas corticales con vectores virales es a menudo una tarea difícil y que requiere mucho tiempo. Aquí, demostramos el uso de resonancia magnética (RM) convección guiada entrega mejorada (CED) de vectores virales optogenéticos en corticas primarias somatosensoriales (S1) y motor (M1) de macacos para obtener una expresión cortical eficiente y generalizada de canales ióniones sensibles a la luz. Los vectores virales asociados a adenos (AAV) que codifican las opsin C1V1 de desplazamiento rojo fusionadas a proteínafluorescentes amarillas (EYFP) se inyectaron en la corteza de macacos de resus bajo CED guiado por RMN. Tres meses después de la infusión, imágenes epifluorescentes confirmaron grandes regiones de expresión optogenética (>130 mm2) en M1 y S1 en dos macacos. Además, pudimos registrar respuestas electrofisiológicas fiables de las áreas de expresión mediante matrices microelectrocortigráficas. El análisis histológico posterior y la inmunomancha contra el reportero revelaron una expresión optogenética generalizada y densa en M1 y S1 correspondiente a la distribución indicada por imágenes epifluorescentes. Esta técnica nos permite obtener expresión en grandes áreas de la corteza en un período de tiempo más corto con un daño mínimo en comparación con las técnicas tradicionales y puede ser un enfoque óptimo para el parto viral optogenético en animales grandes como los NCP. Este enfoque demuestra un gran potencial para la manipulación a nivel de red de circuitos neuronales con especificidad de tipo celular en modelos animales evolutivamente cerca de los seres humanos.
Introduction
La optogenética es una potente herramienta que permite la manipulación de la actividad neuronal y el estudio de las conexiones de red en el cerebro. La implementación de esta técnica en primates no humanos (NCP) tiene el potencial de mejorar nuestra comprensión de la computación neuronal a gran escala, la cognición y el comportamiento en el cerebro de los primates. Aunque la optogenética se ha implementado con éxito en los NCP en los últimos años1,2,3,4,5,6,7, un reto que los investigadores se enfrentan está alcanzando altos niveles de expresión en grandes áreas cerebrales en estos animales. Aquí, estamos proporcionando un enfoque eficiente y simplificado para lograr altos niveles de expresión optogenética en grandes áreas de la corteza en macacos. Esta técnica tiene un gran potencial para mejorar los estudios optogenéticos actuales en estos animales en combinación con la grabación de última generación8,9 y la estimulación óptica10 tecnologías.
La entrega mejorada por convección (CED) es un método establecido de entrega de agentes farmacológicos y otras moléculas grandes, incluidos los vectores virales, al sistema nervioso central11,12,13. Mientras que los métodos de administración convencionales implican múltiples infusiones de bajo volumen distribuidas en pequeñas regiones del cerebro, CED puede lograr una distribución más amplia y uniforme de los agentes con menos perfusiones. El flujo de fluido a granel (convección) impulsado por presión durante la perfusión permite una transducción distribuida más ampliamente y uniformemente del tejido objetivo al administrar vectores virales con CED. En estudios recientes, demostramos la transducción y posterior expresión optogenética de grandes áreas de masilla primaria (M1) y somatosensorial (S1) cortices9 y thalamus14 utilizando Resonancia magnética (MR) guiada por CED.
Aquí, delineamos el uso de CED para lograr la expresión optogenética en grandes áreas corticales con sólo unas pocas inyecciones corticales.
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Protocol
Todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus sitios) de la Universidad de California, San Francisco y cumplen con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El siguiente procedimiento se realizó utilizando dos macacos machos adultos de 8 y 7 años de edad, con un peso de 17,5 kg y 16,5 kg (mono G y mono J), respectivamente.
NOTA: Utilice técnicas asépticas estándar para todos los procedimientos quirúrgicos.
1. Imágenes de línea de base
- Sedar e intubar al animal y mantener la anestesia general bajo isoflurano (concentración cambiada entre 0 a 5% según sea necesario, dependiendo de los signos vitales como la frecuencia respiratoria y la frecuencia cardíaca). Controle la temperatura del animal, la frecuencia cardíaca, la saturación de oxígeno, las respuestas electrocardiográficas y la presión parcial final del CO2 durante todo el procedimiento.
- Coloque el animal en un marco estereotaxico compatible con MR (consulte la Tabla de Materiales)en el que permanecerá durante todo el procedimiento. Conecte el animal a una máquina de isoflurano compatible con RM portátil y llévelo al escáner de RMN (3 T).
- Adquirir T1 estándar (ángulo de volteo a 9o, tiempo de repetición/tiempo de eco a 668,6, tamaño de matriz: 192 x 192 x 80, espesor de la rebanada 1 mm) y T2 (ángulo de volteo a 130o, tiempo de repetición/tiempo de eco a 52,5, tamaño de matriz a 256 x 256 x 45, espesor de la rebanada a 1 mm) imágenes anatómicas MR como imágenes anatómicas MR referencia y para la planificación quirúrgica.
- Recuperar al animal de la anestesia y transportarlo a la zona de alojamiento de los animales.
- Utilice las imágenes T1 y T2 adquiridas para determinar la colocación de la craneotomía. La ubicación de la craneotomía se puede determinar con precisión haciendo coincidir el área cortical de interés de RM con el atlas cerebral macaco (Paxinos, Huang, Petride, Toga 2nd Edition). Además, estas imágenes de referencia pueden proporcionar una estimación de las ubicaciones de la perfusión viral. Las regiones corticales de interés que se muestran aquí son M1 y S1.
2. Implantación de cámara compatible con RM
- Sedar e intubar al animal y mantener la anestesia general con monitoreo anestésico estándar como en 1.1.
- Coloque el animal en el marco estereotaxico compatible con RM en el que permanecerá durante la implantación de la cámara y la administración de vectores virales. Conecte el animal a una máquina de isoflurano compatible con MR portátil.
- Crear una incisión sagital aproximadamente 2 cm de la línea media con una longitud de unos 5 cm con un bisturí.
- Retire el tejido blando subyacente del cráneo con ascensores (ver Tabla de materiales).
- Crear una craneotomía circular (2,5 cm de diámetro) para cubrir las trayectorias preplanificadas para las inyecciones utilizando un trephine (ver Tabla de Materiales).
- Baje el punto de centrado del trephine más allá del borde de la trephine. Crear una sangría en el centro de la craneotomía planificada lo suficientemente profundo en el cráneo para anclar la trephine usando el punto de centrado ajustable de la trephine. Tenga cuidado para evitar penetrar completamente a través de la profundidad del cráneo, ya que esto podría causar daño al tejido neural subyacente.
- Enjuague periódicamente el área con salina según sea necesario para mantener la humedad tisular a lo largo de la craneotomía.
- Una vez que se haya hecho el centro, baje el trephine sobre el cráneo y gire el trephine en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj mientras aplica presión descendente hasta que la tapa ósea se pueda extraer con fórceps. Tenga cuidado para evitar dañar el tejido subyacente con la trefina.
- Enhebrar una sutura fina (tamaño 6-0) a través de la dura en el centro de la craneotomía y levantar la dura tirando suavemente de la sutura de la superficie del cerebro creando una tienda de campaña en el centro de la craneotomía.
- A continuación, perforar la dura cerca del centro de la tienda usando tijeras oftálmicas finas para evitar dañar el cerebro. A continuación, corte la dura desde el centro hasta el borde de la craneotomía y continúe a lo largo del borde con tijeras opthalmic finas.
- Monte la cámara cilíndrica compatible con CED a medida cED MR (Figura1; ver sección 4 para obtener instrucciones de producción) en el cráneo en la parte superior de la craneotomía para proporcionar soporte de cánula durante la perfusión de CED de modo que la curvatura de la brida de la cámara se alinee bien con la curvatura del cráneo.
- Fije los implantes al cráneo con tornillos de plástico y acrílico dental o algunos tornillos de titanio.
3. Entrega de vectores virales
- Poco después de implantar la cámara compatible con MR e insertar la rejilla de inyección de cánula (Figura1A-B, Figura suplementaria 1) en la cámara, llenar la rejilla con salina (0,9% NaCl) para visualizar los lugares de inyección a través de imágenes anatómicas de RM y llenar las cavidades de la cámara con gelatina absorbible estéril húmeda para mantener la humedad del cerebro (Figura 1F).
- Cubra la piel y el cilindro con una cortina antimicrobiana estéril para mantener la esterilidad de los cilindros durante el transporte y las infusiones de RM. Coloque una cápsula de vitamina E para marcar la parte superior de la rejilla de inyección para una identificación positiva.
- Mientras el animal permanece intubado, desconecte el tubo endotraqueal del circuito de anestesia y vuelva a conectarlo a una máquina de isoflurano compatible con RM portátil y transporte al animal al escáner de RMN.
- Adquiera las imágenes T1 (ángulo de giro a 9o, tiempo de repetición/tiempo de eco, 668,6, tamaño de matriz 192 x 192, espesor de la rebanada de 1 mm, 80 rodajas) para calcular la distancia desde la parte superior de la rejilla de inyección y la superficie cortical. La cápsula de vitamina E es claramente visible en imágenes T1 y debe utilizarse como marcador para la parte superior de la rejilla de inyección (Figura2A). Utilice la herramienta de regla del software de imágenes MR para medir la distancia entre la parte superior de la rejilla de inyección y la superficie cortical.
- Adquiera imágenes de T2 (ángulo de volteo de 130o, tiempo de repetición/tiempo de eco 52,5, tamaño de matriz 256 x 256, espesor de la rebanada a 1 mm, 45 rodajas) para determinar las guías de cánula óptimas para cada sitio en función del lugar de perfusión objetivo (Figura2B-C). Como se mencionó anteriormente, la cuadrícula de cánulas está llena de salina que es mejor visible en las imágenes T2. Usando el software de imágenes por RMN, desplácese a través de los planos coronal y sagital para encontrar la ubicación objetivo de la perfusión.
- Después de descongelar el vector viral durante unas horas a temperatura ambiente, mezcle el vector viral con el gadoteridol del agente de contraste MR (Ratio de 250:1; 2mM Gd-DTPA, ver Tabla de Materiales)por pipeta o mezcla de vórtice.
NOTA: La técnica presentada se probó para vectores AAV con un promotor CamKIIa expresión de conducción de C1V1 fusionado a EYFP (AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP, titer: 2.5 x 1012 moléculas de virus/ml; ver Tabla de Materiales). - Cargue el virus mezclado en un tubo IV de alta presión de 0,2 ml (ver Tabla de Materiales).
- Establezca un campo estéril fuera del escáner de RMN para preparar la línea de perfusión viral.
- Utilizando tubos IV de alta presión, conecte una larga línea de extensión (aproximadamente 3-5 metros, dependiendo de la ubicación de la bomba de perfusión con respecto al orificio de RM) a una jeringa de 3 ml compatible con RM y ceba con solución salina.
- Conecte el extremo distal de la línea de extensión larga al extremo proximal del tubo IV de 0,2 ml cargado con el virus y conecte la cánula resistente al reflujo con una punta escalonada de 1 mm (Figura2D;ver sección 5 para las instrucciones de producción de cánulas) al extremo distal de este conjunto con un conector de catéter de estilo abrazadera (ver Tabla de Materiales)(Figura2E).
- Por último, coloque la jeringa en una bomba compatible con MR (ver Tabla de materiales). Coloque el controlador de la bomba en la sala de control del escáner, ya que no es compatible con MR.
- Utilizando las imágenes de RM anatómicas de línea base obtenidas antes, seleccione la ubicación de la rejilla de inyección de cánula y la profundidad de inserción necesarias para llegar al lugar de perfusión objetivo. Marque la profundidad de inserción en la cánula con cinta estéril.
- Iniciar la perfusión a una velocidad de 1 l/min y validar visualmente el flujo del líquido en la línea de perfusión observando la expulsión de líquido desde la punta de la cánula.
- Inserte la cánula manualmente a través de la rejilla de inyección a la profundidad objetivo mientras mantiene el flujo en la línea de perfusión, ya que esto evitará que el tejido penetrado obstruya la cánula durante la inserción.
- Adquiera imágenes ponderadas rápidas (2 minutos) tensas T1 (ángulo de volteo a 30o, tiempo de repetición/tiempo de eco a 3,05, tamaño de matriz 128 x 128, espesor de la rebanada de 1 mm y 64 rodajas) para el monitoreo en línea de la perfusión vectorial viral.
- Después de infundir 10 l del vector de tal manera que se infunde suficiente virus para detectar en el escáner de RM, obtener imágenes de RM para verificar la colocación correcta de la cánula como lo demuestra la propagación observada del virus. Si la profundidad de la cánula insertada es incorrecta, ajuste la profundidad en consecuencia o retire lentamente la cánula y vuelva a intentar la inserción como en 3.12.
- Supervise la perfusión a través de la orientación de imágenes de RM en línea (flash T1 ponderado) y aumente la velocidad de perfusión a 5 l/min en 1 l/min cada pocos minutos (figura3A).
- Después de infundir aproximadamente 40 l del vector viral, comience a reducir la velocidad de perfusión en pasos de 1 L/min y detenga la perfusión después de que se inyecte 50 l y deje la cánula en su lugar durante 10 minutos.
- Retire lentamente la cánula del cerebro y muévase a la siguiente ubicación. Repita los pasos 3.9 a 3.19 para cada ubicación.
- Cubra el cilindro con una cortina estéril al final de las inyecciones, antes del transporte animal. A continuación, transportar el animal de vuelta al quirófano.
- Explantar la cámara compatible con RM y cerrar la incisión quirúrgica reemplazando el colgajo óseo y el músculo que cubre y suturando la piel utilizando técnicas asépticas estándar o reemplazar la cámara con un cilindro de titanio y dura artificial (ver 20169) para el registro y la estimulación neuronal.
4. Producción de cámara compatible con MR
- Fabricar la rejilla de inyección de cánula de nylon (Figura1A-B) mecanizando de acuerdo con las dimensiones especificadas (FiguraSuplementaria 1).
- Imprima en 3D el cilindro compatible con MR de acrilonitrilo butadieno estireno (plástico ABS0 (Figura 1C-E) (véase Archivo suplementario 1–3; véase Tabla de materiales para impresoras y materiales 3D).
NOTA: Un diseño mantiene una rejilla de inyección de cánula fija dentro del cilindro compatible con MR (Figura1C),mientras que otro permite la rotación de la rejilla, extendiendo la región de inyección (Figura1D-E). - Enrosque la rejilla de inyección de cánula y toque la cavidad correspondiente de la cámara compatible con MR de forma que ambas piezas exhiban el mismo roscado.
NOTA: Se puede utilizar cualquier tipo de subprocesamiento siempre que ambos componentes tengan el mismo subproceso. - Inserte la rejilla de inyección de cánula de nylon atornillando el orificio roscado del cilindro compatible con MR.
5. Producción de cánulas resistente al reflujo13
- Corte un tubo de sílice de 30 cm de largo con 0,32 mm ID y 0,43 mm de DIÁMETRO para el tubo de sílice interior (ver Tabla de Materiales)utilizando una cuchilla de afeitar.
- Corte un tubo de sílice de 7,5 cm de largo y un tubo de sílice de 5 cm de largo con 0,45 mm ID y 0,76 mm de DIÁMETRO para el tubo de sílice exterior (ver Tabla de Materiales).
- Adherir el tubo exterior de 7,5 cm al tubo interior de 30 cm con cianoacrilato de tal manera que el tubo interior se extienda 1 mm más allá del tubo exterior, haciendo que el paso resistente al reflujo (Figura2D). Para asegurarse de que el cianoacrilato no entre en el interior del tubo interior, coloque el cianoacrilato en el exterior del tubo interior lejos de la punta de la cánula.
- Pegue el tubo de sílice de 5 cm de largo en el otro extremo del tubo interior para su fijación al conector del catéter estilo abrazadera (ver paso 3.10).
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Representative Results
Entrega mejorada por convección (CED) bajo la Guía de RMN
La propagación del vector viral se monitorizó durante la perfusión de CED bajo la guía de imágenes de RM en línea (Figura3A). En este estudio, S1 y M1 de dos monos fueron atacados (Figura3B). Los volúmenes de distribución tridimensional se estimaron en un análisis post-hoc de las imágenes de RM (Figura3C)como se describe por Yazdan-Shahmorad et al. 20169, confirmando la cobertura de grandes áreas de corteza. Las infusiones M1 para el mono G se realizaron sin guía de RM debido a limitaciones de tiempo.
Validación de la Expresión Viral
La gran expresión otogenética cortical fue confirmada por imágenes epifluorescentes, grabaciones electrofisiológicas y análisis histológicos, tal como se describe en Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Monitorizamos la expresión optogenética por imágenes de epifluorescencia superficial del reportero fluorescente2,9 y estimamos más de 130 mm2 de expresión a lo largo de la superficie cortical en M1 y S1 de dos macacos de sólo tres inyecciones corticales9,15. La estimulación de la luz (488 nm, 20 mW de potencia en la punta; ver Tabla de Materiales)produjo respuestas electrofisiológicas fiables en las áreas de expresión medidas por matrices microelectrocorticográficas semitransparentes8,9 ,16 (Figura 4).
El análisis de las imágenes MR produjo un estimado de 233 mm3 y 433 mm3 de dispersión vectorial en M1 y S1 del mono J, respectivamente, y 317 mm3 en S1 del mono G9. Realizamos análisis histológicos en secciones coronales en serie y observamos la expresión optogenética a gran escala alrededor de los sitios de perfusión en M1 y S1 (Figura5C-I),con un estimado del 70-80% de las células que expresan la opsina. La expresión observada a partir de la histología se alinea con la distribución estimada de la expresión a partir de imágenes epifluorescentes (Figura5A-D). Una de las dos perfusiones realizadas fuera del escáner MR en el mono G no tuvo éxito, sin producir ninguna expresión en la región correspondiente (Figura5D). La propagación estimada a partir de imágenes por RMN estaba completamente dentro de los límites tanto de las medidas epifluorescentes como histológicas de la propagación viral (Figura5E-G). La expansión de las imágenes epifluorescentes más allá de la estimación de RM puede atribuirse a la difusión de partículas virales más allá de la región de advección. Además, la estimación histológica se extendió más allá de la estimación de epifluorescencia debido a la falta de acceso óptico más allá de la craneotomía. Los detalles de estas técnicas se incluyen en nuestro documento anterior9.
Figura 1: Cilindro compatible con RM y rejilla de inyección de cánula. (A, B) rejilla de inyección de nylon diseñada a medida. (C) Cilindro fijo compatible con MR. (D,E) Cilindro giratorio compatible con MR. (F) Cilindro de perfusión compatible con MR con posición de rejilla fija. Las flechas apuntan a las cavidades que están diseñadas para ser llenadas con gelatina absorbible estéril húmeda manteniendo la superficie del cerebro húmeda durante la inyección. (G) Cánula insertada en la rejilla. Esta cifra ha sido modificada de Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes por RMN de línea base y cánula resistente al reflujo. (A) Imagen ponderada por T1 de vitamina E que estaba unida a la parte superior de la rejilla de inyección que nos permite medir la distancia a la superficie del cerebro (flecha blanca). (B) La imagen ponderada por T2 del cerebro ayuda a planificar la ubicación de la inyección de la cuadrícula de cánulas llena de salina. (C) imagen MR de la cámara de perfusión y de la rejilla de cánulas llena de salina. Las líneas ortogonales representan los planos sagital (amarillo) y coronal (púrpura). (D) Foto de la punta de la cánula de inyección resistente al reflujo con el paso resistente al reflujo (flecha negra). (E) Líneas de perfusión. Esta cifra ha sido modificada de Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: IMÁGenes por RMN durante la perfusión y la distribución estimada. (A) Difusión de 50 l del vector viral en secciones coronales del mono G para un lugar de inyección en S1 (mostrado con una flecha en B). (B) representación de la superficie de RMN de la superficie cortical por debajo del cilindro para los monos G y J, respectivamente. Las ubicaciones de perfusión S1 se muestran en azul, m1 ubicaciones en rojo. (C) Reconstrucción del volumen MR de la propagación del vector viral después de la perfusión de CED. El cerebro se muestra en gris claro; Los volúmenes de perfusión S1 y M1 se muestran en azul y rojo, respectivamente. No se dispone de reconstrucción del volumen de RM para las perfusiones M1 para el mono G, ya que no se realizaron en el escáner de RM. Esta cifra ha sido modificada de Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Registros electrofisiológicos de la actividad evocada por la luz. Durante la estimulación óptica pulsada se produjeron grabaciones de microelectrocorticografía. Los rastros de registro fueron desde el electrodo más cercano al sitio de estimulación para ejemplos de ubicaciones de estimulación M1 (rojo) y S1 (verde). Las áreas sombreadas alrededor de las trazas representan un error estándar en 25 ensayos. Los cuadrados azules en las trazas muestran el momento de la estimulación (1 ms). El conjunto completo de formas de onda activadas por estímulo para ambos pares de muestras de sitios de estimulación y registro se superponen en la forma de onda media como se muestra en el lado izquierdo del panel. Esta cifra ha sido modificada de Yazdan-Shahmorad et al. 20169. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis histológico. (A) Imagen de RM coronal basal en el mono G. (B) Difusión del agente de contraste después de la perfusión para la misma rebanada coronal de RMN que en A. (C) Una sección de tejido coronal de aproximadamente el mismo sitio que en A y B; la tinción de peroxidasa refleja la expresión del reportero de EYFP. (D) Se observa una buena alineación entre el área de expresión DeEFP medida con epipoleescencia superficial (zonas verdes oscuras) y con tinción histológica (líneas verdes claras). Estos incluyen la región de dispersión vectorial estimada a partir de imágenes DE RM (línea blanca); los puntos blancos indican los sitios de inyección, y toda la región negra representa el área expuesta por la craneotomía. Los dos sitios de inyección más a la izquierda se encuentran en M1, y los dos sitios a la derecha se encuentran en S1. (E) Imagen de bajo aumento de la sección coronal teñida con anticuerpo anti-GFP que muestra el aspecto medio-lateral de la expresión YFP en la corteza somatosensorial del mono J (áreas 1, 2, 3). La punta de flecha negra indica la ubicación de la pista de cánula; el tejido adyacente (marco negro) se muestra en F, con mayor aumento para mostrar la distribución laminar de las células positivas de YFP. (F) Regiones densamente pobladas de células Positivas yFP se encuentran predominantemente en las capas II-III y V-VI, y también muestran morfología piramidal típica (las células en marcos blancos se agrandan aún más en paneles (G-I). Las puntas de flecha blancas en los paneles inferiores G-I apuntan a las celdas piramidales típicas en las capas II-III (G); capa V (H); y la capa VI (I). Barras de escala de 2 mm (E); 200 m (F); 100 m (G-I). Esta figura ha sido modificada de Yazdan-Shahmorad et al. 20169 y Yazdan-Shahmorad et al. 201815. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1: La rejilla de inyección de cánula antes del enhebrado. La longitud y el diámetro de la rejilla de inyección son de 15,00 mm y 12,00 mm, respectivamente. El patrón de rejilla de inyección consta de agujeros de 0,8 mm de diámetro que forman tres círculos concéntricos (diámetro: 1,6, 3,2 y 4,8 mm) alrededor del centro de la cuadrícula. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivos Suplementarios. Haga clic aquí para descargar estos archivos.
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Discussion
Aquí, delineamos una técnica factible y eficiente para lograr la expresión optogenética a gran escala en la corteza primaria somatosensorial y motora de NHP por CED guiada por RMN. El uso de CED guiado por RMN presenta ventajas significativas sobre los métodos tradicionales de infusión viral en el cerebro NHP. Una de estas ventajas es la capacidad de lograr la expresión en grandes áreas con menos infusiones necesarias. Por ejemplo, con métodos convencionales, múltiples inyecciones de 1-2 l de la expresión de rendimiento vectorial en una región de 2-3 mm de diámetro1,2,5,17. Mientras que los intentos anteriores de lograr la propagación vectorial a gran escala han producido volúmenes de expresión de aproximadamente 10 mm3 con múltiples inyecciones18,aquí presentamos un método para lograr la expresión de más de 200 mm3 con sólo unas pocas infusiones . Una sola perfusión de 50 l por CED puede lograr la propagación vectorial hasta 10 mm desde el lugar de inyección para cortical CED9 y la cobertura completa de las áreas corticales frontales con CED talámico14.
Además, se ha demostrado que el uso de CED puede lograr una distribución más homogénea del agente inyectado12,19,20,21,22, dando lugar a niveles de expresión uniformes alrededor del sitio de la infusión de vectores virales, en comparación con las microinyecciones tradicionales. En nuestros experimentos que empleaban CED, observamos niveles de expresión uniformemente altos con aproximadamente 70-80% de las neuronas que expresan el opsin8,9 (Figura5). Por el contrario, las inyecciones convencionales basadas en la difusión presentan regiones de alta expresión concentradas cerca de los sitios de inyección envueltas por el debilitamiento de los niveles de expresión4,5,17. La menor necesidad de inyecciones múltiples hace que la perfusión de CED sea un método eficiente en el tiempo para obtener una expresión optogenética uniforme a gran escala. Debido al menor número de inyecciones y tasas de perfusión más rápidas, pudimos planificar e infundir el vector viral bajo la guía de la RMN. El uso de imágenes de RM en línea permite la focalización precisa de las perfusiones y el seguimiento de la propagación del vector viral durante la perfusión. Sin embargo, si la profundidad inicial de la cánula insertada es incorrecta, esto puede producir expresión en lugares no deseados como resultado de la infusión inicial de 10 ol necesaria para detectar visualmente la perfusión a través de MR. Alternativamente, los sistemas de navegación neuroquirúrgica comercial, alternativamente, la utilización de marcadores fiduciarios también se puede emplear en lugar de la guía por RMN. Además, los costos de la imagen en línea pueden eludirse marcando la profundidad de inserción deseada en la cánula antes de la inserción y confirmando visualmente la perfusión completa a través de la línea de perfusión, aunque la precisión de la colocación de la cánula sería Reducido. Sin embargo, como se ve por la inyección fallida en M1 del mono G (Figura5D),la guía de RM puede ser crítica para asegurar una perfusión exitosa.
Estudios anteriores han demostrado la seguridad de las infusiones de CED de partículas no virales y virales sin daño tisular observado fuera del tracto cánula y sin déficits de comportamiento9,11,12,13 ,14,15,20. Aquí y en nuestras publicaciones anteriores9,14 reportamos resultados similares después de la infusión de CED de vectores virales optogenéticos. Además de los déficits de comportamiento observados después de la perfusión, NeuN y Nissl9,14,15 tinción revelaron muerte en las células neuronales y gliosis se limitó sólo al tracto de cánula, como se ha informado con métodos basados en la difusión5. Para minimizar el daño de la pista de cánula, podemos reducir potencialmente el diámetro de la cánula. Sin embargo, se necesita una investigación adicional para evaluar el efecto de la reducción del tamaño de la cánula en la consecución de grandes áreas de expresión. Por otra parte, debido a que las altas tasas de perfusión también pueden conducir a daños tisulares13, se recomienda mantener una velocidad de perfusión a o por debajo de 5 l /min. Para obtener información más detallada sobre la técnica CED, consulte nuestra publicación anterior9.
El uso de CED guiado por RMN para alcanzar amplias regiones de expresión optogenética dirigida en la corteza primada puede conducir a investigaciones adicionales de dinámica de circuitos a gran escala, plasticidad neuronal y conectividad de red.
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Disclosures
PNS tiene interés financiero en Neuralink Corp., una empresa que está desarrollando terapias clínicas utilizando estimulación cerebral.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la beca postdoctoral de la Asociación Americana del Corazón (AY), la Reorganización de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA) y la Plasticidad para Acelerar la Recuperación de Lesiones (REPARACION; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, y por el Centro de Imágenes de Neurociencia UCSF. Este trabajo también fue apoyado por el Instituto Nacional Eunice Kennedy Shiver de Salud Infantil y Desarrollo Humano de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Número de Premio K12HD073945, el Centro Nacional de Investigación de Primates de Washington (WaNPCR, P51 OD010425), y el Centro de Neurotecnología (CNT, un Centro de Investigación de Ingeniería de la Fundación Nacional de Ciencias bajo la Beca CEE-1028725). Agradecemos a Camilo Díaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani y Blakely Andrews por su ayuda con los experimentos y Nan Tian, Jiwei He, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz y Toni Haun por su ayuda técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL High Pressure IV Tubing | Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA | 533640 | |
| 0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150027 | |
| 0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP | Penn Vector Core, University of Pennsylvania | ||
| ABS plastic | Stratasys, MN, USA | ABSplus-P430 | |
| Antimicrobial incise drape | 3M | 6650EZ | Ioban Drape |
| Dental Acrylic | Henry Schein, Inc. | 1013117 | Acrylic Bonding Agent |
| Elevators | VWR International, LLC. | 10196-564 | Langenbeck Elevator, Wide Tip |
| Fine suture | McKesson Medical-Surgical Inc. | 1034505 | |
| Gadoteridol | Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ | 0270-1111-04 | |
| Laser for light stimulation | Omicron-Laserage, Germany | PhoxX 488-60 | |
| MR compatible 3 cc syringe | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | 59-8377 | |
| MR Imaging Software | Pixmeo | OsiriX MD 10.0 | |
| MR-Compatible Pump | Harvard apparatus, Holliston, MA, USA | Harvard PHD 2000 | |
| MR-compatible stereotaxic frame | KOPF | 1430M MRI | |
| Perifix Clamp Style Catheter Connector | B-Braun, Bethlehem, PA, USA | N/A | |
| Plastic Screws | Plastics 1 | 0-80 x 1/8N | Nylon screws |
| Titanium screws | Crist Instrument Co., Inc. | 6-YCX-0312 | Self-tapping bone screws |
| Trephine | GerMedUSA Inc, | SKU:GV70-42 | |
| uPrinter SE 3D printer | Stratasys, MN, USA | N/A | |
| Vitamin E Capsule | Pure Encapsulations, LLC. | DE1 | |
| Wet sterile absorbable gelatin | Pfizer Inc. | AZL0009034201 | Gelfoam |
References
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