Summary
Dit protocol beschrijft een gedetailleerde procedure voor het resuspenderen en kweken van menselijke stamcel afgeleide neuronen die eerder werden onderscheiden van neurale voorlopercellen in vitro voor meerdere weken. De procedure vergemakkelijkt op beeld gebaseerde assays van neurites, synapsen, en laat-uitdrukken neuronale markers in een formaat dat compatibel is met lichte microscopie en High-content screening.
Abstract
Neuronen onderscheiden in tweedimensionale cultuur van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide neurale voorlopercellen (Npc's) vormen een krachtig modelsysteem om ziekte mechanismen te onderzoeken en High content screening (HC'S) uit te voeren voor interrogaat verbinding bibliotheken of Identificeer genmutatie fenotypes. Echter, met menselijke cellen de overgang van NPC naar functioneel, volwassen neuron vereist enkele weken. Synapsen beginnen meestal te vormen na 3 weken van differentiatie in monolaag cultuur, en verschillende neuron-specifieke eiwitten, bijvoorbeeld de later uitdrukken pan-neuronale marker neun, of de laag 5/6 cerebrale corticale neuron marker CTIP2, beginnen te uiten ongeveer 4-5 weken na differentiatie. Deze lange differentiatie tijd kan onverenigbaar zijn met optimale cultuuromstandigheden die worden gebruikt voor kleine volumes, multi-well HCS-platformen. Onder de vele uitdagingen zijn de behoefte aan goed-nageleefd, uniform verdeelde cellen met minimale celclustering, en cultuur procedures die lange termijn levensvatbaarheid en functionele Synapse rijping bevorderen. Een benadering is het differentiëren van neuronen in een groot volume formaat, en ze vervolgens opnieuw op een later tijdstip in HCS-compatibele multi-Wells. Enkele belangrijke uitdagingen bij het gebruik van deze replating aanpak betreffen reproduceerbaarheid en de levensvatbaarheid van de cel, als gevolg van de stressvolle verstoring van het dendritische en axonale netwerk. Hier demonstreren we een gedetailleerde en betrouwbare procedure voor enzymatisch resuspenderende menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleide neuronen na hun differentiatie voor 4-8 weken in een groot volume formaat, overbrengen naar 384-well micro titer platen, en kweek ze voor nog eens 1-3 weken met uitstekende overleving van de cel. Deze replating van menselijke neuronen kan niet alleen de studie van Synapse assemblage en rijping binnen twee weken na het replating, maar maakt ook studies van neuriet regeneratie en groei kegel kenmerken. We bieden voorbeelden van schaalbare assays voor neuritogenesis en synaptogenese met behulp van een 384-well platform.
Introduction
Menselijke pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleide neuronen worden steeds relevanter op het gebied van fundamenteel onderzoek, Geneesmiddelenontwikkeling en regeneratieve geneeskunde. Workflows en procedures om hun cultuur en onderhoud te optimaliseren en de efficiëntie van differentiatie in specifieke neuronale subtypen te verbeteren, evolueren snel1,2. Om het nut en de kosteneffectiviteit van menselijke stamcel afkomstige neuronen te verbeteren als modelsystemen die vatbaar zijn voor analyses met een hoog gehalte in geneesmiddelen ontdekking en doel validatie, is het nuttig om de kweektijd te verlagen die nodig is voor het genereren van volwassen, functionele neuronen, met behoud van maximale robuustheid, reproduceerbaarheid en fenotype relevantie. Hoewel 3-dimensionale organoïde-culturen doorbraken in neuroontwikkelingsonderzoek rijden, zijn 2-dimensionale monolaag-culturen met name compatibel met geautomatiseerde beeldvormings toepassingen vanwege hun minimale weefsel dikte.
Echter, de aanpassing van Imaging-gebaseerde screeningmethoden aan modellen van menselijke neurologische en neuroontwikkelingsziekte wordt geconfronteerd met een grote uitdaging. Het langdurige tijdsbestek waarover het menselijk zenuwstelsel in vivo rijpt, vereist uitgebreide tijd in cultuur om tegemoet te komen aan natuurlijke Programma's van genexpressie en neuronale rijping te bereiken.
Een praktisch gevolg van het lange neuronale differentiatie programma is dat het onderhoud van de met hipsc afgeleide monolaag culturen gedurende vele weken moet worden gehandhaafd om een adequate Synapse maturiteit te bereiken. Gedurende deze tijd, neurale voor ouders die ongedifferentieerde blijven blijven verdelen. Deze kunnen de cultuur snel overgroeien en de nutriënten-inhoud die nodig is om levensvatbare postmitotische neuronen te behouden. Krachtig verdelen neurale voorlopercellen (Npc's) kan ook concurreren met neuronen voor de groei substraat. Hierdoor kunnen dergelijke culturen worden onderworpen aan problemen met een slechte hechting, een aandoening die ongeschikt is voor op beeldvorming gebaseerde assays. Bovendien vinden veel onderzoekers dat hoe kleiner het cultuur volume, hoe groter de moeilijkheid bij het handhaven van gezonde populaties van gedifferentieerde neuronen lang genoeg om de late stadia van neuronale differentiatie te observeren. Met andere woorden, assays van Synapse rijping met behulp van High content screening (HCS) benaderingen kunnen zeer uitdagend voor menselijke-afgeleide neuronen.
Om sommige van deze problemen te omzeilen, is een procedure voor het opnieuw opschorten en replating van eerder gedifferentieerde hiPSC-afgeleide neuronen gebruikt. Ten eerste, het maakt de studie van neuriet uitgroei (of, nauwkeuriger, neuriet regeneratie) in een populatie van volledig betrokken neuronen. Ten tweede, de herbeplating van eerder gedifferentieerde neuronen uit een groot volume formaat (zoals 10 cm platen of groter), tot kleine volume formaten (zoals HCS-compatibele 96-of 384-well microtiterplaten) maakt een significante reductie in de totale kweektijd in de kleine volume conditie. Dit vergemakkelijkt de studie van Synapse assemblage en rijping in de daaropvolgende weken in vitro.
Echter, de replating van volwassen neuronen die al hebben vastgesteld lange neurites en een complex connectiviteits netwerk presenteert verschillende uitdagingen, waarvan één is de soms hoge en variabele snelheid van celdood. Hier beschrijven we een replating procedure die resulteert in uitstekende celoverleving en reproduceerbaarheid. Gewoonlijk worden neuronen blootgesteld aan Proteolytische enzymen voor korte incubatie perioden (meestal ~ 3-10 min) om cellen los te maken van het substraat voorafgaand aan de trituratie. Deze korte proteolyse tijd wordt gewoonlijk gebruikt voor het resuspenderen en doorvoeren van vele soorten scheidings cellen, waaronder niet-neuronale cellen en ongedifferentieerde voor ouders4,5,6. Echter, voor gedifferentieerde neuronen met lange, onderling verbonden neurites, is het essentieel niet alleen om cellen los te koppelen van het substraat, maar ook om het dendritische en axonale netwerk te verstoren om individuele cellen te isoleren terwijl de schade wordt geminimaliseerd. Inderdaad, een dik gevlochten van neuronen meestal de neiging om los te koppelen van het substraat als een enkel blad, in plaats van als individuele cellen. Als er geen zorg wordt genomen om het dikke netwerk van neurites los te maken, worden neuronen niet alleen onomkeerbaar beschadigd tijdens de trituratie, maar velen van hen verzuimen het filter te passeren dat wordt gebruikt om klonten te verwijderen, wat resulteert in een slechte celopbrengst. Hieronder beschrijven we een eenvoudige wijziging van een veelgebruikte incubatie procedure voor protease om deze moeilijkheden tegen te gaan.
In het hieronder beschreven protocol worden neuronen gedurende 40-45 minuten geïnnobeerd met een milde protease, zoals het Proteolytische enzym (bijv. Accutase). Tijdens de eerste 5-10 min na het toevoegen van het enzym, het neuronale netwerk Tilt van de ondergrond als een blad. De incubatie met de protease gaat nog 30-40 minuten mee voordat de zachte trituratie en filtering wordt voortgezet. Deze extra incubatietijd zorgt ervoor dat de vertering van het materiaal het intercellulaire netwerk ontspant, zodat de daaropvolgende trituratie een suspensie van individuele cellen oplevert. Deze procedure maximaliseert de uniformiteit van de celverdeling bij het replating, terwijl de celdood wordt geminimaliseerd. We hebben deze replating methode met succes toegepast op door hipsc afgeleide neuronale culturen, gegenereerd door verschillende differentiatie protocollen7,8 en verschillende lijnen van hipscs. De procedure is nominaal geschikt voor gebruik met de meeste of alle lijnen van stamcel afgeleide neuronen. We hebben geconstateerd dat een verlengde incubatietijd van de protease niet absoluut noodzakelijk is voor het replating van culturen uit kleine formaat platen (bijv. 35 mm diameter); echter, zoals we hier laten zien, biedt het een significant voordeel bij het replating van platen met grote diameter (bijv. 10 cm diameter of groter), waarschijnlijk omdat neurites in dergelijke platen zeer lange processen kunnen verlengen en een dicht met elkaar verbonden array vormen.
Hier demonstreren we deze methode en illustreren kort de toepassing ervan in assays voor vroege neuritogenesis en voor Synapse rijping, waarbij clustering van pre-en postsynaptisch eiwitten langs de dendrieten en axonen, gevolgd door hun latere colokalisatie op synaptische sites. De voorbeelden wijzen op de voordelen die dit protocol biedt bij het behoud van de levensvatbaarheid en reproduceerbaarheid van cellen. Ten eerste staat het onderzoekers toe om vroege stappen in menselijke neuritogenese te bestuderen. De experimentele instelling is vergelijkbaar met de veelgebruikte primaire culturen van knaagdieren corticale of hippocampal neuronen, waar cellen worden geëxtraheerd uit de late foetale of vroege postnatale hersenen, gezien door trituratie na milde protease behandeling, en toegestaan om te initieert neurites of regenereren neurites die in de procedure9,10werden verbroken. Vergelijkbaar met dergelijke knaagdieren primaire neuronen, hiPSC-afgeleide neuronen beginnen te vormen of hun neurites regenereren binnen enkele uren na het replating, waardoor Imaging van groei kegels en neuriet morfologie in een omgeving die optimaal is voor hoge spatiotemporele beeldvorming met minder Omringende ongedifferentieerde cellen. We hebben geconstateerd dat neuriet uitgroei is meer gesynchroniseerd in vergelijking met de variabele vertragingen en verschillende uitgroei percentages gezien wanneer neuronen beginnen te onderscheiden van een voorlopercellen populatie. Bovendien, replating maakt assays van neuronen die neuronale subtype markeringen die meestal verschijnen later in neurale ontwikkeling, zoals de corticale laag 5/6 transcriptiefactor CTIP2 (kip ovalbumine upstream Promoter transcriptie factor-interactie eiwit 2), of de pan-neuronale marker NeuN11. Een bijzonder nuttig kenmerk van de replating aanpak is dat synaptogenese verloopt binnen een tijdsbestek compatibel met HCS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. differentiatie periode voorafgaand aan de Herbeplating
- Differentiëren neuronen op 10 cm gerechten, met behulp van een protocol van keuze7,8 totdat neuronen een dik netwerk met hun processen hebben gevormd en uiten niet alleen vroege neuronale markers zoals map2 of TuJ1, maar ook late markers zoals neun.
-
Verander de helft van het medium naar keuze elke 4 dagen tijdens het neuronale differentiatieproces.
Opmerking: meer uitgebreide of frequente veranderingen in het medium verdunnen essentiële trofische factoren, en zou de rijping kunnen verteren.- Voor de IPSC-afgeleide WT126 neuronen, gebruik maken van de volgende post-differentiatie kweekmedia: 5 ml 100x N2 supplement, 10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml gdnf, 1 μg/ml laminin, 200 μM ascorbinezuur, 1 μM dibutyryl-Camp en 10 ml SM1 voor 500 ml dulbecco's gemodificeerde eagle's medium/ mengsel van nutriënten F-12 (DMEM/F12). Geleidelijk, met behulp van half-media veranderingen, vervangen door neurale basale medium (tabel van materialen) en dezelfde supplementen.
- Voor de IPSC-afgeleide CVB WT neuronen, gebruik de volgende post-differentiatie kweekmedium: 500 ml neurale basal een medium (tabel van de materialen) en 500 ml DMEM/F12 medium met 2 μg/ml laminin, 10 ml glutamine supplement (tabel van de materialen), 0,75 mg/mL natriumbicarbonaat, 5 mL minimaal essentieel medium (MEM) niet-essentiële aminozuren, 0,2 mM ascorbinezuur, 10 ng/mL BDNF, 20 mL 50x B27 en 10 mL 100x N2 supplement.
2. coating multi Wells
- De dag voor het replating, vacht met poly-L-Ornithine (PLO). Los PLO in steriel water op om een stamoplossing te maken (10 mg/mL). Bewaar deze kolf bij-20 °C. Verdun de PLO 1:100 in water om een concentratie van 50 μg/mL te leveren bij coating glas en 1:1.000 ratio (10 μg/mL) bij het coaten van kunststof.
- Breng de coating direct op de doelplaten aan. Gebruik het volume van de coating die past bij de plaatgrootte (d.w.z. voor een 24-goed plaat Breng 500 μL PLO-oplossing per put aan).
- Laat de platen 's nachts in het donker zitten bij kamertemperatuur.
- Haal de gecoate platen op de dag van het replating op en breng deze over naar een steriele bioveiligheidskast.
- Aspireren de PLO-oplossing en spoel tweemaal met steriel water.
- Verdund laminine (1,15 mg/mL) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 1:400 verdunning.
Opmerking: Ontdooien laminine bij 4 °C en voeg snel toe aan PBS om aggregatie van laminine en ongelijke coating te voorkomen. - Aspireren steriel water en breng 500 μL laminine coating aan putten eerder bedekt met PLO.
- Plaats de platen in een incubator van 37 °C voor een minimum van 4-6 h. gebruik langere incubaties tot 16 uur voor glazen oppervlakken. Gebruik consistente incubatie tijden.
3. replating gedifferentieerde neuronen
- Reinig de plaat van gedifferentieerde neuronen met PBS eenmaal zachtjes. Dispergeer PBS zachtjes langs de wand van de plaat, en niet rechtstreeks op de cellen, om te voorkomen dat ze worden verstoord.
- Zachtjes aspireren PBS, voorzichtig zijn om te voorkomen dat het aanraken van de cellen rechtstreeks, maar te aspireren vanaf de rand van het gerecht terwijl het kantelen naar de onderzoeker.
- Breng ten minste 1 mL van het Proteolytische enzym (tabel met materialen) per 10 cm plaat aan en keer de cellen terug naar de incubator. Voeg iets hogere volumes toe als de weefselkweek kamer een hoge verdampingssnelheid vertoont als gevolg van een lage luchtvochtigheid.
- Incuberen cellen met proteolytisch enzym voor 40-45 min om ze los te maken van de plaat en ze los te maken van andere neuronen binnen het neuronale netwerk.
Opmerking: Timing bij deze stap is van cruciaal belang. De protease te vroeg afschrikken kan leiden tot een verhoogde celdood na het replating. De fabrikant van het Proteolytische enzym raadt aan dat temperaturen die veel lager zijn dan 37 °C worden gebruikt met langere incubatie perioden voor het doorvoeren van cellijnen (bijv. 's nachts bij 4 °C). Het hanteren van neuronen bij 4 °C dient echter te worden vermeden, omdat ze vaak een slechte overleving vertonen na een koude blootstelling. De fabrikant verklaart ook dat een incubatie van 60 minuten met het enzym bij 37 °C leidt tot de enzymatische inactivatie. Echter, in de ervaring van de auteurs, een 40-45 min incubatie van de hiPSC afkomstige neuronale culturen bij 37 ° c is voldoende voor efficiënte dissociatie en uitstekende neuronale overleving bij het replating. - Controleer de neuronen op een fase-contrast Microscoop tijdens de incubatietijd en laat de protease behandeling doorgaan tot het neurale netwerk volledig loskomt van de plaat en begint te breken in kleinere vellen bij het kort schudden van de plaat onder de Microscoop.
- Quench de protease activiteit met 5 mL verse DMEM-media per 1 mL protease in de 10 cm-plaat om de spijsvertering te stoppen. Schud de cellen voorzichtig tegenplaat 5-8 keer om het netwerk te verstoren met behulp van serologische pipetten. Wees voorzichtig niet te veel druk toe te passen bij het tritureren, als gedifferentieerde neuronen zijn kwetsbaar. Gebruik niet een P1000 tip, als het einde is te scherp en smal, en dus kan pure of beschadiging van de neuronen.
- Breng oplossing met cellen aan via een celzeef met een diameter van 100 μm mesh in een verse 50 mL conische buis druppel voor druppel.
- Spoel de zeef af met nog 5 mL verse DMEM media, nadat de cellen zijn gefiltreerd.
- Spin cellen in tafel centrifuge bij 1.000 x g gedurende 5 min.
- Keer de conische buis terug naar de bioveiligheid-kast en zuig het grootste deel van de media op en laat ongeveer 250 μL om ervoor te zorgen dat de cellen vocht vasthouden.
- Respendeer cellen zachtjes in 2 mL verse DMEM media. Pipetteer de pellet niet tegen de zijkant van de buis. Inverteer in plaats daarvan de conische 2-3 keer zachtjes en geef cellen door aan het einde van een serologische Pipet van 5 mL om ze af te maken.
- Breng 10 μL geresuspendeerde neuronen aan op de rand van een hemocytometer.
- Voeg 8-10 μL trypan Blue toe aan de druppeltjes cellen om de levensvatbaarheid van de cel te beoordelen tijdens deze resuspensie stap. Breng 10 μL van dit mengsel aan op de hemocytometer of andere automatische celloketten. Beoordelen als levensvatbaar die cellen die fase helder zijn en uitsluiten van de trypan blauwe kleurstof.
- Bepaal de hoeveelheid levensvatbare cellen/mL en bereid u voor om de inhoud van de conische buis te verdunnen volgens de gewenste celdichtheid.
- Plaat ~ 10.000 cellen per put voor een 384-goed plaat; plaat ~ 150000-200000 cellen per put voor een 24-goed plaat.
- Voeg verse DMEM toe aan de conische buis van geresuspendeerde cellen om de juiste verdunning te bereiken en Voeg aanvullende passende supplementen zoals B27 en/of BDNF toe, afhankelijk van de vereisten van de specifieke cellijn.
- Kantel de conische buis zachtjes om 2-3 keer te mengen.
- Aspirate laminine coating van de 24-Well plaat, of van de 384-well multi well plaat met behulp van een 16-kanaals pipet en spoel één keer met PBS.
- Aspirate PBS met behulp van een P1000 voor de 24-Well plaat, of de 16-kanaals pipet voor 384-well platen.
- Breng de celoplossing aan op elk goed in een figuur 8-beweging om klontering te voorkomen. Plating uniformiteit kan ook worden geoptimaliseerd door gebruik te maken van geautomatiseerde vloeistofbehandelings apparaten.
Opmerking: De toevoeging van laminine aan de media vanaf 2-4 dagen na het replating ook helpt bij het handhaven van een homogene verdeling van de cellen. - Herhaal stap 3,19 en 3,20 voor elke put.
- Keer de plaat terug naar de incubator ingesteld op 37 °C en 5% CO2.
- Na 2 dagen, beginnen met het veranderen van de helft van het medium elke 4 dagen met behulp van de post-differentiatie kweekmedia beschreven in paragraaf 1,2. Na de gewenste rijpingstijd, fixeer culturen met behulp van 3,7% formaldehyde bij 37 °C en vlekken cellen volgens de experimentele eisen.
4. levensvatbaarheid van de cel assays post-replating
- Voeg de Early Cell Death Reporter (VivaFix: 0,5 μL van de 50 μL stamoplossing per goed van 500 μL kweekmedia per put) toe na een korte voorraad van de stamoplossing.
- Beeld de levende en dode cellen gekweekt op glazen bodem multi Wells, na 20 min, zonder enige wasstap, aangezien de kleurstof fluoresceert slechts eenmaal in de cellen, of Fix en co-vlek met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en/of andere antilichamen voorbeeld vorming met behulp van een confocale Microscoop.
5. immunokleuring
- Repareer culturen met 3,7% formaldehyde in PBS Plus 120 mM sucrose gedurende 20 minuten bij 37 °C.
- Spoel en permeabilize met 0,2% Triton X-100 gedurende 5 min bij kamertemperatuur en blok vervolgens gedurende 30 minuten met 2% boviene serumalbumine (BSA).
- Aspirate de BSA zonder spoelen en inbroed voor 1 uur bij kamertemperatuur met konijn anti-MAP2 antilichaam 1:1000, muis anti-β3 tubuline (TuJ1) antilichaam 1:2000, kip anti-NeuN antilichaam (1:100) en rat anti-CTIP2 antilichaam (1:500), of met muis anti-PSD95 ( 1:200), konijn anti-synapsin 1 (1:200) en kip anti-MAP2 antilichaam voor synaptische kleuring.
- Spoel af met PBS en inincuberen met de met fluor geconjugeerde secundaire antilichamen plus DAPI voor 45 min bij 37 °C.
- Spoel ten slotte tweemaal met PBS voor Imaging.
6. calcium beeldvorming
- Besmetten gekweekte cellen met AAV8-SYN-jGCAMP7f-WPRE (het Salk Instituut voor biologische studies, GT3 kern faciliteit) op 10 dagen na replating en beeld om spontane calcium transiënten te beoordelen op 3-4 weken na het replating.
7. beeld verwerving en-analyse
Opmerking: Voor meer informatie over het acquisitie systeem verwijzen wij u naar Calabrese et al.12.
- Gebruik een Imaging module voorhand matige of geautomatiseerde beeld verwerving en een software module voorbeeld analyse, zoals CellProfiler13, voor morphometrische metingen.
- Bereken de gemiddelde lengte van TuJ1 positieve neurites en MAP2 positieve dendrites door het meten van de totale lengte per gezichtsveld gedeeld door het aantal neuronen (DAPI + MAP2 of TuJ1 positieven cellen) binnen hetzelfde veld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De replating van de hiPSCs-afgeleide neuronen die zijn gedifferentieerd voor meerdere weken biedt verschillende voordelen. Echter, loskoppelen en replating gedifferentieerde neuronen die lange, onderling verbonden dendrites en axonen hebben (Figuur 1A) kan resulteren in een hoge Fractie van onomkeerbaar beschadigde neuronen.
Zoals beschreven in het protocol gedeelte gebruikten we incubatie met een proteolytisch enzym om de neuronen los te maken van het substraat. Meestal, als gevolg van hun dikke gevlochten van neurites (Figuur 1A), de cellen hebben de neiging om alles los in één keer als een enkele syncytial-achtige laag, die vaak begint te zweven in de put (Figuur 1C). Dit gebeurt vrij snel, en is misschien de reden waarom de meeste laboratoria de neiging hebben om de cellen te verzamelen na slechts 5 minuten incubatie met hun Proteolytische enzym naar keuze, en om het vel cellen onmiddellijk te splitsen door trituratie (Pipetteer het op en neer). Echter, deze mechanische manipulatie lijkt te resulteren in hoge spanning voor neuronen. Wij geloven dat de mate van stress evenredig kan zijn met het gebied dat wordt bedekt door het neuronale netwerk, omdat we vaststellen dat de schijnbare schade door inadequate incubatie van protease groter is voor 10 cm of grotere platen dan voor 35 mm of kleinere platen. Zo, contra intuïtief, vonden we dat het verlengen van de enzymatische incubatie naar 40-45 min de celdood vermindert op het moment van celdissociatie (Figuur 1C) en een efficiënter herstel van levende, gezonde cellen mogelijk maakt die processen over uren uitzenden tot dagen na het replating (Figuur 1B). Vermoedelijk maakt de verlengde incubatietijd met een mild proteolytisch enzym de gedeeltelijke vertering van eiwitten mogelijk die de cellen en hun processen sterk hechten aan elkaar en aan de extracellulaire matrix. Hierdoor kan het resuspensie proces efficiënt werken om afzonderlijke cellen te scheiden zonder de noodzaak van overdreven krachtige trituratie.
Om de effectiviteit van de uitgebreide enzym incubatie procedure te kwantificeren, evalueerden we onmiddellijk na de trituratie de levensvatbaarheid van hangende cellen met trypan Blue (Figuur 1C), en later op 1, 3 en 7 dagen na replating met een vroege cel dood marker (Figuur 2). Onmiddellijk na de trituratie gaf trypaanse blauwe kleuring aan dat er na een incubatie van 5 minuten een aanzienlijk grotere celdood was, vergeleken met een incubatie van 45 minuten met het Proteolytische enzym (Figuur 1C). De twee iPSC-lijnen die we gebruikten om deze waarneming te illustreren, werden gedifferentieerd in neuronen uit de neurale voorlopercellen met behulp van verschillende protocollen, en toonden breed verschillende gevoeligheid voor de replating procedure. Culturen uit de WT126-lijn, gedifferentieerd in Npc's met behulp van de "rozet selectiemethode"7 waren gevoeliger voor schade dan culturen onderscheiden van de CVB WT24 lijn met behulp van een snelle differentiatie methode8. Niettemin was voor beide lijnen de graad van onmiddellijke celdood ongeveer gehalveerd door gebruik te maken van de uitgebreide enzym incubatie procedure.
Na het replating vertoonden culturen een geschatte verdubbeling van de levensvatbaarheid van de cellen gedurende de daaropvolgende dagen met behulp van de uitgebreide enzym incubatie procedure, zoals bepaald door de dichtheid van DAPI-positieve cellen (Figuur 2B, grafiek aan de linkerkant). Bovendien resulteerde de verlengde enzym incubatie in een lagere dichtheid van dode of stervende cellen gedetecteerd met behulp van een kleurstof-uitsluiting levensvatbaarheid Kit (Figuur 2B, grafiek aan de rechterkant). De Fractie van dode cellen die werd gedetecteerd met behulp van de levensvatbaarheid assay na 24 h na replating was hoger dan die gezien met behulp van trypan Blue onmiddellijk na de trituratie. Dit weerspiegelt waarschijnlijk de accumulatie van dode en stervende cellen over deze eerste 24 uur, hoewel het ook mogelijk is dat de levensvatbaarheid test de celdood gevoeliger detecteert dan de trypaanse blauwe test. Dode cellen bleven worden gedetecteerd gedurende 1-7 dagen na het replating (Figuur 2B). De aanvankelijke beplating dichtheid voor beide experimentele groepen (5 min en 45 min) was identiek en gebaseerd op hemocytometers levende celtellingen van de post-trituratie celsuspensie. Belangrijk, op alle tijdstippen na het replating, het aantal levende, gezonde cellen was ongeveer verdubbeld na de 45 min enzym incubatie in vergelijking met de incubatie van 5 minuten. Deze waarnemingen werden kwalitatief met fase contrast microscopie bevestigd om de celmorfologie bij elke stap te monitoren: vóór het replating, tijdens het replating en na het replating (Figuur 1 en Figuur 2).
Een van de voordelen van het replating van hipsc-afgeleide neuronen nadat deze gedurende enkele weken zijn differentiëren, is dat de meeste cellen het stadium van de voorlopercellen hebben verlaten en zich hebben gecommitteerd aan een neuronale fenotype op het moment van replating. De overgangsfase van neuronale differentiatie van neurale voorlopercellen vindt plaats gedurende meerdere dagen, met een groter aantal celwaarden die geleidelijk in vroege stadia neuronale markers uitdrukken, zoals bèta-III tubuline (gedetecteerd door antilichaam TuJ1) of MAP2. Genexpressie evolueert over enkele weken, uiteindelijk resulterend in expressie van late-stage panneuronale markers, zoals NeuN, of cel-type specifieke markers voor corticale neuronen zoals CTIP2. Daarom, de replating van eerder gedifferentieerde hipsc-afgeleide neuronen maakt het mogelijk om vroege en voorbijgaande neuronale gebeurtenissen te bestuderen, zoals neuriet initiatie, in geïdentificeerde subtypen van neuronen. Figuur 3 illustreert de onmiddellijke aanwezigheid van vroege neuronale markers in culturen die na 4 weken van pre-differentiatie in een groter cultuur gerecht werden nagekrompen. Merk op dat NeuN-en CTIP2-uitdrukken neuronen gemakkelijk worden geïdentificeerd binnen een paar dagen na het replating (Figuur 3). Kenmerken en timing van neuronale differentiatie kunnen variëren tussen hiPSC-lijnen. Voor de WT 126 lijn en de CVB WT24 lijnen beschrijven we hier, 85 ± 12% (n = 2) en 52 ± 11% (n = 5) van de cellen, respectievelijk, uitgedrukt immunoreactiviteit voor de βIII-tubuline marker TuJ1 na 4 dagen na het replating met behulp van de verlengde protease incubatie procedure. Voor beide lijnen, 30-40% van de cellen, en 80-90% van de neuronen ook uitdrukken de laag 5/6 neocorticale marker CTIP2. Naast verbeterde levensvatbaarheid, het uitgebreide protease protocol ook matig verbeterd neuriet uitgroei (gemiddelde neuriet lengte per neuron), zoals weergegeven in Figuur 4. Beide totale neuriet lengte (gekwantificeerd met behulp van antilichamen Tuj1, die vlekken zowel axonen en dendrieten; Figuur 4 B, linker grafiek) en dendriet groei (gekwantificeerd met behulp van Map2, die vlekken alleen dendrieten; Figuur 4 B, middelste grafiek) werden begunstigd bij gebruik van de Extended protease incubatie procedure. Merk op dat de grafiek voor DAPI-positive (DAPI (+)) cellen in Figuur 2 is gebaseerd op dezelfde beeld monsters als de cel graaf grafiek in Figuur 4, maar in Figuur 2 werden ze gekwantificeerd met behulp van een niet-geautomatiseerde methode, bijgestaan door Fiji-software, in Figuur 4 werden ze gekwantificeerd met behulp van het geautomatiseerde Image Analysis software platform cellprofiler. Deze twee beeldanalyse benaderingen leverde vergelijkbare resultaten op.
Replating is nuttig niet alleen voor het bestuderen van neuriet uitgroei, maar ook om te studeren synapsen of andere later verschijnende biologische kenmerken van neuronen. Inderdaad, na slechts een week na het replating observeren we markers voor veel presynaptische en postsynaptische eiwitten versieren van de neuronale dendrites in een punctata patroon (Figuur 5a). Na 4 weken beginnen we ook met het detecteren van hun colokalisatie, wat een indicator is van de vorming van functionele synapsen (Figuur 5A). Bovendien is elektrische activiteit van spontane depolarisatie en Synaptisch aangedreven stromingen detecteerbaar met behulp van calcium beeldvorming (Figuur 5B) of multi elektrode arrays (mea's).
Figuur 1 : Superieur behoud van neuronale levensvatbaarheid na een langere incubatie met het Proteolytische enzym voor celdissociatie. (A) fase contrast beeld van NPC-afgeleide neuronen gedifferentieerd voor 3 weken. De boxed regio in de linker afbeelding is vergroot rechts. In dit stadium hebben neuronen lange processen, die een dik meshwork vormen. Schaal staven = 80 μm (links); 35 μm (rechts). B) geselecteerde beelden van neuronen van hipsc die zijn verkregen na 1 en 5 dagen na het replating. Schaalbalk = 100 μm. (C) left: cellen loskoppelen als één vel binnen enkele minuten na het starten van de protease behandeling. Schaalbalk = 200 μm. Rechts: na trituratie cellen worden geteld op de hemocytometer voordat replating. Grafieken tonen kwantificering van niet-levensvatbare, trypaan-blauwe positieve cellen na 5 min of 45 min incubatie met het Proteolytische enzym voor twee verschillende lijnen CVB WT24 (* * * p < 0,0003, ongepaarde t-test) en WT 126 (* * * p < 0,0001, ongepaarde t-toets). Waarden vertegenwoordigen het gemiddelde ± S. E. M van 4 individuele replicaten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Neuronale levensvatbaarheid na enkele dagen na het replating. A) beelden van WT126 op NPC afgeleide neuronen na 1 en 3 dagen na replating met 5 min en 45 min protease incubatie. Stervende cellen zijn gelabeld met de gevoelige vroegtijdige celdood Reporter. De corresponderende brightfield-afbeeldingen worden links weergegeven. Sommige cellulaire puin (blauwe pijl) wordt meestal gedetecteerd na het replating, vooral in de 5 min groep. Schaal staven = 150 μm.B) beelden van CVB WT24 NPC-afgeleide culturen na 1, 3 en 7 dagen na replating met 5 min en 45 min protease incubatie. Stervende cellen zijn gelabeld met de gevoelige vroegtijdige celdood Reporter (rood). Alle kernen van levende en stervende cellen zijn gelabeld met DAPI (cyaan). Het samengevoegde witte signaal vertegenwoordigt DAPI-en VivaFix-positieve (+) cellen. Een paar cellen tonen VivaFix kleuring, maar missen DAPI-kleuring (rode cellen in de gecombineerde afbeelding aan de rechterkant); Dit zijn waarschijnlijk cellen die vele uren dood waren. Schaal stangen: 25 μm. Rechter grafiek toont kwantificering van de Fractie van dode cellen (VivaFix/DAPI) na verschillende incubatietijd met het Proteolytische enzym (5 min VS 45 min: * p < 0,05 1 d en * * * p < 0,001, 3 d; twee richtings-ANOVA, gevolgd door multi vergelijking Bonferroni post hoc test). Linker grafiek toont veranderingen in de totale celdichtheid (# DAPI (+) cellen voor 5 min VS 45 min: * * * p < 0,0001 voor alle tijdspunten; twee richtings-ANOVA, gevolgd door multi vergelijking Bonferroni post hoc test). Alle waarden worden weergegeven als de gemiddelde ± S. E. M van 3 replicaten, met een minimum van 1.500 cellen gescoord per aandoening. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Detecteerbare expressie van late-stage neuronale markers onmiddellijk na het replating. Culturen van CVB WT24 hipsc-afgeleide cellen afbeelding gemaakt 4 dagen na het replating, met behulp van 45 min protease incubatie, van een 10 cm gerecht dat was onderscheiden van de NPC fase voor 4 weken. Getoonde voorbeelden waren gekleurd voor de panneuronale markers TuJ1, MAP2, of NeuN; of de Deep-Layer corticale piramidevormige neuron marker CTIP2. Let op de aanwezigheid van uitgebreide neurites, en de robuuste expressie van TuJ1 en MAP2. Let vooral op dat een aanzienlijke Fractie van de neuronen ook laat-stage markers NeuN en CTIP2 uitdrukt. Schaalbalk = 16 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Neuriet en dendriet groei na verloop van tijd na kortere en langere enzym incubatie tijdens het replating. A) REPLATED CVB WT24 door hipsc afgeleide neuronen breiden snel neurites uit, zoals gedetecteerd met antilichamen Tuj1. Merk op dat de verlengde incubatietijd van protease de neuritogenese bevordert. Schaalbalk = 25 μm.B) kwantificering van neuriet en dendriet lengte, meer dan 1, 3 en 7 dagen na replating met 5 min of 45 min protease. Totale neuriet lengte werd gekwantificeerd uit TuJ1 (βIII-tubulin) kleuring; dendriet-specifieke kleuring werd gekwantificeerd uit MAP2 kleurings SNF gecorrigeerd voor de totale celdichtheid (rechter grafiek). Alle waarden worden weergegeven als de gemiddelde ± S. E. M van 3 replicaten. Neuriet lengte 5 min VS 45 min: * p < 0,05 op 1 dag en 7 dagen, * * p < 0,01 op 3 dag; dendriet lengte 5 min VS 45 min: * * p < 0,01 op 1 dag en 3 dagen, niet significant (NS) op 7 dag; # DAPI (+) 5 min VS 45 min: * * * p < 0,0001 voor alle tijdspunten; twee richtings-ANOVA, gevolgd door een multivergelijkingstest Bonferroni post hoc test. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Synaptogenese en spontane calcium transiënten in gedifferentieerd hiPSC-afgeleide neuronen na replating. A) links: na 4 weken na het replating met behulp van het verlengde protease incubatie protocol, is de presynaptische marker synapsin 1 detecteerbaar in punctata clusters langs de map2 positieve dendrieten. Schaal staven = 5 μm. Rechts: geselecteerde dendritische regio die colokalisatie toont tussen presynaptische en postsynaptische clusters (gele pijl), een indicatie van mogelijk actieve synapsen. Schaal staven = 1,5 μm. (B) links: met hipsc afgeleide neuronen die zijn GEÏNFECTEERD met AAV8-SYN-jGCaMP7f-wpre werden gebruikt om spontane calcium transiënten te monitoren, aangestuurd door netwerkactiviteit. De brightfield-afbeelding wordt weergegeven naast de pseudokleur weergave van GCaMP7 fluorescentie op een enkel tijdstip in de time-lapse-serie. Schaalbalk = 25 μm. gekleurde getallen geven de 4 geselecteerde cellen aan waarin GCaMP7 fluorescentie in de loop van de tijd werd gemeten, zoals weergegeven in de sporen aan de rechterkant. Elke gekleurde Trace correspondeert met één cel. Het sterretje wijst naar de tijd tijdens de live-opname waaraan de afbeelding links correspondeert. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 : Workflow van replating procedures aan Culture hiPSCs voor het screenen van hoge content en/of gedetailleerde studies van differentiatie en neuriet uitgroei of mea opnames. Beginnend met een gedifferentieerde kweek van neuronen die gedurende 4 of meer weken in een groter formaat worden geteeld (bijv. een 10 cm kweek schaal), worden neuronen geïnineerd met een protease voor 40-45 min, voorzichtig getritureerd om te dissociëren en te hervatten. Cellen worden vervolgens gedistribueerd in multi-Wells die compatibel zijn met HC'S, weer op substraten die compatibel zijn met beeldvormings groei kegels (gele pijl) of andere structuren, of op multi-Wells die geschikt zijn voor multi-elektrode array opnames. Schaal staven = 27 μm, 5 μm, 2,5 μm, 130 μm (van links naar rechts). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij hebben blijk gegeven van een rechtlijnig proces voor de resuspensie en herbeplating van menselijke neuronale culturen die de levensvatbaarheid, het succes van differentiatie en de subcellulaire beeldvorming optimaliseren op een manier die verenigbaar is met platforms voor het screenen van hoge inhoud, en andere assays die relevant zijn voor de opsporing van geneesmiddelen. Figuur 6 illustreert de algemene workflow en voorbeelden van dergelijke toepassingen.
Hoewel we ons hier concentreerden op hiPSC-afgeleide neuronen die gericht zijn op het lot van een corticale neuron, verwachten we dat deze methode even toepasbaar moet zijn op menselijke embryonale stamcel-afgeleide neuronen, en op stamcel afgeleide neuronen gericht op andere neuronale fenotypes14,15,16,17,18. Bovendien stellen we dat deze uitgebreide protease procedure gunstig zou kunnen zijn voor andere situaties die een resuspensie vereisen van cellen met een gevestigd neuriet meshwork, bijvoorbeeld voor het sorteren van FACS of eencellige analyses van primaire neuronen19 , 20.
Het replating van hiPSC afkomstige neuronen biedt een levensvatbaar modelsysteem om cellulaire en moleculaire mechanismen van veel belangrijke biologische gebeurtenissen te onderzoeken. Bijvoorbeeld, deze procedure kan gedetailleerde studies van menselijke neuriet uitgroei en groei kegel kenmerken vergemakkelijken, en vergelijking van de bevindingen aan de uitgebreide kennisbasis opgebouwd uit decennia van het bestuderen van andere soorten, zowel gewervelde en ongewervelde. We vinden dat de replating procedure heeft gemaakt dat het makkelijker is om voorwaarden te optimaliseren om grotere groei kegels te genereren die goed geschikt zijn voor optische evaluatie van subcellulaire structuur en functie (Figuur 6). Ter vergelijking, de groei kegels meer typisch waargenomen tijdens de initiële differentiatie van neuronen van hiPSCs zijn meestal klein en compact, en de dichte matrix van niet-neuronale cellen in dergelijke culturen maakt het moeilijk om zowel de substraat voorwaarden aan te passen aan bevordering van groei kegel verspreiden en beeld individuele groei kegels binnen de complexe weefsel omgeving. Dus, replating neuronen op een vers gerecht biedt een "schonere leisteen" waarop de groei kegels onder goede beeldvormende omstandigheden te bekijken.
Het replating is bijzonder voordelig bij het gebruik van celcultuurplatformen die geschikt zijn voor HC'S, omdat het de totale tijd waarin culturen in kleine volumes worden geteeld aanzienlijk vermindert. De kleine werkvolumes van de afzonderlijke putten van 96, 384 of 1536-well multi-Wells (ongeveer 100, 50 en 5 microliter werkvolume, respectievelijk) vereist meestal frequente (d.w.z. dagelijks) media veranderingen om verdamping en nutriënten depletie tegen te gaan. Frequente media veranderingen zijn kostbaar, niet alleen in termen van reagentia en arbeid, maar ze kunnen de levensvatbaarheid van culturen in gevaar brengen door geconditioneerde media te verdunen door de kans te vergroten dat cellen zich losmaken van het substraat als gevolg van mechanische turbulentie. Het herbeplating van hipscs kan ook het opnemen van fysiologische activiteit vergemakkelijken met behulp van multi elektrode arrays21,22, of Live beeldvorming van culturen in assays van dynamische neuronale fenotypes23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk is een onderdeel van de nationale coöperatieve geherprogrammeerde Celonderzoeksgroepen (NCRCRG) om psychische aandoeningen te bestuderen en werd ondersteund door NIH Grant U19MH1 2015-0644. Het initiële werk werd ook ondersteund door NIH Grant NS070297. We bedanken drs. Carol Marchetto en Fred Gage, het Salk Institute, voor het leveren van de WT 126 lijn van neurale voorlopercellen, en Drs. Eugene Yeo en Lawrence Goldstein, UC San Diego voor het verstrekken van de CVB WT24 lijn van neurale voorlopercellen. We bedanken Deborah pre in het laboratorium van Dr. Anne bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, voor nuttige discussies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1 mL of 200 mM stock to 1 L of N2B27 media |
| Dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50x) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 mL to 1 L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1 L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µL to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5 mL to 1 L N2B27 media |
| N2 (100x) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5 mL to 500 mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10 mL to 1 L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10 cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1,000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100 mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1 mL/10 cm plate for 30-45 min; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 mL of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| Mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| Rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| Chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| Chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| Rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| Mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| Rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
- Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
- Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).
- Amin, N. D., Paşca, S. P. Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids. Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).
- Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
- Langdon, S. P. Cancer Cell Culture. , Humana Press. New York, NY. (2010).
- Picot, J. Human Cell Culture Protocols. 107, Springer Science & Business Media. Berlin, Germany. (2005).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Banker, G., Goslin, K.
- Calabrese, B., Halpain, S. Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology. Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
- Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms. PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Gupta, S., et al. Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).
- Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells. Development. 145, (2018).
- Playne, R., Jones, K., Connor, B. Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors. Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).
- Rao, M. S., et al. Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols. Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).
- Suga, H. Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells. Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).
- Endaya, B., et al. Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling. Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).
- Grainger, A. I., et al. In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells. Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).
- Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).
