Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Aussetzung und Kultivierung von neuronen menschlichen Stammzellen, die zuvor mehrere Wochen lang von neuronalen Vorläufern in vitro unterschieden wurden. Das Verfahren erleichtert bildgebende Assays von Neuriten, Synapsen und spät exemitten neuronalen Markern in einem Format, das mit Lichtmikroskopie und High-Content-Screening kompatibel ist.
Abstract
Neuronen, die in der zweidimensionalen Kultur von menschlichen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen (NPCs) unterschieden werden, stellen ein leistungsfähiges Modellsystem dar, um Krankheitsmechanismen zu erforschen und ein hochgehaltiges Screening (HCS) durchzuführen, um Verbindungen zu verhören. oder Genmutationsphänotypen zu identifizieren. Bei menschlichen Zellen dauert der Übergang vom NPC zum funktionellen, reifen Neuron jedoch mehrere Wochen. Synapsen beginnen sich in der Regel nach 3 Wochen Differenzierung in der Monolayer-Kultur zu bilden, und mehrere neuronspezifische Proteine, z. B. der später exprimierende panneuronale Marker NeuN, oder die Schicht 5/6 zerebralen kortikalen Neuronenmarker CTIP2, beginnen auszudrücken ca. 4-5 Wochen nach der Differenzierung. Diese lange Differenzierungszeit kann mit optimalen Kulturbedingungen für kleine, multi-well-HCS-Plattformen nicht kompatibel sein. Zu den vielen Herausforderungen gehören die Notwendigkeit gut haftender, gleichmäßig verteilter Zellen mit minimalem Zellclustering und Kulturverfahren, die die langfristige Lebensfähigkeit und die funktionelle Synapsenreifung fördern. Ein Ansatz besteht darin, Neuronen in einem großen Volumenformat zu differenzieren und sie dann zu einem späteren Zeitpunkt in HCS-kompatiblen Multi-Wells neu zu zeichnen. Einige der Hauptherausforderungen bei der Verwendung dieses Replating-Ansatzes betreffen die Reproduzierbarkeit und Zelllebensfähigkeit aufgrund der belastenden Störung des dendritischen und axonalen Netzwerks. Hier zeigen wir ein detailliertes und zuverlässiges Verfahren zur enzymatischen Suspendierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell (hiPSC)-abgeleiteten Neuronen nach ihrer Differenzierung für 4-8 Wochen in einem großvolumigen Format und übertragen sie auf 384-Well-Mikrotiter und kultivieren sie für weitere 1-3 Wochen mit ausgezeichnetem Zellüberleben. Diese Replatierung menschlicher Neuronen ermöglicht nicht nur die Untersuchung der Synapsenmontage und Reifung innerhalb von zwei Wochen nach der Replatierung, sondern ermöglicht auch Studien zur Neuritregeneration und Wachstumskegeleigenschaften. Wir liefern Beispiele für skalierbare Assays für Neuritogenese und Synaptogenese mit einer 384-Well-Plattform.
Introduction
Humane pluripotente Stammzell (hiPSC)-abgeleitete Neuronen sind zunehmend relevant in den Bereichen Grundlagenforschung, Arzneimittelentwicklung und regenerative Medizin. Workflows und Verfahren zur Optimierung ihrer Kultur und Wartung und zur Verbesserung der Effizienz der Differenzierung in bestimmte neuronale Subtypen entwickeln sich schnell1,2. Um den Nutzen und die Kostenwirksamkeit menschlicher Stammzellen-abgeleiteter Neuronen als Modellsysteme zu verbessern, die für hochklassige Analysen in der Arzneimittelentdeckung und Zielvalidierung geeignet sind, ist es sinnvoll, die Kultivierungszeit zu verringern, die erforderlich ist, um ausgereifte, funktionelle Unter Beibehaltung maximaler Robustheit, Reproduzierbarkeit und Phänotyprelevanz. Obwohl dreidimensionale organoide Kulturen den Durchbruch inder Neuroentwicklungsforschung vorantreiben 3, sind 2-dimensionale Monolayer-Kulturen aufgrund ihrer minimalen Gewebedicke besonders kompatibel mit automatisierten bildgebenden Anwendungen.
Die Anpassung bildgebender Screening-Methoden an Modelle menschlicher neurologischer und neuroentwicklungsbasierter Erkrankungen steht jedoch vor einer großen Herausforderung. Der lange Zeitrahmen, über den das menschliche Nervensystem in vivo reift, erfordert eine längere Zeit in der Kultur, um natürliche Programme der Genexpression aufzunehmen und eine neuronale Reifung zu erreichen.
Eine praktische Folge des langwierigen neuronalen Differenzierungsprogramms ist, dass die Aufrechterhaltung von hiPSC-abgeleiteten Monolayer-Kulturen für viele Wochen aufrechterhalten werden muss, um eine angemessene Synapsenreife zu erreichen. Während dieser Zeit, neuronale Vorläufer, die undifferenziert bleiben weiterhin zu teilen. Diese können schnell die Kultur überwuchern und den Nährstoffgehalt an sich reißen, der erforderlich ist, um lebensfähige postmitotische Neuronen aufrechtzuerhalten. Kräftig trennende neuronale Vorläuferzellen (NPCs) können auch mit Neuronen um das Wachstumssubstrat konkurrieren. Dies kann solche Kulturen Zufall von Problemen der schlechten Haftung machen, eine Bedingung, die für bildgebende Assays ungeeignet ist. Darüber hinaus stellen viele Forscher fest, dass je kleiner das Kulturvolumen, desto größer die Schwierigkeit bei der Aufrechterhaltung gesunder Populationen von differenzierten Neuronen lange genug, um die späten Stadien der neuronalen Differenzierung zu beobachten. Mit anderen Worten, Assays der Synapsenreifung mit HIGH-Content-Screening -Ansätzen (HCS) können für vom Menschen abgeleitete Neuronen eine große Herausforderung darstellen.
Um einige dieser Probleme zu umgehen, wurde ein Verfahren zum Resuspendieren und Replatieren von zuvor differenzierten hiPSC-abgeleiteten Neuronen verwendet. Erstens ermöglicht es die Untersuchung des Neuritenwachstums (oder genauer gesagt der Neuritenregeneration) in einer Population voll engagierter Neuronen. Zweitens ermöglicht die Replatierung von zuvor differenzierten Neuronen von einem großvolumigen Format (z. B. 10 cm Platten oder größer) bis hin zu kleinen Volumenformaten (wie HCS-kompatible 96- oder 384-Well-Mikrotiterplatten) eine signifikante Reduzierung der Gesamtkultivierungszeit in die kleine Lautstärkebedingung. Dies erleichtert die Untersuchung der Synapsenmontage und Reifung in den folgenden Wochen in vitro.
Die Wiederherstellung von ausgereiften Neuronen, die bereits lange Neuriten und ein komplexes Konnektivitätsnetzwerk etabliert haben, stellt jedoch mehrere Herausforderungen dar, von denen eine die manchmal hohe und variable Rate des Zelltodes ist. Hier beschreiben wir ein Replating-Verfahren, das zu einem ausgezeichneten Zellüberleben und Reproduzierbarkeit führt. Üblicherweise sind Neuronen proteolytischen Enzymen für kurze Inkubationsperioden (in der Regel 3-10 min) ausgesetzt, um Zellen vor der Trituration vom Substrat zu lösen. Diese kurze Proteolysezeit wird üblicherweise für das Resuspendieren und Passieren vieler Arten von teilenden Zellen verwendet, einschließlich nicht-neuronaler Zellen und undifferenzierter Vorläufer4,5,6. Für differenzierte Neuronen mit langen, miteinander verbundenen Neuriten ist es jedoch wichtig, nicht nur Zellen vom Substrat zu lösen, sondern auch das dendritische und axonale Netzwerk zu stören, um einzelne Zellen zu isolieren und gleichzeitig Schäden zu minimieren. Tatsächlich neigt ein dickes Netz von Neuronen in der Regel dazu, sich als einzelnes Blatt vom Substrat zu lösen, anstatt als einzelne Zellen. Wenn nicht darauf geachtet wird, das dicke Netz von Neuriten zu lösen, werden Neuronen nicht nur während der Trituration irreversibel geschädigt, sondern viele von ihnen passieren nicht den Filter, der verwendet wird, um Klumpen zu entfernen, was zu einer schlechten Zellausbeute führt. Im Folgenden beschreiben wir eine einfache Änderung an einem weit verbreiteten Protease-Inkubationsverfahren, um diesen Schwierigkeiten entgegenzuwirken.
In dem unten beschriebenen Protokoll werden Neuronen für 40-45 min mit einer milden Protease, wie dem proteolytischen Enzym (z. B. Accutase), inkubiert. Während der ersten 5-10 min nach Zugabe des Enzyms hebt sich das neuronale Netzwerk als Blatt vom Substrat ab. Die Inkubation mit der Protease erfolgt für weitere 30-40 min, bevor es mit sanfter Triturierung und Filterung geht. Diese zusätzliche Inkubationszeit trägt dazu bei, dass die Verdauung des Materials das interzelluläre Netzwerk entspannt und somit sicherstellt, dass die nachfolgende Trituration zu einer Suspension einzelner Zellen führt. Dieses Verfahren maximiert die Gleichmäßigkeit der Zellverteilung beim Replatieren bei gleichzeitiger Minimierung des Zelltodes. Wir haben diese Replating-Methode erfolgreich auf hiPSC-abgeleitete neuronale Kulturen angewendet, die durch verschiedene Differenzierungsprotokolle7,8 und aus verschiedenen Zeilen von hiPSCs erzeugt werden. Das Verfahren ist nominell für die Verwendung mit den meisten oder allen Linien von Stammzell-abgeleiteten Neuronen geeignet. Wir haben festgestellt, dass eine verlängerte Protease-Inkubationszeit für die Replatierung von Kulturen aus Kleinformatplatten (z. B. 35 mm Durchmesser) nicht unbedingt erforderlich ist; Wie wir hier zeigen, bietet es jedoch einen erheblichen Vorteil bei der Replatierung von Platten mit großem Durchmesser (z.B. 10 cm Durchmesser oder größer), wahrscheinlich weil Neuriten in solchen Platten sehr lange Prozesse ausdehnen und ein dicht miteinander verbundenes Array bilden können.
Hier zeigen wir diese Methode und veranschaulichen kurz ihre Anwendung in Assays für die frühe Neuritogenese und für die Synapsenreifung, die das Clustern von prä- und postsynaptischen Proteinen entlang der Dendriten und Axone beinhaltet, gefolgt von deren späteren Kolokalisierung an synaptischen Standorten. Die Beispiele zeigen die Vorteile dieses Protokolls bei der Erhaltung der Zelllebensfähigkeit und Reproduzierbarkeit. Erstens erlaubt es den Forschern, frühe Schritte in der menschlichen Neuritogenese zu untersuchen. Die experimentelle Umgebung ähnelt den häufig verwendeten Primärkulturen von Nagetierkortikal- oder Hippocampus-Neuronen, bei denen Zellen aus dem späten fetalen oder frühen postnatalen Gehirn extrahiert, durch Trituration nach sanfter Proteasebehandlung dissoziiert und erlaubt werden, Neuriten initiieren oder Neuriten regenerieren, die im Verfahren9,10abgetrennt wurden. Ähnlich wie solche Nagetier-Primärneuronen beginnen hiPSC-abgeleitete Neuronen ihre Neuriten innerhalb von Stunden nach der Replatierung zu bilden oder zu regenerieren, was die Abbildung von Wachstumskegeln und Neuritenmorphologie in einer Umgebung ermöglicht, die für eine hohe raumzeitliche Bildgebung mit weniger umsiebende undifferenzierte Zellen. Wir haben beobachtet, dass das Neuritenwachstum im Vergleich zu den variablen Verzögerungen und unterschiedlichen Auswuchsraten, die beobachtet werden, wenn Neuronen zum ersten Mal beginnen, sich von einer Vorläuferpopulation zu unterscheiden, stärker synchronisiert ist. Darüber hinaus ermöglicht die Replatierung Assays von Neuronen, die neuronale Subtypmarker exemiten, die typischerweise später in der neuronalen Entwicklung auftreten, wie z. B. der kortikale Schicht 5/6 Transkriptionsfaktor CTIP2 (Chicken ovalbumin upstream promoter transcription Faktor-interagierendes Protein 2) oder den pan-neuronalen Marker NeuN11. Ein besonders nützliches Merkmal des Replating-Ansatzes ist, dass die Synaptogenese innerhalb eines mit HCS kompatiblen Zeitrahmens verläuft.
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Protocol
1. Differenzierungszeitraum vor dem Replatieren
- Unterscheiden Sie Neuronen auf 10 cm Geschirr, mit einem Protokoll der Wahl7,8 bis Neuronen haben ein dickes Netzwerk mit ihren Prozessen gebildet und drücken Nicht nur frühe neuronale Marker wie MAP2 oder TuJ1, sondern auch späte Marker wie NeuN.
-
Ändern Sie die Hälfte des Mediums der Wahl alle 4 Tage während des neuronalen Differenzierungsprozesses.
HINWEIS: Umfangreichere oder häufige mittlere Veränderungen verdünnen wesentliche trophische Faktoren und könnten die Reifung begünstigen.- Für die iPSC-abgeleiteten WT126-Neuronen verwenden Sie die folgenden Kultivierungsmedien nach der Differenzierung: 5 ml 100x N2-Ergänzung, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 g/mL-Laminin, 200 M Ascorbinsäure, 1 M Dibutyryl-cAMP und 10 ml SM1 für 500 mL Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium/ Nährstoffgemisch F-12 (DMEM/F12). Allmählich, mit Halb-Medien-Änderungen, ersetzen mit neuronalen basalen Medium (Tabelle der Materialien) und die gleichen Ergänzungen.
- Verwenden Sie für die iPSC-abgeleiteten CVB-WT-Neuronen das folgende nach-Differenzierungs-Kultivierungsmedium: 500 ml neuronales Basal-A-Medium (Materialtabelle) und 500 ml DMEM/F12-Medium mit 2 g/ml Laminin, 10 ml Glutamin-Ergänzung (Materialtabelle), 0,75 mg/ml Natriumbicarbonat, 5 ml mL minimum essential medium (MEM) nonessential aminosäures, 0.2 mM Ascorbinsäure, 10 ng/mL BDNF, 20 mL 50x B27 und 10 mL 100x N2 Supplement.
2. Beschichtung Multiwells
- Am Tag vor dem Replatieren mit Poly-L-Ornithin (PLO) beschichten. Plo in sterilem Wasser auflösen, um eine Stammlösung (10 mg/ml) herzustellen. Bewahren Sie diesen Bestand bei -20 °C auf. PLO 1:100 in Wasser verdünnen, um eine Konzentration von 50 g/ml beim Beschichten von Glas und 1:1.000 Verhältnis (10 g/ml) beim Beschichten von Kunststoff zu ergeben.
- Tragen Sie die Beschichtung direkt auf die Zielplatten auf. Verwenden Sie das der Plattengröße entsprechende Beschichtungsvolumen (d. h. für eine 24-Well-Platte 500 l PLO-Lösung pro Bohrung auftragen).
- Teller über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln sitzen lassen.
- Holen Sie beschichtete Platten am Tag der Replatierung ab und übertragen Sie sie in einen sterilen Biosicherheitsschrank.
- Die PLO-Lösung ansaugen und zweimal mit sterilem Wasser abspülen.
- Laminin (1,15 mg/ml) in phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) bei 1:400 Verdünnung verdünnen.
HINWEIS: Laschin bei 4 °C auftauen und schnell zu PBS hinzufügen, um eine Aggregation von Laminin und ungleichmäßiger Beschichtung zu vermeiden. - Steriles Wasser ansaugen und 500 l Lamininbeschichtung auf Brunnen auftragen, die zuvor mit PLO beschichtet waren.
- Platten in einen 37 °C-Inkubator für mindestens 4-6 h legen. Verwenden Sie längere Inkubationen, bis zu 16 h, für Glasoberflächen. Verwenden Sie konsistente Inkubationszeiten.
3. Replating Differentiated Neurons
- Spülen Sie die Platte von differenzierten Neuronen mit PBS einmal sanft. Verteilen Sie PBS sanft an der Wand der Platte und nicht direkt auf die Zellen, um sie nicht zu stören.
- Beruhigen Sie PBS vorsichtig, achten Sie darauf, die Zellen nicht direkt zu berühren, aber vom Rand der Schale zu aspirieren, während Sie sie in Richtung des Forschers kippen.
- Tragen Sie mindestens 1 ml des proteolytischen Enzyms (Materialtabelle) pro 10 cm Platte auf und geben Sie Zellen in den Inkubator zurück. Fügen Sie etwas höhere Volumina hinzu, wenn der Gewebekulturraum aufgrund der geringen Luftfeuchtigkeit eine hohe Verdunstungsrate aufweist.
- Inkubieren Sie Zellen mit proteolytischem Enzym für 40-45 min, um sie von der Platte zu lösen und sie von anderen Neuronen innerhalb des neuronalen Netzwerks zu lösen.
HINWEIS: Das Timing dieses Schritts ist entscheidend. Eine zu frühe Sautierung der Protease kann zu einem erhöhten Zelltod nach dem Replatieren führen. Der herstellerfreundliche Enzymhersteller empfiehlt, Temperaturen von weit unter 37 °C mit längeren Inkubationszeiten für passaging Zelllinien (z. B. über Nacht bei 4 °C) zu verwenden. Der Umgang mit Neuronen bei 4 °C sollte jedoch vermieden werden, da sie oft ein schlechtes Überleben nach Einer Erkältung aufweisen. Der Hersteller stellt auch fest, dass eine 60 min Inkubation mit dem Enzym bei 37 °C zu seiner enzymatischen Inaktivierung führt. Nach der Erfahrung der Autoren reicht jedoch eine 40-45 min Inkubation von hiPSC-abgeleiteten neuronalen Kulturen bei 37 °C für eine effiziente Dissoziation und ein ausgezeichnetes neuronales Überleben beim Replatieren aus. - Überprüfen Sie die Neuronen während der Inkubationszeit auf einem Phasenkontrastmikroskop und lassen Sie die Proteasebehandlung so lange fortsetzen, bis sich das neuronale Netzwerk vollständig von der Platte löst und beginnt, in kleineren Blättern auseinanderzubrechen, wenn die Platte unter der mikroskop.
- Quench die Protease-Aktivität mit 5 ml frischem DMEM-Medium pro 1 ml Protease in der 10 cm Platte, um die Verdauung zu stoppen. Sanft trituieren Zellen gegen Platte 5-8 mal, um das Netzwerk zu stören, mit serologischen Pipetten. Achten Sie darauf, nicht zu viel Druck beim Trituieren anzuwenden, da differenzierte Neuronen zerbrechlich sind. Verwenden Sie keine P1000-Spitze, da das Ende zu scharf und schmal ist und somit die Neuronen verkleinern oder beschädigen kann.
- Die Lösung mit Zellen durch ein Zellsieb mit einem Netz mit einem Durchmesser von 100 m in ein frisches 50 ml konisches Rohr Tropfen für Tropfen auftragen.
- Spülen Siebich mit zusätzlichen 5 ml frischem DMEM-Medium, nachdem Zellen durchgefiltert wurden.
- Spinzellen in Tischzentrifuge bei 1.000 x g für 5 min.
- Kehren Sie konische Rohre in den Biosicherheitsschrank zurück und aspirieren Sie die meisten Medien, sodass sie etwa 250 l übrig lassen, um sicherzustellen, dass die Zellen Feuchtigkeit zurückhalten.
- Zellen in 2 ml frischer DMEM-Medien sanft aussetzen. Pipette das Pellet nicht gegen die Seite des Rohres. Stattdessen, sanft invertieren konische 2-3 mal und passieren Zellen durch das Ende einer 5 ml serologischen Pipette, um sie zu vertreiben.
- Tragen Sie 10 L resuspendierte Neuronen auf den Rand eines Hämozytometers auf.
- Fügen Sie 8-10 L Trypanblau zu Tröpfchen von Zellen hinzu, um die Zelllebensfähigkeit während dieses Resuspensionsschritts zu bewerten. 10 L dieser Mischung auf das Hämozytometer oder andere automatische Zellzähler auftragen. Bewerten Sie als lebensfähig die Zellen, die phasenhell sind, und schließen Sie den Trypan-Blaufarbstoff aus.
- Bestimmen Sie die Menge der lebensfähigen Zellen/ml und bereiten Sie sich darauf vor, den Inhalt des konischen Rohres entsprechend der gewünschten Zelldichte zu verdünnen.
- Platte 10.000 Zellen pro Brunnen für eine 384-Well-Platte; Platte 150.000-200.000 Zellen pro Brunnen für eine 24-Well-Platte.
- Fügen Sie dem konischen Rohr von resuspendierten Zellen frisches DMEM hinzu, um eine angemessene Verdünnung zu erreichen, und fügen Sie zusätzliche geeignete Ergänzungen wie B27 und/oder BDNF hinzu, je nach den Anforderungen der spezifischen Zelllinie.
- Biegen Sie das konische Rohr vorsichtig um, um 2-3 Mal zu mischen.
- Aspirieren Sie Lamininbeschichtung aus der 24-Well-Platte oder aus der 384-Well-Multiwell-Platte mit einer 16-Kanal-Pipette und spülen Sie einmal mit PBS.
- Aspirieren Sie PBS mit einer P1000 für die 24-Well-Platte oder der 16-Kanal-Pipette für 384-Well-Platten.
- Tragen Sie die Zelllösung auf jeden Brunnen in einer Bewegung der Abbildung acht auf, um Verklumpungen zu vermeiden. Die Gleichmäßigkeit der Beschichtung kann auch durch den Einsatz automatisierter Flüssigkeitshandhabungsgeräte optimiert werden.
HINWEIS: Die Zugabe von Laminin zu den Medien ab 2-4 Tagen Nach-Replating hilft auch, eine homogene Verteilung der Zellen aufrechtzuerhalten. - Wiederholen Sie die Schritte 3.19 und 3.20 für jeden Brunnen.
- Geben Sie die Platte auf 37 °C und5% CO2 an den Inkubator zurück.
- Nach 2 Tagen beginnen Sie, alle 4 Tage die Hälfte des Mediums zu wechseln, indem Sie die in Abschnitt 1.2 beschriebenen Post-Differenzierungsmedien verwenden. Fixieren Sie nach der gewünschten Reifungszeit Kulturen mit 3,7% Formaldehyd bei 37 °C und Färben von Zellen entsprechend den experimentellen Anforderungen.
4. Cell Viability Assays Post-Replating
- Fügen Sie den frühen Zelltod-Reporter (VivaFix: 0,5 l der 50-L-Lagerlösung pro 500 L-Kulturmedium pro Brunnen) nach einer kurzen Wirbelung der Stammlösung hinzu.
- Stellen Sie sich die lebenden und abgestorbenen Zellen auf Glasboden-Multiwells nach 20 min ohne Waschschritt vor, da der Farbstoff nur einmal in den Zellen fluoresziert, oder fixieren und ko-stainieren Sie mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) und/oder anderen Antikörpern vor der Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop.
5. Immunostaining
- Fixkulturen mit 3,7% Formaldehyd in PBS plus 120 mM Saccharose für 20 min bei 37 °C.
- Spülen und permeabilisieren mit 0,2% Triton X-100 für 5 min bei Raumtemperatur, und dann für 30 min mit 2% RinderserumAlbumin (BSA) blockieren.
- Aspirieren Sie den BSA ohne Spülen und inbrüten für 1 h bei Raumtemperatur mit Kaninchen Anti-MAP2 Antikörper 1:1.000, Maus Anti-3 Tubulin (TuJ1) Antikörper 1:2.000, Huhn Anti-NeuN Antikörper (1:100) und Rattenanti-CTIP2 Antikörper (1:500), oder mit Maus-Antikörper PSD95 ( 1:200), Kaninchen Anti-Synapsin 1 (1:200) und Huhn Anti-MAP2 Antikörper für synaptische Färbung.
- Mit PBS abspülen und mit Alexa Fluorkonjugierten Sekundärantikörpern plus DAPI 45 min bei 37 °C inkubieren.
- Schließlich zweimal mit PBS waschen, bevor Sie bildgebungsbilden.
6. Calcium-Bildgebung
- Infizieren Sie kultivierte Zellen mit AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (The Salk Institute for Biological Studies, GT3 Core Facility) an 10 Tagen nach der Replatierung und Bild, um spontane Kalziumtransienten bei 3-4 Wochen Nach-Replating zu bewerten.
7. Bildaufnahme und -analyse
HINWEIS: Details zum Akquisitionssystem finden Sie unter Calabrese et al.12.
- Verwenden Sie ein Imaging-Modul für die manuelle oder automatisierte Bildaufnahme und ein Bildanalyse-Softwaremodul, z. B. CellProfiler13, für morphometrische Messungen.
- Berechnen Sie die durchschnittliche Länge der TuJ1-positiven Neuriten und MAP2-positiven Dendriten, indem Sie die Gesamtlänge pro Sichtfeld dividiert durch die Anzahl der Neuronen (DAPI + MAP2 oder TuJ1-positive Zellen) innerhalb desselben Feldes messen.
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Representative Results
Die Replatierung von hiPSCs-abgeleiteten Neuronen, die seit mehreren Wochen differenziert wurden, bietet mehrere Vorteile. Das Lösen und Replatieren differenzierter Neuronen, die lange, miteinander verbundene Dendriten und Axone haben (Abbildung 1A) kann jedoch zu einem hohen Anteil irreversibel geschädigter Neuronen führen.
Wie im Protokollabschnitt beschrieben, verwendeten wir die Inkubation mit einem proteolytischen Enzym, um die Neuronen vom Substrat zu lösen. Typischerweise neigen die Zellen aufgrund ihres dicken Netzes von Neuriten (Abbildung1A) dazu, sich auf einmal als eine einzige synzytial-ähnliche Schicht zu lösen, die oft im Brunnen zu schweben beginnt (Abbildung 1C). Dies geschieht ziemlich schnell, und vielleicht ist der Grund, warum die meisten Laboratorien neigen dazu, die Zellen nach nur 5 min Inkubation mit ihrem proteolytischen Enzym der Wahl zu sammeln, und sofort das Blatt der Zellen durch Triturierung zu brechen (Pipettieren es nach oben und unten). Jedoch, Diese mechanische Manipulation scheint zu hohen Stress für Neuronen führen. Wir glauben, dass der Grad der Belastung proportional zu der Fläche sein kann, die durch das neuronale Netzwerk abgedeckt wird, weil wir feststellen, dass die offensichtlichen Schäden durch unzureichende Protease-Inkubation für 10 cm oder größere Platten größer sind als für 35 mm oder kleinere Platten. So fanden wir kontraintuitiv heraus, dass die Verlängerung der enzymatischen Inkubation auf 40-45 min den Zelltod zum Zeitpunkt der Zelldissoziation reduziert (Abbildung 1C) und eine effizientere Wiederherstellung lebender, gesunder Zellen ermöglicht, die Prozesse über Stunden emittieren. tagelang nach der Replatierung (Abbildung 1B). Vermutlich ermöglicht die verlängerte Inkubationszeit mit einem milden proteolytischen Enzym die partielle Verdauung von Proteinen, die Zellen und ihre Prozesse stark aneinander und an die extrazelluläre Matrix anhaften. Dadurch kann der Resuspensionsprozess effizient arbeiten, um einzelne Zellen zu trennen, ohne dass eine übermäßig kräftige Trituration erforderlich ist.
Um die Wirksamkeit des erweiterten Enzyminkubationsverfahrens zu quantifizieren, evaluierten wir die Lebensfähigkeit von suspendierten Zellen unmittelbar nach der Trituration mit Trypanblau (Abbildung1C), und später bei 1, 3 und 7 Tagen nach der Replatierung mit einer frühen Zelle. Todesmarker (Abbildung 2). Unmittelbar nach der Triturierung deutete die Trypanblaufärbung darauf hin, dass es nach einer Inkubation von 5 min wesentlich einen wesentlich höheren Zelltod gab als bei einer 45 min Inkubation mit dem proteolytischen Enzym (Abbildung 1C). Die beiden iPSC-Linien, die wir zur Veranschaulichung dieser Beobachtung verwendeten, wurden mit verschiedenen Protokollen in Neuronen aus der neuronalen Vorläuferstufe unterschieden und zeigten eine weitgehend unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber dem Replating-Verfahren. Kulturen aus der WT126-Linie, die nach der "Rosette-Auswahlmethode"7 in NPCs differenziert wurden, waren empfindlicher gegenüber Schäden als Kulturen, die sich von der CVB WT24-Linie mit einer schnellen Differenzierungsmethode8unterschieden. Dennoch wurde der Grad des unmittelbaren Zelltodes für beide Linien durch das erweiterte Enzyminkubationsverfahren etwa halbiert.
Nach der Replatierung zeigten die Kulturen eine ungefähre Verdoppelung der Zelllebensfähigkeit über die folgenden Tage mit hilfe des erweiterten Enzyminkubationsverfahrens, wie durch die Dichte von DAPI-positiven Zellen bestimmt (Abbildung2B, Grafik links). Darüber hinaus führte die erweiterte Enzyminkubation zu einer geringeren Dichte toter oder sterbender Zellen, die mit einem Farbstoff-Ausschluss-Lebensfähigkeits-Kit nachgewiesen wurden (Abbildung2B, Grafik rechts). Der Anteil der abgestorbenen Zellen, der nach 24 h Nachreplatierung mit dem Lebensfähigkeitstest erkannt wurde, war höher als der, der unmittelbar nach der Triturierung mit Trypanblau beobachtet wurde. Dies spiegelt wahrscheinlich die Anhäufung von toten und sterbenden Zellen über diese ersten 24 h wider, obwohl es auch möglich ist, dass der Lebensfähigkeitstest den Zelltod empfindlicher erkennt als der Trypan-Blau-Assay. Abgestorbene Zellen wurden nach der Replatierung über 1-7 Tage weiter nachgewiesen (Abbildung 2B). Die anfängliche Beschichtungsdichte für beide Versuchsgruppen (5 min und 45 min) war identisch und basiert auf hämozytometer-Livezellzahlen der Posttriturationszellsuspension. Wichtig ist, dass die Anzahl der lebenden, gesunden Zellen nach der Inkubation des Enzyms 45 min im Vergleich zur Inkubation von 5 min ungefähr verdoppelt wurde. Diese Beobachtungen wurden qualitativ mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie bestätigt, um die Zellmorphologie bei jedem Schritt zu überwachen: vor dem Replatieren, während der Replatierung und nach dem Replatieren (Abbildung1 und Abbildung 2).
Einer der Vorteile der Replating hiPSC-abgeleiteten Neuronen, nachdem sie seit mehreren Wochen differenzieren, ist, dass die meisten der Zellen das Vorläuferstadium verlassen haben und sich zum Zeitpunkt der Replatierung einem neuronalen Phänotyp verschrieben haben. Die Übergangsphase der neuronalen Differenzierung von neuronalen Vorläufern findet über mehrere Tage statt, wobei eine größere Anzahl von Zellen allmählich neuronale Marker im Frühstadium exemitt, wie Beta-III-Tubulin (von Antikörper TuJ1) oder MAP2 erkannt. Die Genexpression entwickelt sich über mehrere Wochen, was schließlich zur Expression von panneuronalen Markern im spätstadium, wie NeuN, oder zelltypspezifischen Markern für kortikale Neuronen wie CTIP2 führt. Daher ermöglicht die Replatierung von zuvor differenzierten hiPSC-abgeleiteten Neuronen, frühe und transiente neuronale Ereignisse, wie die Neuriteninitiation, in identifizierten Subtypen von Neuronen zu untersuchen. Abbildung 3 zeigt das unmittelbare Vorhandensein von frühen neuronalen Markern in Kulturen, die nach 4 Wochen Vordifferenzierung in einem größeren Kulturgericht neu plattiert wurden. Beachten Sie, dass NeuN- und CTIP2-exättige Neuronen innerhalb weniger Tage nach der Replatierung leicht identifiziert werden können (Abbildung 3). Eigenschaften und Timing der neuronalen Differenzierung können zwischen hiPSC-Linien variieren. Für die WT 126-Linie und die CVB-WT24-Linien, die wir hier beschreiben, exprimieren 85 x 12 % (n = 2) bzw. 52 x 11 % (n = 5) der Zellen die Immunreaktivität für den 3-Tubulin-Marker TuJ1 4 Tage nach der Replatierung mit dem erweiterten Protease-Inkubationsverfahren. Für beide Linien drücken 30-40% der Zellen und 80-90% der Neuronen auch die Schicht 5/6 neokortikalen Marker CTIP2 aus. Neben der verbesserten Lebensfähigkeit verbesserte das erweiterte Protease-Protokoll auch mäßig erhöhtes Neuritenwachstum (durchschnittliche Neuritenlänge pro Neuron), wie in Abbildung 4dargestellt. Beide Gesamtneuritenlänge (quantifiziert mit Antikörper Tuj1, der sowohl Axone als auch Dendriten färbt; Abbildung 4 B, linkes Diagramm) und Dendritenwachstum (quantifiziert mit MAP2, das nur Dendriten färbt; Abbildung 4 B, Mitteldiagramm) wurden bevorzugt, wenn das erweiterte Protease-Inkubationsverfahren verwendet wurde. Beachten Sie, dass das Diagramm für DAPI-positive (DAPI (+))-Zellenzahlen in Abbildung 2 auf denselben Bildbeispielen wie das Zellzahldiagramm in Abbildung 4basiert, aber in Abbildung 2 wurden sie mit einer nicht automatisierten Methode quantifiziert, die von Fidschi-Software unterstützt wird. in Abbildung 4 wurden sie mit der automatisierten Bildanalyse-Softwareplattform CellProfiler quantifiziert. Diese beiden Bildanalyseansätze lieferten ähnliche Ergebnisse.
Replating ist nützlich, nicht nur um das Neuritenwachstum zu studieren, sondern auch, um Synapsen oder andere später erscheinende biologische Merkmale von Neuronen zu studieren. Tatsächlich beobachten wir nach nur einer Woche nach der Replatierung Marker für viele präsynaptische und postsynaptische Proteine, die die neuronalen Dendriten in einem Punktionsmuster schmücken (Abbildung 5A). Nach 4 Wochen beginnen wir auch, ihre Kolokalisierung zu erkennen, die ein Indikator für die Bildung von funktionellen Synapsen ist (Abbildung 5A). Darüber hinaus ist die elektrische Aktivität durch spontane Depolarisation und synaptisch angetriebene Ströme mit Kalzium-Bildgebung (Abbildung 5B) oder Multielektroden-Arrays (MEAs) nachweisbar.
Abbildung 1 : Überlegene Erhaltung der neuronalen Lebensfähigkeit nach längerer Inkubation mit dem proteolytischen Enzym zur Zelldissoziation. (A) Phasenkontrastbild von NPC-abgeleiteten Neuronen, die 3 Wochen lang differenziert wurden. Der geschachtelte Bereich im linken Bild wird rechts vergrößert. In diesem Stadium haben Neuronen lange Prozesse, die ein dickes Netz bilden. Skalenbalken = 80 m (links); 35 m (rechts). (B) Ausgewählte Bilder von hiPSC-abgeleiteten Neuronen nach 1 und 5 Tagen nach der Replatierung. Skala bar = 100 m. (C) Links: Zellen lösen sich als einzelnes Blatt innerhalb weniger Minuten nach Beginn der Proteasebehandlung. Skalenbalken = 200 m. Rechts: Nach Triturierung werden Zellen vor dem Replatieren auf das Hämozytometer gezählt. Graphen zeigen die Quantifizierung nicht lebensfähiger, trypanblauer positiver Zellen nach 5 min oder 45 min Inkubation mit dem proteolytischen Enzym für zwei verschiedene Linien CVB WT24 (*** p < 0.0003, ungepaarter t-Test) und WT 126 (*** p < 0.0001, ungepaarter t-Test). Die Werte stellen den Mittelwert von 4 einzelnen Replikationen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Neuronale Lebensfähigkeit nach mehreren Tagen nach der Replatierung. (A) Bilder von WT126 NPC-abgeleiteten Neuronen nach 1 und 3 Tagen nach der Replatierung mit 5 min und 45 min Protease-Inkubation. Sterbende Zellen werden mit dem empfindlichen Reporter für den frühen Zelltod beschriftet. Entsprechende Hellfeldbilder werden auf der linken Seite angezeigt. Einige Zellteile (blauer Pfeil) werden in der Regel nach dem Replatieren erkannt, vor allem in der 5-min-Gruppe. Skala ng = 150 m . (B) Bilder von CVB WT24 NPC-abgeleiteten Kulturen bei 1, 3 und 7 Tagen Nachreplatierung mit 5 min und 45 min Protease-Inkubation. Sterbende Zellen werden mit dem empfindlichen Frühzelltodreporter (rot) gekennzeichnet. Alle Kerne lebender und sterbender Zellen sind mit DAPI (Cyan) gekennzeichnet. Das zusammengeführte weiße Signal stellt DAPI- und VivaFix-positive (+) Zellen dar. Einige Zellen zeigen VivaFix Färbung, aber fehlt DAPI Färbung (rote Zellen im kombinierten Bild auf der rechten Seite); dies sind wahrscheinlich Zellen, die für viele Stunden tot waren. Skalenbalken: 25 m. Das rechte Diagramm zeigt die Quantifizierung des Anteils abgestorbener Zellen (VivaFix/DAPI) nach unterschiedlicher Inkubationszeit mit dem proteolytischen Enzym (5 min vs 45 min: * p < 0,05 1 d und *** p < 0,001, 3 d; Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von einem Multivergleich Bonferroni Post-hoc-Test). Das linke Diagramm zeigt Veränderungen der Gesamtzellendichte (DAPI(+)-Zellen für 5 min vs 45 min: *** p < 0.0001 für alle Zeitpunkte; zweiseitig ANOVA, gefolgt von einem Multivergleich Bonferroni Post hoc Test). Alle Werte werden als mittelwertig s.E.M von 3 Replikationen angezeigt, wobei mindestens 1.500 Zellen pro Bedingung bewertet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Nachweisbarer Ausdruck von neuronalen Markern im späten Stadium unmittelbar nach dem Replatieren. Kulturen von CVB WT24 hiPSC-abgeleiteten Zellen, die 4 Tage nach der Replatierung mit 45 min Protease-Inkubation von einer 10 cm Schale abgebildet wurden, die 4 Wochen lang von der NPC-Stufe unterschieden worden war. Gezeigte Beispiele waren für die panneuronalen Marker TuJ1, MAP2 oder NeuN; oder den tiefschichtigen kortikalen Pyramiden-Neuronenmarker CTIP2. Beachten Sie das Vorhandensein umfangreicher Neuriten und den robusten Ausdruck von TuJ1 und MAP2. Beachten Sie insbesondere, dass ein erheblicher Teil der Neuronen auch späte Marker NeuN und CTIP2 ausdrückt. Maßstabsleiste = 16 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Neurit- und Dendritenwachstum im Laufe der Zeit nach kürzerer und längerer Enzyminkubation während der Replatierung. (A) Replated CVB WT24 hiPSC-abgeleitete Neuronen dehnen neurititen schnell aus, wie mit Demonstantia Tuj1 nachgewiesen. Beachten Sie, dass die verlängerte Protease-Inkubationszeit die Neuritogenese fördert. Skala bar = 25 m. (B) Quantifizierung der Neuriten- und Dendritenlänge, über 1, 3 und 7 Tage Nachreplatierung mit entweder 5 min oder 45 min Protease. Die Gesamtneuritenlänge wurde aus tuJ1 (III-Tubulin) Färbung quantifiziert; dendritspezifische Färbung wurde aus MAP2-Färbungss-Snf quantifiziert, korrigiert für die Gesamtzelldichte (rechte Grafik). Alle Werte werden als Mittelwert von 3 Replikationen angezeigt. Neuritenlänge 5 min vs 45 min: * p < 0.05 bei 1 Tag und 7 Tagen, ** p < 0.01 bei 3 Tag; Dendritlänge 5 min vs 45 min: ** p < 0,01 bei 1 Tag und 3 Tagen, nicht signifikant (ns) bei 7 Tagen; DAPI(+) 5 min vs 45 min: *** p < 0.0001 für alle Zeitpunkte; zweiseitig ANOVA, gefolgt von einem Multi-Vergleich Bonferroni Post-hoc-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5 : Synaptogenese und spontane Calciumtransienten in differenzierten hiPSC-abgeleiteten Neuronen nach der Replatierung. (A) Links: Nach 4 Wochen Nachderreplatierung mit dem erweiterten Protease-Inkubationsprotokoll ist der präsynaptische Marker Synapsin 1 in Punktionsclustern entlang der MAP2-positiven Dendriten nachweisbar. Skalenbalken = 5 m. Rechts: ausgewählte dendritische Region mit Kolokalisierung zwischen präsynaptischen und postsynaptischen Clustern (gelber Pfeil), ein Hinweis auf potenziell aktive Synapsen. Skalenstäbe = 1,5 m . (B) Links: mit AAV8-syn-jGCaMP7f-WPRE infizierte hiPSC-abgeleitete Neuronen wurden verwendet, um spontane Kalziumtransienten zu überwachen, die durch Netzwerkaktivität angetrieben werden. Das Hellfeldbild wird neben dem Pseudofarb-Rendering der GCaMP7-Fluoreszenz zu einem einzigen Zeitpunkt in der Zeitrafferserie angezeigt. Skala bar = 25 'm. Farbige Zahlen zeigen die 4 ausgewählten Zellen an, in denen die GCaMP7-Fluoreszenz im Laufe der Zeit gemessen wurde, wie in den Spuren auf der rechten Seite dargestellt. Jede farbige Spur entspricht einer Zelle. Das Sternchen zeigt auf die Zeit während der Live-Aufnahme, der das Bild auf der linken Seite entspricht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6 : Workflow von Replating-Verfahren zu Kultur-HiPSCs für high content Screening und/oder detaillierte Studien der Differenzierung und Neuritenauswüchse oder MEA-Aufnahmen. Ausgehend von einer differenzierten Kultur von Neuronen, die 4 oder mehr Wochen in einem größeren Format (z.B. einem 10 cm großen Kulturgericht) angebaut werden, werden Neuronen mit einem Protease für 40-45 min inkubiert, sanft trituiert, um sich zu distanzieren und wieder aufzuhängen. Die Zellen werden dann in mit HCS kompatibleN Multi-Wells verteilt, auf Substraten, die mit bildgebenden Wachstumskegeln (gelber Pfeil) oder anderen Strukturen kompatibel sind, oder auf Multi-Wells, die für Multielektroden-Array-Aufnahmen geeignet sind. Skalenstäbe = 27 'm, 5 'm, 2,5 'm, 130 'm (von links nach rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wir haben ein geradliniges Verfahren zur Resuspension und Replatierung menschlicher neuronaler Kulturen demonstriert, das die Lebensfähigkeit, den Differenzierungserfolg und die subzelluläre Bildgebung in einer Weise optimiert, die mit Screening-Plattformen mit hohem Inhalt kompatibel ist. und andere Assays, die für die Entdeckung von Arzneimitteln relevant sind. Abbildung 6 zeigt den gesamten Workflow und Beispiele für solche Anwendungen.
Obwohl wir uns hier auf hiPSC-abgeleitete Neuronen konzentrierten, die auf ein kortikales Neuronenschicksal ausgerichtet sind, erwarten wir, dass diese Methode gleichermaßen auf menschliche embryonale Stammzellen-abgeleitete Neuronen und auf Stammzellen abgeleitete Neuronen anwendbar sein sollte, die auf andere neuronale Phänotypen14,15,16,17,18. Darüber hinaus postulieren wir, dass dieses erweiterte Protease-Verfahren für andere Situationen von Vorteil sein könnte, die eine Resuspension von Zellen mit einem etablierten Neuriten-Netz erfordern, z. B. für die FACS-Sortierung oder einzellige Analysen von Primärneuronen19 , 20.
Das Replating von hiPSC-abgeleiteten Neuronen bietet ein tragfähiges Modellsystem, in dem zelluläre und molekulare Mechanismen vieler wichtiger biologischer Ereignisse untersucht werden können. Beispielsweise kann dieses Verfahren detaillierte Studien des menschlichen Neuritenwachstums und der Wachstumskegeleigenschaften sowie den Vergleich der Befunde mit der umfangreichen Wissensbasis erleichtern, die aus der jahrzehntelangen Untersuchung anderer Arten, sowohl Wirbeltiere als auch Wirbellose, aufgebaut wurde. Wir stellen fest, dass das Replating-Verfahren es einfacher gemacht hat, die Bedingungen zu optimieren, um größere Wachstumskegel zu erzeugen, die für die optische Bewertung der subzellulären Struktur und Funktion gut geeignet sind (Abbildung 6). Im Vergleich dazu sind die Wachstumskegel, die eher während der anfänglichen Differenzierung von Neuronen von HiPSCs beobachtet werden, in der Regel klein und kompakt, und die dichte Anordnung nicht-neuronaler Zellen in solchen Kulturen macht es schwierig, sowohl die Substratbedingungen an die Förderung der Ausbreitung von Wachstumskegeln und zur Abbildung einzelner Wachstumskegel innerhalb der komplexen Gewebeumgebung. So bietet das Replating von Neuronen auf ein frisches Gericht einen "saubereren Schiefer", auf dem Wachstumskegel unter guten bildgebenden Bedingungen betrachtet werden können.
Das Replating ist besonders vorteilhaft bei der Verwendung von für HCS geeigneten Zellkulturplattformen, da es die Gesamtzeit, in der Kulturen in kleinen Mengen angebaut werden, erheblich reduziert. Die kleinen Arbeitsvolumina der einzelnen Brunnen von 96, 384 oder 1536-Well-Multibrunnen (ca. 100, 50 bzw. 5 Mikroliter Arbeitsvolumen) erfordern in der Regel häufige (d.h. tägliche) Medienwechsel, um Verdunstung und Nährstoffmangel entgegenzuwirken. Häufige Medienwechsel sind kostspielig, nicht nur in Bezug auf Reagenzien und Arbeit, sondern sie können die Lebensfähigkeit von Kulturen gefährden, indem sie konditionierte Medien verdünnen und die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass sich Zellen aufgrund mechanischer Turbulenzen vom Substrat lösen. Das Replatieren von hiPSCs kann auch die Aufzeichnung physiologischer Aktivität mit Multielektroden-Arrays21,22oder Live-Bildgebung von Kulturen in Assays dynamischer neuronaler Phänotypen23erleichtern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit ist Bestandteil der National Cooperative Reprogrammed Cell Research Groups (NCRCRG) zur Untersuchung psychischer Erkrankungen und wurde durch das NIH-Stipendium U19MH1 2015-0644 unterstützt. Die ersten Arbeiten wurden auch durch den NIH-Zuschuss NS070297 unterstützt. Wir danken Dr. Carol Marchetto und Fred Gage, The Salk Institute, für die Bereitstellung der WT 126 Linie von neuronalen Vorläuferzellen, und Dr. Eugene Yeo und Lawrence Goldstein, UC San Diego für die Bereitstellung der CVB WT24 Linie von neuronalen Vorläuferzellen. Wir danken Deborah Pre im Labor von Dr. Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, für nützliche Diskussionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1 mL of 200 mM stock to 1 L of N2B27 media |
| Dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50x) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 mL to 1 L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1 L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µL to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5 mL to 1 L N2B27 media |
| N2 (100x) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5 mL to 500 mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10 mL to 1 L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10 cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1,000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100 mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1 mL/10 cm plate for 30-45 min; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 mL of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| Mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| Rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| Chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| Chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| Rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| Mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| Rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
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