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Bioengineering

उच्च थ्रूपुट ट्रैक्शन फोर्स माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके Epithelial-to-Mesenchymal संक्रमण पर परिवर्तन विकास फैक्टर-जेड के खुराक-निर्भर प्रभाव का पता चलता है

Published: June 1, 2019 doi: 10.3791/59364
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 4, 1,2
1Department of Bioengineering, McGill University, 2Goodman Cancer Research Centre, McGill University, 3Department of Medicine, McGill University, 4Department of Emergency Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center

Summary

हम सिलिकॉन रबर (PDMS) के साथ निर्मित एक उच्च थ्रूपुट कर्षण बल परख प्रस्तुत करते हैं। इस उपन्यास परख विभिन्न जैविक और जैव चिकित्सा प्रक्रियाओं और रोगों के दौरान सेल संकुचन में शारीरिक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है. हम उपकला-से-मेसेनकाइमल संक्रमण के दौरान एक TGF-जेड निर्भर वृद्धि को मापने के द्वारा इस विधि की उपयोगिता का प्रदर्शन.

Abstract

सेलुलर संकुचन जीव विज्ञान के विविध पहलुओं में आवश्यक है, ड्राइविंग प्रक्रियाओं है कि गतिशीलता और विभाजन से लेकर, ऊतक संकुचन और यांत्रिक स्थिरता के लिए, और बहु कोशिकीय पशु जीवन का एक प्रमुख तत्व का प्रतिनिधित्व करता है. अनुलग्न कोशिकाओं में, एक्टो-मायोसिन संकुचन कर्षण बलों में देखा जाता है जो कोशिकाओं को उनके सब्सट्रेट पर लागू करते हैं। सेलुलर अनुबंधता के Dysregulation रोगों के असंख्य में प्रकट होता है, एक मीट्रिक के रूप में जैव भौतिकी का उपयोग कर विविध नैदानिक दृष्टिकोण में एक आशाजनक लक्ष्य contractility बना रही है. इसके अलावा, उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों सेल संकुचन के स्पष्ट खराबी को सही करने पर आधारित किया जा सकता है. तथापि, इन अनुप्रयोगों के लिए इन बलों के प्रत्यक्ष परिमाणीकरण की आवश्यकता होती है।

हमने एक समानांतर बहु-वेल प्रारूप में सिलिकॉन इलोस्टोमर-आधारित कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) विकसित किया है। एक सिलिकॉन रबर का हमारा उपयोग, विशेष रूप से polydimethylsiloxane (PDMS), बजाय आमतौर पर कार्यरत hydrogel polyacrylamide (पीएए) हमें अनिश्चित शेल्फ के साथ मजबूत और निष्क्रिय substrates बनाने के लिए सक्षम बनाता है कोई विशेष भंडारण की स्थिति की आवश्यकता होती है. जीपीए रेंज में एक मापांक है कि स्तंभ-PDMS आधारित दृष्टिकोण के विपरीत, PDMS यहाँ इस्तेमाल बहुत अनुरूप है, लगभग 0.4 kPa से लेकर 100 kPa. हम इन बड़े अखंड substrates स्थानिक रूप से जैव रासायनिक स्वतंत्र कुओं में विभाजित करके TFM के लिए एक उच्च throughput मंच बनाने, कर्षण बल स्क्रीनिंग कि मौजूदा बहु अच्छी तरह से सिस्टम के साथ संगत है के लिए एक बहु अच्छी तरह से मंच बनाने.

इस पांडुलिपि में, हम इस बहु-वेल कर्षण बल प्रणाली का उपयोग मेसेन्काइमल संक्रमण (ईएमटी) के लिए एपिथेलियल की जांच करने के लिए करते हैं; हम उन्हें TGF करने के लिए उजागर द्वारा NMuMG कोशिकाओं में EMT प्रेरित-जेड, और EMT के दौरान biophysical परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए. हम एकाग्रता और TGF की अवधि के एक समारोह के रूप में संकुचन उपाय - जोखिम. हमारे निष्कर्ष यहाँ रोग जैव भौतिकी के संदर्भ में समानांतर TFM की उपयोगिता का प्रदर्शन.

Introduction

Acto-myosin संकुचन सक्रिय सेल यांत्रिकी का एक अनिवार्य तत्व है, गतिशीलता और प्रसार से सेल व्यवहार को प्रभावित करने के लिए स्टेम सेल भेदभाव. ऊतकों में, संकुचन भ्रूणजनन में ध्रुवीय जुदाई से गतिविधि ड्राइव, airway संकुचन और हृदय गतिविधि के लिए. गंभीर रूप से, तनाव उत्पन्न करने के लिए, कोशिकाओं को पहले अपने extracellular वातावरण का पालन करना चाहिए. ऐसा करने में, यह संकुचन अपने परिवेश पर कर्षण बलों उत्पन्न करता है। ट्रैक्शन फोर्स माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) विभिन्न परिस्थितियों में विभिन्न कोशिकाओं से इन बलों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक तरीका के रूप में रूपों की एक भीड़ में उभरा है।

TFM के क्षेत्र नवाचार और आवेदन की एक असाधारण चौड़ाई देखा है, और परिणाम जीव विज्ञान, जो यांत्रिकी और शारीरिक बलों को शामिल में नए दृष्टिकोण के लिए रास्ता प्रशस्त किया है. सिलिकॉन substrates1wrinkling के साथ शुरू , शोधकर्ताओं ने सेल कर्षण बलों को मापने के लिए विभिन्न तकनीकों को लागू किया है. इन दृष्टिकोणों में लगातार सुधार किया गया है और अब कई माइक्रोन2के क्रम पर संकल्प के स्तर तक पहुंच गया है . तथापि, एक प्रमुख समस्या उत्पन्न हुई है, जो उपलब्ध सिलिकॉनों का उपयोग करके उपयुक्त रूप से कम आधुनिकता के उपकेन्द्रों को बनाने में कठिनाई है। इस समस्या को दूर करने के लिए, 1-20 केपीए3के आदेश पर सबस्ट्रेट्स बनाने में आसानी के कारण पॉलीऐक्रिलमाइड को प्रतिस्थापन के रूप में अपनाया गया था। हम हाल ही में TFM4में बहुत अनुरूप सिलिकॉन लागू किया, हमें polyacrylamide के रूप में moduli की एक ही रेंज बनाने के लिए अनुमति देता है, लेकिन निष्क्रिय और मजबूत सिलिकॉन के फायदे के साथ.

TFM दृष्टिकोण मूल्यवान mechano-जैविक खोजों सक्षम है, तथापि, एक लगातार कमी उनकी जटिलता है, अक्सर इंजीनियरिंग या भौतिक विज्ञान विषयों में शोधकर्ताओं के लिए उनके उपयोग सीमित. यह विस्तृत अंशांकन और चुनौतीपूर्ण गणना है कि संकुचन की मात्रा के लिए आवश्यक हैं करने के लिए बड़े हिस्से में कारण है. एक और महत्वपूर्ण चुनौती यह है कि टीएफएम के तरीके काफी हद तक कम-थ्रूपुट हैं और इसलिए एक साथ कई अलग-अलग स्थितियों या आबादी का अध्ययन करने के लिए अनुपयुक्त हैं। यह एक बाधा प्रस्तुत किया है, जो व्यापक जैविक और औषधीय अनुप्रयोगों में एक विशेषज्ञ जैव भौतिकी सेटिंग से TFM के हस्तांतरण में बाधा उत्पन्न की है.

हम हाल ही में एक बहु अच्छी तरह से प्रारूप TFM प्लेट विकसित की है, जो शोधकर्ताओं को संकुचन मैट्रिक्स के तेजी से परिमाणीकरण के लिए अपने TFM माप समानांतर करने की अनुमति देता है, जबकि विभिन्न यौगिकों के प्रभाव की खोज और भी कम अभिकर्मकों का उपयोग4 . इस पद्धति विविध mechanobiology अध्ययन में व्यापक उपयोगिता है, सेलुलर गतिविधि पर यौगिकों के प्रभाव का मूल्यांकन करने से, भेदभाव या रोग में संकुचन परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए.

जैव चिकित्सा अनुसंधान के एक क्षेत्र है कि TFM से बहुत लाभ होगा कैसे शारीरिक संकेतों कैंसर कोशिकाओं के घातक phenotypes प्रभाव का अध्ययन है. मेटास्टेसिस, कैंसर से संबंधित मौतों के 90% के लिए जिम्मेदार है, कैंसर कोशिकाओं उनके मूल ट्यूमर साइट छोड़ने और एक माध्यमिक साइट colonizing द्वारा विशेषता है. कोशिकाओं के लिए ऊतक के माध्यम से विस्थापित करने के लिए और में और संवहनी प्रणाली से बाहर पारित करने के लिए, वे मौलिक इन भौतिक बाधाओं के माध्यम से निचोड़ करने के लिए अपने आकार को बदलने के लिए, जबकि पर्याप्त बलों पैदा करने के लिए extracellular मैट्रिक्स के साथ अपना रास्ता खींच या अन्य के बीच ले जाएँ कक्षों. इन बलों को फोकल आसंजन अन्योन्यक्रिया2,3के माध्यम से सब्सट्रेट में संचारित किया जाता है और टीएफएम का उपयोग करके इसकी मात्रा निर्धारित की जा सकती है। जबकि कैंसर जैव रासायनिक असाधारण विविध रहे हैं, ज्ञात उत्परिवर्तनों और प्रोटीन परिवर्तन के एक विस्तार प्रदर्शनों की सूची के साथ, कुछ आम शारीरिक परिवर्तन देखा गया है; स्तन, प्रोस्टेट, और फेफड़ों के कैंसर सहित कैंसर की एक किस्म में, मेटास्टैटिक कोशिकाओं को 2-3 बार गैर-मेटास्टैटिक कोशिकाओं के कर्षण बलों लागू करने के लिए दिखाया गया है6,7,8. इन परिणामों का सुझाव है कि वहाँ metastatic प्रगति और कोशिकाओं द्वारा लागू कर्षण बलों के बीच एक मजबूत संबंध हो सकता है; तथापि, अनुबंधता में विस्तृत समय-निर्भर परिवर्तनों की जांच करना कठिन है।

उपकला-से-मेसेन्काइमल संक्रमण (ईएमटी) एक प्रक्रिया है जिसके द्वारा कोशिकाओं को अनुयायियों को कम- और तंग-जंक्शन मध्यस्थता सेल सेल आसंजन, अधिक प्रवासी और आक्रामक बनने. शारीरिक कार्यों के अलावा जो घाव भरने और विकासात्मक प्रक्रियाओं में शामिल हैं, ईएमटी मेटास्टेसिस के दौरान शोषण की एक प्रक्रिया भी है, जिससे यह इस प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रणाली बना रही है। TGF-जेड का उपयोग करना, हम murine स्तन उपकला कोशिकाओं में EMT प्रेरित कर सकते हैं (NMuMG)9 सीधे इस परिवर्तन के दौरान शारीरिक परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए, और समय और TGF के खुराक पर निर्भर प्रभाव की विशेषता-जेड EMT और सेल संकुचन पर. इस आलेख में, हम एक प्रेरित EMT के दौरान contractility में परिवर्तन को मापने के द्वारा इस दृष्टिकोण की उपयोगिता का प्रदर्शन.

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Protocol

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल चित्र 1में दिखाया बहु अच्छी तरह से टीएफएम पकवान fabricating और का उपयोग करने में शोधकर्ताओं का मार्गदर्शन करेंगे.

1. PDMS सिलिकॉन substrates की तैयारी

  1. दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किटों के मिश्रित मिश्रण के आधार पर पीडीएमएस सिलिकॉन रबर मिश्रण तैयार करना।
    1. PDMS किट के भाग ए और भाग बी जोड़ें (उदा., GEL-8100, सामग्री की तालिकादेखें) एक 1:1 वजन अनुपात में 50 एमएल ट्यूब में.
      नोट: मिश्रण पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए क्रांति के दौरान आगे और पीछे प्रवाह करने के लिए मिश्रण के लिए काफी धीमी गति से एक रोटेटर पर मिलाया जाता है।
    2. सब्सट्रेट के वांछित मापांक के लिए इलाज एजेंट की आवश्यक राशि जोड़ें.
      नोट: मिश्रण करने के लिए जोड़ा जा करने के लिए एजेंट के इलाज की राशि सब्सट्रेट के वांछित मापांक पर निर्भर करता है और आम तौर पर 0.1% से 1.8% तक हो सकता है। विशिष्ट क्रॉसलिंकर सांद्रता और परिणामी मोडुली के लिए एक मार्गदर्शिका के लिए सारणी 1 और चित्र 3 को देखें।
    3. 30-45 मिनट के लिए रोटेटर पर तैयार मिश्रण; सुनिश्चित करें कि रोटेशन पूरी तरह से मिश्रण के लिए काफी धीमी है।
  2. नीचे परत: कांच स्लाइड पर पीडीएमएस substrates कोटिंग
    1. स्पिन-कोटर पर चित्र 2 में सचित्र कस्टम-निर्मित चक को रखें। इथेनॉल या आइसोप्रोपेनोल के साथ कांच को साफ करें, और लिंट-मुक्त पोंछे के साथ सूखा एंटरलैंड करें। चक में कांच स्लाइड प्लेस और जगह में स्लाइड पकड़ करने के लिए वैक्यूम पर बारी।
    2. किनारों से लगभग 1 सेमी uncured PDMS लागू करें और केंद्र की ओर काम करते हैं। पर्याप्त (3-4 एमएल) PDMS लागू करने के लिए सुनिश्चित करें कि पूरी सतह को कवर किया जाएगा.
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि पीडीएमएस कांच की सतह पर समान रूप से फैल ताक, एक पिपेट टिप केंद्र से किनारों तक PDMS मिश्रण को फैलाने में सहायक हो सकता है।
    3. निम्नलिखित प्रोटोकॉल के साथ एक स्पिन-कोटर पर PDMS मिश्रण के साथ कांच स्पिन।
      1. स्लाइड पर uncured PDMS प्रसार करने के लिए, 0 से 200 आरपीएम तक 50 आरपीएम/ 1 मिनट के लिए 200 आरपीएम पर पकड़.
      2. 100 डिग्री मोटी PDMS परत प्राप्त करने के लिए, 50 rpm/s से 300 आरपीएम में तेजी लाने और 300 आरपीएम पर 1 मिनट के लिए पकड़। 100 डिग्री मीटर के अलावा अन्य विभिन्न वांछित मोटाई विशिष्ट गति मानों की आवश्यकता होगी।
      3. हटाने के लिए, 50 आरपीएम/एस से 0 आरपीएम पर कम करें। वैक्यूम अक्षम करें और लेपित स्लाइड को हटा दें, लेपित सतह को छूने के लिए ध्यान नहीं दे रहे हैं।
        नोट: यह एक चिकनी सतत सतह सुनिश्चित करने के लिए त्वरण और मंदी कदम शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है।
        चेतावनी: यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूना चक से उड़ नहीं है, कस्टम-निर्मित धारक को स्लाइड को पकड़ने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, और वैक्यूम और मौजूदा फ्लैट चक पर बस भरोसा नहीं करना चाहिए। इस धारक का विवरण और विनिर्देश चित्र 2में दिए गए हैं।
    4. 2 ज के लिए निर्माता की सिफारिश की तापमान (100 डिग्री सेल्सियस) पर ओवन में स्पिन लेपित नमूना रखें।
      नोट: ओवन की सतह जहां नमूना रखा जाता है ठोस होना चाहिए (यानी, नहीं एक तार रैक) और स्तर की सतह समान हीटिंग और नमूना की मोटाई सुनिश्चित करने के लिए। एक सिरेमिक या स्टील प्लेट एक आदर्श सतह बनाता है।
  3. शीर्ष मनका परत
    1. शेष PDMS मिश्रण करने के लिए उपयुक्त अनुपात में मनका समाधान जोड़ें.
      नोट: यह अनुपात स्टॉक मनका समाधान और नमूने पर वांछित मनका घनत्व की एकाग्रता पर निर्भर करता है। विशिष्ट अंतिम मान 9.2 x 1011 मोती/एमएल और 0.05-0.2 मोती/$m2हैं, और मोती की अधिकता आम तौर पर अपर्याप्त राशि के लिए बेहतर होती है।
    2. बिना का उठा हुआ PDMS के साथ मनका समाधान मिक्स. यह लगभग 30 मिनट के लिए एक रोटेटर पर ट्यूब रखकर पूरा किया जा सकता है, 1-2 मिनट के लिए भंवर, या 30 मिनट के लिए sonication. इन विधियों को संयोजित किया जा सकता है।
      नोट: हमारे आवेदन में, हम sonication मनका समुच्चय तोड़ने में प्रभावी है कि पाते हैं, और रोटेशन मिश्रण में प्रभावी है। संश् लेषित प्रत्ययी मनकों के भंडारण में समुच्चय हो सकता है। उपयोग करने से पहले, वे हेक्सेन और sonicated में resuspended किया जा सकता है. यदि महत्वपूर्ण बड़े समुच्चय हैं, तो एक 5 डिग्री सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से मनका निलंबन फ़िल्टर कर सकता है। यह निस्पंदन चरण वैकल्पिक है; यह मोनोdispersed मोती के साथ नमूना कोट करने में मदद करता है, लेकिन मोती का एक महत्वपूर्ण अंश फिल्टर में खो सकता है.
    3. ओवन से स्लाइड बाहर ले लो, कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं, और यह स्पिन-कोटर पर जगह है।
    4. लेपित नमूने की सतह पर मनका और uncured PDMS मिश्रण के 3-4 एमएल जोड़ें.
      नोट: जोड़ा मोती के साथ मिश्रण हेक्सेन के कारण कम चिपचिपा है। यह पहले से ही लेपित PDMS सब्सट्रेट नुकसान हो सकता है के रूप में सब्सट्रेट की सतह को छूने के लिए सुनिश्चित करें। इसके अतिरिक्त, मनका मिश्रण शुरू में सतह गीला नहीं हो सकता है; ध्यान रखना है कि मिश्रण तुरंत ठीक PDMS सतह से प्रवाह नहीं है.
    5. नमूने को निम्न प्रोटोकॉल के साथ स्पिन करें.
      1. मनका और uncured PDMS मिश्रण प्रसार करने के लिए, 0 से 500 आरपीएम के लिए 100 आरपीएम / 1 मिनट के लिए 500 आरपीएम पर पकड़.
      2. मनका-एम्बेडेड पीडीएमएस ($1$m) की एक पतली परत को प्राप्त करने के लिए, 500 से 5000 आरपीएम तक 200 आरपीएम/ 10 s के लिए 5000 आरपीएम पर पकड़.
      3. हटाने के लिए, 100 आरपीएम/ वैक्यूम अक्षम करें और लेपित स्लाइड को हटा दें, लेपित सतह को छूने के लिए ध्यान नहीं दे रहे हैं।
    6. 1 h के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में स्पिन लेपित नमूना रखें।
      नोट: 100 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान या 1 एच से अधिक अवधि मनका फ्लोरोसेंट को कम कर सकते हैं। सुनिश्चित करें कि ओवन का तापमान 100 डिग्री सेल्सियस पर सेट है और उच्च नहीं है।
    7. प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है। नमूना स्टोर करने के लिए, धूल और प्रकाश जोखिम से बचने के लिए सतह को कवर करें। सुनिश्चित करें कि कुछ भी नहीं सतह छू लेती है। नमूना अनिश्चित काल के लिए कमरे के तापमान पर शेल्फ-स्थिर है।
  4. प्लेट को इकट्ठा करना
    1. 50 एमएल ट्यूब में एक 10:1 वजन अनुपात में एक PDMS elastomer किट के भाग ए (आधार) और भाग बी (कर एजेंट, उदा., Sylgard) जोड़ें.
    2. 30-45 मिनट के लिए रोटेटर पर मिश्रण मिक्स.
      नोट: एक प्लेट के लिए, इलाज एजेंट के 0.5 एमएल के साथ आधार के 5 एमएल मिश्रण। मिश्रण की चिपचिपापन को कम करने के लिए 1 एमएल हेक्सेन को जोड़ा जा सकता है।
    3. विभाजक के नीचे मिश्रण लागू करें और मिश्रण फैला.
      नोट: डिवाइडर को उल्टा-नीचे रखा जाना चाहिए।
    4. डिवाइडर पर सब्सट्रेट को उल्टा-नीचे रख दिया।
    5. 2 ज के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में नमूना उल्टा रखें।
    6. ओवन से नमूने बाहर ले लो और 70% इथेनॉल या आइसोप्रोपेनोल के साथ कांच के नीचे साफ करने के लिए किसी भी PDMS अवशेषों को दूर.
      नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है। नमूना स्टोर करने के लिए, सब्सट्रेट पर एक ढक्कन जगह है और प्रकाश के लिए जोखिम से बचने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में डिवाइस लपेटो। नमूना अनिश्चित काल के लिए कमरे के तापमान पर शेल्फ-स्थिर है। इस विधि में उपयोग किया गया विभाजक 96-वेल प्रारूप में है; हालांकि, शोधकर्ताओं ने वांछित प्रयोग setups और विभाजन संरचनाओं की उपलब्धता के आधार पर अन्य प्रारूपों (384-अच्छी तरह से, 2-अच्छी तरह से, 4-वेल, 8-वेल, आदि) को रोजगार कर सकते हैं। कुछ और अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है.

2. सतह प्रकार्यात्मकन

  1. 0.1 एम एचईपीबफर (पीएच 7-9) के 40 एमएल में एक सल्फो-सानपाह अलीकोट के 80 डिग्री सेल्सियस को भंग करें।
    नोट: 2 एमएल बाँझ डाइमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में सल्फो-सैनपाह पाउडर के 100 मिलीग्राम को भंग करके सल्फो-सैनपाह एलिकोट्स तैयार करें। 450 एमएल बंध्याकरण deionized पानी में HEPES के 50 एमएल को कम करके 0.1 M HEPES बफर तैयार करें और 0ण्22m pores फिल्टर के माध्यम से फिल्टर करें।
  2. 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 200 डिग्री पतला सल्फो-सैनपाह घोल डालें।
  3. उचित दूरी और अवधि पर यूवी (300-460nm) प्रकाश के लिए प्लेट को उजागर.
    नोट: यूवी जोखिम के बाद, समाधान का रंग गहरा होना चाहिए। यूवी जोखिम दूरी और अवधि यूवी दीपक शक्ति पर निर्भर करते हैं। हमारे आवेदन में, हम 5 सेमी की दूरी पर 10-15 मिनट के लिए बेनकाब.
  4. कुओं से सल्फो-सैनपाह समाधान निकालें और प्रत्येक कूप के लिए 200 डिग्री सेल्सियस 5 ग्राम/एमएल फाइब्रोनेक्टिन समाधान जोड़ें।
    नोट: शोधकर्ता निर्दिष्ट प्रोटीन सतह कोटिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कुछ आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रोटीन कोलेजन, फाइब्रोनेक्टिन, और laminin हैं। हमने पाया है Sulfo-SANPAH सबसे प्रभावी तरीका है, और प्लाज्मा सफाई जबकि कभी कभी PDMS में रोजगार हतोत्साहित किया जाता है के रूप में यह एक सिलिकॉन डाइऑक्साइड परत बनाता है और जाहिरा तौर पर सतह नुकसान.
  5. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    नोट: विभिन्न ऊष्मायन विधियों कोटिंग के लिए इस्तेमाल किया प्रोटीन के आधार पर लागू किया जा सकता है।
  6. फाइब्रोनेक्टिन समाधान निकालें और प्रत्येक को फॉस्फेट-बफर्ड नमकीन (पीबीएस) के साथ दो बार अच्छी तरह से धो लें।
  7. नमूने पर एक ढक्कन रखें।
  8. प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस के 200 $L जोड़ें.
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है। फाइब्रोनेक्टिन लेपित नमूने 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।

3. यूवी नसबंदी

  1. 30 मिनट के लिए एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में यूवी प्रकाश के तहत नमूना बाँझ।
    नोट: लंबे समय तक यूवी जोखिम बार नकारात्मक मनका फ्लोरोसेंट को प्रभावित कर सकते हैं. सभी बाद के चरणों बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए.

4. सेल संस्कृति

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति मीडिया में निलंबित कोशिकाओं के 200 $L जोड़ें.
    1. वांछित सेल घनत्व पर कोशिकाओं प्लेट. कोशिका घनत्व वांछित प्रयोग पर निर्भर करता है। एकल सेल अध्ययन के लिए, कोशिकाओं के अलावा 50 डिग्री मीटर की न्यूनतम होना चाहिए और इमेजिंग विंडो के किनारों के पास कोशिकाओं TFM माप में शामिल नहीं किया जाना चाहिए. मोनोलेयर कोशिकाओं के लिए, इमेजिंग विंडो में कोशिकाओं की एक शंकु परत के साथ कवर देखने के क्षेत्र होना चाहिए।
    2. डीएमईएम के लिए पूर्ण विकास संस्कृति मीडिया को 5% एफबीएस, 10 एमएम हेप्स, 10 ग्राम/एमएल इंसुलिन, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1 एमएम एल-ग्लूटामाइन, और 0.5 ग्राम/
    3. अम्लीकृत जल में पुनर्गठन करके इंसुलिन स्टॉक तैयार करें (2.5 एमएल हिमनदीय ऐसीटिक अम्ल का 130 एमएल deionized पानी में) 10 मिलीग्राम/एमएल की सांद्रता के लिए। स्टॉक समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें। समाधान स्पष्ट होने तक प्रतीक्षा करें, और तब 0.22 m pores फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें.
  2. TGF-जेड अतिरिक्त
    1. TGF-जेड स्टॉक तैयार करने के लिए, 10 एमएम साइट्रिक अम्ल (पी एच 3-0) के 100 डिग्री एल में TGF-जेड के 2 डिग्री ग्राम को भंग करें और 0ण्22m pores के साथ स्टरलाइज़ करें। वांछित मात्रा में ट्यूब और aliquot भंवर. -80 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट ्स्वट ों।
    2. 3 एनजी/एमएल की अंतिम TGF-जेड सांद्रता के साथ सेल संस्कृति मीडिया का गठन करने के लिए पूर्ण सेल संस्कृति मीडिया के 10 एमएल के लिए TGF-जेड स्टॉक समाधान के 1.5 डिग्री एल जोड़ें।
      नोट: 10 म PH 3.0 साइट्रिक अम्ल बनाने के लिए, पानी में अम्ल को पतला करें तथा एचसीएल जोड़कर 3ण्0 को 3-0 में तृप्ति दें।

5. डेटा अधिग्रहण

  1. प्रत्येक स्थिति के लिए, प्रत्ययी कणों और कोशिकाओं के कम से कम एक छवि प्राप्त. मनका परत पर ध्यान दें.
    नोट: पिक्सेल आकार का इस्तेमाल किया जा रहा प्रत्ययी कणों और छवि प्रसंस्करण विधि के आकार के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस आवेदन में, लेखकों एक 10x 0.4 एनए उद्देश्य का उपयोग करें, और छवियों 1024 x 1024 संकल्प के साथ, 455 एनएम / सामान्य में, यह मनका प्रति कम से कम लगभग 1-5 पिक्सल का एक संकल्प बनाए रखने के लिए उपयोगी है; यहाँ, मोती polydisperse हैं और 300-500 एनएम के एक व्यक्तिगत आकार है. यह महत्वपूर्ण है कि फ्लोरोसेंट प्रत्ययी मोती छवियों के लिए ध्यान में हो TFM गणना के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. मनकों का फोकस और इमेजिंग गुणवत्ता को स्वयं कोशिकाओं को इमेजिंग पर प्राथमिकता दी जानी चाहिए। विभिन्न चैनलों के बीच कोई क्रॉस-टॉक नहीं होना चाहिए, विशेष रूप से किसी भी फ्लोरोसेंट नहीं प्रत्ययी मोती जो मोती के इमेजिंग स्पेक्ट्रम में प्रकट होता है से.
  2. एक बार ब्याज की सभी पदों दर्ज किया गया है, प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए टुकड़ी समाधान जोड़ने के लिए प्रत्ययी कणों के बल मुक्त संदर्भ छवियों को प्राप्त करने के लिए.
    1. सेल टुकड़ी समाधान तैयार करने के लिए, 2% TritonX-100, 50 m सोडियम azide, और 500 m पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड युक्त एक जलीय समाधान मिश्रण.
      नोट: इसके बाद के संस्करण एक प्रभावी टुकड़ी समाधान का एक उदाहरण के रूप में प्रदान की जाती है. शोधकर्ताओं के विवेक पर विभिन्न टुकड़ी समाधान सब्सट्रेट सतह से कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

6. छवि विश्लेषण

  1. वांछित के रूप में उचित छवि विश्लेषण प्रदर्शन.
    नोट: विश्लेषण सॉफ्टवेयर घर में विकसित किया गया था. छवि विश्लेषण कस्टम बनाया सॉफ्टवेयर या सॉफ्टवेयर ऑनलाइन उपलब्ध के साथ किया जा सकता है.

7. बीड संश्लेषण

नोट: निम्न प्रोटोकॉल क्लेन एट अल 10 द्वारावर्णित संश्लेषण विधि पर आधारित है।

  1. एक धूआं हुड के तहत, एक पानी ठंडा भाटा कंडेनसर के साथ तीन गर्दन फ्लास्क तैयार करते हैं।
    चेतावनी: एक अच्छी तरह से हवादार रासायनिक धूआं हुड में एक संश्लेषण सेट करें।
  2. फ्लास्क में पीडीएमएस स्टेबलाइजर और फ्लोरोफोर की 0.5 एमएल जोड़ें।
  3. एक गर्दन को एक रबर पट के साथ एक नाइट्रोजन इनलेट सुई और आउटलेट सुई के साथ लैस करें और दूसरी गर्दन को एक सिरिंज के साथ अभिकर्मक जोड़ने के लिए रबर पट से लैस करें।
  4. फ्लास्क में 250 एमएल में एनहाइड्रोस हेक्सेन के 100 एमएल जोड़ें और एक छोटा चुंबकीय हलचल बार जोड़ें।
  5. खनिज तेल स्नान में फ्लास्क को 75 डिग्री सेल्सियस पर रखें और इसे नाइट्रोजन गैस से 1 ज के लिए शुद्ध करें।
  6. एक 25 एमएल गोल नीचे फ्लास्क में 6 एमएल मेथिलेथमेथाक्रिलेट जोड़ें।
  7. गोल नीचे फ्लास्क के लिए 0.100 ग्राम 2,2'-azobisisobutyronitrile (AIBN) जोड़ें और 1 ज के लिए नाइट्रोजन गैस के साथ मिश्रण शुद्ध.
    नोट: उपयोग करने से पहले अवरोधकों को हटाने के लिए प्रीपैक्ड कॉलम के माध्यम से फ्लश मिथाइलेमेथाक्रिलेट। तीन गर्दन के फ्लास्क में मेथिलेमेथाक्रिलेट और एआईबीएन मिश्रण डालें।
  8. समाधान शुरू में बादल हो जाता है और दूधिया बदल जाता है। समाधान के बादल बनने के बाद अभिक्रिया को 3 ज तक चलने दें।
  9. 3 ज के बाद, एक बर्फ के पानी के स्नान में फ्लास्क जगह है.
  10. वैक्यूम मोटे फिल्टर कागज के साथ समाधान फिल्टर।
  11. छानना और हेक्सेन में कणों को फिर से निलंबित करें।
    नोट: जोड़ा जा करने के लिए हेक्साने की मात्रा मनका समाधान की वांछित एकाग्रता पर निर्भर करता है। Sonication हेक्सेन समाधान में मनका कणों के फिर से फैलाव की सुविधा. लेखकों द्वारा उत्पादित मोती लगभग 300-500nm के polydisperse व्यास है. विस्थापन निर्धारित करने के लिए क्रॉस-सहसंबंध पैटर्न ट्रैकिंग के उपयोग के कारण, मोनोडिफिकेस मोती की आवश्यकता नहीं है।

8. Rheology माप प्रोटोकॉल

नोट: Rheology प्रत्येक शोधकर्ता या प्रयोग के लिए आवश्यक नहीं है, लेकिन PDMS के नए योगों के लिए moduli मात्रा निर्धारित करने के लिए आवश्यक है. इस प्रोटोकॉल में, हम crosslinker, आवृत्ति, और PDMS नमूनों की moduli पर तनाव के प्रभाव को मापने के लिए एक कतरनी rheometer रोजगार. उपलब्ध उपकरणों और विशेषज्ञता के आधार पर, moduli भी कई अन्य यांत्रिक विश्लेषण दृष्टिकोण का उपयोग कर मापा जा सकता है. इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने वाले शोधकर्ता सारणी1, चित्र 3 और चित्र 4में प्रस्तुत हमारे प्रकाशित मॉडुली का उपयोग करने का चुनाव कर सकते हैं।

  1. एक 25 मिमी व्यास समानांतर प्लेट ज्यामिति के साथ एक rheometer का प्रयोग करें. अन्य geometries इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. प्रणाली शुरू और डिवाइस और मापने प्रणाली जांचना (समानांतर प्लेट, घ ] 25 मिमी). शून्य अंतर को मापने के बाद, PDMS नमूना लोड हो रहा है शुरू करते हैं.
  3. जैसे ही पीडीएमएस इलेस्टोमर और क्रॉसलिंकिंग एजेंट को मिलाया गया है, मिश्रण को रीमीटर की निचली प्लेट पर पाइप करें।
    1. पूरी तरह से PDMS नमूने के शीर्ष से संपर्क करने के लिए धुरी नीचे ले जाएँ.
    2. ध्यान से नीचे की थाली से भरी हुई नमूना अतिरिक्त ट्रिम।
  4. एक तनाव स्वीप परीक्षण में, बहुलक संरचना सभी कतरनी माप के दौरान रैखिक विस्कोलोचिक शासन में रहता है यह सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न crosslinking घनत्व के साथ प्रत्येक संरचना के लिए बढ़ती उपभेदों लागू होते हैं।
    नोट: कक्ष अध्ययन के लिए प्रासंगिक तनाव मान सामान्य रूप से 0.1-10% की श्रेणी में होते हैं. हम PDMS लगभग 100% तनाव के लिए रैखिक हो पाया है.
  5. 1 00 डिग्री सेल्सियस पर 1 हर्ट्ज की आवृत्ति और दोलनी कतरनी तनाव के साथ एक समय स्वीप परीक्षण में PDMS नेटवर्क के गतिशील कतरनी भंडारण मापांक (G'), और हानि मापांक (G$) को मापने।
  6. अंतिम PDMS नेटवर्क की विस्कोलोचता और समय निर्भरता निर्धारित करने के लिए, 0.1-100 हर्ट्ज और 0.5% की दोलन कतरनी तनाव से लेकर आवृत्ति के साथ एक आवृत्ति स्वीप परीक्षण लागू होते हैं।

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Representative Results

TGF-जेड के अलावा करने से पहले, कोशिकाओं के एक confluent monolayer आकार की तरह एक मोची पत्थर है और कसकर पैक किया जाता है. TGF-जेड उपचार पर, कोशिकाओं को और अधिक आकृति विज्ञान में लम्बी हो जाते हैं, सेल क्षेत्र का विस्तार और एक अधिक mesenchymal phenotype प्राप्त. नरम PDMS elastomers के साथ निर्मित बहु अच्छी तरह से डिवाइस का उपयोग, कुल 17 विभिन्न स्थितियों में कोशिकाओं के भौतिक गुणों का अध्ययन किया गया. कोशिकाओं को चार अलग-अलग टीजीएफ-जेड सांद्रता (0.5, 1, 2, और 4 एनजी/एमएल) और चार अलग-अलग ऊष्मायन समय (12, 24, 48, 96 ज) के साथ उपचारकिया गया और इन परिणामों को चित्र 5में संक्षेप किया गया। TGF-जेड के साथ इलाज कोशिकाओं TGF-जेड के बिना सुसंस्कृत कोशिकाओं की तुलना में बड़ा कर्षण तनाव और तनाव ऊर्जा लागू किया. 96 एच के लिए TGF-जेड के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं ने सबसे बड़ा कर्षण तनाव और तनाव ऊर्जा दिखाया। कोशिकाओं बड़ा तनाव और तनाव ऊर्जा लागू जब TGF की उच्च एकाग्रता के साथ इलाज किया-जेड. कर्षण और तनाव ऊर्जा में अंतर अब ऊष्मायन समय में अधिक अलग थे.

सब्सट्रेट की सतह को चिकनी और समान रूप से लिगंड के साथ लेपित होने की आवश्यकता होती है, जैसे कि फाइब्रोनेक्टिन या कोलेजन। खरोंच सतह और / या ligands के गैर वर्दी कोटिंग अनुचित सेल लगाव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, गलत कर्षण माप में जिसके परिणामस्वरूप. चित्र 6 गैर-समान सब्सट्रेट सतह के कारण स्थानीयकृत कर्षण तनावदर्शाते दर्शाता है।

Figure 1
चित्र 1 : बहु अच्छी तरह से प्लेट निर्माण का अवलोकन. (ए) एक कस्टम-कट ग्लास स्लाइड प्रारंभिक बिंदु है। (ख) कांच की स्लाइड को एक मोटी (पीडीएमएस की 100 डिग्री मी परत) से लेपित किया जाता है। (ग) प्रत्ययी मोतियों की एक परत (हरे रंग में दिखाया गया है) तो पिछले परत के शीर्ष पर एक $ 1 डिग्री मीटर मोटी परत में स्पिन लेपित हैं। (घ) बहु-कूप विभाजक को प्रत्ययी मनका परत के शीर्ष पर सावधानीपूर्वक रखा जाता है। (ई) पूर्ण बहु-वेल प्लेट को इकट्ठा किया जाता है और उपयोग या भंडारण के लिए तैयार किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : स्पिन-कोटर के लिए कस्टम चक। मानक स्पिन-कोटर चक के बंद उड़ान से नीचे कांच (जहां PDMS लेपित है) को रोकने के लिए, एक कस्टम बनाया धारक चक पर रखा गया है। (ए) स्पिन-कोटर चक के लिए एक कस्टम-निर्मित धारक। (बी) सभी आयामों के साथ धारक की इंजीनियरिंग ड्राइंग। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : क्रॉसलिंकर एकाग्रता (wt%) को बदलने के साथ कठोरता को घटाना। PDMS मिश्रण के रूप में वर्णित तैयार कर रहे हैं, अतिरिक्त crosslinker प्रतिशत के साथ लोचदार मापांक में वृद्धि जब तक 1.8 वजन प्रतिशत (wt%) पर 100 kPa की एक अधिकतम क्रॉसलिंकर. एक गाइड के रूप में, crosslinker के एक समारोह के रूप में मापांक रैखिक फिट है, जो शोधकर्ताओं द्वारा इस सीमा के भीतर एक विशेष वांछित मापांक पर अपने स्वयं के मिश्रण तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : 100 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर 0, 0.15, 0.36 और क्रॉसलिंक एजेंटों के 1 wt% युक्त पीडीएमएस इलेस्टोमर के Rheology। त्रिभुज प्रतीक हानि मापांक (G') इंगित करते हैं और वर्ग प्रतीकों भंडारण मापांक (G') इंगित करते हैं। (क) गेलेशन के दौरान 1 हर्ट्ज की आवृत्ति पर दोलनीय समय झाडू और 0.5% की कतरनी विकृति। (ख) 0.5% की कतरनी तनाव पर पीडीएमएस नेटवर्क की दोलन आवृत्ति स्वीप। (सी) 1 हर्ट्ज की आवृत्ति पर PDMS नेटवर्क के तनाव स्वीप. सभी डेटा अंक त्रि-बिंदु में प्राप्त किए गए थे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : प्रतिनिधि परिणाम बहु अच्छी तरह से प्रारूप के साथ कर्षण तनाव डिवाइस का उपयोग. विभिन्न स्थितियों में कोशिकाओं के मोनोलेयर को संकुचनता और तनाव ऊर्जा को मापने के लिए एक बहु-अच्छी डिवाइस में सुसंस्कृत किया गया था। (क) कर्षण का ग्राफ विभिन्न टीजीएफ-जेड सांद्रताओं के लिए टीजीएफ-जेड ऊष्मायन समय को बढ़ाने के साथ जोर देता है। ट्रैक्शन में वृद्धि के साथ TGF-जेड सांद्रता और ऊष्मायन समय में वृद्धि हुई है। नियंत्रण के संबंध में सभी डेटा सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण हैं (यानी, कोई TGF-जेड) निम्नलिखित को छोड़कर: 12 ज - 0.5 एनजी, 12 ज - 1 एनजी, 48 ज - 1 एनजी। (बी) विभिन्न TGF-जेड सांद्रता के लिए TGF-जेड ऊष्मायन समय में वृद्धि के साथ तनाव ऊर्जा का ग्राफ. तनाव ऊर्जा TGF-जेड सांद्रता और ऊष्मायन समय में वृद्धि के साथ वृद्धि हुई. नमूना आकार n से लेकर 7 से n तक 15. नियंत्रण के संबंध में सभी डेटा सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण हैं (यानी, कोई TGF- $) निम्नलिखित को छोड़कर: 12 ज - 0.5 एनजी, 12 ज - 1 एनजी, 24 ज - 0.5 एनजी, 24 ज - 1 एनजी, 48 ज - 1 एनजी। सांख्यिकीय महत्व Kruskal वालिस परीक्षण है, जो एक सामान्य वितरण ग्रहण नहीं करता का उपयोग कर निर्धारित किया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

Figure 6
चित्र 6 : एक उप इष्टतम से प्रतिनिधि परिणाम (ए, बी) और एक संतोषजनक (सी, डी) प्रयोग. (क) सब्सट्रेट सतह का परावर्तन प्रतिबिंब। अवांछित contaminants, जो धूल या फाइबर शामिल कर सकते हैं, या खरोंच जैसे सामग्री दोष सब्सट्रेट सतह पर मौजूद हैं. (बी) कोशिका संकुचन का तनाव मानचित्र: गैर-समान सतह के कारण, वस्तुओं के चारों ओर अनियमित और गलत कर्षण तनाव पाए जाते हैं। (सी) सब्सट्रेट सतह का प्रतिबिंब छवि. कोई स्पष्ट संदूषक दिखाई नहीं दे रहे हैं। (डी) सेल संकुचन के तनाव नक्शा: कोई कलाकृति discontinuities दिखाई दे रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

क्रॉसलिंकर एकाग्रता (wt%) जी' (पा) मानक विचलन ई (केपीए) मानक विचलन
0 0.135 0.014 0.405 0.043
0.15 1 0.1 3 0.35
0.36 4.027 0.245 12.081 0.73
0.75 16.01 0.49 48.03 १.२
1 18.44 0.989 55.32 1.94
1.5 27.638 0.93 82.91 1.64
1.8 33.986 0.88 101.94 1.088
२ 33.36 0.67 100.08 1.1

तालिका 1: क्रॉसलिंकर एकाग्रता (wt%) को बदलने के साथ कठोरता को घटाना। अतिरिक्त crosslinker सांद्रता बदलने से, वांछित युवा moduli के PDMS substrates गढ़े हैं. PDMS कतरनी moduli एक rheometer के साथ मापा गया और युवा moduli निर्धारित किया गया. प्रत्येक डेटा बिंदु के लिए, 3 स्वतंत्र तैयारी की गई और मानक विचलन दिया जाता है।

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Discussion

इस विधि की सफलता के लिए, यह लगभग 100 डिग्री की एक निरंतर मोटाई के साथ एक समान लेपित नमूना है करने के लिए महत्वपूर्ण है. ब्याज की जैविक प्रणाली के भौतिक महत्व की जांच करने के लिए मापांक को सावधानीपूर्वक चुना जाना चाहिए। जब एक शीर्ष परत fabricating, fiducial फ्लोरोसेंट कणों की एकाग्रता विस्थापन और कर्षण तनाव का सही विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. अलग-अलग एकल कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए एक सघन प्रत्ययी परत की आवश्यकता होती है, जो एक-दूसरे के मोनोलेयरों को मापने की तुलना में होती है। इसके अतिरिक्त, सब्सट्रेट की सतह में आसंजन अणुओं के स्थिर और समान कोटिंग होनी चाहिए जैसे कोलेजन, फाइब्रोनेक्टिन, और लेमिन नमन सभी स्तर की सतह पर कोशिकाओं के उचित लगाव को सुनिश्चित करने के लिए। बहु-वेल विभाजक संलग्न करते समय विशेष ध्यान रखा जाना चाहिए; यह संस्कृति की सतह पर smeared किया जा रहा से सील PDMS गोंद को रोकने के लिए फिसलने के बिना रखा जाना चाहिए, और बाहरी किनारे ध्यान से सीमा कुओं पर किसी भी लीक को रोकने के लिए कांच आयाम के साथ गठबंधन किया जाना चाहिए.

कुओं को लीक होने से रोकने के लिए, पीडीएमएस गोंद की पर्याप्त मात्रा को अच्छी तरह से विभाजित करने के लिए इसे जगह में रखने के लिए लागू करने की आवश्यकता है। हालांकि, अत्यधिक मात्रा का उपयोग सेल संस्कृति की सतह को कवर किया जाएगा.

स्पिन-कोटिंग प्रक्रिया के दौरान पीडीएमएस की पर्याप्त मात्रा को जोड़े जाने की आवश्यकता है। जब इलाज, ओवन और रैक के स्तर की जरूरत है. अपर्याप्त PDMS या एक unleveled ओवन असमान PDMS मोटाई के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.

मनका घनत्व उचित विश्लेषण के लिए अनुकूलित करने की जरूरत है. जब मनका घनत्व पर्याप्त नहीं है, प्रत्ययी PDMS मिश्रण में मोती की एकाग्रता को बढ़ाने की जरूरत है. इसके अतिरिक्त, मिश्रण की एक पर्याप्त राशि स्पिन कोटिंग के लिए जोड़ा जा करने की जरूरत है. प्रत्ययी मनका कणों के उचित फ्लोरोसेंट संकेतों को सुनिश्चित करने के लिए, इलाज की स्थिति को सावधानी से निगरानी की जानी चाहिए। लंबे समय तक और इस प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट लोगों की तुलना में उच्च तापमान फ्लोरोसेंट को नीचा कर सकता है। नमूने की सतह पर अनुचित प्रोटीन कोटिंग गरीब सेल आसंजन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसे रोकने के लिए, सतह को साफ करने की आवश्यकता है और सल्फो-सानपाह और लिगन्ड्स जैसे अभिकर्मकों की समाप्ति की जांच करने की आवश्यकता है। यूवी जोखिम समय और शक्ति अनुकूलित किया जाना चाहिए. इम्यूनोफ्लोरेसेंस या अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन निर्माण एक समान लिगेंड कोटिंग सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण किया जा सकता है।

इस विधि और पीडीएमएस योगों के सेट के साथ निर्मित डिवाइस केवल 0.4 केपीए से 100 केपीए तक यंग की मोडुली के साथ substrates के लिए लागू है। अन्य moduli वैकल्पिक योगों का उपयोग कर संभव हो सकता है, तथापि, वर्तमान रेंज शारीरिक रूप से प्रासंगिक मूल्यों का एक बड़ा सेट तक फैला है. हालांकि यह विधि बहु-वेल निर्माण के लिए विशेष रूप से है, यह भी अलग-अलग स्लाइड या अन्य स्लाइड geometries तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और इन उदाहरणों में आगे उपयोगकर्ता समस्या निवारण आवश्यक हो सकता है। इस अवतार में, एक अपेक्षाकृत मोटी (1 मिमी) कांच स्लाइड कार्यरत है, एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर आम उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) उद्देश्यों को रोक. हालांकि यह पतली गिलास का उपयोग कर इन बहु अच्छी तरह से TFM व्यंजन का निर्माण करने के लिए तकनीकी रूप से संभव है, प्रसंस्करण और विधानसभा में इन की कमजोरी टूटना की एक उच्च दर में परिणाम हो सकता है, और उच्च throughput दृष्टिकोण के विपरीत चला सकते हैं. इसके अलावा, सतह कोटिंग डिवाइस के व्यापक अनुप्रयोगों के लिए आगे की जांच की जा सकती है.

एक बहु अच्छी तरह से प्रारूप का उपयोग, उच्च throughput प्रयोगों संभव हो रहे हैं. मल्टी-वेल प्रारूप ने हमें एक ही डिश में विभिन्न सांद्रता और विभिन्न ऊष्मायन समय के संयोजन के साथ टीजीएफ-जेड उपचार के साथ EMT के दौरान NMuMG कोशिकाओं के भौतिक परिवर्तनों की जांच करने में सक्षम बना दिया। ऐसे polyacrylamide जेल के रूप में hydrogels के साथ कर्षण तनाव उपकरणों का निर्माण कई सीमाएं हैं. प्रमुख घटक पानी होने के साथ, hydrogels नमक सांद्रता के प्रति संवेदनशील हैं (osmolarity), तापमान, आर्द्रता, और पीएच परिवर्तन. इन गुणों में से किसी में परिवर्तन सामग्री के यांत्रिक गुणों में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, नमूनों का उपयोग कर और परिणामों की व्याख्या में अतिरिक्त देखभाल की आवश्यकता होती है. इसके अलावा, पानी होने, hydrogels संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, अतिरिक्त देखभाल की आवश्यकता होती है. जल-आधारित हाइड्रोगेल्स के विपरीत, सिलिकॉन-आधारित पीडीएमएस स्थिर और निष्क्रिय है। एक बार गढ़े, यह किसी भी विशेष हैंडलिंग या भंडारण की स्थिति की आवश्यकता के बिना अनिश्चित काल के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है.

PDMS की अपारगम्य प्रकृति हमें एक अखंड सब्सट्रेट बनाने के लिए अनुमति देता है, यह सुनिश्चित करना है कि सभी कुओं सब्सट्रेट मोटाई और संरचना में सही मायने में समान हैं, जबकि अद्वितीय जैव रसायन मीडिया में लागू किया जा करने की अनुमति, या विभिन्न कोशिकाओं को प्रत्येक में उपयोग किया जा करने के लिए अच्छा. एक hydrogel आधारित सतह diffusive कारकों को व्याप्त करने के लिए और इसके माध्यम से यात्रा करने की अनुमति देता है, कुओं कि अन्यथा पार संदूषण को रोकने के लिए विभाजित कर रहे हैं करने के लिए hydrogel जोड़ने की आवश्यकता.

इस विधि शोधकर्ताओं सेल संकुचन, सेल जीव विज्ञान के एक बुनियादी और सर्वव्यापी पहलू का अध्ययन करने की अनुमति देता है, एक उच्च throughput तरीके से, और अधिक कुशल और reproduible डेटा अधिग्रहण को सक्षम करने. यह संकुचन बल स्क्रीनिंग में ट्रैक्शन फोर्स माइक्रोस्कोपी का अनुवाद करने में मदद करता है, जिससे शोधकर्ताओं को सेल गतिविधि के लिए एक मीट्रिक के रूप में संकुचन का सही मायने में उपयोग करने की अनुमति मिलती है, या एक यौगिक की प्रभावकारिता। एक पद्धति के रूप में, यह जैव भौतिक और जैव चिकित्सा विज्ञान भर में व्यापक आवेदन किया है, कोशिकाओं के भौतिकी को समझने से, विशेषता और मानकीकृत सेल प्रकार के खिलाफ दवा यौगिकों का परीक्षण करने के लिए, या शायद अत्यधिक विशेष व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए अलग-अलग कोशिकाओं।

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Disclosures

AJE और आर के लाइव सेल टेक्नोलॉजीज, एक कंपनी है जो इस लेख में वर्णित सामग्री fabricates में रुचि है.

Acknowledgments

लेखकों टॉम Kodger, माइकल Landry, और क्रिस्टोफर जे Barret मनका संश्लेषण के साथ सहायता के लिए धन्यवाद. A.J.E. स्वीकार करता है प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद अनुदान RGPIN/05843-2014 और EQPEQ/472339-2015, कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान अनुदान के संस्थानों अनुदान संख्या 143327, कनाडा कैंसर सोसायटी अनुदान संख्या 703930, और अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन परियोजना #32749. आर. कृष्णन ने राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान को स्वीकार किया। R21HL123522 और R01HL136209. H.Y. Fonds de recherche Sant] कुबेक, और Fonds de recherche प्रकृति एट टेक्नोलॉजीज कुबेक द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक वीडियो और पांडुलिपि के साथ सहायता के लिए Johanan Idicula धन्यवाद और वीडियो तैयार करने में सहायता के लिए zixin वह.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plate
GEL-8100 Nusil Technology GEL-8100 High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit
Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG curing agent
Custom Cut Glass  Hausser Scientific Company 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness
Target 2TM Nylon Syringe Filter ThermoFisher Scientific F2513-4
96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder Corning 2572
Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch  Corning 3099
Ethyl alcohol Greenfield Global P016EA95 0.95
2-Propanol Sigma-Aldrich 190764 ACS reagent, ≥99.5%
Surface Coating
Sulfo-SANPAH Crosslinker Proteochem c1111-100mg
Fibronectin bovine plasma Sigma-Aldrich F1141-1MG solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
PBS, 1X Wisent 319-005-CL pH 7.4, without calcium and magnesium
DMSO Sigma-Aldrich 472301
Cell Culture
DMEM, 1X Wisent 319-005-CL 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red
FBS (Fetal Bovine Serum) Wisent 080-150 Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25
HEPES Wisent 330-050-EL 1M, free acid
Human Insulin Recombinant Wisent 511-016-CM USP grade
Penicillin-Streptomycin Solution Wisent 450-201-EL 100 X, sterile filtered for cell culture
L-Glutamine solution Wisent 609-065-EL 200mM solution, sterile filtered for cell culture
Amphotericine B Wisent 450-105-QL 250μg/ml, sterile filtered for cell culture
Recombinant Human TGF-β1 Peprotech 100-21 HEK293 Derived
Acetic acid Sigma-Aldrich 537020 Glacial, ≥99.85%
Cictric acid Sigma-Aldrich 251275  ACS reagent, ≥99.5%
NMuMG ATCC CRL-1636 Mouse Mammary Gland Cell Line
Sodium azide Fisher Schientific AC190385000 99%, extra pure, ACROS Organics
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 221473 ACS reagent, ≥85%, pellets
TritonX-100 Sigma-Aldrich X100 laboratory grade
Bead Synthesis
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) Sigma-Aldrich  468495-100MG 97%
Methyl methacrylate Sigma-Aldrich  M55909-500ML contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99%
Inhibitor Remover Sigma-Aldrich  306312-1EA Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone
Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane Gelest  DMS-R31 (25,000g/mol) Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt
2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) Sigma-Aldrich  441090-25G 98%
Hexane  Sigma-Aldrich  296090-2L anhydrous, 95%
Hexane, mixture of isomers Sigma-Aldrich  227064-1L anhydrous, ≥99%
Whatman qualitative filter paper, Grade 1 Sigma-Aldrich  WHA1001055 circles, diam. 55 mm,
Equipment
Laurell WS-650Mz-23NPPB Laurell Technologies
UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 VWR 21474-622
Rheometer Anton Paar MCR 302 WESP

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References

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उच्च थ्रूपुट ट्रैक्शन फोर्स माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके Epithelial-to-Mesenchymal संक्रमण पर परिवर्तन विकास फैक्टर-जेड के खुराक-निर्भर प्रभाव का पता चलता है
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Yoshie, H., Koushki, N., Molter, C., Siegel, P. M., Krishnan, R., Ehrlicher, A. J. High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-β on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition. J. Vis. Exp. (148), e59364, doi:10.3791/59364 (2019).

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