Summary
Vi presentiamo un saggio di forza di trazione ad alta velocità di trazione fabbricato con gomma in silicone (PDMS). Questo nuovo test è adatto per studiare i cambiamenti fisici nella contrattilità cellulare durante vari processi e malattie biologiche e biomediche. Dimostriamo l'utilità di questo metodo misurando un aumento dipendente dal TGF e dalla contrattilità durante la transizione epiteliale-mesenchymal.
Abstract
La contrattilità cellulare è essenziale in diversi aspetti della biologia, guidando processi che vanno dalla motilità e divisione, alla contrazione dei tessuti e alla stabilità meccanica, e rappresenta un elemento fondamentale della vita animale multicellulare. Nelle cellule aderenti, la contrazione acto-miosina è osservata nelle forze di trazione che le cellule esercitano sul loro substrato. La disregolazione della contrattilità cellulare appare in una miriade di patologie, rendendo la contrattilità un obiettivo promettente in diversi approcci diagnostici utilizzando la biofisica come metrica. Inoltre, nuove strategie terapeutiche possono essere basate sulla correzione dell'apparente malfunzionamento della contrattilità cellulare. Queste applicazioni, tuttavia, richiedono la quantificazione diretta di queste forze.
Abbiamo sviluppato la microscopia a forza di trazione basata su elastomeri in silicone (TFM) in un formato multi-well parallelizzato. Il nostro uso di gomma in silicone, in particolare polidimetilsiloxane (PDMS), piuttosto che la poliacrilammide idrogel comunemente impiegata (PAA) ci permette di fare substrati robusti e inerti con una durata di conservazione indefinita che non richiede condizioni di stoccaggio specializzate. A differenza degli approcci basati su pillar-PDMS che hanno un modulo nella gamma GPa, il PDMS qui utilizzato è molto conforme, che vanno da circa 0,4 kPa a 100 kPa. Creiamo una piattaforma ad alta velocità per TFM partizionando questi grandi substrati monolitici spazialmente in pozzi biochimicamente indipendenti, creando una piattaforma multi-bene per lo screening della forza di trazione che è compatibile con i sistemi multi-well esistenti.
In questo manoscritto, utilizziamo questo sistema di forza di trazione multi-bene per esaminare la transizione epitelica a mesenchymica (EMT); induciamo EMT nelle cellule NMuMG esponendole al TGF-z e per quantificare i cambiamenti biofisici durante EMT. Misuriamo la contrattilità in funzione della concentrazione e della durata dell'esposizione al TGF- I nostri risultati qui dimostrano l'utilità della TFM parallelizzata nel contesto della biofisica della malattia.
Introduction
La contrattilità dell'acto-miosina è un elemento essenziale della meccanica delle cellule attive, influenzando i comportamenti delle cellule dalla motilità e la proliferazione alla differenziazione delle cellule staminali. Nei tessuti, la contrattilità determina l'attività dalla separazione polare nell'embriogenesi, alla costrizione delle vie aeree e all'attività cardiaca. Fondamentalmente, per generare tensione, le cellule devono prima aderire al loro ambiente extracellulare. In questo modo, questa contrattilità genera forze di trazione sull'ambiente circostante. La microscopia a forza di trazione (TFM) è emersa in una moltitudine di forme come un modo per quantificare queste forze da diverse cellule in diverse condizioni.
Il campo della TFM ha visto un'eccezionale ampiezza di innovazione e applicazione, e i risultati hanno aperto la strada a nuove prospettive in biologia, che incorporano la meccanica e le forze fisiche. A partire da substrati di silicone rugosa1, i ricercatori hanno applicato varie tecniche per misurare le forze di trazione cellulare. Questi approcci sono stati continuamente migliorati e hanno ora raggiunto un livello di risoluzione dell'ordine di diversi micron2. Tuttavia, è emerso un problema principale, che è la difficoltà di creare substrati di moduli opportunamente bassi utilizzando i siliconi disponibili. Per aggirare questo problema, la poliacrilammide è stata adottata in sostituzione grazie alla facilità di creazione di substrati nell'ordine di 1-20 kPa3. Recentemente abbiamo implementato siliconi moltoconformi in TFM 4, permettendoci di fabbricare la stessa gamma di moduli come poliacrilammide, ma con i vantaggi di silicone inerte e robusto.
Gli approcci TFM hanno permesso preziose scoperte meccano-biologiche, tuttavia, una persistente carenza è la loro complessità, spesso limitandone l'uso ai ricercatori nelle discipline ingegneristiche o scienze fisiche. Ciò è dovuto in gran parte alle calibrazioni dettagliate e ai calcoli impegnativi necessari per quantificare la contrattilità. Un'altra sfida significativa è che i metodi TFM sono in gran parte a bassa velocità effettiva e quindi inadatti a studiare molte condizioni diverse o popolazioni contemporaneamente5. Ciò ha presentato un collo di bottiglia, che ha ostacolato il trasferimento di TFM da un'impostazione di biofisica specialistica in applicazioni biologiche e farmacologiche più ampie.
Recentemente abbiamo sviluppato una piastra TFM multi-bene, che consente ai ricercatori di parallelizzare le loro misurazioni TFM per una più rapida quantificazione delle metriche di contrattilità, esplorando l'impatto di diversi composti e utilizzando anche meno reagenti4 . Questa metodologia ha un'ampia utilità in diversi studi di meccanobiologia, dalla valutazione degli effetti dei composti sull'attività cellulare, alla quantificazione dei cambiamenti contrattuali nella differenziazione o nella malattia.
Un'area di ricerca biomedica che trarrà grande beneficio dalla TFM è lo studio di come i segnali fisici influenzano i fenotipi maligni delle cellule tumorali. La metastasi, responsabile del 90% dei decessi correlati al cancro, è caratterizzata da cellule cancerose che lasciano il loro sito tumorale originale e colonizzano un sito secondario. Affinché le cellule migrano attraverso i tessuti e passino dentro e fuori dal sistema vascolare, devono cambiare radicalmente le loro forme per spremere attraverso queste barriere fisiche, generando forze sostanziali per muoversi lungo la matrice extracellulare o spostarsi tra gli altri Cellule. Queste forze vengono trasmesse al substrato attraverso interazioni di adesione focale2,3e possono essere quantificate utilizzando TFM. Mentre i tumori sono biochimicamente eccezionalmente diversi, con un repertorio in espansione di mutazioni note e cambiamenti proteici, sono stati osservati alcuni cambiamenti fisici comuni; in una varietà di tumori, tra cui il seno, la prostata e i tumori polmonari, le cellule metastatiche hanno dimostrato di esercitare 2-3 volte le forze di trazione delle cellule non metastatiche6,7,8. Questi risultati suggeriscono che ci può essere una forte correlazione tra la progressione metastatica e le forze di trazione esercitate dalle cellule; tuttavia, i cambiamenti dettagliati dipendente dal tempo nella contrattilità sono difficili da esaminare.
La transizione epiteliale-mesenchica (EMT) è un processo attraverso il quale le cellule riducono l'adesione mediata cellulare-aderente e a giunzione stretta, diventando più migratoria e invasiva. Oltre alle funzioni fisiologiche che includono la guarigione delle ferite e i processi di sviluppo, EMT è anche un processo sfruttato durante la metastasi, rendendolo un utile sistema modello per studiare questo processo. Utilizzando il TGF-z, possiamo indurre l'EMT nelle cellule epiteliali mammarie murine (NMuMG)9 a quantificare direttamente i cambiamenti fisici durante questa trasformazione e a caratterizzare gli effetti dipendenti dal tempo e dalla dose del TGF- su EMT e sulla contratcietà cellulare. In questo articolo viene illustrata l'utilità di questo approccio misurando i cambiamenti nella contrattilità durante un EMT indotto.
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Protocol
NOTA: Il seguente protocollo guiderà i ricercatori nella fabbricazione e nell'utilizzo del piatto TFM multi-bene illustrato nella Figura 1.
1. Preparazione dei substrati in silicone PDMS
- Preparazione della miscela di gomma in silicone PDMS basata su una miscela composita composta di due kit disponibili in commercio.
- Aggiungere la parte A e la parte B del kit PDMS (ad esempio, GEL-8100, vedere la Tabella dei materiali) in un rapporto di peso 1:1 nel tubo da 50 mL.
NOTA: La miscela viene miscelata su un rotatore ad una velocità sufficientemente lenta da far scorrere la miscela avanti e indietro durante la rivoluzione per garantire una miscelazione completa. - Aggiungere la quantità necessaria di agente di stagionatura per il modulo desiderato del substrato.
NOTA: La quantità di agente di cura da aggiungere alla miscela dipende dal modulo desiderato del substrato e può in genere variare da 0,1% a 1,8%. Fare riferimento alla tabella 1 e alla figura 3 per una guida a specifiche concentrazioni di crosslinker e ai moduli risultanti. - Mescolare la formulazione sul rotatore per 30-45 min; garantire che la rotazione sia abbastanza lenta per una miscelazione accurata.
- Aggiungere la parte A e la parte B del kit PDMS (ad esempio, GEL-8100, vedere la Tabella dei materiali) in un rapporto di peso 1:1 nel tubo da 50 mL.
- Strato inferiore: rivestimento PDMS substrati sul vetrino di vetro
- Posizionare il mandrino personalizzato illustrato in Figura 2 sullo spin-coater. Pulire il bicchiere con etanolo o isopropanolo e asciugarlo con una salvietta senza lafone. Posizionare il vetrino di vetro nel mandrino e accendere il vuoto per tenere il vetrino in posizione.
- Applicare PDMS non curato a circa 1 cm dai bordi e lavorare verso il centro. Applicare abbastanza PDMS (3-4 mL) per garantire che l'intera superficie sarà coperta.
NOTA: Per garantire che il PDMS sia distribuito uniformemente sulla superficie del vetro, una punta pipetta può essere utile per diffondere la miscela PDMS dal centro ai bordi. - Girare il vetro con la miscela PDMS su uno spin-coater con il seguente protocollo.
- Per diffondere il PDMS non curato sul vetrino, accelerare a 50 rpm/s da 0 a 200 giri/min; tenere a 200 rpm per 1 min.
- Per ottenere uno strato PDMS spesso 100 m, accelerare a 50 giri/s a 300 giri/mm e tenere per 1 min a 300 rpm. Diversi spessori desiderati diversi da 100 m richiedono valori di velocità specifici.
- Per rimuovere, decelerare a 50 rpm/s a 0 rpm. Disattivare il vuoto e rimuovere il vetrino rivestito, facendo attenzione a non toccare la superficie rivestita.
NOTA: È importante includere le fasi di accelerazione e decelerazione per garantire una superficie continua liscia.
AVVISO: Per garantire che il campione non voli fuori dal mandrino, il supporto su misura deve essere utilizzato per tenere il vetrino, e non fare affidamento semplicemente sul vuoto e sul mandrino piatto esistente. I dettagli e le specifiche di questo titolare sono riportati nella figura 2.
- Mettere il campione rivestito a spin in forno alla temperatura raccomandata dal produttore (100 gradi centigradi) per 2 ore.
NOTA: La superficie del forno in cui è posizionato il campione deve essere solida (cioè, non un rack di filo) e la superficie di livello per garantire il riscaldamento uniforme e lo spessore del campione. Una lastra in ceramica o in acciaio è una superficie ideale.
- Strato di perline superiore
- Aggiungere la soluzione di perline nel rapporto appropriato alla miscela PDMS rimanente.
NOTA: Questo rapporto dipende dalla concentrazione della soluzione di perline di riserva e dalla densità di perline desiderata sul campione. I valori finali tipici sono 9,2 x 1011 perline/mL e 0,05-0,2 perline/m2, e un eccesso di perline è generalmente preferibile a una quantità inadeguata. - Mescolare la soluzione di perline con il PDMS non curato. Questo può essere fatto posizionando il tubo su un rotatore per circa 30 min, vortice per 1-2 min, o sonicazione per 30 min. Questi metodi possono essere combinati.
NOTA: Nella nostra applicazione, troviamo che la sonicazione è efficace nel rompere gli aggregati di perline, e la rotazione è efficace nella miscelazione. Perline fiduciarie sintetizzate possono aggregarsi in magazzino. Prima dell'uso, possono essere risospesi in esasta e sonicati. Se ci sono aggregati di grandi dimensioni significativi, si può filtrare la sospensione del tallone attraverso un filtro di siringa da 5 m. Questa fase di filtrazione è facoltativa; aiuta a rivestire il campione con perline monodisperse, ma una frazione significativa di perline può essere persa nel filtro. - Togliere lo scivolo dal forno, lasciare raffreddare a temperatura ambiente e posizionarlo sullo spin-coater.
- Aggiungere 3-4 mL del tallone e la miscela PDMS non curata sulla superficie del campione rivestito.
NOTA: La miscela con perline aggiunte è meno viscosa a causa dell'esano. Assicurarsi di non toccare la superficie del substrato in quanto potrebbe danneggiare il substrato PDMS già rivestito. Inoltre, la miscela di perline può inizialmente non bagnato la superficie; assicurarsi che la miscela non scorra immediatamente dalla superficie del PDMS curata. - Ruotare l'esempio con il protocollo seguente.
- Per diffondere la miscela di perline e PDMS non curata, accelerare a 100 rpm/s da 0 a 500 giri/min; tenere a 500 rpm per 1 min.
- Per ottenere un sottile strato di PDMS incorporato in perline (1 m), accelerare a 200 rpm/s da 500 a 5000 rpm; tenere a 5000 rpm per 10 s.
- Per rimuovere, decelerare a 100 rpm/s a 0 rpm. Disattivare il vuoto e rimuovere il vetrino rivestito, facendo attenzione a non toccare la superficie rivestita.
- Mettete il campione rivestito a spin in forno a 100 gradi per 1 h.
NOTA: Le temperature superiori a 100 o durate superiori a 1 h possono ridurre la fluorescenza del tallone. Assicurarsi che la temperatura del forno sia impostata su 100 gradi centigradi e non superiore. - Il protocollo può essere messo in pausa qui. Per conservare il campione, coprire la superficie per evitare la polvere e l'esposizione alla luce. Assicurarsi che nulla tocchi la superficie. Il campione è stabile a temperatura locale a tempo indeterminato.
- Aggiungere la soluzione di perline nel rapporto appropriato alla miscela PDMS rimanente.
- Assemblaggio della piastra
- Aggiungere la parte A (base) e la parte B (agente di polimeraggio, ad esempio Sylgard) di un kit di elastomeri PDMS in un rapporto di peso 10:1 nel tubo da 50 mL.
- Mescolare il composto sul rotatore per 30-45 min.
NOTA: Per una piastra, mescolare 5 mL di base con 0,5 mL di agente di polimerità. Fino a 1 mL di esagonale può essere aggiunto per ridurre la viscosità della miscela. - Applicare la miscela sul fondo del divisore e stendere la miscela.
NOTA: Il divisore deve essere posizionato capovolto. - Appoggiare il substrato sul divisore capovolto.
- Mettete il campione a testa in giù in forno a 65 gradi centigradi per 2 ore.
- Estrarre i campioni dal forno e pulire il fondo del vetro con 70% di etanolo o isopropanolo per rimuovere eventuali residui PDMS.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Per conservare il campione, posizionare un coperchio sul substrato e avvolgere il dispositivo in un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce. Il campione è stabile a temperatura locale a tempo indeterminato. Il divisore utilizzato in questo metodo è in un formato di 96 po' ; tuttavia, i ricercatori possono impiegare altri formati (384-bene, 2-bene, 4-bene, 8-bene, ecc)) a seconda delle configurazioni di esperimento desiderate e la disponibilità di strutture divisorie. Potrebbe essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione.
2. Funzionalizzazione delle superfici
- Dissolvere 80 - L di un Sulfo-SANPAH in 40 mL di buffer HEPES da 0,1 M (pH 7-9).
NOTA: Preparare l'aliquota Sulfo-SANPAH sciogliendo 100 mg di polvere Sulfo-SANPAH in 2 mL di zolfo didimetilo sterile (DMSO). Preparare il buffer HEPES da 0,1 M diluindo 50 mL di HEPES in 450 mL di acqua sterile e filtrare attraverso un filtro poroso da 0,22 m. - Aggiungere 200 l di soluzione Sulfo-SANPAH diluita ad ogni pozzo della piastra di 96 pozze.
- Esporre la piastra alla luce UV (300-460nm) a distanza e durata appropriate.
NOTA: dopo l'esposizione ai raggi UV, il colore della soluzione deve essere più scuro. La distanza e la durata dell'esposizione ai raggi UV dipendono dalla potenza della lampada UV. Nella nostra applicazione, esponiamo per 10-15 min ad una distanza di 5 cm. - Togliere la soluzione Sulfo-SANPAH dai pozzetti e aggiungere a ogni pozzo 200 -L di 5 g/mL di fibronectina.
NOTA: La proteina specificata dal ricercatore può essere utilizzata per il rivestimento superficiale. Alcune proteine comunemente utilizzate sono collagene, fibronectina, e laminina. Abbiamo trovato Sulfo-SANPAH per essere il metodo più efficace, e la pulizia del plasma mentre a volte impiegando in PDMS è scoraggiato in quanto crea uno strato di biossido di silicio e danneggia visibilmente la superficie. - Incubare la piastra a 4 gradi durante la notte.
NOTA: Diversi metodi di incubazione possono essere applicati a seconda della proteina utilizzata per il rivestimento. - Rimuovere la soluzione di fibronectina e lavare ogni pozzo con la salina (PBS) con buffer fosfato due volte.
- Posizionare un coperchio sul campione.
- Aggiungere 200 l di PBS ad ogni pozzo.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. I campioni rivestiti di fibronectina possono essere conservati a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 settimane.
3. sterilizzazione UV
- Sterilizzare il campione sotto la luce UV in un armadietto di sicurezza biologico per 30 min.
NOTA: tempi di esposizione UV più lunghi possono avere un impatto negativo sulla fluorescenza del tallone. Tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti in condizioni sterili.
4. Cultura cellulare
- Rimuovere il PBS da ogni pozzo e aggiungere 200 l di celle sospese nei supporti di coltura ad ogni pozzo.
- Piastrare le celle alla densità di cellule desiderata. La densità cellulare dipende dall'esperimento desiderato. Per gli studi a cella singola, le cellule devono essere distanti almeno 50 m e le cellule vicine ai bordi della finestra di imaging non devono essere incluse nella misurazione TFM. Per le cellule monostrato, la finestra di imaging deve avere il campo di visualizzazione coperto con uno strato confluente di cellule.
- Preparare la coltura completa per le cellule NMuMG integrando DMEM con 5% FBS, 10 mHE HEPES, 10 anamporterine b, 1% penicillina-streptomycin, 1 mM L-glutamine e 0,5 g/mL di anforcume b.
- Preparare lo stock di insulina ricostituito in acqua acidificata (2,5 mL di acido acetico glaciale in 130 mL di acqua deionizzata) a una concentrazione di 10 mg/mL. Conservare la soluzione di stock a 4 gradi centigradi. Attendere che la soluzione sia chiara, quindi filtrare attraverso un filtro poro s 0,22 m.
- Aggiunta TGF-z
- Per preparare lo stock di TGF-z, sciogliere di 2 g di TGF-z in 100 -L di 10 mM di acido citrico (pH 3,0) e sterilizzare il filtro con 0,22 m di pori. Vorticare il tubo e aliquota nei volumi desiderati. Conservare gli aliquote a -80 gradi centigradi.
- Aggiungete 1,5 l di soluzione azionaria tGF-z a 10 mL del supporto di coltura cellulare completo per costituire i supporti di coltura cellulare con la concentrazione finale di TGF-z di 3 ng/mL.
NOTA: Per fare 10 mM pH 3.0 acido citrico, diluire l'acido in acqua e regolare il pH a 3.0 aggiungendo HCl.
5. Acquisizione dati
- Per ogni posizione, acquisire almeno un'immagine di particelle fiduciarie e cellule. Concentrati sullo strato di perline.
NOTA: le dimensioni dei pixel devono essere ottimizzate in base alle dimensioni delle particelle fiduciarie e al metodo di elaborazione delle immagini utilizzato. In questa applicazione, gli autori utilizzano un obiettivo 10x 0.4 NA e le immagini vengono acquisite con risoluzione 1024 x 1024, con 455 nm/pixel. In generale, è utile mantenere una risoluzione di almeno 1-5 pixel per tallone; qui, le perline sono polidisperse e hanno una dimensione individuale di 300-500 nm. È fondamentale che le perle fiduciarie fluorescenti siano a fuoco per le immagini da utilizzare per i calcoli TFM. La qualità di messa a fuoco e di imaging delle perline dovrebbe essere prioritaria rispetto all'imaging delle cellule stesse. Non ci dovrebbe essere alcun dialogo incrociato tra i diversi canali, in particolare qualsiasi fluorescenza non dalle perline fiduciarie che appare negli spettri di imaging delle perline. - Una volta registrate tutte le posizioni di interesse, aggiungere una soluzione di distacco ad ogni pozzo per acquisire immagini di riferimento senza forza delle particelle fiduciarie.
- Per preparare la soluzione di distacco delle celle, mescolare una soluzione acquosa contenente 2% TritonX-100, 50 mM di azie di sodio e 500 mM di idrossido di potassio.
NOTA: quanto sopra è fornito come esempio di una soluzione di distacco efficace. Diverse soluzioni di distacco a discrezione dei ricercatori possono essere utilizzate per staccare le cellule dalla superficie del substrato.
- Per preparare la soluzione di distacco delle celle, mescolare una soluzione acquosa contenente 2% TritonX-100, 50 mM di azie di sodio e 500 mM di idrossido di potassio.
6. Analisi dell'immagine
- Eseguire l'analisi dell'immagine appropriata come desiderato.
NOTA: il software di analisi è stato sviluppato internamente. L'analisi delle immagini può essere effettuata con software o software su misura disponibili online.
7. Sintesi di perline
NOTA: Il seguente protocollo si basa sul metodo disintesi descritto da Klein et al.
- Sotto un cofano a fumi, preparare il flacone a tre colli con un condensatore di reflusso raffreddato ad acqua.
AVVISO: Impostare una sintesi in una cappa di fumi chimici ben ventilata. - Aggiungere al flacone 0,5 mL di stabilizzatore PDMS e fluoroforo.
- Equipaggiare un collo con un setto di gomma con un ago di azoto in sella e un ago di uscita e dotare l'altro collo con un setto di gomma per aggiungere reagente con una siringa.
- Aggiungere 100 mL di anidrioe esano in 250 mL al pallone e aggiungere una piccola barra magnetica di stiro.
- Collocare il pallone nel bagno di olio minerale a 75 gradi centigradi e purificarlo con gas di azoto per 1 ora.
- Aggiungere 6 mL di metilmethacryla a un pallone rotondo rotondo da 25 mL.
- Aggiungere al flacone del fondo rotondo 0,100 g di 2,2'-azobisobutyronitrile (AIBN) al flacone inferiore rotondo ed eliminare la miscela con gas di azoto per 1 h.
NOTA: Sciacquare il metilamethacrylato attraverso la colonna preconfezionata per rimuovere gli inibitori prima dell'uso. Aggiungere il metilamethacrita e la miscela AIBN al flacone a tre colli. - La soluzione inizialmente diventa torbida e diventa lattiginosa. Lasciare che la reazione venga eseguita per 3 h dopo che la soluzione diventa torbida.
- Dopo 3 h, mettere il pallone in un bagno d'acqua ghiacciata.
- Filtrare a vuoto la soluzione con carta da filtro grossolana.
- Centrifugare il filtrato e ri-sospendere le particelle in esano.
NOTA: Il volume dell'esano da aggiungere dipende dalla concentrazione desiderata della soluzione di perline. La sonicazione facilita la ridispersione delle particelle di perline nella soluzione exane. Perline prodotte dagli autori hanno diametri polidisperso di circa 300-500nm. A causa dell'uso del tracciamento del modello di correlazione incrociata per determinare gli spostamenti, non sono necessarie perline monodisperse.
8. Protocollo di misurazione della reologia
NOTA: La reologia non è necessaria per ogni ricercatore o esperimento, ma è necessario quantificare la moduliper nuove formulazioni di PDMS. In questo protocollo, impieghiamo un reometro di taglio per misurare gli effetti del linker incrociato, della frequenza e della tensione sulla moduli di campioni PDMS. A seconda degli strumenti e delle competenze disponibili, i moduli possono anche essere misurati utilizzando molti altri approcci di analisi meccanica. Inoltre, i ricercatori che utilizzano questo protocollo possono scegliere di utilizzare il nostro modulista pubblicato presentato nella tabella 1, Figura 3 e Figura 4.
- Utilizzare un reometro con una geometria a piastre parallele di 25 mm di diametro. È possibile utilizzare altre geometrie.
- Inizializzare il sistema e calibrare il dispositivo e il sistema di misura (piastra parallela, d - 25 mm). Dopo aver misurato lo spazio zero, iniziare a caricare il campione PDMS.
- Non appena il clammaero PDMS e l'agente crosslinking sono stati mescolati, pinnare la miscela sulla piastra inferiore del reometro.
- Spostare il mandrino verso il basso per contattare completamente la parte superiore del campione PDMS.
- Tagliare con attenzione l'eccesso di campione caricato dalla piastra inferiore.
- In un test di sweep di deformazione, applicare ceppi crescenti per ogni composizione con densità di interconnessione diversa per garantire che la struttura polimerica rimanga nel regime viscoelastico lineare durante tutte le misurazioni di taglio.
NOTA: I valori di deformazione rilevanti per gli studi sulle cellule sono in genere compresi nell'intervallo di 0,1-10%. Abbiamo scoperto che pdMS è lineare fino a circa il 100% di deformazione. - Misurare il modulo di taglio dinamico (G') e il modulo di perdita (G) della rete PDMS in un test di sweep del tempo con una frequenza di 1 Hz e ceppo di taglio oscillatorio dello 0,5% a 100 gradi centigradi.
- Per determinare la viscosità e la dipendenza dal tempo della rete PDMS finale, applicare un test di sweep di frequenza con frequenza compresa tra 0,1 e 100 Hz e una deformazione oscillatoria di taglio dello 0,5%.
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Representative Results
Prima dell'aggiunta del TGF-z, un monostrato confluente di cellule ha una forma simile a un ciottolo ed è strettamente imballato. Dopo il trattamento con il TGF-z, le cellule diventano più allungate in morfologia, allargando l'area cellulare e acquisendo un fenotipo più mesenchymal. Utilizzando il dispositivo multi-bene fabbricato con elastomeri PDMS morbidi, sono state studiate le proprietà fisiche delle cellule in un totale di 17 condizioni diverse. Le cellule sono state trattate con quattro diverse concentrazioni di TGF - z (0,5, 1, 2 e 4 ng/mL) e quattro diversi tempi di incubazione (12, 24, 48, 96 h), e questi risultati sono riassunti nella Figura 5. Le cellule trattate con TGF-z hanno applicato sollecitazioni di trazione e energie di deformazione più grandi rispetto alle cellule coltivate senza TGF-z. Le cellule incubate con TGF-z per 96 h hanno mostrato le più grandi sollecitazioni di trazione e le energie di deformazione. Le cellule hanno applicato sollecitazioni e energie di deformazione più grandi quando sono state trattate con una maggiore concentrazione di TGF-z. La differenza nelle trazioni e nelle energie di deformazione era più distinta a tempi di incubazione più lunghi.
La superficie del substrato deve essere liscia e uniformemente rivestita con ligando, come fibronectina o collagene. La superficie graffiata e/o il rivestimento non uniforme dei ligandi può portare a un attaccamento cellulare improprio, con conseguente misurazione imprecisa della trazione. La figura 6 mostra le sollecitazioni di trazione localizzate dovute alla superficie del substrato non uniforme.
Figura 1 : Panoramica della fabbricazione di piastre multi-bene. (A) Una diapositiva di vetro tagliata su misura è il punto di partenza. (B) Lo scivolo di vetro è rivestito con uno spessore di PDMS. (C) Uno strato di perline fiduciarie (mostrate in verde) vengono poi rivestite in uno strato spesso 1 m di euro sulla parte superiore dello strato precedente. (D) Il divisore multi-bene è accuratamente posizionato sopra lo strato di perline fiduciarie. (E) La piastra multi-bene completa è assemblata e pronta per l'uso o lo stoccaggio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : mandrino personalizzato per spin-coater. Per evitare che il vetro inferiore (dove il PDMS è rivestito) salvi dal mandrino spin-coater standard, un supporto su misura viene posizionato sul mandrino. (A) Un supporto su misura per il mandrino spin-coater. (B) Disegno ingegneristico del supporto con tutte le dimensioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Rigidità substrato con concentrazione di interlinker mutevole (wt%). Le miscele PDMS vengono preparate come descritto, con la percentuale aggiuntiva di crosslinker che aumenta il modulo elastico fino a un massimo di 100 kPa a 1,8 peso percentuale (wt%) paralinker. Come guida, il modulo in funzione del crosslinker è in forma linearmente, che può essere utilizzato dai ricercatori per formulare la propria miscela in un particolare modulo desiderato all'interno di questa gamma. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Reologia di elastomer PDMS contenente 0, 0,15, 0,36 e 1 wt% di agenti di collegamento incrociato ad una temperatura di 100 gradi centigradi. I simboli triangolari indicano il modulo di perdita (G'') e i simboli quadrati indicano il modulo di archiviazione (G'). (A) Sweep di tempo oscillatorio alla frequenza di 1 Hz e ceppo di taglio dello 0,5% durante la gelazione. (B) Sweep di frequenza oscillatoria della rete PDMS a ceppo di taglio dello 0,5%. (C) Sweep di deformazione della rete PDMS alla frequenza di 1 Hz. Tutti i punti dati sono stati acquisiti in triplice copia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Risultati rappresentativi che utilizzano un dispositivo di stress di trazione con formato multi-bene. Il monostrato di cellule in condizioni diverse è stato coltivato in un dispositivo multi-bene per misurare la contrattilità e l'energia di sforzo. (A) Grafico delle sollecitazioni di trazione con l'aumento dei tempi di incubazione del TGF-z per diverse concentrazioni di TGF-z. Le sollecitazioni di trazione sono aumentate con l'aumento delle concentrazioni di TGF e del tempo di incubazione. Tutti i dati sono statisticamente significativi per quanto riguarda il controllo (ad es. (B) Grafico dell'energia di deformazione con l'aumento del tempo di incubazione di TGF-z per diverse concentrazioni di TGF-. Le energie di deformazione aumentarono con l'aumento delle concentrazioni di TGF e del tempo di incubazione. Le dimensioni dei campioni variano da n a 7 a n - 15. Tutti i dati sono statisticamente significativi per quanto riguarda il controllo (ad es., nessun TGF- ) tranne i seguenti: 12 h - 0,5 ng, 12 h - 1 ng, 24 h - 0.5 ng, 24 h - 1 ng, 48 h - 1 ng. La rilevanza statistica è stata determinata utilizzando il test Kruskal Wallis, che non presuppone una distribuzione normale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Risultati rappresentativi di un esperimento non ottimale (A, B) e soddisfacente (C, D). (A) Immagine riflessiva della superficie del substrato. Contaminanti indesiderati, che possono includere polvere o fibre, o difetti di materiale come graffi sono presenti sulla superficie del substrato. (B) Per quanto mi risse in due Mappa di stress della contrattilità cellulare: a causa della superficie non uniforme, intorno agli oggetti si osservano sollecitazioni di trazione irregolari e imprecise. (C) Per quanto mi licolo, la Immagine riflessa della superficie del substrato. Non sono visibili contaminanti apparenti. (D) Mappa di stress della contrattilità cellulare: non sono visibili discontinuità di artefatto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Concentrazione del paradisi incrociato (wt%) | G' (Pa) | Deviazione standard | E (kPa) | Deviazione standard |
| 0 (in vie | 0.135 (in tissuma in stato di inade | 0,014 (in linguaggio da 2>) | 0.405 | 0,043 (in via 0,0) |
| 0.15 | 1 : il nome del | 0.1 0 | 3 (COM del nome | 0,35 (in questo da fwlinka che) |
| 0,36 (in inglese) | 4.027 | 0.245 (in questo da 245) | Ore 12.081 | 0,73 (in questo da fwlinkin conto) |
| 0,75 (in questo 0,05) | Ore 16.01 | 0,49 (in questo da 19). | 48.03 | 1.2 (in questo modo) |
| 1 : il nome del | Ore 18.44 | 0,989 | 55.32 | 1.94 (in questo da un'ora di inda |
| 1.5 1. | Ore 27.638 | 0,93 (lei, da quando il calibro della | 82.91 (in modo | 1.64 (in inglese) |
| 1.8 Del nome | 33.986 | 0,88 (in linguaggio da 18). | 101.94 | 1.088 (in linguaggio 1,088) |
| 2 Il nome del sistema | 33.36 | 0,67 (in inglese) | 100.08 | 1.1 (inquesto> |
Tabella 1: Rigidità substrato con concentrazione di interlinker mutevole (wt%). Modificando ulteriori concentrazioni di crosslinker, vengono fabbricati i substrati PDMS del moduli desiderato di Young. La cesoia PDMS è stata misurata con un misuratore di modulio e sono stati determinati i moduli di Young. Per ogni punto dati sono state effettuate 3 preparazioni indipendenti e viene fornita la deviazione standard.
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Discussion
Per il successo di questo metodo, è fondamentale avere un campione uniformemente rivestito con uno spessore costante di circa 100 m. Il modulo deve essere scelto con attenzione per esaminare il significato fisico del sistema biologico di interesse. Quando si fabbrica uno strato superiore, la concentrazione delle particelle fluorescenti fiduciarie deve essere ottimizzata per un'analisi accurata dello spostamento e dello stress da trazione. L'analisi di singole cellule isolate richiede uno strato fiduciario più denso rispetto alla misurazione di monostrati confluenti. Inoltre, la superficie del substrato deve avere un rivestimento stabile e uniforme di molecole di adesione come collagene, fibronectina e laminina per garantire il corretto attaccamento delle cellule alla superficie del substrato. Particolare attenzione deve essere presa quando si fissa il divisore multi-pozzo; deve essere posizionato senza scorrimento per evitare che la colla PDMS di sigillamento venga spalmata sulla superficie della coltura, e il bordo esterno deve essere accuratamente allineato con le dimensioni del vetro per evitare perdite sui pozzi di confine.
Per evitare che i pozzi siano fuoriuscito, una quantità adeguata di colla PDMS deve essere applicata al ben divisore per tenerla in posizione. Tuttavia, l'uso di quantità eccessive coprirà la superficie di coltura cellulare.
Durante la procedura di rivestimento di spin è necessario aggiungere un volume sufficiente di PDMS. Durante la stagionatura, il forno e le rastrelliere devono essere livellati. PDMS inadeguato o un forno non livellato possono portare a spessore spareggiabile PDMS.
La densità del tallone deve essere ottimizzata per una corretta analisi. Quando la densità del tallone non è adeguata, la concentrazione delle perline nella miscela fiduciaria PDMS deve essere aumentata. Inoltre, una quantità adeguata della miscela deve essere aggiunto per il rivestimento di spin. Per garantire segnali fluorescenti adeguati delle particelle di perline fiduciarie, le condizioni di stagionatura devono essere attentamente monitorate. Tempi più lunghi e temperature più elevate di quelle specificate in questo protocollo possono degradare la fluorescenza. Rivestimento proteico improprio sulla superficie del campione può portare a scarsa adesione cellulare. Per evitare questo problema, è necessario pulire la superficie e verificare la scadenza dei reagenti, ad esempio Sulfo-SANPAH e ligando. Il tempo e la forza di esposizione ai raggi UV devono essere ottimizzati. L'immunofluorescenza o altri costrutti di proteine fluorescenti possono essere testati per garantire un rivestimento uniforme della legatura.
Il dispositivo fabbricato con questo metodo e set di formulazioni PDMS è applicabile solo ai substrati con la modulina di Young che vanno da 0,4 kPa a 100 kPa. Altri moduli possono essere possibili utilizzando formulazioni alternative, tuttavia, l'intervallo attuale si estende su un ampio insieme di valori fisiologicamente rilevanti. Mentre questo metodo è specificamente per la fabbricazione multi-bene, può anche essere utilizzato per preparare singole diapositive o altre geometrie di diapositive, e in questi casi potrebbe essere necessaria un'ulteriore risoluzione dei problemi dell'utente. In questa forma di realizzazione, viene impiegato uno scivolo di vetro relativamente spesso (1 mm), precludendo obiettivi comuni ad alta apertura numerica (NA) su un microscopio invertito. Mentre è tecnicamente fattibile costruire questi piatti TFM multi-bene utilizzando vetro più sottile, la fragilità di questi nella lavorazione e nell'assemblaggio può provocare un alto tasso di rottura e può funzionare in contrasto con l'approccio più elevato. Inoltre, il rivestimento superficiale può essere studiato ulteriormente per applicazioni più ampie del dispositivo.
Utilizzando un formato multi-bene, sono possibili esperimenti ad alta velocità effettiva. Il formato multi-bene ci ha permesso di esaminare i cambiamenti fisici delle cellule NMuMG durante il trattamento EMT con il trattamento TGF-z con combinazioni di diverse concentrazioni e diversi tempi di incubazione in un unico piatto. La fabbricazione di dispositivi di sollecitazione di trazione con idrogel come gel poliacrilammide hanno diverse limitazioni. Con l'ingrediente dominante è l'acqua, gli idrogel sono sensibili alle concentrazioni di sale (osmolarità), temperatura, umidità e cambiamenti di pH. Le modifiche in una qualsiasi di queste proprietà possono portare al cambiamento delle proprietà meccaniche del materiale, richiedendo particolare attenzione nell'utilizzo di campioni e nell'interpretazione dei risultati. Inoltre, avendo acqua, gli idrogel sono più suscettibili alle infezioni, richiedendo cure supplementari. A differenza degli idrogel a base d'acqua, la PDMS a base di silicone è stabile e inerte. Una volta fabbricato, può essere conservato a temperatura ambiente a tempo indeterminato senza richiedere particolari condizioni di movimentazione o conservazione.
La natura impermeabile del PDMS ci permette di fabbricare un substrato monolitico, assicurando che tutti i pozzi siano veramente identici nello spessore e nella composizione del substrato, consentendo al contempo di applicare una biochimica unica nei media, o cellule diverse da utilizzare in ogni bene. Una superficie a base di idrogel permette ai fattori diffusivi di permeare e viaggiare attraverso di essa, richiedendo l'aggiunta dell'idrogel a pozzi che altrimenti sono partizionati per evitare la contaminazione incrociata.
Questo metodo consente ai ricercatori di studiare la contrattilità cellulare, un aspetto di base e onnipresente della biologia cellulare, in modo ad alto velocità, consentendo un'acquisizione di dati più efficiente e riproducibile. Questo aiuta a tradurre la microscopia della forza di trazione in Contractile Force Screening, permettendo ai ricercatori di utilizzare veramente la contrattilità come metrica per l'attività cellulare o l'efficacia di un composto. Come metodologia, questo ha ampie applicazioni attraverso le scienze biofisiche e biomediche, dalla comprensione della fisica delle cellule, alla caratterizzazione e al test di composti farmaceutici contro i tipi di cellule standardizzate, o forse altamente specializzati singole cellule per la medicina personalizzata.
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Disclosures
AJE e RK hanno interesse per Live Cell Technologies, una società che fabbrica materiali descritti in questo articolo.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Tom Kodger, Michael Landry e Christopher J. Barrett per l'assistenza con la sintesi di perline. A.J.E. riconosce le sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council fecondazione RGPIN/05843-2014 e EQPEQ/472339-2015, Canadian Institutes of Health Research grant n. 143327, Canadian Cancer Society grant no. 703930 e Canadian Foundation for Innovation #32749 del progetto. R. Krishnan riconosce la sovvenzione dei National Institutes of Health no. R21HL123522 e R01HL136209. H.Y. è stato supportato da Fonds de recherche Santé Québec e Fonds de recherche Nature et Technologies Québec. Gli autori ringraziano Johanan Idicula per l'assistenza con il video e il manoscritto e per l'assistenza nella preparazione del video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP |
References
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