Summary
血管化复合同种异体移植为移植受者提供了改变生活的益处, 但移植排斥反应和血管病变的生物学原因仍然鲜为人知。这里介绍的啮齿类动物手术模型提供了一个可重复的, 临床相关的移植模型, 使研究人员能够评估排斥事件和潜在的治疗策略, 以防止其发生。
Abstract
血管化复合同种异体移植 (VCA) 是重建手术中一个比较新的领域。人类 VCA 的临床成就包括手部和面部移植, 以及最近的腹壁、子宫和泌尿生殖系统移植。功能结果超出了最初的预期, 大多数受惠者的生活质量得到改善。然而, 随着临床经验的积累, 必须解决免疫抑制引起的慢性排斥反应和并发症。在移植失败的许多情况下, 病因病理是缺血性血管病变。VCA 相关的急性和慢性排斥反应的生物学机制, 特别是缺血性血管病, 是重要的研究领域。然而, 由于 VCA 患者数量很少, 在实验模型中更好地解决了对拟议机制的评价问题。多个小组使用动物模型来解决 VCA 排斥和血管病变中一些相关的未解决的问题。文献中描述了几种涉及各种物种的模型设计。本文提出了一种可供大鼠应用于翻译 VCA 研究的大鼠 vca 异位后肢肌皮瓣的重现模型。该模型允许对移植物进行连续评估, 包括活检和不同的成像方式, 同时保持较低的发病率。
Introduction
截肢、爆炸伤、恶性肿瘤和先天性缺陷造成的灾难性组织损失的重建手术受到患者组织供应和供体部位造成的额外发病率的限制。在某些情况下, 如烧伤受害者或四边形截肢者, 患者无法获得重建的可行组织。1964年, 厄瓜多尔进行了首次现代手部移植。虽然这是一个技术上的成功, 免疫抑制在当时可用的是不足以防止排斥, 和移植丢失不到 3周 1.1998年和 1999年, 在法国里昂2号和美国肯塔基州路易斯维尔3号进行了免疫抑制现代的第一手移植.重建外科医生第一次可以像那样取代。面部移植于 2005年首次进行, 目前正在进行其他一些 vca 移植, 如腹壁5、子宫和泌尿生殖系统移植 6。
与固体器官移植不同, 大多数 VCA 技术涉及高度抗原性供体皮肤的存在。临床经验已经确定, 急性排斥皮肤是相对容易控制, 但可能有助于慢性排斥的基础组织和血管, 这对治疗没有很好的反应7。与同种异体免疫反应相关的血管功能障碍是 VCA7领域更不祥的障碍。大血管病变会导致灌注缺陷、延迟愈合和炎症疾病。手部移植受者均发生血管扩张性血管病变和局灶性内膜增生7。此外, 微血管病变可能也会导致 VCA 并发症, 甚至可能导致排斥事件。虽然免疫和非免疫因素都可能在手部移植受者的血管病变中发挥作用, 但促进 VCA 远端血管功能障碍的具体机制尚不清楚, 特别是在低品位、慢性排斥的情况下。这些未回答的问题要求开发一个动物 VCA 模型, 这将允许在 VCA 排斥/维持和血管病变的临床过程中对移植进行连续评估。这种模型将提供深入了解排斥和血管病变面对免疫抑制, 感染挑战, 和/或其他术后创伤 8,9。
本文介绍了一种同种异体大鼠 VCA 异位后肢骨膜皮瓣模型。基于先前发布的 VCA 模型, 此过程在技术上易于执行, 可在大量重现, 并显示出最低的发病率和不适的受赠者动物。该模型旨在允许对 VCA 接受与排斥进行临床和组织病理学评估, 并提供一个机会来评估排斥反应所涉及的潜在免疫和非免疫机制。
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Protocol
所有动物手术都是根据路易斯维尔大学动物护理和使用机构委员会 (iac委员会批准的18198号议定书) 和国家卫生研究院 (NIH) 《动物护理和使用指南》批准的协议进行的。实验动物10。四个月大的男性布朗-挪威 (RT1。A) 和4个月大的男性刘易斯 (RT1。Al) 大鼠分别被用作 vca 供体和受者。
1. 供体同种异体收获
- 用通过室内施用的汽化异氟醚对供体动物进行镇静剂。
- 患者移植供体区 (后肢), 以及腹股沟和腹部区域。之后, 用脱毛霜处理, 以减少剪子留下的绒毛量。
- 用腹腔内氯胺酮 (60 mg/kg)/xylazine (15 mg/kg)/aceprozine (2 mg/kg) 对供体动物进行深度麻醉。管理 0.2 mL/100 的体重和每小时0.2 毫升的额外剂量。为方便起见, 可以选择在步骤2之前执行此步骤。
- 连续监测动物在麻醉期间的呼吸, 体温, 和麻醉深度, 使用脚趾捏退出反射测试。
- 手术前在擦洗区域进行 30 u 肝素溶液的皮下注射 (SC), 以防止凝血。
- 戴口罩、头套、一次性隔离服和一次性手套。
- 将供体动物仰视放在加热垫上。通过准备、擦洗和覆盖手术区域, 包括腿部的腹侧和背部, 产生无菌的手术场。不要无菌手套。
- 使用手术刀刀片在腹股沟凹槽中做一个3厘米长的皮肤切口 #15 用虹膜剪刀侧向反射腹股沟脂肪垫。
- 将常见的股骨血管切除, 并放置一个带有松紧带的铁丝钩, 以收回腹部肌肉。
- 使用解剖显微镜 (40x), 从腹股沟韧带下常见的股血管的出现, 并在远端到椎弓根血管融合到移植物的远端, 将椎弓根近端解剖。
- 使用微夹和双极珠宝师的钳子, 结扎和分割大的动脉和静脉分支, 如外侧环状股血管、浅端上腹部血管、隐动脉和股骨近端血管, 以动员主要的股骨血管。小心使用精细双极钳的任何小分支。
- 用虹膜剪刀从前一个皮肤的中心沿着后肢腹侧切割皮肤, 到脚踝区域。
- 切割优雅的肌肉, 以及它下面的其他内收肌, 以垂直的方式暴露和结扎内侧近端生殖器血管, 深支小血管, 和坐骨神经。
请注意:此时, 在单独的手术台上, 另一位外科医生应给接受者动物插管并麻醉 (2.5%-3% 异氟醚);这使得外科医生能够及时为接受者的手术部位进行移植, 并最大限度地减少移植物的缺血时间。 - 在供体动物身上, 在膝盖和脚踝的水平上做圆周皮肤切口。切除膝盖和脚踝, 切除多余的肌肉和组织, 并在后肢的背侧做一个垂直的皮肤切口, 以释放移植物。在这一点上, 移植物 (由腓骨和胫骨组成, 覆盖着相关的肌肉和由穿孔滋养滋养的皮肤岛) 只由椎弓根连接。
- 将小夹具尽可能近端放置在股动脉和静脉上, 并在腹股沟韧带附近尽可能近端切除椎弓根。
- 要冲洗血液移植物, 请使用 27 G 冲洗钝器将肝素化盐水 (30 u l) 注射到股动脉中。
请注意:在肝素冲洗前扩张动脉, 可以方便地插入插管。在冲洗过程中, 密切监测股静脉的流出。一旦清除液体退出股静脉, 停止冲洗。 - 将分离的嫁接物包裹在温暖的盐水浸透的纱布中, 并立即将其运输到接受者的餐桌。此时, 接受者的手术部位应该已经做好血管吻合术的准备。
- 移植收获后, 立即通过气胸对供体大鼠进行安乐死。
2. 受者移植手术
- 采用通过腔内的汽化异氟醚进行镇静诱导后, 通过呼吸机控制的气管插管和 2.5%-3% 的异氟醚对受受物动物进行深度麻醉。
请注意:在这个阶段, 供体大鼠仍然被麻醉。 - 持续监测受物动物的心率、呼吸率、体温和麻醉深度, 使用脚趾捏戒断反射试验。
- 为了防止脱水和低血糖, 在手术开始时注射2毫升乳酸林格溶液, 在术后再注射2.5% 的葡萄糖, 在手术结束时再注射2毫升。
- 磨掉腹股沟区域, 然后用脱毛膏处理, 以减少剪子留下的绒毛量。
- 戴上口罩、头套、一次性隔离服和无菌手套。
- 将动物仰视放在加热垫上。应用眼药膏, 以防止角膜擦伤在麻醉过程中。通过准备、擦洗和覆盖手术区域, 产生无菌手术场。
- 使用手术刀刀片在腹股沟凹槽中做一个3厘米长的皮肤切口 #15 用虹膜剪刀侧向反射腹股沟脂肪垫。
- 将常见的股骨血管切除, 并放置一个带有松紧带的铁丝钩, 以收回腹部肌肉。
- 结扎和划分墨菲分支。
- 采用10-0 尼龙中断缝合线, 通过静脉端侧技术和动脉端到端技术将供体血管与受者血管吻合。逐渐释放动脉的夹子, 然后释放静脉。监测吻合部位出血, 并在需要时添加额外的缝合线。
- 目视评估血管吻合术, 以确保有效的移植物再灌注。
- 将移植物插入腹股沟口袋, 倒置, 踝关节上、膝关节下。
- 使用夹紧缝合线, 固定到相邻肌肉的移植物。关闭皮肤通过中断的水平床垫皮肤吸收4-0 缝合。
- 将受接受者的动物从麻醉中取出, 并将其从呼吸机上擦掉。将动物放在加热垫上进行热支撑。
请注意:根据外科医生的经验和对外科手术的了解, 整个手术时间在3至4小时之间。 - 在皮下服用 meloxicam (1 mg/kg) 进行疼痛抑制和监测, 直到动物完全恢复和移动。
3. VCA 接收者监控
- 除了手术失败 (前48–72小时) 或排斥反应外, 还对受者大鼠进行单独的家庭, 并每天监测它们的临床症状, 以确定疼痛、脱水、体重减轻和活动减少的情况。在止痛的前 3天, 每天皮下注射 (1 mg/kg)。
- 根据研究终点, 选择要服用的免疫抑制剂药物。
4. 组织学
- 在吸入异氟醚麻醉 (2.5%-3%) 下, 从供体移植物中获得在所需时间点的连续皮肤和基础肌肉活检。在进行活检之前, 应擦洗和覆盖皮肤, 并应进行无菌场和技术。
- 用一到两针缝合伤口, 使用可吸收的4-0 缝线。将动物送回笼子, 让它从麻醉中恢复。
- 将活检组织固定在10% 福尔拉林的单独管中。
- 在结束时间点和吸入异氟醚麻醉 (2.5%-3%) 下, 进行跨越捐献者/接受者边界的更大的皮肤活检。在吻合部位仔细定位容器皮带对;由于缝合线的原因, 适当的部位会很明显。从动脉和静脉中提取所需的血管样本。将所有样品分别固定在10% 福尔拉林中。收集组织样本后, 当动物仍处于异氟醚麻醉之下时, 立即通过气胸对动物进行安乐死。
- 使用组织处理器 (或其他首选嵌入技术), 石蜡嵌入到自己的块中的每个活检。对于皮肤样本, 确定组织的方向, 以便在单个切片中可以看到所有表皮和真皮层。对于容器样品, 确定容器的方向, 以便获得横截面。
- 使用微目, 切割6μm 厚的部分, 并将其应用于幻灯片中的血红素和 eosin (H & E) 染色。
- 使用标准协议对 H & E 进行染色。
- 使用明亮场显微镜技术获取所有所需组织样本的代表性图像。
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Representative Results
大鼠 VCA 异位后肢骨髓肌皮瓣模型允许在免疫抑制下长期同种异体移植存活。该模型可靠、重现性好、操作简单。皮瓣隐藏在腹股沟区域, 并构成最小的发病率和不适的动物。皮肤表现是同种异体移植生存和排斥的临床表现 (图 1)。皮瓣设计允许全面的临床监测, 并创造了各种成像技术的机会, 如激光多普勒 (图 2)。皮肤、肌肉和动脉的连续活检使在不同的排斥反应阶段实现组织病理学随访和分析成为可能 (图 3)。
图 1: 来自移植动物的代表性图像.(A) 在术后第45天 (pod 45), 未经免疫抑制治疗, 在异种 vca 长期存活;注意由于移植物的倒置方向, 毛皮生长方向的差异。(B) 在 pod 5 上, 每天使用免疫抑制剂药物治疗。(C) 同种异体 vca 长期存活, 每日在 pod 40 上使用免疫抑制剂治疗;注意正常的毛皮生长表明移植物的适当灌注, 没有排斥的迹象。(D) 在 POD 33 上遭到拒绝。在 POD 14 上完全停止免疫抑制治疗;注意排斥反应的临床症状 (皮肤萎缩, 脱皮, 毛皮丢失)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 激光多普勒成像系统, 监测同种异体皮肤浅表血运重建.术后第4天、第14天和64天对同种异体移植进行监测。左侧的面板显示了多普勒成像测量的血液灌注, 而右侧的面板显示的是多普勒成像的区域。请注意从 vca 后立即最小的血液灌注到第64天皮瓣的完全血运重建的转变。同种异体移植在适当的免疫抑制下保持, 没有排斥的迹象。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 同种异体移植与同种异体移植的 h &Amp; e 组织病理学.(A) 在 pod 45 (10倍放大倍率) 上进行同种异体移植的皮肤活检;注意皮肤成分的正常形态 (表皮、附件, 没有单核细胞浸润的迹象)。(B) 在 pod 75 排斥反应中进行同种异体同种异体移植的皮肤活检, 每日用较低剂量的免疫抑制剂进行治疗 (10倍放大);注意表皮萎缩、附件萎缩、单核细胞浸润、血管周围浸润和毛细血管血栓形成。(C) pad 45 (10倍放大倍率) 同种异体同种异体共移的肌肉活检;注意条纹肌肉的正常形态。(D) 对 pod 98 排斥反应的同种异体同种异体移植的肌肉活检, 每日用较低剂量的免疫抑制剂 (10倍放大) 进行治疗;注意肌肉萎缩和单核细胞浸润。(E) pod 45 (20x 放大) 同种异体同种异体异种的股动脉活检;注意动脉的正常形态。(F) 对 pod 98 排斥反应的同种异体同种异体同种异体同种异体股骨动脉活检, 每日用低剂量的免疫抑制剂 (20x 放大) 进行治疗;注意内膜增生, 狭窄的腔, 和血管周围的浸润。刻度杆 = 200 微米 (a-d);100μm (e和f)。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在开发这种 VCA 模型时, 考虑了几个关键问题。首先, 重要的是要包括完整的骨头 (胫骨和腓骨), 骨髓, 和皮肤的移植。虽然成人捐献者的临床手移植不会转移大量的积极造血骨髓, 但对骨髓生态位作用的研究使用的是完整的、血管化的骨头, 而不是切长的骨头, 从而导致暴露的骨髓纤维化。此外, 闭合性骨膜瓣设计可降低感染和出血的风险。骨髓和皮肤都是高度免疫原性组织, 如果需要, 可用于触发免疫反应。其次, 移植物没有必要发挥作用, 因此无需采用需要复杂的骨合成和移植再吸收的原位模型。这也可以防止一些众所周知的麻烦后果的原位模型, 如延长手术和动物不适11,12。然而, 重要的是要注意的是, 异位设计不允许骨骼和软骨的功能结果测量, 以及肌肉功能, 所有这些都是在 VCA 研究中的重要兴趣。第三, 移植物需要可用于成像系统、临床随访和连续活检。最后, 为了吞吐量的目的, 嫁接手术需要很容易地进行没有并发症。考虑到这些因素, 开发了一种改良的大鼠骨灰岩 vca 模型, 将供体 (布朗-挪威) 膝盖和脚踝之间的远端后肢, 包括覆盖皮肤和相关血管移植到接收方 (Lewis) 上的腹股沟区域。在这种情况下, 血管供应的移植物发生通过股动脉和静脉吻合。
由于皮肤是监测 VCA 排斥反应的重要关键因素, 因此在准备移植时采取了特别的注意措施, 以保持支持皮肤灌注的小动脉穿孔器。在建立该模型时, 我们使用内膜绿色 (ICG) 血管造影 (未显示结果) 进行了初步实验, 以确认模型的皮肤灌注设计。
由于移植物是倒置的, 使移植物的远端是优越的, 并且移植物的近端是劣质的, 需要一个长的椎弓根, 以避免链接。因此, 应该强调的是, 供体股血管应尽可能近端分开, 受体股动脉应尽可能远端分开。
建议两名外科医生同时参与供体移植的最后准备/分离;一个外科医生应该完成移植隔离, 而另一个外科医生麻醉和插管接受者的动物, 并开始准备血管吻合。如果有空间和设备, 第三名外科医生可以准备第二个受赠者动物, 两个捐献者的腿可以用于 VCA 移植。外科医生必须在吻合前相互协调, 以确保最小的移植物缺血时间。根据我们的经验, 大多数术后死亡都是麻醉技术造成的。如果可能, 我们建议不同的团队成员在手术期间负责麻醉监测。不用说, 为了成功地实施这种模式, 需要一个受过训练的外科医生, 他们需要基本的微血管技术。根据外科医生的经验, 该模型可以成功地实现后, 两到六次手术尝试。
合基因大鼠可作为对照组, 用于治疗与排斥无关的愈合动力学。受体大鼠的对侧腿也可用作对照, 尤其是在进行成像和活检时。
毛皮在移植皮肤上再生是同种异体移植灌注成功的最佳适应症之一。另一方面, 毛皮丢失, 皮肤红斑, 和去上皮可能表明排斥事件和减少血液供应的一些部分皮瓣。在一个非常先进的排斥期, 皮肤可能会出现坏死和脱落。由于去神经萎缩, 同种异体肌质量在晚期下降。这些动物通常会减肥 (高达 1 0%)在前 7-10天, 但随后恢复和茁壮成长。我们建议在术后的头几天添加营养强化水凝胶 (例如, DietGel 恢复), 以支持受体大鼠的营养。在极少数动物 (超过50只实验动物中的两种) 中, 我们目睹了皮肤感染和自体吞噬。
总之, 本文提出的异位、异基因后肢肌膜 VCA 移植的改进模型提供了一个可重复的、通用的移植范式。串行活检和成像提供了有关拒绝事件的时间过程的信息。用这种方法可以研究的各种临床症状使其成为一个适应性很强的翻译模型, 有可能在未来几年进行大量有见地的发现。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了主管卫生事务助理国防部长办公室通过第1号奖下的国会指导医学研究方案的支持。W81XWH-13-2-0057。意见、解释、结论和建议是作者的意见、解释、结论和建议, 不一定得到国防部的认可。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acepromazine | Henry Schein | 5700850 | |
| Adventitia Scissors | ASSI | SAS15R8 | |
| Approximator Clamp (Double) | ASSI | ABB2V, ABB22V | |
| Approximator Clamp (single) | FST | 00398-02 | |
| Clamp Applying Forceps | ASSI | CAF4 | |
| Dissecting Scissors | ASSI | SDS18R8 | |
| Flushing blunt needle 27 G | SAI | ||
| Heparin Sodium | Sagent | 25021-400-30 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-704-06 | |
| Jewelers Bipolar | ASSI | 103000BPS03 | |
| Jewelers forceps #3 | FST | 11231-30 | |
| Ketamine HCl 100 mg/mL | Zoetis | 043-304 | DEA License required |
| Lactated Ringer Solution | Hospira | 0409-7953-03 | |
| Lactated Ringer Solution + 5% Dextrose | Hospira | 0409-7953-09 | |
| Meloxicam | Henry Schein | 11695-6925-2 | |
| Micro forceps | ASSI | JFAL3 | |
| Micro needle holder | ASSI | B138 | |
| Prograf (Tacrolimus) 5 mg/mL | Astellas | 0469-3016-01 | |
| Suture, 10-0 Prolene | Ethicon | W2790 | or 10-0 Ethilon (2830) |
| Suture, 4-0 Coated Vicryl | Ethicon | J714D | |
| Vessel Dilator Forceps | ASSI | D5AZ | |
| Xylazine | VetOne | 13985-612-50 |
References
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