Summary
짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 운반하는 렌티바이러스에 의해 형화되는 분산된 인간 섬 세포로부터 유전자 변형된 인간 의사구성을 생성하는 프로토콜이 제시된다. 이 프로토콜은 쉽게 사용할 수있는 효소 및 배양 혈관을 활용하고, 쉽게 수행 할 수 있으며, 기능 및 형태 학적 연구에 적합한 유전자 변형 인간 의사 를 생산합니다.
Abstract
다양한 유전 도구는 당뇨병 연구를위한 췌도 유전자의 기능을 해부설치류의 췌도에서 유전자를 조절할 수 있습니다. 그러나 설치류 섬으로부터 얻은 데이터는 종 간의 섬 구조 및 기능의 잘 알려진 차이로 인해 인간 섬에 완전히 재현되거나 인체에 적용되지 않는 경우가 많습니다. 현재, 인간 적인 작은 섬의 유전자 발현을 조작하기 위하여 유효한 기술은 아주 제한됩니다. 아데노바이러스, 플라스미드 및 올리고뉴클레오티드에 의한 천체 섬으로의 이식유전자 도입은 종종 낮은 효율과 높은 독성을 갖는다. 낮은 효율은 고효율을 요구하는 온전한 작은 섬에 있는 유전자 다운조절 연구에서 특히 문제가 됩니다. 효소적으로 분산된 섬 세포가 슈도이슬이라고 불리는 스페로이드를 형성하는 배양에서 재집계되는 것으로 알려져 있다. 인간 섬 세포의 크기 조절 재연은 장기간 배양 후 동적 첫 번째 단계 인슐린 분비를 유지하고 독성이 낮은 렌티바이러스 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 효율적으로 도입할 수있는 창을 제공하는 의사 를 생성합니다. 여기서, 2개의 상업적으로 이용 가능한 멀티웰 플레이트를 사용하여 렌티바이러스 환전 후 인간 의사구성의 생성을 위한 상세한 프로토콜이 기재되어 있다. 이 프로토콜은 쉽게 수행될 수 있으며 인간 아일렛 세포를 사용하여 인슐린 분비의 역동성및 유전자의 효율적인 하향 조절을 가능하게 한다. 따라서, 렌티바이러스 매개 유전자 변조를 가진 인간 의사세포는 인간 섬 세포 내의 유전자 기능을 평가하는 강력하고 다양한 모델을 제공한다.
Introduction
기능성 베타 세포 질량의 손실은 타입-1과 타입-2 당뇨병둘다를 위한 중앙 병리1입니다. 베타 세포는 췌도에서 인슐린의 생산자인 반면, 베타 세포와 비베타 세포 간의 통신은 인슐린 분비제2의 조절에 중요한 역할을 한다. 또한, 글루카곤 분비의 dysregulation는 당뇨병에 있는 고혈당증에 기여합니다3. 따라서, 췌도 내 세포의 유전자 발현을 조절하여 당뇨병에서 췌도 기능 장애의 발병 의 배후에 있는 기전을 해결하는 데 큰 관심이 있다. 형질전환 마우스를 포함하여 접근의 각종은 마우스 작은 섬의 유전자 발현을 조절하기 위하여 유효합니다. 그러나, 인간과 마우스 섬은 뚜렷한 내분, 세포 분포, 베타와 알파 세포의비율, 및 분비에 대한 반응을 보여준다 4. 따라서, 인간 췌도에서 유전자 기능의 직접적인 평가는 인간 췌도의 병리생리학을 이해하는 데 매우 중요하다.
아데노바이러스 벡터는 비분열 세포에서 의한 고효율의 형질전환으로 인해 시험관내에서 췌도를 트랜스듀서하는 데 가장 널리 사용되는 바이러스 벡터이다. 그러나, 아데노바이러스는 특히 인간 섬 5에서 효율적으로 작은섬의 중심부에 침투하지 않으며, 고용량6에서세포 독성이다. 비교적, 렌티바이러스 벡터는 세포독성이 적고 유사분열 후 세포의 염색체내로 외인성 유전자를 영구적으로 전달하여 유전자치료 7에 대해 널리 테스트된 비히클입니다. 그러나, 렌티바이러스가 그대로 인간 섬의 코어를 관통하는 능력도 제한되어, 따라서 효소 소화에 의한 부분분산이 요구되어감전 효율을 증가시킨다 8. 본래 인간 아일의 분산과 주의되는 것은 세포-세포-세포-매트릭스 통신의 중단이며, 이는 인간에서 포도당 항상성의 유지에 중요한 인슐린분비의 동적 조절을 손상시키는 9. 따라서, 인간 섬 모델에서 아일렛 기능의 동적 조절에 대한 유전자 변조의 영향을 평가하는 것이 어려웠습니다.
인간과 설치류 섬으로부터 분산된 섬 세포가 자율적으로 "의사"라고 불리는 작은 섬과 같은 구조로 재집계되는 것으로 알려져 있습니다. 슈도이스렛은 네이티브 아일렛10,11과유사한 베타 및 비베타 세포 분포를 보여준다. 또한, 장기 배양 후, 네이티브 아일렛은 점차적으로 강력한제 1 상 인슐린 분비를 잃게 5,10,11,12. 그러나, 의사이스렛은 동일한 배양 기간5이후 네이티브 아일렛에 비해 포도당에 반응하여 제1상 인슐린 분비의 더 나은 보존을 입증했다. 인슐린 분비의 더 나은 보존을 갖는 것 이외에, 낮은 부착 플레이트(11)에 있는 인간 적인 작은 세트 세포의 크기 통제한 재응계는 그들의 재응집에 의하여 lentivirus 벡터를 소개하는 기회의 창을 제공합니다 의사 입니다. 여러 연구는 렌티 바이러스 매개 전이와 결합 된 의사 이스틀릿의 유용성을 입증했다. Caton 등 13은 렌티바이러스를 발현하는 녹색 형광 단백질(GFP)의 도입이 비감염 대조군과 비교하여 쥐 의사에서 GFP의 균질발현을 달성하면서 인슐린 분비에 거의 영향을 미치지 않았다고 보고했다. 그(것)들은 또한 lentivirus13를통해 connexins 32, 36 및 43를 과발현하여 인슐린 분비에 다른 connexins의 특정 효력을 설명했습니다. 시판되는 96웰 초저부착플레이트로 제조된 인간 의사이슬렛은 렌티바이러스-매개된 전사 인자의 과발현이 정적 배양에 의해평가된 인슐린 분비를 향상시킨다는 것을 입증하였다 14. 최근, 96웰 초저부착플레이트로 제조된 인간 의사이스제임제는 글루코코키나제를 렌티바이러스 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 통해 글루코키나제를 하향조절하는 데 사용되었으며, 이는 포도당 자극인슐린 분비가 감소한다는 것을 입증하는 원리의 증거로서, KCl 자극된 인슐린 분비는5. 이 연구는 또한 인간의 의사가 유전자 발현 및 분비 프로파일에서 네이티브 아일렛과 유사하다는 것을 입증했으며, 더 나아가 아일렛 기능의조절을 해부하는 인간 의사들의 유용성을 뒷받침한다 5. 회음이 수행되지 는 않았지만, 최근 상용화 된 생체 공학 마이크로 웰 배양 판은 렌티 바이러스 트랜스덕션과 호환되며 우수한 인슐린을 나타내는 인간 의사 를 생산하는 것으로 보고되었습니다. 이식 후 생체외 및 생체내 분비물11. Lentiviral transduction과 결합된 인간 의사 형성은 인간 섬 병리생리학을 조사하는 간단하고 효율적인 접근법이며, 인간 아일레에서 기계론적 연구를 수행하는 귀중한 도구를 제공합니다.
현재 보고서에서는 상용 두 개의 플랫폼을 사용하여 렌티바이러스로 트랜스화된 인간 의사를 형성하는 프로토콜, 96웰 초저 부착 플레이트 및 마이크로웰 배양판이 제시된다. 둘 다 유전자 발현의 능률적인 변조를 달성하고 정적 배양 및 회수를 포함하여 다운스트림 평가에 호환되는 인간 의사 를 만듭니다.
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Protocol
연구의 개시하기 전에, 인간 과목 연구 결정은 아이오와 대학 기관 검토 위원회에 의해 만들어졌다, 누가 연구가 인간 과목 연구에 대한 기준을 충족하지 않는 결정. 연구가 시작되기 전에 지역 검토 위원회에 문의하여 섬및 계획된 연구의 출처가 사전 승인이 필요한지 확인하십시오.
참고: 일반적으로, 인간 작은 섬의 1,200-1,400 섬 등가물 (IEQ)는 96 웰 초저 부착 플레이트또는 500 세포 / 의사 의 크기에 3,000 세포 / 의사 구성의 크기로 192 의사 구성의 형성에 필요합니다 마이크로웰 배양 플레이트. 필요한 섬의 IEQ는 공여자 요인(나이, 건강, 체중), 분리 효율 및 배양 조건이 단일 세포 현탁액의 수율에 영향을 미치면서 인간 아일의 상이한 제제 사이에서 다양하다. 이 프로토콜에서, 관심 있는 유전자를 표적화하는 shRNA를 포함하는 렌티바이러스가 사용된다. 세포메갈로바이러스(CMV) 및 인간 인산성피질성 키나아제(hPGK) 프로모터 기반 렌티바이러스 벡터는 인간 의사들5,15에서효율적으로 유전자를 하향 조절하는 것으로 보고된다. 렌티바이러스의 사용은 생물학적 위험으로 예방 조치가 필요합니다16. 렌티바이러스 사용개시 전에 지역 생물안전위원회에 문의하십시오.
1. 선적 후 회복을 위한 인간 섬의 하룻밤 문화
- 준비 Connaught 의학 연구 실험실 1066 (CMRL-1066) CMRL-1066의 50 mL, HSA의 0.5 g, 페니실린-스트렙토마이신의 0.5 mL, 및 0.5 mL의 100 mg/mL의 100 mg/mL의 MG를 결합하여 1% 인간 혈청 알부민(HSA)으로 보충된 배지 안전 캐비닛(BSC)과 멸균을 위한 0.2 μm 필터를 통과합니다.
- 배송병을 부드럽게 돌리면 섬이 서스펜션에 유지됩니다. 50 mL 원유 원심 분리튜브에 섬을 포함하는 운송 매체를 전송합니다. 작은 섬이 튜브의 바닥에 정착되도록 튜브가 BSC에 15 분 동안 앉아 보자.
- 10 mL 파이펫을 사용하여 아일렛 펠렛을 방해하지 않고 배송 매체를 부드럽게 제거하십시오. 1% HSA CMRL에서 아일렛 펠릿을 400 IEQ/mL의 농도로 다시 일시 중단합니다.
- 비 조직 배양 처리 접시로 섬을 전송합니다. 작은 섬이 여러 접시로 분할되는 경우, 분할하기 전에 부드럽게 소용돌이에 의해 중간에 균등하게 중단 섬을 유지합니다. 배양 섬은 하룻밤 동안 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서.
참고: 비 조직 배양 처리 된 접시의 사용은 플레이트에 작은 섬이 부착되는 것을 방지하기 위해 요구된다.
2. 인간 적인 섬에서 단세포 현탁액의 준비
- 다음을 준비: CMRL-1066 10% 열 불활성화 태아 소 혈청 (HiFBS), 페니실린-스트렙토마이신, 글루타민 (10% HiFBS CRML) 실온에서, 40 μm 스트레이너, 35mm 페트리 접시, 1 mL 결핵 증계.
- 15 mL 원원원심분리관으로 하룻밤 배양 후 인간 섬을 옮김을 옮김. 스윙 버킷 로터에서 5분 동안 190 x g의 원심분리기. 아지스펠렛을 방해하지 않고 5 mL 파이펫으로 배지를 흡인합니다.
- 튜브에 10 mL의 인산완식염수(PBS)를 추가하여 펠릿을 세척하고, 190 x g에서 원심분리기를 5분간 부드럽게 섞습니다.
- 미리 온난한 프로테올액 및 콜라주용 효소 혼합물의 0.5 mL에서 아일렛 펠릿을 다시 중단하고 P1000 피펫을 사용하여 파이펫 5x를 혼합하여 섬을 혼합합니다. 37°C에서 5분간 배양합니다.
참고: 적극적인 파이펫팅은 세포 손실을 증가시킬 것이다. - 흐림(단일 셀) 및 플레이크 수(소화되지 않은 섬)를 확인합니다. 흐림과 플레이크 수로 판단되는 소화 정도에 따라 2-3분에서 37°C인큐베이션을 추가합니다. 플레이크가 소화 전의 ~10%로 감소하고 용액이 흐리면 소화를 멈추십시오.
참고: 소화에 필요한 시간은 각 인간 본도 제제의 아일렛 크기 분포에 따라 다릅니다. - 35 mm 페트리 접시에 40 μm 스트레이너를 놓고 10% HiFBS CMRL 의 1 mL을 추가하고 1 mL 주사기 플런저로 눌러 스트레이너를 적시다. 스트레이너 위에 모든 세포 현탁액을 전달하고 신선한 15 mL 튜브에서 통과를 수집합니다.
- 남은 세포를 수집하고 여과기를 통해 세척을 통과 신선한 CMRL 배지의 0.5 mL와 아일레 소화에 사용되는 튜브를 씻어. 통과를 15 mL 튜브에 결합합니다. 한 번 반복합니다.
- 다음으로, 1 mL 주사기 플런저와 35mm 접시에 배치 된 여과기를 눌러 스트레이너에 남아있는 소화되지 않은 섬을 해리. 통과를 다시 수집하고 스트레이너와 접시에서 남아있는 모든 소화 섬을 제거하기 위해 신선한 CMRL-1066으로 여과기를 씻어. 단일 세포 현탁액의 총 ~ 3 mL는 이제 15 mL 튜브에있을 것입니다.
- 세포 현탁액의 총 부피를 기록하고 혈세포계에서 세포 번호를 계산하기 위해 세포의 10 μL aliquot를 취합니다.
- 200 x g에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리기. 펠릿을 방해하지 않고 배지를 제거합니다. 3.1.1단계를 진행하여 세포를 재집계하기 위해 24웰 마이크로웰 배양판을 사용하는 경우 96웰 초저부착플레이트 또는 3.2.1단계를 사용한다.
3. 렌티 바이러스에 의한 의사 형성 및 전이
- 96웰 초저 부착 플레이트를 사용한 프로토콜
- 의사 구성량당 원하는 셀 수와 생성할 의사 수의 수를 결정합니다. 일반적으로 1,000-3,000 개의 셀은 96 웰 초저 부착 플레이트의 각 의사 에 사용됩니다. 의사당 3,000개의 세포의 경우, 30 μL의 세포 현탁액이 3,000개의 세포를 가지도록 10% HiFBS CMRL에서 2.10단계에서 아일렛 펠릿을 재중단하여 셀 현탁액을 1 x 105 셀/mL로 조정합니다. 다음 방정식을 사용하여 필요한 단일 셀 현탁액(mL)의 총 부피를 1 x 10 5셀/mL로 계산합니다.
단일 세포 현탁액 (mL) = x (의사 구성량 수) x (의사 구성수) / 1 x 105의총 부피.
참고: 30 μL의 세포 현탁액이 하나의 의사 이슬렛을 만들 수 있도록 의사 당 셀 의 원하는 수에 따라 세포 현탁액의 농도를 조정합니다. - 단일 세포 현탁액의 필요한 부피(30 μL x 가명 수)를 신선한 15 mL 튜브로 옮니다. 관심 또는 대조군 유전자를 표적화하는 shRNA를 포함하는 렌티바이러스의 250개의 형질전환 단위(TU)/세포를 추가합니다.
주의 사항: 렌티바이러스는 생체 안전 수준 2로 분류되며 감염된 세포의 DNA에 통합될 수 있습니다.
참고: 추가 된 렌티 바이러스의 양이 최소화되도록 농축 렌티 바이러스를 사용하십시오. 효율적인 유전자 침묵을 위해 세포당 요구되는 계수는 렌티바이러스 구조에 따라 다를 수 있다. - P1000 파이펫으로 5x 부드럽게 파이펫팅하여 세포 현탁액을 바이러스와 혼합합니다. 8채널 파이펫을 사용하는 경우 혼합 세포를 50 mL 멸균 시약 저장소로 이송합니다.
- 웰 수에 따라 8채널 파이펫 또는 P200 피펫을 사용하여 렌티바이러스와 혼합된 단일 셀 서스펜션당 30 μL을 분배합니다.
- 96웰 플레이트를 RT에서 270 x g의 스윙 버킷 플레이트 원심분리기에서 7분 동안 원심분리합니다. 그렇지 않은 경우, 우물의 중심에있는 모든 세포의 집합으로 다시 원심 분리는 의사 형성에 매우 중요합니다. 37°C에서 배양하여 밤새 가습된 5%CO2 인큐베이터에 배양하였다.
- 후속 배양 중에 세포의 건조를 피하기 위해 다음날 아침 잘 10% HiFBS CMRL을 미리 데운 100 μL을 추가합니다. 270 x g에서 원심분리기, RT를 7분 동안 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다. 의사 구성은 5-7 일 안에 형성을 완료합니다.
- 의사 를 수확 할 때, 10 % HiFBS CMRL (섬 당 100 μL)의 원하는 부피를 미리 따뜻하게하고, 50 mL 멸균 저수지 1 개, 멸균 10cm 페트리 접시 1 개, BSC에서 8 채널 파이펫 1 개를 준비하십시오.
- 인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 제거하고 BSC에 놓습니다. 피펫 100 μL 10% HiFBS CMRL의 작은슬기당 저수지내로.
- 피펫 100 μL 의 웰 당 10% HiFBS CMRL 의 저수지에서 의사 이스틀릿과 파이펫을 위아래로 2−3 배 부드럽게 우물에서 섬을 들어 올립니다. 이어서, 가명식을 함유하는 웰내 배지를 흡인하고 10 cm 페트리 접시로 배출한다. 8채널 파이펫을 사용하면 한 번에 8개의 가이스틀릿을 전송할 수 있습니다.
- 모든 의사 의 완전한 제거를 보장하기 위해 빛 현미경에서 플레이트를 확인합니다. 슈도이슬렛은 단단한 응집체를 형성하고 리프팅 후 응집된 상태를 유지합니다. 이제 의사 가이스틀릿이 다운스트림 실험에 사용할 준비가 되었습니다.
- 의사 구성량당 원하는 셀 수와 생성할 의사 수의 수를 결정합니다. 일반적으로 1,000-3,000 개의 셀은 96 웰 초저 부착 플레이트의 각 의사 에 사용됩니다. 의사당 3,000개의 세포의 경우, 30 μL의 세포 현탁액이 3,000개의 세포를 가지도록 10% HiFBS CMRL에서 2.10단계에서 아일렛 펠릿을 재중단하여 셀 현탁액을 1 x 105 셀/mL로 조정합니다. 다음 방정식을 사용하여 필요한 단일 셀 현탁액(mL)의 총 부피를 1 x 10 5셀/mL로 계산합니다.
- 24웰 마이크로웰 배양판을 이용한 프로토콜
- 효율적인 스페로이드 형성을 위해 RT에 항밀성 린스 용액(재료 표)을 데우세요. 또한, 미리 따뜻한 일반 CMRL-1066 및 10% HiFBS CMRL.
- 의사이슬렛에 사용되는 24웰 마이크로웰 배양 플레이트의 각각의 웰에 항순염 헹구 액의 웰당 500 μL을 첨가한다. 스윙 버킷 플레이트 원심분리기에서 5분 동안 1,300 x g의 원심분리기.
- 현미경으로 플레이트를 관찰하여 기포가 마이크로웰에서 제거되었는지 확인합니다. 기포가 마이크로웰에 갇혀 있으면 1,300 x g에서 원심 분리기를 5분 동안 다시 합니다.
- BSC의 우물에서 항 준수 헹구 솔루션을 흡인합니다. 따뜻한 일반 CMRL-1066 2 mL로 각 잘 헹굽니다. 흡인 CMRL-1066. 사용하기 위해 계획된 각 잘 에 따뜻한 10 % HiFBS CMRL의 0.5 mL / 우물을 추가하십시오. 웰은 이제 2.10단계에서 제조된 분산된 인간 아일렛 세포를 로딩할 준비가 되었습니다.
- 각 웰에 필요한 총 셀 수를 결정합니다. 24웰 마이크로웰 배양 플레이트 중 한 웰은 1,200개의 마이크로웰을 함유하고 있으며 1,200개의 의사구성을 형성합니다. 의사 수 당 500 셀 x 1200 마이크로 웰 = 6 x 105 셀. 멸균 된 1.5 mL 튜브에서 10 % HiFBS CMRL의 0.8 mL에서 단계 2.10 에서 6 x 105 세포에서 단일 세포를 다시 중단하십시오.
참고: 웰당 최대 부피는 2 mL입니다. 셀 서스펜션의 부피는 1.5 mL를 초과해서는 안됩니다. 프로토콜은 렌티바이러스에 의해 변환된 의사이슬렛의 하나의 웰을 만들기 위한 단계를 설명합니다. 각 렌티바이러스에 대해 만들어질 우물의 수에 따라 확장합니다. - 바이러스 성 전적의 경우 단일 세포 현탁액에 125 TU / 세포를 추가하십시오. 바이러스의 양을 0.2 mL 이하로 유지하십시오. 3.2.8단계에서 세포를 응결하기 전에 바이러스와 세포의 접촉을 허용하기 위해 37°C에서 세포와 바이러스 혼합물을 1시간 동안 가끔 씩 부드럽게 혼합하여 배양한다.
참고: 추가 된 렌티 바이러스의 양이 최소되도록 농축 렌티 바이러스를 사용하십시오. 셀당 총 부피가 적기 때문에 프로토콜 1과 비교하여 셀당 TU 수가 적어 프로토콜 2에 사용됩니다. 그러나, 효율적인 유전자 침묵을 위해 세포당 요구되는 계수는 렌티바이러스 구성에 따라 다를 수 있으며 최적화가 필요하다.
주의 사항: 렌티바이러스는 생체 안전 수준 2로 분류되며 감염된 세포의 DNA에 통합될 수 있습니다. - 1시간 후, 10% HiFBS CMRL을 첨가하여 1 mL에 아일렛 세포 및 바이러스 혼합물의 총 부피를 조절한다. 세포가 1 시간 배양 후 덩어리를 형성하는 경우, 부드럽고 빠른 파이펫팅에 의해 단일 세포 현탁액으로 분산 2−3 시간. 파이펫팅은 마이크로웰 전반에 걸쳐 세포의 균일한 분포에 매우 중요합니다. 24웰 마이크로웰 배양 플레이트 중 하나의 웰로 셀 현탁액을 전달한다.
- 파이펫팅 직후, RT에서 100 x g의 원심분리기를 3분 간 사용하여 세포를 모든 마이크로웰로 포획합니다. 현미경으로 관찰하여 세포가 모든 마이크로웰에 고르게 분포되어 있는지 확인하십시오.
- 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 마이크로웰 배양판을 배양하였다. 슈도이스렛은 24-48 시간에서 형성됩니다.
- 7일 이상 배양배지를 변경하는 경우, 각 배지변화에 대해 배지의 50%-75%를 다음과 같이 교체한다. 각 우물에서 P1000 파이펫을 사용하여 매체의 0.5-1 mL을 천천히 제거하십시오. 0.5-1 mL의 신선한 10% HiFBS CMRL을 마이크로웰 배양 판에서 디졸브를 피하기 위해 웰의 벽에 팁을 놓음으로써 천천히 추가한다.
- 가성비 를 수확할 준비를 하려면 10% HiFBS CMRL 배지를 예열합니다. 슈도이슬렛은 혈청 프리 CMRL-1066에 떠 있는 경향이 있어 선택하기가 어렵습니다.
- 잘 1 mL 파이펫을 사용하여 잘에서 매체의 0.5 mL을 흡기 및 마이크로 웰 배양 플레이트에서 의사 를 들어 올리기 위해 플레이트 표면에 강제로 다시 매체를 분배.
- 1 mL 파이펫을 이용하여 가이스제틀을 부드럽게 흡인하고, 6웰 플레이트를 처리된 비조직 배양으로 옮기는 것을 말한다. 15 mL 원엽 튜브에 놓인 작은 37 μm 가역 스트레이너를 통과합니다. 의사 는 필터에 남아있을 것입니다; 통합되지 않은 단일 셀이 흐를 것입니다.
참고: 여과기를 통해 더 작은 크기의 의사 의 손실을 피하기 위해, 여과기는 생략 될 수있다. - 웰의 전체 표면에 걸쳐 10% HiFBS CMRL의 1 mL을 분배하여 잔여 의사를 빼내고, 흡인된 의사를 배출하고, 스트레이너를 통과한다. 3x를 반복하여 우물에서 모든 의사 를 완벽하게 수집합니다.
- 모든 의사 가명자가 수집되었는지 확인하기 위해 반전 현미경 아래 마이크로 웰 배양 판을 관찰하십시오. 의사가 남아있는 경우 3.2.14 단계에서와 같이 세척을 반복하십시오.
4. 유전자 침묵 효율 평가를 위한 RNA 추출
- 4°C에서 3분 동안 300 x g에서 1.5mL 의 미세원원지 튜브와 원심분리기에서 RNase 프리 PBS에 의사 를 선택합니다. 아일렛 펠릿을 방해하지 않고 PBS를 제거하고 4 °C에서 3 분 동안 300 x g에서 원심 분리후 PBS로 한 번 씻으십시오.
- P1000 파이펫을 사용하여 대부분의 PBS를 흡인합니다. 그런 다음, P10 피펫으로 변경하여 아일렛 펠렛을 방해하지 않고 PBS의 나머지 부분을 제거한다.
- 튜브 당 구니디늄 티오티아네이트 RNA 추출 시약(재료 표)의0.5 mL를 추가합니다. 모터 구동 유봉을 사용하여 의사 를 균질화하여 2-3 배. 구니디늄 티오티야네이트 RNA 추출 시약내의 균질화는 이제 -80°C에서 저장되거나 RNA 정제를 위해 처리될 수 있다.
참고: 마이크로웰 배양 플레이트에서 형성된 500개의 세포-의사도이스렛 중 96개의 웰 플레이트 또는 48개에 형성된 3,000개의 세포-의사도이스렛 중 24개는 0.5-1 μg의 RNA를 얻기에 충분하다.
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Representative Results
도 1은 96웰 초저 부착 플레이트 및 마이크로웰 배양 플레이트를 사용하여 의사이슬렛의 제조에 있는 주요 단계를 도시한다. 도 2a는 96웰 초저 부착 플레이트에서 3 x 103 인간 섬 세포로부터의 의사 형성 동안 형태학의 순차적 변화를 나타낸다. 1일째에 관찰된 세포의 단층 또는 느슨한 덩어리는 5일째부터 7일째까지 매끄럽고둥근 테두리를 가진 고체 응집체로 변화하였다(그림 2a). 마이크로웰 배양 플레이트에서, 고체 가이스제의 형성은 보통4일 이내에 볼 수 있다(도 2b). 600 개의 세포 / 마이크로 웰이 마이크로 웰 배양 판에서 도금되었을 때, 인간 아일렛 세포는 균일 한 크기의 스페로이드로 응축되었습니다. 마이크로웰 배양 플레이트는 96웰 초저 부착 플레이트에 비해 소수의 세포로부터 의사 구성을 성공적으로 형성할 수 있음을 관찰한다. 일반적으로 96웰 초저 부착 플레이트에는 1,500개 이상의 세포/의사 이스처가 필요하며, 500개의 세포/의사이스렛은 24웰 마이크로웰 배양 플레이트에 충분합니다. 성공적으로 형성된 슈도슬렛은 96개의 초저부착플레이트 또는 마이크로웰 배양판으로부터 회수한 후 스페로이드로 남아 있으며 정적 배양(도3a)및 회수(그림)를 포함한 다운스트림 애플리케이션에 호환됩니다. 3b).가이스틀릿의 균일한 크기는 시험 군 내의 변동을 감소시키고 측정당 5개의 의사이스틀렛을 사용하여 정적 인큐베이션을 허용한다(그림3a). 또한, 인간 의사제는 7일 후 배양 후 포도당에 반응하여 강력한 1상 인슐린 분비를 유지하되, 원래 인간 섬이 유사한 기간 동안 배양될 때 1상 포도당 자극 인슐린 분비를 무디게 한 것으로 나타났다. 그림 3b)5. 단일 세포 현탁액에 렌티 바이러스를 도입하면 아일렛 세포의 효율적이고 균일한 형질 전환이 보장되며 그림 3c에나타난 바와 같이 유전자의 매우 효율적인 하향 조절을 달성합니다. 표시된 모든 결과는 비 당뇨병 기증자로부터 인간 섬을 사용하여 얻어졌다.
그림 1: 인간의 의사 의사 처리 과정. (a) 인간 아일렛의 4,000 IEQ를 함유하는 현탁액은 경질 및 콜라겐 분해 효소 혼합물 및 온화한 파이펫팅에 의해 소화 후 흐린다. (b) 분산 후 인간 섬은 여과기를 통해 전달된다. 스트레이너 위에 남아 있는 소화되지 않은 섬은 1 mL 주사기 플런저를 사용하여 분산됩니다. (c,d) 3,000개의 세포를 함유하는 단세포 현탁액의 현미경 이미지/96웰 초저 부착 판에(c) 및 원심분리 후. (e,f) 24웰 마이크로웰 배양플레이트에서 500개의 세포/마이크로웰을 함유하는 단일 세포현탁액의 현미경 이미지는 원심분리 전(e) 및 후(f) 배율 표시줄 = 250 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 인간의 의사 형성의 형태. 인간 의사들의 형태에 대한 순차적변화는 500세포로부터 24웰 마이크로웰 배양플레이트에서 3,000개의 세포및 (b)에서 96웰 초저부착플레이트에서 생성되었다. 배율 표시줄 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 인간의 의사 를 사용하여 기능 적 검정. (a) 대표적인 정적 배양은 의사당 500개의 인간 섬 세포의 크기로 단일 공여자로부터 마이크로웰 배양 플레이트에서 생성된 인간 의사세포를 사용하여 수행하였다. 5개의 슈도이슬렛 4세트를 2 mM 또는 16.8 mM 포도당으로 보충된 크렙스 링거 중탄산염 완충제에서 1시간 동안 배양하였다. 각 심볼은 5개의 의사이스렛 의 한 세트에서 인슐린 분비를 나타낸다. 평균 ±표준 오차(SEM)가 도시된다. *, p < 0.05 학생의 t 시험에 의해. 3명의 기증자의 대표적인 결과. (b) 대표적인 회음선 회음시험은 16.7 mM포도당 및 30 mM KCl. 회액에 대한 반응으로 마이크로웰 배양판에서 생성된 인간 의사들로부터의 인슐린 분비물에서 인슐린 분비를 이전에 공표하였다5. 단일 공여자로부터 마이크로웰 배양플레이트에서 생성된 40개의 가성자 2세트로부터의 인슐린 분비의 평균 ±SEM은 500개의 인간 섬 세포당 가성계 플레이트의 크기로 나타났다. 6명의 기부자의 대표 데이터. (c) 슈도이슬렛은 인간 ATGL(CCTGCCACTCTCTATTAA, 왼쪽) 또는 PLIN5(가카아그아가가가아아아아아그CTTT, 오른쪽 을 표적으로 하는)를 대상으로 shRNA를 운반하는 렌티바이러스로 만들어졌다. 제어 의사 슬릿은 이전에 출판 된 스크램블 서열 (Scr)을발현렌티 바이러스로 변환하였다 5. 각 유전자의 mRNA 발현은 이전에 발표된바와같이 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 결정되었다. 데이터는 2-DDCT를 사용하여 펩디딜프로릴이라아제 B(PPIB)를 내부 대조군으로 복용하여 표현하였다(17). 각 점은 표시된 프라이머에 대한 각 기증자의 데이터를 나타내고 동일한 기증자의 데이터 세트는 한 줄로 연결됩니다. N = 3 기증자. *; p < 0.05 학생의 t 시험에 의해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서, 96웰 초저부착플레이트 또는 마이크로웰 배양판을 이용하여 렌티바이러스에 의해 트랜스화된 인간 의사를 생성하는 상세한 프로토콜이 제시된다. 가성이슬렛은 네이티브 인간 섬과 유사한 형태 및 분비 기능을 입증하는 것으로 보고되었으며 시험관내 5,11,18에서장기간 배양될 수 있다. 크기의 넓은 변화를 보여주는 네이티브 인간 섬과는 달리, 의사 이슬렛은 기증자와 실험 복제5,11사이의 변화를 감소, 크기가 상대적으로 균일하다. 높은 감전 효율을 요구하는 유전자의 하향 조절은 단일 세포 현탁액에서 의사 이슬렛이 형성되기 전에 쉽게 수행 될 수있다. 이 방법은 그대로 섬에있는 세포의 층을 통해 바이러스 침투의 어려움을 방지 할 수 있습니다. 따라서, 인간의 의사 구성의 생성을위한 이 간단하고, 매우 효율적이고, 재현 가능한 프로토콜은 광범위한 응용 프로그램을 가지고있다.
여러 개의 상이한 플랫폼이 의사 구성을 위해 보고되었지만12,14,19,20,모두 96웰 초저 부착 플레이트와 마이크로웰 배양 플레이트는 시판되며, 이 기술을 모든 실험실에서 채택할 수 있습니다. 교수형 낙하 방법(12)은 또한 일반적인 실험실용품을 사용하여 인간 의사 구성을 허용하지만, 잠재적인 한계는 의사들의 크기 및 재aggregation 기간을 제어하는 데 어려움을 포함한다. 이러한 제한은 의사 형성에 필요한 5-7일 배양 동안 의사 및 지속적인 증발의 한 방울당 제한된 부피 때문이었다. 또한, 매달려 드롭 방법에 비해 96 웰 초저 부착 플레이트 또는 마이크로 웰 배양 플레이트를 사용하여 렌티 바이러스를 함유하는 것이 더 쉽습니다.
프로토콜 내의 여러 단계는 세심한 주의가 필요합니다. 체질 용해 및 콜라주 용해 효소 혼합물로 손상되지 않은 작은 섬의 소화를 최적화하는 것은 단세포 현탁액의 수율을 감소시키고 이후에 의사 세포의 응고에 영향을 미치기 때문에 중요합니다. 소화 하는 동안, 밀접 하 게 덩어리의 실종에 대 한 섬을 모니터링 하는 것이 중요 하 고 작은 섬 단일 세포로 해리로 흐림의 증가. 소화를 위한 최적 시간은 다른 기증자에서 섬 사이에서 변화한다는 것을 주의하는 것이 중요합니다. 최적의 시간은 각 기증자의 병력 및 나이, 허혈 시간의 길이, 사용되는 아일렛 격리 절차, 아일렛 크기, 아일렛 순도, 아일렛 생존 가능성 및 운송 조건을 포함한 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 전형적으로, 생존력과 순도가 80% 이상인 인체 섬과 5일 이내에 격리가 사용된다. 분산 시 조심스럽고 부드러운 파이펫팅은 세포 생존력과 회복을 유지하는 데 중요하며 궁극적으로 세포 응집및 형성되는 의사 구성의 최종 크기에 영향을 미칩니다. 웰에 아일렛 셀 현탁액을 분배할 때(단계 3.1.4 및 3.2.7), 세포의 부드럽고 철저한 혼합은 단일 세포를 마이크로웰에 균일하게 분배하는 데 중요합니다. 세포가 렌티바이러스로 1시간 배양 후 덩어리를 형성하는 경우, 최종 원심분리 전에 덩어리를 단일 세포 현탁액으로 부수기 위해 부드러운 피펫팅이 필요합니다.
우리는 96 웰 플레이트와 마이크로웰 배양 플레이트를 모두 사용하여 렌티 바이러스 전환 후 인간의 의사 구성을 만드는 데 비슷한 성공을 거두었습니다. 두 플랫폼 간의 선택은 원하는 의사 수의 크기와 수에 따라 달라집니다. 마이크로웰 배양 플레이트에는 96개의 잘 둥근 바닥 판에 비해 적은 수의 셀이 응축될 수 있는 작은 피라미드 모양의 하의가 있습니다. 따라서, 마이크로웰 배양 판에 대해 의사질수당 세포수가 감소될 수 있다. 또한 단일 원심분리 단계는 마이크로웰 배양 플레이트에서 동시에 모든 의사 구성을 생성하는 반면, 96웰 플레이트에서 의사 구성을 만들기 위해서는 다중 파이펫팅이 필요합니다. 따라서, 마이크로웰 배양 판에서 의사 구성의 생성을 확장하는 것이 더 쉽습니다. 그러나, 현재 이용 가능한 마이크로웰 배양 플레이트는 생성되는 의사 수에 유연성을 제공하지 않는다. 현재, 마이크로웰 배양판을 사용하여 생성된 의사 구성의 최소 수는 1,200이고 1,200의 비율로만 증가될 수 있다. 따라서, 우리는 전형적으로 작은 규모의 파일럿 실험 및 유전자 발현을 위한 인슐린 분비 분석 및 RNA 추출과 같은 소량의 샘플이 충분한 실험을 위해 96 웰 플레이트를 사용합니다. 우리는 웨스턴 블롯, 신진 대사 분석기의 산소 소비 율 결정 및 트리글리세라이드 추출과 같은 많은 수의 세포를 필요로하는 분석을 위해 마이크로 웰 배양 판에서 의사 방출을 사용했습니다.
인간 의사 세포의 생성을 위한 주요 제한 인자는 단세포 현탁액의 제조 도중 세포의 손실입니다. 인간 작은이의 1 IEQ는 약 2,000개의 세포를 포함하는 것으로 간주되지만, 단일 세포 현탁액의 회복은 전형적으로 다중 세척 및 여과기를 통과하기 때문에 30% 이하이다. 또한 섬 크기의 이질성은 모든 섬을 동시에 해리하는 것을 어렵게 만듭니다. 부드러운 파이펫팅과 프로토콜에서 단백질 용해 및 콜라게용 효소 혼합물의 사용은 단일 세포의 최대 회복을 위한 기계적 및 효소적 힘을 결합하려는 노력이지만, 여전히 세포의 불가피한 손실이 존재한다. 따라서, 의사 의 응용 프로그램은 그대로 인간의 섬을 공부를 통해 명확한 정당화를 필요로한다. 또한 의사들로부터의 인슐린 분비가 같은 기간 동안 배양된 섬보다 더 강력하지만, 새로 고립된 아일렛5,11에비해 낮은 경향이 있음을 상기할 필요가 있다.
한계가 존재하지만, 안정적이고 고효율 유전자 침묵은 배양기간 동안 포도당 자극된 인슐린 분비물의 더 나은 보존과 결합되어 인간 아일렛 세포에서 유전자 기능의 평가를 가능하게 한다. 부가적으로, 베타-베타 및 베타 비 베타 세포 사이의 복잡한 세포간 통신은 아일렛 기능에서 조절역할을 하도록 제안된다. 그러나, 현재 인간의 섬 내에서 세포 간 통신에 관한 제한 된 정보가 있다. 세포 특이적마커(21)의가용성이 증가함에 따라, 최근에 마우스 아일렛 세포(22)에서 보고된바와 같이 정의된 세포 조성을 가진 인간 의사세포를 만드는 것이 가능하며, 이는 세포 세포의 이해를 용이하게 할 것이다. 인간 아일렛 세포 간의 통신. 3 차원 조직의 화상 진찰의 최근 발전은 또한 잠재적으로 세포 극성과 세포 간 통신이 인간 적인 작은 섬에 통제되는 방법을 마스크를 해제하는 모형으로 인간 적인 의사 의 유용성을 증가합니다. 따라서, 인간의 의사 세포는 섬 생물학 분야에서 관심있는 유전자및 기타 질문의 기능을 해부하는 유용한 모델을 제공한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 Y.I.에 건강의 국립 연구소에 의해 재정적으로 지원되었다 (R01-DK090490) Y.I.에 미국 당뇨병 협회 (1-17-IBS-132). J.A. 및 Y.I.는 이글스 당뇨병 연구 센터의 형제 순서에 의해 지원됩니다. A.B.는 국립 보건원 교육 교부금(T32NS45549)의 지원을 받고 있습니다. 저자는 희망의 도시 (2UC4DK098085)에서 NIDDK 자금 통합 섬 분배 프로그램 (IIDP)에 의해 제공되는 인간의 췌도를 활용.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-adherence rinsing solution | Stemcell technologies | 7919 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series Type A2 | |
| Cell strainer, 40 micrometer | Corning | 431750 | |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530037 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Heracell VIOS 160i | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent | ThermoFisher | 15596026 | Trizol |
| Glutamine | ThermoFisher | 25030164 | |
| Hemocytometer | Marien Feld | Neubauer-Improved Bright line | |
| Human serum albumin | Sigma | A1653 | |
| Inverted microscope | Fisher brand | 11-350-119 | |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 20 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microwell culture plate | Stemcell technologies | 34411 | Aggrewell 400, 24 well |
| Motor-driven pestle | GAMUT | #399X644 | |
| Non-tissue culture treated dish, 10 cm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| PBS | ThermoFisher | 14190250 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Petri dish, 35 mm | Celltreat | 229638 | |
| Pipette, 5 mL | DOT Scientific, | 667205B | |
| Pipette, 8-channel | VWR | #613-5253 | |
| Pipette, 10 mL | VWR | 667210B | |
| Pipette, P10 | Denville | UEZ-P-10 | |
| Pipette, P200 | Denville | UEZ-P-200 | |
| Pipette, P1000 | Denville | UEZ-P-1000 | |
| Proteolytic and collagenolytic enzyme mixture | Sigma | A6965 | Accutase |
| Reagent reservoir, 50 mL | VWR | 89094-680 | |
| Reversible strainer, 37 micrometer | Stemcell technologies | 27251 | |
| Swing bucket plate centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14R | |
| Swing bucket rotor | Beckman Coulter | SX4750A | |
| Tuberculin syringe, 1 mL | BD | 309659 | |
| Ultra low attachment microplate, 96 well | Corning | 4515 |
References
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