Summary
Ett protokoll för att skapa genmodifierade mänskliga pseudoöar från spridda mänskliga öar celler som är sensorik av lentivirus redovisade kort hårnål RNA (shRNA) presenteras. Detta protokoll utnyttjar lättillgängliga enzym-och kultur fartyg, kan utföras enkelt och producerar genetiskt modifierade pseudoöar som lämpar sig för funktionella och morfologiska studier.
Abstract
Olika genetiska verktyg finns tillgängliga för att modulera gener i bukspottskörteln öar av gnagare att dissekera funktion av Holmen gener för diabetesforskning. De uppgifter som erhållits från gnagare är dock ofta inte helt återgivna i eller tillämpliga på mänskliga öar på grund av välkända skillnader i holme struktur och funktion mellan arterna. För närvarande är tekniker som är tillgängliga för att manipulera genuttryck för mänskliga öar mycket begränsade. Införandet av transgenens i intakt öar av adenovirus, plasmid, och oligonukleotides lider ofta av låg verkningsgrad och hög toxicitet. Låg verkningsgrad är särskilt problematiskt i gen nedreglering studier i intakt öar, som kräver hög verkningsgrad. Det har varit känt att enzymatiskt spridda ö-celler reaggregera i kulturen bildar spheroids kallas pseudoislets. Storlekskontroll reaggregation av mänskliga ö-celler skapar pseudoöar som upprätthåller dynamiska första fasen insulinsekretion efter långvarig kultur och ge ett fönster för att effektivt införa lentiviral kort hårnål RNA (shRNA) med låg toxicitet. Här beskrivs ett detaljerat protokoll för skapandet av mänskliga pseudoöar efter lentiviral signaltransduktion med hjälp av två kommersiellt tillgängliga multispot-plattor. Protokollet kan enkelt utföras och möjliggör effektiv nedreglering av gener och bedömning av dynamiken i insulinsekretionen med hjälp av mänskliga ö-celler. Sålunda, mänskliga pseudoöar med lentiviral medierad gen modulering ger en kraftfull och mångsidig modell för att bedöma genfunktion inom mänskliga ö-celler.
Introduction
Förlusten av funktionell beta cellmassa är den centrala patologi för både typ 1 och typ 2 diabetes1. Medan betaceller är producenter av insulin i bukspottskörteln öar, kommunikation mellan betaceller och icke-betaceller spelar en avgörande roll i regleringen av insulinsekretion2. Dessutom bidrar dysreglering av glukagon sekretion till hyperglykemi i diabetes3. Således, det finns ett starkt intresse att modulera genuttryck av celler i bukspottskörteln öar att ta itu med mekanismen bakom utvecklingen av Holmen dysfunktion i diabetes. En mängd olika metoder, inklusive transgena möss, finns tillgängliga för att modulera genuttryck av mus öar. Men, mänskliga och mus öar visar distinkt innervation, cell distribution, förhållandet mellan beta till alfaceller, och svar på sekretagogues4. Därför är direktbedömning av genfunktion i humana öar oerhört viktigt för att förstå patofysiologin hos mänskliga pankreasöar.
Adenoviral vektor är den mest använda viral vektor för att transduce pankreasöar in vitro på grund av den höga verkningsgraden av transduktion i icke-skiljande celler. Adenovirus tränger dock inte in i kärnan av kobbar effektivt, särskilt i humana öar5, och är cytotoxiskt vid höga doser6. Jämförelsevis, lentiviral vektor är mindre cytotoxiska och levererar exogena gener permanent in i kromosomen av post-mitotiska celler, vilket gör det ett allmänt testat fordon för genterapi7. Emellertid, förmågan hos lentivirus att tränga in i kärnan av intakt mänskliga öar är också begränsad, vilket kräver partiell dispersion av enzymatisk matsmältning för att öka transduktionseffektivitet8. Förbehållet med spridningen av intakt mänskliga öar är avbrottet i cell-cell och cell-matris kommunikation, som äventyrar den dynamiska regleringen av insulinsekretion kritisk för upprätthållandet av glukos homeostas i människor9. Det har således varit en utmaning att bedöma gen moduleringens inverkan på den dynamiska regleringen av Holmen-funktionen i en modell av mänskliga öar.
Det har varit känt att spridda ö-celler från mänskliga och gnagare öar självständigt reaggregera till Holmen-liknande strukturer som kallas "pseudoislets". Pseudoislets Visa beta och icke-beta cell distribution liknar inhemska öar10,11. Dessutom, efter långsiktig kultur, inhemska holmar förlorar successivt robust första fasen insulinsekretion5,10,11,12. Ändå visade pseudoöar bättre bevarande av första fasen insulinsekretion som svar på glukos jämfört med inhemska öar efter samma kultur period5. Förutom att ha bättre bevarande av insulinsekretion, storleks-kontrollerad reaggregation av mänskliga ö-celler i låga tillbehör tallrikar11 ger ett fönster av möjlighet att införa lentivirus vektorer innan deras reaggregation i pseudoislets. Flera studier har visat nyttan av pseudoislets kombinerat med lentiviral medierad transduktion. Caton et al.13 rapporterade att införandet av den gröna fluorescerande protein (GFP) uttrycker lentivirus hade liten effekt på insulinsekretion samtidigt uppnå homogena uttryck av GFP i råtta pseudoöar jämfört med icke-infekterad kontroll. De visade också den specifika effekten av olika connexins på insulinsekretion genom att överuttrycka connexins 32, 36, och 43 via lentivirus13. Mänskliga pseudoöar beredd med en kommersiellt tillgänglig 96-väl ultra-låg fästplatta visade att lentiviral-medierad överuttryck av transkriptionsfaktorn SIX3 förbättrar insulinsekretion bedömas genom statisk inkubation14. Nyligen, mänskliga pseudoislets utarbetats med en 96-väl ultra-låg fästplatta användes för att downreglera glukokinas via lentiviral kort hårnål RNA (shRNA) som ett bevis på princip för att visa att glukossänkande insulinsekretion reduceras, medan KCl-stimulerad insulinsekretion bevarades5. Studien visade också att mänskliga pseudoöar liknar inhemska öar i genuttryck och sekretoriska profiler, ytterligare stödja nyttan av mänskliga pseudoöar att dissekera regleringen av Islet funktion5. Även om perifusion inte utfördes, en bioengineered mikrobrunn kultur tallrik som nyligen blev kommersiellt tillgängliga, rapporterades också vara förenligt för lentiviral transduktion och producerade mänskliga pseudoöar som uppvisade utmärkt insulin sekretion in vitro och in vivo efter transplantation11. Kollektivt, mänskliga pseudoholmen formation kombinerat med lentiviral transduktion är en enkel och effektiv metod för att undersöka mänsklig holme patofysiologi, vilket ger ett värdefullt verktyg för att utföra mekanistiska studier i mänskliga öar.
I den aktuella rapporten, ett protokoll för att bilda mänskliga pseudoislets sensorik med lentivirus med två kommersiellt tillgängliga plattformar, en 96-väl ultra-låg fästplatta och en mikrobrunn kultur tallrik presenteras. Både uppnå effektiv modulering av genuttryck och skapa mänskliga pseudoöar som är kompatibla för nedströms bedömningar inklusive statisk inkubation och perifusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Före påbörjande av studier, en försökspersoner forsknings beslut gjordes av University of Iowa institutionella Review Board, som fastställt att studien inte uppfyllde kriterierna för försökspersoner forskning. Konsultera den lokala Granskningsnämnden innan studien inleds för att avgöra om källan till kobbar och planerad studie kräver förhandsgodkännande.
Anmärkning: Typiskt är 1200 − 1400 ö-ekvivalent (IEQ) av humana öar krävs för bildandet av 192 pseudoöar i storlek 3 000 celler/pseudoöar i en 96-väl ultra-låg fästplatta eller 1 200 pseudoöar i storleken på 500 celler/pseudoöar i en mikrobrunn kultur tallrik. IEQ av öar som krävs varierar mellan olika preparat av mänskliga öar som givare faktorer (ålder, hälsa, vikt), isolering effektivitet, och odlingsförhållanden påverkar avkastningen av den enda cellsuspensionen. I detta protokoll, lentivirus som innehåller shRNA inriktning en gen av intresse används. Cytomegalovirus (CMV) och humant fosfoglyceratkinas (hpgk) promotor baserade lentivirala vektorer rapporteras att besegra-reglera genen effektivt i mänskliga pseudoislets5,15. Användningen av lentivirus kräver försiktighet som Biohazard16. Kontakta den lokala Biosäkerhetskommittén innan du påbörjar användningen av lentivirus.
1. över natten kultur av mänskliga öar för återhämtning efter transporten
- Förbered Connaught medicinska forskningslaboratorier 1066 (CMRL-1066) medium kompletterat med 1% humant serumalbumin (HSA) genom att kombinera 50 mL av CMRL-1066, 0,5 g HSA, 0,5 mL penicillin-streptomycin och 0,5 mL av 100 mg/mL glutamin (1% HSA CMRL) i biologisk säkerhetsskåp (BSC) och passerar genom ett 0,2 μm filter för sterilisering.
- Snurra försiktigt frakt flaskan för att hålla kobbar i fjädring. Överför transportmediet som innehåller kobbar till ett 50 mL koniskt centrifugeringsrör. Låt röret sitta i BSC i 15 min så att holarna bosätta sig på botten av röret.
- Ta försiktigt borttransport mediet utan att störa Holmen-pelleten med en 10 mL pipett. Återsuspendera Holmen-pelleten i 1% HSA CMRL till en koncentration av 400 IEQ/mL.
- Överföra öar till en icke-vävnad kultur behandlade skålen. Om kobbar är uppdelade i flera rätter, hålla holmar jämnt suspenderade i medium genom att försiktigt snurra innan klyvning. Kultur öar vid 37 ° c i en 5% CO2 inkubator över natten.
Anmärkning: Användning av en icke-vävnad kultur behandlade skålen krävs för att förhindra fastsättning av holkar till plattan.
2. beredning av encellig suspension från humana öar
- Förbered följande: CMRL-1066 medium med 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (HiFBS), penicillin-streptomycin, och glutamin (10% HiFBS CRML) vid rumstemperatur (RT), en 40 μm SIL, en 35 mm petriskål, en 1 mL tuberkulin spruta och en hemocytometer.
- Överför mänskliga öar efter natten kultur till ett 15 mL koniskt centrifug röret. Centrifugera vid 190 x g i 5 min i en sväng skopa rotor. Aspirera medium med en 5 mL pipett utan att störa öpelleten.
- Tvätta pelleten genom att tillsätta 10 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i röret, blanda försiktigt och centrifugera vid 190 x g i 5 min. Aspirera PBS utan att störa Holmen pellets.
- Re-suspendera Holmen pellet i 0,5 mL av en pre-värmde proteolytiska och collagenolytic Enzymblandning och Pipettera 5x med hjälp av en P1000 pipett att blanda holkar. Inkubera vid 37 ° c i 5 min. Blanda genom att Pipettera upp och ner försiktigt 1 − 5 gånger.
Anmärkning: Aggressiv pipettering kommer att öka cell förlusten. - Kontrollera för grumlighet (enstaka celler) och antalet flingor (osmält öar). Tillsätt 2 − 3 min till 37 ° c inkubation beroende på omfattningen av matsmältningen bedömas av grumlighet och antalet flingor. Stoppa matsmältningen när flingor reduceras till ~ 10% av predigestion och lösningen är grumlig.
Anmärkning: Tid som krävs för matsmältningen varierar beroende på Holmen storleksfördelning av varje mänsklig ö beredning. - Placera en 40 μm SIL i en 35 mm petriskål och blöt SIL genom att tillsätta 1 mL 10% HiFBS CMRL och pressning med 1 mL sprutkolven. Överför alla cellsuspensionen ovanpå sil och samla in pass-through i en ny 15 mL tub.
- Tvätta röret som används för Holmen matsmältning med 0,5 mL färskt CMRL medium för att samla överblivna celler och passera tvätta genom SIL. Kombinera pass-through i en 15 mL tub. Upprepa en gång.
- Därefter separera osmälta öar kvar på SIL genom att trycka på SIL placeras i en 35 mm skålen med 1 mL spruta kolven. Samla pass-through igen och tvätta SIL med färska CMRL-1066 att ta bort alla kvarvarande smält öar från sil och skålen. En total ~ 3 mL encellig suspension kommer nu att vara i 15 mL-röret.
- Anteckna den totala volymen av cellsuspensionen och ta 10 μL alikvot av celler för att räkna cellnumret på en hemocytometer.
- Centrifugera cellsuspensionen i 5 minuter vid 200 x g. Avlägsna mediet utan att störa pelleten. Gå vidare till steg 3.1.1 om du använder en 96-väl ultra-låg fästplatta eller steg 3.2.1 om du använder en 24 väl mikrobrunn odlings plåt för att aggregera cellerna.
3. pseudoholmen formation och transduktion av lentivirus
- Protokoll med hjälp av en 96-well ultra-låg fästplatta
- Bestäm önskat antal celler per pseudoholmen och antalet pseudoöar att skapa. Typiskt, 1000 − 3000 celler används för varje pseudoholmen för en 96-väl ultra-låg fästplatta. För 3 000 celler per pseudoholmen, justera cellsuspensionen till 1 x 105 celler/ml genom att omsuspenderas Holmen pellets från steg 2,10 i 10% HiFBS cmrl så att 30 μl cellsuspension har 3 000 celler. Beräkna den totala volymen av 1 x 105 celler/ml encellig suspension (ml) som krävs enligt följande ekvation:
Den totala volymen av 1 x 105 celler/ml encellig suspension (ml) = (antal celler per pseudoö) x (antal pseudoöar som görs)/1 x 105.
Anmärkning: Justera koncentrationen av cellsuspensionen baserat på önskat antal celler per pseudoislet så att 30 μL cellsuspension gör en pseudoislet. - Överför den begärda volymen (30 μL x antal pseudoöar) av encellig suspension till ett nytt 15 mL-rör. Tillsätt 250 transduktionsenheter (TU)/cell av lentivirus innehållande shRNA som riktar sig mot en gen av intresse eller kontroll.
Försiktighet: Lentivirus klassificeras som biosäkerhetsnivå 2 och kan integreras i DNA av infekterade celler.
Anmärkning: Använd koncentrerad lentivirus så att volymen av lentivirus läggas är minimal. Titer krävs per cell för effektiv gen ljuddämpning kan variera beroende på lentiviral konstruktion. - Blanda cellsuspensionen med virus genom att Pipettera försiktigt 5x med en P1000 pipett. Överför blandade celler till en 50 mL steril reagensmedelsbehållare om du använder en 8-kanals pipett.
- Fördela 30 μL per brunn av encellig suspension blandat med lentivirus i varje brunn med hjälp av en 8-kanals pipett eller en P200 pipett beroende på antalet brunnar.
- Centrifugera 96-brunnen plattan i en sväng-skopplatta Centrifugera vid 270 x g vid RT för 7 min. Kontrollera om cellerna är samlade i mitten av varje brunn. Om inte, Centrifugera igen som insamling av alla celler i mitten av brunnen är kritisk för pseudoholmen formation. Kultur vid 37 ° c i en Befuktad 5% CO2 inkubator över natten.
- Tillsätt 100 μL förvärmd 10% HiFBS CMRL per brunn nästa morgon för att undvika uttorkning av celler under efterföljande kultur. Centrifugera vid 270 x g, RT för 7 min. kultur vid 37 ° c i en 5% Co2 inkubator. Pseudoislets kommer att slutföra bildandet i 5 − 7 dagar.
- Vid skörd av pseudoöar, Förvärm den önskade volymen av 10% HiFBS CMRL (100 μL per holme), Förbered 1 50 mL steril reservoar, en steril 10 cm petriskål och en 8-kanals pipett i BSC.
- Ta bort 96-brunnen plattan från inkubatorn och placera i BSC. Pipettera över 100 μL per holme med 10% HiFBS CMRL till en reservoar.
- Pipettera 100 μL per brunn av 10% HiFBS CMRL från en reservoar till pseudoöar och Pipettera upp och ned 2 − 3 gånger försiktigt i brunnen för att lyfta upp holmar. Sedan aspirera medium i brunnen som innehåller en pseudoislet och mata ut i en 10 cm petriskål. Användning av en 8-kanals pipett möjliggör överföring av 8 pseudoöar på en gång.
- Kontrollera plattan under ett ljusmikroskop för att säkerställa fullständig avlägsnande av alla pseudoöar. Pseudoöar bildar fast aggregat och förblir aggregerade efter lyft. De pseudoöar är nu redo för nedströms experiment.
- Bestäm önskat antal celler per pseudoholmen och antalet pseudoöar att skapa. Typiskt, 1000 − 3000 celler används för varje pseudoholmen för en 96-väl ultra-låg fästplatta. För 3 000 celler per pseudoholmen, justera cellsuspensionen till 1 x 105 celler/ml genom att omsuspenderas Holmen pellets från steg 2,10 i 10% HiFBS cmrl så att 30 μl cellsuspension har 3 000 celler. Beräkna den totala volymen av 1 x 105 celler/ml encellig suspension (ml) som krävs enligt följande ekvation:
- Protokoll med hjälp av en 24-brunn mikrobrunn kultur tallrik
- Värm upp anti-vidhäftning Sköljlösningen (tabell över material) till RT för effektiv sfäroid formation. Också, före varm Plain CMRL-1066 och 10% HiFBS CMRL.
- Tillsätt 500 μl per brunn av anti-följsamhet sköljlösning till varje brunn av 24-väl mikrobrunn kultur plattan som ska användas för pseudoislets. Centrifugera vid 1 300 x g i 5 minuter i en svängig plattcentrifug.
- Observera plattan under ett mikroskop för att säkerställa att luftbubblor avlägsnas från mikrobrunnar. Om luftbubblor fastnar i mikrobrunnar, Centrifugera vid 1 300 x g i 5 min igen.
- Aspirera på anti-följning Sköljlösningen från brunnarna i en BSC. Skölj varje brunn med 2 mL varm slätt CMRL-1066 en gång. Aspirera CMRL-1066. Tillsätt 0,5 mL/brunn av varm 10% HiFBS CMRL till varje brunn planerat för användning. Brunnar är nu redo för lastning spridda mänskliga ö-celler som utarbetats i steg 2,10.
- Bestäm det totala antalet celler som behövs för varje brunn. En brunn av 24-brunn mikrobrunn kultur Plate innehåller 1 200 mikrobrunnar och bildar 1 200 pseudoislets. 500 celler per pseudoislet x 1200 mikrobrunnar = 6 x 105 celler. Omsuspendera enstaka celler från steg 2,10 till 6 x 105 celler i 0,8 ml 10% HiFBS cmrl i ett sterilt 1,5 ml-rör.
Anmärkning: Den maximala volymen per brunn är 2 mL. Volym av cellsuspensionen bör inte överstiga 1,5 mL. Protokollet beskriver steg för att skapa en brunn av pseudoholmen sensorik av lentivirus. Skala upp beroende på antalet brunnar som ska göras för varje lentivirus. - För viral Transduction, tillsätt 125 TU/cell till Single cellsuspensionen. Håll volymen av viruset under 0,2 mL. Inkubera cell-och virus blandningen vid 37 ° c med enstaka mild blandning för 1 h för att tillåta kontakt av celler med virus före kondensation av celler i steg 3.2.8.
Anmärkning: Använd koncentrerad lentivirus så att volymen av lentivirus tillsätts är minimum. Lägre antal TU per cell används för protokoll 2 jämfört med protokoll 1 som den totala volymen av medel per cell nummer är mindre. Men titer krävs per cell för effektiv ljuddämpning kan variera beroende på lentiviral konstruera och behöver optimering.
Försiktighet: Lentivirus klassificeras som biosäkerhetsnivå 2 och kan integreras i DNA av infekterade celler. - Efter 1 h, justera den totala volymen av Holmen cell och virus blandningen till 1 mL genom att lägga till 10% HiFBS CMRL. Om celler bildas klumpar efter 1 h inkubation, skingra i enstaka cellsuspension av mild och snabb pipettering 2 − 3 gånger. Pipettering är mycket viktigt för jämn spridning av celler över mikrobrunnar. Överför cellsuspensionen till en brunn av 24-brunnen mikrobrunn kultur plattan.
- Omedelbart efter pipettering, Centrifugera vid 100 x g i 3 min vid RT för att fånga in celler i alla mikrobrunnar. Observera under ett mikroskop för att kontrollera att cellerna är jämnt fördelade i alla mikrobrunnar.
- Odla mikrobrunn-kulturplattan vid 37 ° c i en 5% Co2 -inkubator. Pseudoislets bildas i 24 − 48 h. Pseudoholer kan odlas utan medium förändring i upp till 7 dagar.
- När du byter medium för kultur efter 7 dagar, Ersätt 50% − 75% av mediet för varje medium förändring enligt följande. Avlägsna långsamt 0,5 − 1 mL medium med en P1000 pipett från varje brunn. Tillsätt 0,5 − 1 ml av färska 10% hifbs cmrl långsamt genom att placera ett tips på väggen i brunnen för att undvika att ta bort pseudoöar från mikrobrunn kultur plattan.
- För att förbereda för skörd av pseudoöar, Värm upp 10% HiFBS CMRL medium. Pseudoislets tenderar att flyta upp i serum gratis CMRL-1066 gör det svårt att plocka dem.
- Aspirera 0,5 ml medium från brunn med en 1 ml pipett och fördela Media kraftfullt tillbaka till plattytan för att lyfta upp pseudoöar från mikrobrunn kultur plattan.
- Försiktigt aspirera disingerade pseudoöar med hjälp av 1 mL pipett och överföra öar till en icke-vävnad kultur behandlas 6-brunn tallrik. Passera genom en liten 37 μm vändbar SIL placerad på ett 15 mL koniskt rör. Pseudoislets kommer att förbli på filtret; alla oinkorporerade enskilda celler kommer att flöda igenom.
Anmärkning: För att undvika förlust av mindre pseudoöar genom SIL, kan SIL utelämnas. - Fördela 1 mL 10% HiFBS CMRL över hela ytan av brunnen för att få bort eventuella kvarvarande pseudoöar, aspirera disingerade pseudoöar och passera genom SIL. Upprepa 3x för att säkerställa fullständig insamling av alla pseudoöar från brunnar.
- Observera mikrobrunn-kulturplattan under ett invertermikroskop för att säkerställa att alla pseudoöar samlas in. Upprepa tvätten som i steg 3.2.14 om pseudoislets kvarstår.
4. RNA-extraktion för utvärdering av effektiviteten hos gen ljuddämpning
- Plocka pseudoislets i RNase gratis PBS i en 1,5 mL microcentrifug röret och centrifugera vid 300 x g i 3 min vid 4 ° c. Ta bort PBS utan att störa Holmen pellets och tvätta en gång med PBS följt av centrifugering vid 300 x g i 3 min vid 4 ° c.
- Sug upp det mesta av PBS med en P1000 pipett. Byt sedan till en P10-pipett för att ta bort resten av PBS utan att störa Holmen-pelleten.
- Tillsätt 0,5 mL guanidinium tiocyanat RNA extraktionsmedel (tabell över material) per tub. Homogenisera pseudoöarna med hjälp av en motordriven stöt för 2 − 3 gånger. Den homogena i guanidinium kaliumtiocyanat RNA extraktion reagens kan nu lagras vid-80 ° c eller bearbetas för RNA rening.
Anmärkning: 24 av 3 000 cell-pseudoöar bildas i en 96 väl tallrik eller 48 av de 500 cell-pseudoöar bildas i en mikrobrunn kultur plattan är tillräckliga för att få 0,5 − 1 μg RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerar viktiga steg i tillverkningen av pseudoöar med hjälp av en 96-well ultra-låg fästplatta och en mikrobrunn kultur tallrik. Figur 2A visar sekventiella förändringar i morfologin under bildandet av pseudoöar från 3 x 103 mänskliga ö-celler i en 96-väl ultra-låg fästplatta. Monolayer eller lösa klumpar av celler observerade i dag 1 ändras till fasta aggregat med en slät, rund kant vid dag 5 till 7 (figur 2A). I en mikrobrunn kultur tallrik, bildandet av solida pseudoöar är vanligtvis synlig inom 4 dagar (figur 2b). När 600 celler/mikrobrunn var pläterade i mikrobrunn kultur plattan, var mänskliga ö-celler kondenseras till spheroids av enhetlig storlek. Det observeras att en mikrobrunn kultur plattan tillåter framgångsrik bildandet av pseudoöar från ett litet antal celler jämfört med en 96-väl ultra-låg fästplatta. Typiskt, över 1 500 celler/pseudoislet behövs för en 96-väl ultra-låg fästplatta, medan 500 celler/pseudoislet är tillräckliga för en 24-väl mikrobrunn kultur tallrik. Framgångsrikt bildade pseudoöar kvarstår som spheroids efter återhämtning från en 96 ultra-låg fästplatta eller en mikrobrunn kultur tallrik och är kompatibla för nedströms tillämpningar inklusive statisk inkubation (figur 3a) och perifusion (figur 3b). den enhetliga storleken på pseudoöar minskar variationen inom en testgrupp och möjliggör statisk inkubation med så lite som 5 pseudoöar per mätning (figur 3a). Också, mänskliga pseudoöar upprätthöll robust första fasen insulinsekretion som svar på glukos efter 7 dagar av kultur när de ursprungliga mänskliga öar odlade under en liknande tid visade avtrubbar första fasen glukos-stimulerad insulinsekretion ( Figur 3b)5. Införandet av lentivirus i en enda cellsuspension säkerställer en effektiv och homogen transduktion av ö-celler och uppnår mycket effektiv Down-reglering av gener som visas i figur 3c. Alla resultat som visades erhölls med hjälp av humana öar från icke-diabetiska givare.
Figur 1: process av mänsklig pseudoholsberedning. a) suspensionen som innehåller 4 000 IEQ av humana öar blir grumlig efter nedbrytning av en proteolytisk och kollagenolytisk Enzymblandning och mild pipettering. (b) mänskliga öar efter spridningen leds genom en sil. Osmälta öar som återstår ovanpå SIL sprids med hjälp av en 1 mL sprutkolv. (c, d) Mikroskopbilder av den enda cellsuspensionen som innehåller 3 000 celler/väl i en 96-väl ultra-låg fästplatta före (c) och efter (d) centrifugering. (e, f) Mikroskopbilder av den enda cellsuspensionen som innehåller 500 celler/mikrobrunn i en 24-brunn mikrobrunn kultur plattan före (e) och efter (f) centrifugering. Scale bar = 250 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: morfologi av mänskliga pseudoöar. Sekventiella förändringar i morfologi av mänskliga pseudoöar skapade (a) i en 96-väl ultra-låg fästplatta från 3 000 celler och (b) i en 24-väl mikrobrunn kultur tallrik från 500 celler. Scale bar = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: exempel på funktionella analyser med humana pseudoöar. (a) representativ statisk inkubation utförd med hjälp av mänskliga pseudoöar som skapats i en mikrobrunn kultur tallrik från en enda givare i storlek 500 mänskliga ö-celler per pseudoislet. Fyra uppsättningar av 5 pseudoöar inkuberades för 1 h i Krebs-ringer bikarbonatbuffert kompletterad med antingen 2 mM eller 16,8 mM glukos. Varje symbol representerar insulinsekretion från en uppsättning av 5 pseudoöar. Medelvärde ± standardfel för medelvärdet (SEM) visas. *, p < 0,05 av Students t-test. Representativa resultat från tre givare. b) representativ perifusions testning av insulinsekretion från mänskliga pseudoöar som skapats i en mikrobrunn odlings platta som svar på 16,7 mm glukos och 30 mm KCL. metod för perifusion publicerades tidigare5. Medelvärde ± SEM av insulinsekretion från två uppsättningar av 40 pseudoöar som skapats i en mikrobrunn kultur tallrik från en enda givare i storlek 500 mänskliga ö-celler per pseudoislet tallrik visas. Representativa uppgifter från sex givare. (c) pseudoislets skapades med lentivirus redovisade shRNA inriktning Human atgl (inriktning CCTGCCACTCTATGAGCTTAA, vänster) eller PLIN5 (inriktning GACAAGCTGGAAGAGAAGCTT, höger). Kontroll pseudoöar var sensorik med lentivirus uttrycker kodade sekvens (SCR) tidigare publicerade5. MRNA-uttrycket för varje gen bestämdes genom realtids polymeras kedjereaktion (PCR) som tidigare publicerats5. Data uttrycktes med 2-ddct med peptidylprolyl Isomerase B (ppib) som intern kontroll17. Varje punkt representerar data från varje givare för en indikerad primer och en datauppsättning från samma givare ansluts med en linje. N = 3 givare. *; p < 0,05 av Students t-test. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här, ett detaljerat protokoll för att generera mänskliga pseudoöar som är sensorik av lentivirus med hjälp av en 96-väl ultra-låg fästplatta eller en mikrobrunn kultur tallrik presenteras. Pseudoöar har rapporterats Visa morfologi och sekretoriska funktioner som liknar infödda mänskliga öar och kan odlas för långvarig tid in vitro-5,11,18. Till skillnad från infödda mänskliga öar som uppvisar en stor variation i storlek, pseudoöar är relativt enhetliga i storlek, minska variationen mellan givare och experimentella replikat5,11. Nedreglering av gener som kräver högeffektiv transduktion kan utföras enkelt före bildandet av pseudoöar i encellig suspension. Denna metod undviker svårigheten att viral penetration genom lager av celler i intakt öar. Sålunda, denna enkla, mycket effektiv, och reproducerbara protokoll för skapandet av mänskliga pseudoislets har breda tillämpningar.
Medan flera olika plattformar har rapporterats för bildandet av pseudoislets12,14,19,20, både en 96-väl ultra-låg fästplatta och en mikrobrunn kultur tallrik är kommersiellt tillgänglig, vilket gör att denna teknik kan antas av alla laboratorier. Även om hängande droppe metod12 också tillåter bildandet av mänskliga pseudoöar med hjälp av gemensamma LabWare, potentiella begränsningar inkluderar svårigheten att kontrollera storlek och reaggregation varaktigheten av pseudoöar. Dessa begränsningar berodde på den begränsade volymen per droppe pseudoholmen och pågående avdunstning under den 5 − 7-dagarskultur som krävdes för pseudoholmen. Dessutom är det lättare att innehålla lentivirus med användning av en 96 väl ultra-låg fästplatta eller en mikrobrunn kultur tallrik jämfört med hängande Drop metoden.
Flera steg i protokollet kräver noggrann uppmärksamhet. Att optimera nedbrytning av intakta öar med den proteolytiska och collagenolytiska enzym blandningen är kritisk eftersom både under-och över-rötning kommer att minska avkastningen av encellig suspension och därefter påverka aggregering av pseudoislets. Under matsmältningen är det viktigt att noga övervaka öar för försvinnandet av klumpar och den ökade grumlighet som kobbar separerar till enskilda celler. Det är viktigt att notera att den optimala tiden för matsmältningen varierar mellan öar från olika givare. Den optimala tiden är beroende av flera faktorer, inklusive sjukdomshistoria och ålder av varje givare, längden på ischemi tid, den ö isolering förfarande som används, holme storlek, ö renhet, Holmen lönsamhet, och sjöfart villkor. Vanligtvis används mänskliga öar med lönsamhet och renhet som är högre än 80% och inom 5 dagar efter isolering. Noggrann och skonsam pipettering under spridningen är också viktigt att bibehålla cellernas lönsamhet och återhämtning som i slutändan kommer att påverka cell aggregering och den slutliga storleken på pseudoöar bildas. Vid dispensering av ö-cellsuspension till brunnar (steg 3.1.4 och 3.2.7) är skonsam och noggrann blandning av celler viktigt för att uppnå en jämn fördelning av enstaka celler till mikrobrunnar. Om celler bildas klumpar efter 1 h inkubering med lentivirus, det kräver mild pipettering att bryta klumpar i encellig suspension före den slutliga centrifugering.
Vi har haft liknande framgångar i skapandet av mänskliga pseudoöar efter lentiviral signaltransduktion med både en 96-brunn tallrik och mikrobrunn kultur tallrik. Valet mellan de två plattformarna beror på storleken och antalet pseudoöar som önskas. En mikrobrunn kultur plattan har små, Pyramid formade bottnar tillåter kondensation av ett mindre antal celler jämfört med en 96 väl rund bottenplattan. Således kan antalet celler per pseudoislet reduceras för en mikrobrunn kultur tallrik. Dessutom skapar ett enda centrifugeringssteg alla pseudoöar samtidigt i en mikrobrunn kultur tallrik medan flera pipettering krävs för att skapa pseudoholkar i en 96-brunn tallrik. Sålunda, skala upp skapandet av pseudoöar är lättare i en mikrobrunn kultur tallrik. Den för närvarande tillgängliga mikrobrunnen kultur plattan erbjuder dock inte flexibilitet i antalet pseudoöar som skapas. För närvarande är det minsta antalet pseudoöar som skapats med hjälp av en mikrobrunn kultur plattan 1 200 och kan ökas endast med faktorn 1 200. Således använder vi vanligtvis en 96-brunn plattan för småskaliga pilotexperiment och för ett experiment där små mängder av prover är tillräcklig, såsom en insulinsekretion assay och RNA extraktion för genuttryck. Vi har använt pseudoislets från en mikrobrunn kultur tallrik för analyser som kräver ett stort antal celler såsom Western blot, syreförbrukning hastighet bestämning av en metabolisk analysator, och triglycerid utvinning.
Den viktigaste begränsande faktorn för generering av mänskliga pseudoöar är förlusten av celler under beredningen av Single cellsuspension. Medan 1 IEQ av mänsklig holme anses innehålla runt 2 000 celler, återvinning av Single cellsuspension är typiskt 30% eller lägre på grund av flera tvättning och passerar genom en sil. Heterogenitet av Holmen storlek gör det också svårt att separera alla öar samtidigt. Medan mild pipettering och användning av proteolytiska och collagenolytiska enzym blandningen i protokollet är insatser för att kombinera mekaniska och enzymatiska krafter för maximal återhämtning av enstaka celler, det finns fortfarande en oundviklig förlust av celler. Således kräver tillämpningen av pseudoöar tydlig motivering framför studerar intakt mänskliga öar. Det måste också påminnas om att insulinutsöndringen från pseudoholer är mer robust än öar odlade under samma period men tenderar att vara lägre jämfört med nyligen isolerade öar5,11.
Även om det finns begränsningar, stabil och högeffektiv ljuddämpning kombinerat med bättre bevarande av glukos-stimulerad insulinsekretion för långvarig tid i kulturen möjliggör bedömning av genfunktion i mänskliga ö-celler. Dessutom, den komplexa intercellulära kommunikationen mellan beta-beta och beta-icke betaceller föreslås ha en reglerande roll i Islet funktion. Emellertid, det finns för närvarande begränsad information om intercellulära kommunikation inom human islets. Med ökad tillgänglighet av cellspecifika markörer21, är det möjligt att skapa mänskliga pseudoöar med definierad cell sammansättning, som nyligen rapporterats i mus ö-celler22, vilket kommer att underlätta förbättrad förståelse av cell-cell kommunikation mellan mänskliga ö-celler. Den senaste utvecklingen av avbildning av tredimensionella vävnader också potentiellt ökar nyttan av mänskliga pseudoislets som en modell för att avslöja hur cellulära polaritet och intercellulära kommunikation regleras i mänskliga öar. Sålunda, mänskliga pseudoöar ger en användbar modell för att dissekera funktioner gener av intresse och andra frågor inom området för ö-biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes ekonomiskt av National Institutes of Health till Y.I. (R01-DK090490) och American Diabetes Association till Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. och Y.I. stöds av den broderliga Order of Eagles diabetes Research Center. A.B. stöds av ett nationellt institut för hälsoutbildning Grant (T32NS45549). Författarna utnyttjas mänskliga pankreasöar som tillhandahålls av NIDDK-finansierade integrerade Holmen distribution program (IIDP) vid City of Hope (2UC4DK098085).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-adherence rinsing solution | Stemcell technologies | 7919 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series Type A2 | |
| Cell strainer, 40 micrometer | Corning | 431750 | |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530037 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Heracell VIOS 160i | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent | ThermoFisher | 15596026 | Trizol |
| Glutamine | ThermoFisher | 25030164 | |
| Hemocytometer | Marien Feld | Neubauer-Improved Bright line | |
| Human serum albumin | Sigma | A1653 | |
| Inverted microscope | Fisher brand | 11-350-119 | |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 20 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microwell culture plate | Stemcell technologies | 34411 | Aggrewell 400, 24 well |
| Motor-driven pestle | GAMUT | #399X644 | |
| Non-tissue culture treated dish, 10 cm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| PBS | ThermoFisher | 14190250 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Petri dish, 35 mm | Celltreat | 229638 | |
| Pipette, 5 mL | DOT Scientific, | 667205B | |
| Pipette, 8-channel | VWR | #613-5253 | |
| Pipette, 10 mL | VWR | 667210B | |
| Pipette, P10 | Denville | UEZ-P-10 | |
| Pipette, P200 | Denville | UEZ-P-200 | |
| Pipette, P1000 | Denville | UEZ-P-1000 | |
| Proteolytic and collagenolytic enzyme mixture | Sigma | A6965 | Accutase |
| Reagent reservoir, 50 mL | VWR | 89094-680 | |
| Reversible strainer, 37 micrometer | Stemcell technologies | 27251 | |
| Swing bucket plate centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14R | |
| Swing bucket rotor | Beckman Coulter | SX4750A | |
| Tuberculin syringe, 1 mL | BD | 309659 | |
| Ultra low attachment microplate, 96 well | Corning | 4515 |
References
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. Stable and flexible system for glucose homeostasis. Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).
- Cryer, P. E. Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes. Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).
- Arrojo e Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
- Harata, M., et al. Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets. Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).
- Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response. Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).
- Hughes, A., et al. Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus. Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).
- Jimenez-Moreno, C. M., et al. A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors. Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).
- Bonora, E., et al. Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).
- Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets. Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).
- Yu, Y., et al. Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice. Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).
- Zuellig, R. A., et al. Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).
- Caton, D., et al. Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells. Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Peiris, H., et al. Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays. Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).
- Schlimgen, R., et al. Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Li, N., et al. Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).
- Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening. British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).
- Hilderink, J., et al. Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).
- Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis. Cell Metabolism. (18), (2018).
- Reissaus, C. A., Piston, D. W. Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets. Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).
