Summary
Здесь мы представляем протокол для анализа в пробирке нуля с использованием первичных фибробластов и для in vivo кожи раны заживления анализа у мышей. Оба анализа являются простыми методами для оценки in vitro и in vivo заживления ран.
Abstract
Нарушение кожного заживления ран является серьезной проблемой для пациентов, страдающих диабетом и для пожилых людей, и есть необходимость в эффективном лечении. Соответствующие подходы in vitro и in vivo необходимы для идентификации новых молекул-мишеней для лечения лекарственными препаратами для улучшения процесса заживления ран. Мы определили субъединицу кальциевых каналов с напряжением,загнанные в напряжение (Каве3) в качестве потенциальной целевой молекулы, способной влиять на заживление ран в двух независимых анализах, т.е. в анализе миграции в пробирке и модели камеры in vivo dorsal skinfold. Первичные мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) остро изолированы от дикого типа (WT) и Cav3-дефицитныхмышей (CavNo3 KO) или фибробластов остро изолированы от WT мышей, обработанных siRNA для снижения регулирования экспрессии гена Cacnb3 , кодирование CavNo3, были использованы. Царапина была применена на монослой соединительных клеток, и за закрытием разрыва последовало получение микроскопических изображений в определенных временных точках до полного перераспределения разрыва мигрирующими клетками. Эти изображения были проанализированы, и скорость миграции клеток была определена для каждого состояния. В in vivo анализ, мы имплантировали царской кожи камеры на WT и Cav'3 KO мышей, применяется определенная круговая рана 2 мм диаметром, покрыл рану стеклянным крышкой, чтобы защитить его от инфекций и высыхания, и мониторинг макроскопической замыкания раны с течением времени. Закрытие ран было значительно быстрее у мышей Cacnb3-генно-дефицитных. Потому что результаты in vivo и in vitro assays коррелируют хорошо, анализ in vitro может быть полезен для скрининга высокой пропускной способностью перед проверкой in vitro хитов по модели заживления ран In vivo. То, что мы показали здесьдля диких типа и Cav 3-дефицитных мышей или клеток также может быть применимо к конкретным молекулам, кроме Cav'3.
Introduction
Заживление ран ы кожи начинается сразу после повреждения кожи, чтобы восстановить целостность кожи и защитить организм от инфекций. Процесс заживления ран проходит через четыре перекрывающиеся фазы; коагуляция, воспаление, формирование новых тканей и ремоделированиетканей 1. Миграция ячеек имеет решающее значение на этих этапах. Воспалительные клетки, иммунные клетки, кератиноциты, эндотелиальные клетки и фибробласты активируются в разное время и вторгаются в рануобласти 2. Методы исследования заживления ран in vitro и in vivo представляют большой интерес не только для понимания основных механизмов, но и для тестирования новых препаратов и разработки новых стратегий, направленных на улучшение и ускорение заживления ран ы.
Для мониторинга и анализа миграции клеток можно использовать анализ миграции царапин. Это часто называют in vitro раны заживления анализа. Этот метод требует объекта культуры клеток3. Это простая процедура, нет необходимости в высококачественном оборудовании и анализ может быть выполнен в большинстве лабораторий клеточной биологии. В этом ассоциировании область, свободная от клеток, создается механическим нарушением монослойной клеток, предпочтительно эпителиальных или эндотелиальных клеток или фибробластов. Клетки на краю нуля будут мигрировать для того, чтобы заселить созданный пробел. Количественная оценка уменьшающейся области, свободной от клеток, со временем напоминает скорость миграции и указывает время, которое ячейки должны закрыть разрыв. Для этой цели, исследователи могут использовать либо остро изолированных клеток из WT мышей или мышей, не имеющих гена интереса4, или увековеченные клетки, доступные из надежных хранилищ клеток. Анализ царапин позволяет изучать влияние фармакологически активных соединений или влияние трансинфицированных cDNA или siRNAs на миграцию клеток.
In vivo, заживление ран является сложным физиологическим процессом, требующим различных типов клеток, включая кератиноциты, воспалительные клетки, фибробласты, иммунные клетки и эндотелиальные клетки для того, чтобы восстановить физическую целостность кожи как можно быстрее1 . Различные методы для изучения in vivo заживление ран были разработаны и используются в прошлом5,6,7,8. Дорсальная камера скожа, описанная в этой статье, ранее использовалась для анализов заживления ран9. Он используется в качестве модифицированного складной шкуры подготовки к коже для мышей. Модифицированная модель камеры для стежков имеет ряд преимуществ. 1) Это сводит к минимуму сокращение кожи, что предотвращает наблюдение за процессом заживления ран и может повлиять на восстановление рану у мышей. 2) Эта камера использует покрытие раны со стеклянным покрыванием, снижение инфекций тканей и высыхания, которые могут задержать процесс заживления. 3) Поток крови и васкуляризация могут непосредственно контролироваться. 4) Это позволяет повторяющиеся актуальные применения фармакологически активных соединений и реагентов для того, чтобы лечить рану и ускорить заживление9,10.
Мы определили субъединики высокого напряжения-gated кальциевых каналов (Cav'3) в качестве потенциальной целевой молекулы, чтобы влиять на заживление раны кожи с помощью двух независимых протоколов, т.е. в пробирке нуля миграции анализа и in vivo дорсальный кожной камеры модели. Для анализа in vitro, мы использовали первичные фибробласты, эти клетки выражают ген Cacnb3, кодирующий белок Cav'3, но не имеют деполяризации индуцированной Ca2 "приток или напряжение-зависимых Токов Ca2 ". Мы описали новую функцию Cav'3 в этих фибробластах: Каве3 связывается с инозитол1,4,5-трисфосфатный рецептор (IP3R) и ограничения кальция релиз из эндоплазмической ретикулума. Удаление гена Cacnb3 у мышей приводит к повышенной чувствительности IP3R для IP3, усиленной миграции клеток и увеличению ремонта раны кожи4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были утверждены и проведены в соответствии с правилами этики и комитетами по защите животных Саарландского и Саарского университетов.
1 Первичная культура клеток и трансфекция siRNA
ПРИМЕЧАНИЕ: В описанном методе используются первичные фибробласты. Эти клетки играют решающую роль в заживлении ран и ремоделирования тканей11. В этом эксперименте, ген Cacnb3, кодируя подразделение Cav'3 высоковольтных закрытых кальциевых каналов12 было вниз-регулируется, тем самым показывая свою роль в миграции клеток в пробирке и ремонте раны кожи в vivo4.
- Подготовка siRNA: Перед восстановлением siRNAs, кратко центрифуги труб, чтобы убедиться, что содержание находится на дне. Восстановите siRNAs в 100 l RNase-свободнобуфер (100 mM ацетат калия, 30 mM HEPES, pH 7.5) обеспеченный изготовлением на концентрации 20 мкм. Это акционерное решение siRNAs.
- Aliquot этот запас раствор на 10 qL на трубку (20 мКм концентрации) и хранить при -20 градусов до использования.
- Используя ультратонкий перманентный маркер, отметьте 6-ну колодую пластину с горизонтальной линией в нижней части каждой скважины, чтобы иметь возможность всегда определить одну и ту же область царапин, представляющих интерес, и следить за ее закрытием.
ПРИМЕЧАНИЕ: 6-хорошо культуры пластин были использованы в этом ассее, потому что они достаточно велики, чтобы обеспечить достаточно места и гибкости, чтобы применить последовательный, воспроизводимый и вертикальный нуля с помощью 200 л пипетки отзыв через монослой ячейки. Если доступно ограниченное число ячеек, то альтернативным и, вероятно, экономичным способом было бы использование 12- или 24-колодцев культуры. - Плита первичных фибробластов, изолированных от дикого типа и No 3-дефицитных мышей4, в 6-колодцов пластины при плотности 5 х 105 клеток / хорошо в присутствии 2 мл Dulbecco в модифицированных Eagle в среде (DMEM) дополнены 10% сыворотки крупного рогатого скота (FCS).
ПРИМЕЧАНИЕ: 5 х 105 5 клеток на хорошо была создана для 6-хорошо культуры пластины и для первичных фибробластов мыши. Тесты могут быть необходимы, если с помощью 12- или 24-хорошо клеточной культуры пластин или других типов клеток, которые могут быть различными по размеру. Клетки должны обрабатываться в стерильной среде, такой как биологическая безопасность шкафов класса II. - Пометьте 6-колодецную пластину клеточного типа, генотипа и даты.
- Переместите 6-хорошую пластину в инкубатор клеточной культуры и поддерживайте клетки при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2 на 24 ч.
- На следующий день, возьмите пластину из инкубатора, аспирировать среды клеточной культуры из колодца, отбросить его и заменить его 2,25 мл свежей среде культуры, добавив его тщательно к стене колодца.
- Для того, чтобы трансфектировать фибробласты с siRNAs, используйте липидный трансфекционный реагент, как это рекомендовано производителем.
- Для каждого трансфекции, этикетка две микроцентрифуги труб. В первом, добавить 9 л трансфекционного реагента и разбавить его 150 л уменьшенной среде сыворотки. Во второй трубке добавьте 1,5 зЛ siRNA(Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 или scrambled siRNA в качестве отрицательного контроля) и разбавьте ее с пониженной сывороткой 150 л.
- Добавьте разбавленную siRNA в трубку, содержащую разбавленный трансфекционный реагент и вихрь в течение 2 с. Инкубировать смесь в течение 5 мин при 21 градусов по Цельсию.
- Этикетка скважин либо Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 или скремблированный siRNA. Добавьте в клетки 250 кЛ смеси реагента siRNA-transfection.
- Поместите 6-колодую культурную пластину обратно в инкубатор и держите клетки при 37 градусах по Цельсию и 5% CO2 на 72 ч.
- Для того, чтобы проверить эффективность заглушения гена Cacnb3, собирать трансинфицированные клетки и выполнять иммуноблотный анализ, как описано ранее4.
2. In vitro раны заживления анализ (царапина миграции анализ)
- Возьмите пластины культуры клеток из инкубатора и изучить клетки под микроскопом с помощью 10x цели. Начните с нуля асссеможно только тогда, когда они достигли 100% выпуклости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для точности и воспроизводимости, 100% сложение является обязательным фактором для начала скретч-миграционных исследований. Поэтому важно сеять одинаковое количество клеток в культурные колодцы, исследовать каждую скважину на случай стыковки и применять царапину в одно и то же время (день 0. Ожидание дольше после того, как клетки достигнут 100% стопроцентности может вызвать различные ответы. - Как только клетка достигает 100% вспухить, аспирируйте среду культуры из наилучшим образом и отбрасываете ее.
- Используйте наконечник пипетки (200 л), чтобы вручную создать повертичную царапину к горизонтальной линии, отмеченной в нижней части скважины, поперек монослойа сольственных ячеек в середине скважины.
- Промыть каждую скважину дважды с 2 мл фосфат-буферного сосудистого (PBS) (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1,5 мМ KH2PO4, 8,1 мМ Na2HPO4, рН 7,4) для удаления высвобожденных факторов из поврежденных клеток, свободных клеток и мусора из поцарапанной области. Добавить 2 мл PBS тщательно против стены колодца, чтобы избежать отсоединения клеток от клеточной культуры хорошо.
- Добавьте 2 мл среды клеточной культуры, содержащей либо 10% сыворотки или 1% сыворотки тщательно каждый колодец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется выполнять царапины под 10% сыворотки и менее 1% сыворотки, чтобы подтвердить, что наблюдаемый эффект вызван пролиферации клеток и миграции или только клеточной миграции. - Переместите пластину на стадию микроскопа и захватите яркие полевые изображения области, свободной от клеток (две области на скважину) сразу после царапин (t'0h) при 10-кратным увеличением с помощью светового микроскопа. Чтобы отобразить всегда одну и ту же область нуля, используйте горизонтальную линию, которая была подготовлена в шаге (1.3), и возьмите одно изображение над этой линией и одно изображение ниже этой линии. Сохранение изображений как TIFF или JPEG.
- Поскольку стадия микроскопа не поддерживает состояние роста клеток, переместите пластину обратно в инкубатор клеточной культуры и держите клетки на уровне 37 градусов по Цельсию и 5% CO2.
- После 6, 10 и 30 ч, переместить пластину на стадии микроскопа снова и захватить изображения так же, как описано в шаге 2.6.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти временные точки были установлены для описанной процедуры и для первичных фибробластов. В ходе первого экспериментального эксперимента было проверено больше временных точек, чтобы увидеть, как быстро фибробласты заселяют этот пробел. Хотя 0, 6, 10 и 30 ч являются разумными точками начала, исследователи должны оптимизировать и установить соответствующие временные точки для каждого приложения и для каждого типа ячейки. Более точной альтернативой, если она имеется, было бы использование замедленной микроскопии. - Использование ImageJ13,количественно первоначальной области, свободной от клеток (100%) а остальная площадь после 6, 10 и 30 ч(рисунок 1). Процент области царапин, заселенной мигрирующими ячейками, затем рассчитывается по отношению к исходной области нуля.
3. Анализ области царапин
- Открытое программное обеспечение ImageJ13.
- Загрузите первое изображение как JPEG (например, 24-разрядные изображения RGB 1360x1024), сбросив изображение в панель меню ImageJ.
- Выберите кнопку freehand и пометьте область без ячейки
- Нажмите на анализ и выберите меру. Появится окно с результатами, содержащее значение области.
- Перенесите это значение в таблицу анализа.
- Повторите шаги 3.2-3.5 для каждого изображения из точки времени 0 ч, а затем начните снова в следующий раз точки 6, 10 и 30 ч.
- Рассчитайте процент области нуля, заселенной мигрирующими ячейками после 6, 10 и 30 ч для каждой царапины, используя следующее уравнение:
a - свободная область ячейки первоначальной царапины, b и свободная область ячейки после 6 ч - Рассчитайте среднее и стандартную ошибку среднего (S.E.M.) для процента области нуля, заселенной мигрирующими ячейками после 6 ч. Отображение данных в виде графика столбца или участка рассеяния.
4. In vivo кожи раны заживления асссек
ПРИМЕЧАНИЕ: C57BL/6 диких типа мужчин (8-12 недель с 22-26 г массы тела) и Cav'3-дефицитных мышей в качестве контроля используются для этого исследования.
- За день до начала эксперимента, автоклавировать все хирургические инструменты, винты, гайки и титановые рамы, которые будут использоваться для подготовки скин-фолк камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Титановая рама состоит из двух симметричных дополнительных половинок и имеет круглое окно наблюдения, где рана будет применяться с последующей микроскопией (см. рисунок 2a). - Анестезия дикого типа или 3-дефицитной мыши (22-26 г массы тела) путем интраперитонеальной (т.р.) инъекции 0,1 мл солевых/10 г массы тела, содержащей смесь кетамина (75 мг/кг массы тела) и ксилазина (25 мг/кг массы тела). Проверьте глубину анестезии на отсутствие реакции на щепотку ног.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта инъекция дает около 30 мин хирургической анестезии и глубина анестезии должны контролироваться с помощью хирургической процедуры, путем проверки рефлексов мыши. - Чтобы избежать сухости или повреждения глаз, нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза и при необходимости повторите применение.
- Тщательно побрить на курьесную цуп, используя электрическую бритву с последующим применением крема для депиляции в бритую область, чтобы удалить оставшиеся волосы. Позаботьтесь, чтобы не травмировать кожу мыши. Оставьте крем для депиляции около 10 минут, чтобы полностью удалить все волосы.
- Подготовьте титановую камеру, взяв одну часть симметричной титановой камеры и зафиксируя соединительные винты с гайками с одной стороны. Эти орехи будут служить в качестве прокладки держать 400-500 мкм между двумя симметричными частями камеры, чтобы избежать сжатия кровеносных сосудов в коже.
- Снимите крем с задней части мыши и очистите область без волос теплой (35-37 градусов по Цельсию) водопроводной водой.
- Убедитесь, что место для проведения операции чистое, теплое (37 градусов по Цельсию) и увлажнено.
- Дезинфекция без волос области мыши с дезинфицирующей кожи. Возьмите складку задней кожи мыши перед источником света и положение средней линии двойного слоя кожи, где титановая камера будет имплантирована. После этого, исправить скин с полипропиленовым швом черепно и caudally и затяните другую сторону шва на металлической стойке, чтобы поднять мышь сложенной кожи. Отрегулируйте высоту стойки, чтобы мышь удобно сидела.
- Имплантировать титановую камеру в складку задней кожи мыши таким образом, чтобы сэндвич сложенный слой спинной кожи между двумя симметричными половинками титановой рамы. Прикрепите первую половину титановой рамы полипропиленовыми швами на ее верхнем краю к задней части спинной кожи.
ПРИМЕЧАНИЕ: На титановой раме, Есть 8 отверстий на верхнем краю(Рисунок 2)и сложенная кожа должна быть хорошо зафиксирована полипропиленовые швы на каждом из восьми отверстий. - Перед переходом к следующему шагу, проверьте рефлексы мыши, чтобы убедиться, что глубина анестезии сохраняется.
- У основания скин-складки пройдите два соединительных винта, прикрепленных к первой половине титановой камеры, чтобы проникнуть в скин-фолд со спины к передней стороне. Сделайте небольшие разрезы на коже (с помощью тонких ножниц), чтобы помочь плавному проникновению соединительных винтов.
- Отсоедините мышь от стойки и поместите ее на боковое положение. Положите вторую дополнительную половину титановой камеры поверх 3 соединительных винтов (см. Рисунок 2а)и нанесите небольшое давление пальцами, чтобы пройти эти винты через вторую половину титановой рамы. Затем, исправить обе симметричные части с орехами из нержавеющей стали.
- Обратите пристальное внимание на герметичность винтов на этом этапе, так как он может отделить, если он слишком свободен. В отличие от этого, если он слишком туго, он будет сжимать кожу, уменьшить приток крови и может привести к ухудшению тканей и некроза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Орехи, приготовленные в шаге 4.5, служат в качестве прокладки для того, чтобы держать расстояние 400-500 мкм между двумя симметричными половинками титановой камеры. Орехи следует затянуть до тех пор, пока не будет ощущаться небольшое сопротивление. - Вырежьте оставшуюся часть винтов с помощью плоскогубцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо на этом шаге использовать лабораторные защитные очки для защиты глаз в случае, если винт сходит не в ту сторону. - Отметьте область раны стандартизированным бивней биопсии (2 мм в диаметре), в центре кожи в окне наблюдения (см. Рисунок 2a)камеры скобами для того, чтобы обеспечить воспроизводимые размеры ран.
- Используя тонкие щипцы и ножницы, создайте круговую рану в отмеченной области, удалив полную кожу с эпидермисом и дермой. Окончательная площадь раны составит около 3,5-4,5 мм2,см. Рисунок 2b. Очистите рану стерильным сольником 0,5 мл (0,9% NaCl, 37 градусов по Цельсию).
- Обложка раны со стеклянным крышкой и исправить это стекло coverslip с оснастки кольцо с помощью плоскогубца оснастки кольцо на титановой камере.
- Сразу после окончания хирургической процедуры поместите мышь на этап визуализации стереомикроскопа, оснащенного камерой, и снимайте снимки (день 0) под освещением. Используйте увеличение 40X и сохраните изображения для будущего автономного анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следователь должен изучить изображения сразу после захвата, чтобы убедиться, что качество достаточно для будущего автономного анализа. Подготовка камеры для стежков и производительность раны кожи занимает около 30 минут. - Держите мышь в теплом месте во время восстановления после анестезии, по крайней мере 2 ч. После этого, передача мышей в отдельных клетках обратно на объект животных (12 ч свет / темный цикл) и убедитесь, что мыши имеют доступ к пище и воде.
- Три дня после ранения место мыши в мышь-ограничитель и исправить удерживающий на верхней части стадии изображения.
- Поместите сцену под стереомикроскоп, оснащенный камерой. Возьмите изображения под освещением с 40-кратным увеличением, запишите все фотографии и сохраните их для будущих автономных анализов
- Повторите шаги 4.20 и 4.21 снова в день 6, 10 и день 14 после ранения.
- Используйте изображения ран, для автономного анализа в ImageJ13. Область раны в день 0 считается 100% и замыкания раны с течением времени накладываются относительно первоначальной области раны. Результаты представительи показаны на рисунке 2c,d.
- Рассчитать процент (%) раневой области в каждый момент времени с использованием следующего уравнения:
x: время (день 0, 3, 10 или 14), :область раны в день 0, b: область раны в точке времени x
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Царапина была проведена на слияние клеток монослой дикого типа и No 3-дефицитных MEFs(Рисунок 1c). После выполнения "царапины" с помощью наконечника пипетки 200 л, клетки из обоих генотипов мигрируют в область нуля и закрывают зазор. Изображения были сделаны после 6, 10 и 30 ч(рисунок 1a). Миграция ячеек была количественно определена как процент (%) нуля области заселены мигрирующих ячеек 6 часов после выполнения нуля. Мигрирующие Cav-3-дефицитные MEFs закрыли область царапин значительно раньше, чем MEFs от диких мышей типа(Рисунок 1a,b). Чтобы исключить любой эффект пролиферации клеток, скретч-миграционный контроль проводился в присутствии 10% или 1% FCS. На 10% FCS оба процесса присутствуют, пролиферация клетки и миграция, тогда как на 1% ПРОлиферации FCS клетки свести к минимуму. Фибробласты в 10%(рисунок 1b, слева) или 1% FCS(Рисунок 1b, справа) показали аналогичную схему миграции, исключая возможность распространения клеток вклад в Cav'3 наблюдается фенотип. В обоих условиях МЕФс, не добывающие 3, закрыли этот разрыв значительно раньше, чем МЕФ дикого типа. Для подтверждения эффекта, зависимого от Каве3, наблюдаемого в фибробластах, фибробласты дикого типа были трансинфицированы сиРНК для снижения регулирования белка Кав-3(рисунок 1e). В качестве контроля за даун-регуляцией были проведены иммуноблоты для подтверждения эффективности лечения siRNA. Были использованы два независимых CACnb3 специфические siRNA (siRNA1 и siRNA2) и скрембированная siRNA (в качестве контроля). Фибробласты, обработанные cacnb3-специфические siRNAs ведут себя как 3-дефицитные фибробласты(Рисунок 1г),т.е. миграция увеличивается в отсутствие белка Cav'3(Рисунок 1e).
In vivo была имплантирована спинная кожная камера(рисунок 2a,b),а на бритовой спине(рисунок 2б)диких мышей типа и Каве3-дефицитных мышей (8 животных на генотип, 8-12 недель и 22-26 г веса). Рана была выполнена путем удаления полной кожи с эпидермисом и дермой. Для сравнения заживления раны кожи между обоими генотипами, область раны в камере складки кожи была сфотографирована сразу после ранения (день 0), а затем были сделаны фотографии 3, 6, 10 и 14 дней после ранения(рисунок 2c). Размеры ран были измерены на этих цифровых изображений и раны области в данный день был выражен в процентах (%) первоначальной области ран(рисунок 2d). Замыкание ран увеличивается у мышей с дефицитом 3-х по сравнению с элементами управления дикого типа. В отличие от дикого типа, рана у мышей с дефицитом 3 была почти полностью закрыта уже через 10 дней. На следующий день 14 после ранения, раны были полностью закрыты в обоих генотипов(рисунок 2c,d).
Рисунок 1 : In vitro нуля миграции анализ. () Репрезентативные изображения культур дикого типа (WT, слева) и Каве3 KO (No3 KO, справа) первичных эмбриональных фибробластов мыши (MEFs) сразу, 6, 10 и 30 ч после выполнения царапины. Изображения были преобразованы в 8-битную серую шкалу, а контрастность, а также яркость, были адаптированы для максимальной визуализации области, свободной от ячейки. Анализ свободной области ячейки (% площади царапин, заселенной мигрирующими ячейками) был выполнен на исходных 24-битных RGB-изображениях. (b)Графики баров, показывающие проценты (%) нуля области заселены мигрирующих клеток после 6 часов либо в присутствии высоких (10%, слева) или низкой (1%, справа) сыворотки крупного рогатого скота плода (FCS) в диком типе (черный) и Cav 3 KO (красный) эксперименты (c) Иммуноблот: Белковые экстракты из мозга дикого типа (50 мкг на полосу) и фибробласты (MEFs, 100 мкг на полосу) с использованием конкретных антител Cav'3. Белок No3 (55 кДа) присутствует в мозге дикого типа (используется в качестве контроля) и фибробластах, но отсутствует в белковых экстрактах мозга и фибробластов, приготовленных из мышей Кав-3. (d)Резюме процента области нуля, заселенной мигрирующими клетками после 6 часов в клетках дикого типа, обработанных либо скрембированными siRNA (контроль, черный) или двумя независимыми Cacnb3 siRNAs (siRNA1 и siRNA2, красными открытыми полосками). (e)Соответствующий иммуноблот от эксперимента в(d). Данные отображаются как средние значения SEM, значения p были рассчитаны с помощью непарного двуххвостого теста Студента. Панели a и b были изменены из «Belkacemi et al., 2018»4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : In vivo кожа раны заживления у мышей. () Титанкадр внутренней стороны вид показывает одну половину титановой камеры и вид передней стороны показаны собраны титановой камеры с двумя симметричными половинками прилагается с винтами и гайками. (b)Мышь после бритья сонной кожи и монтажа сонной кожной камеры, состоящей из двух симметричных титановых рам (вес титановой рамы составляет около 2 г) и нанесения круговой раны (диаметр омнивка 2 мм). (c)Изображения раны сразу после ранения (день 0) и 3, 6, 10 и 14 дней после ранения. Непрерывный процесс замыкания раны, с полной эпителилизацией, показан в течение 14 дней у диких мышей типа (WT, top) и Cav'3 KO (No3 KO, дно). (d)В указанное время область раны была определена с помощью компьютерной программы анализа изображений и построена в процентах от раневой области сразу после травмы в день 0 (средний - SEM n No 8, 3 KO мышей и соответствующего дикого типа контроль мышей). Значения P были рассчитаны с помощью двухсторонних тестов ANOVA и Bonferroni. Панели c и d были изменены из «Belkacemi et al., 2018»4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой рукописи мы описываем in vitro и in vivo анализ заживления ран и соотносим полученные результаты. Для анализа in vitro мы использовали первичныефибробласты мыши4,14,15, которые играют важную роль в заживлении ран и ремоделирования тканей11. Другие типы клеток адептов, растущие как монослои (например, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, кератиноциты) также могут быть использованы. Покрытие такого же количества жизнеспособных и здоровых клеток и применение нуля при той же степени сближания имеет первостепенное значение для получения точных и воспроизводимых результатов. Настоятельно рекомендуется выполнять биологические и технические репликации. В настоящем методе использовались 6-колодные пластины, но 12- или 24-нужные пластины могут также использоваться, особенно когда клетки доступны только в ограниченном количестве. В случае лечения siRNA, иммуноблотный анализ после каждого набора экспериментов является обязательным, чтобы убедиться, что целевой белок эффективно регулируется. Реагент трансфекции и временное окно должны быть проверены и выбраны для каждого типа ячейки, прежде чем начать с миграционного асссе. В случае фибробластов и гена Cacnb3, потребовалось от 3 до 4 дней, чтобы достичь желаемого уровня вниз регулирования. В отличие от этого, анализ миграции царапин требует более короткого времени (6 ч до 24 ч). Чтобы избежать высокой изменчивости размера нуля, обязательно, чтобы тот же следователь применяет царапины для каждого набора экспериментов, что равное давление осуществляется пипетка отзыв и держать рану как можно больше вертикальной к отмеченной линии на нижней части пластины через монослой ячейки. Применение механической царапины по всему монослой клетки приводит к высвобождению различных клеточных факторов (например, АТФ) из поврежденных клеток во внеклеточное пространство. Эти факторы будут вызывать паракриновые сигнализации в том числе Ca2 "сигнализациив соседних клетках, которые, в свою очередь, будет влиять на клеточные ответы16. Чтобы избежать этих эффектов, культура вставки могут быть использованы для покрытия клеток и после удаления этих вставок ячейки свободной разрыв создается без повреждения соседних клеток17. Для высокой пропускной пробы, следователи могли бы рассмотреть вопрос об использовании инструментов, доступных на рынке для создания воспроизводимых и последовательных царапин в 96-колодец пластин. Чтобы непрерывно следить за кинетикой миграции клеток, пользователи могут также рассмотреть возможность использования высококачественных коммерческих систем для автоматического захвата изображения. Однако автоматизированные системы для применения нуля и захвата изображений не всегда доступны из-за высоких затрат. Более доступным и экономичным решением для визуализации замедленного времени было бы, например, с помощью системы (ATLIS: доступная система визуализации и инкубации времени), описанная Эрнандесом Верой и коллегами18.
При отсутствии каких-либо ингибиторов пролиферации клеток, репопуляция пробела в анализе миграции царапин представляет собой сочетание миграции клеток и пролиферации клеток. Для мониторинга только миграции клеток, пролиферация клеток может быть подавлена, например, путем лечения либо актиномицин C19 или митомицин C20. Адекватные концентрации этих соединений должны быть тщательно определены и протестированы, чтобы избежать токсического воздействия этих соединений, которые могут повлиять на жизнеспособность клеток и их способность мигрировать. Как описано в настоящей статье, голод в сыворотке крови или снижение концентрации сыворотки в культуре среды является еще одним способом уменьшить последствия пролиферации клеток. Сывороточное голодание используется в нескольких других клеточных анализов. Это может вызвать большое количество клеточных реакций, которые могут помешать полученным результатам и интерпретациям21. Сывороточный голод должен быть тщательно применен и его влияние на жизнеспособность клетки должны быть оценены перед началом эксперимента. В настоящей статье показана миграция первичных фибробластов при наличии 10% или 1% сыворотки (см. рисунок 1b). Скорость миграции, как и ожидалось, медленнее при низких концентрациях сыворотки. Тем не менее, фибробласты с дефицитом 3 мигрируют быстрее, чем клетки дикого типа в обоих условиях; высокая и высокая концентрация сыворотки.
Кожа раны заживления ассссс с помощью царской кожи камеры является относительно простой процедурой для расследования закрытия раны кожи с течением времени in vivo. Имплантация титановой складки кожи была описана впервые у крыс22. Sorg et al. использовали эту технику в SKH1-hr голые мыши следить за заживление ран и образование новых кровеносных сосудов9. Модель камеры скожного диска, описанная в этой статье, имеет много преимуществ по сравнению с классическими анализами заживления ран, выполненными на пстевой коже, на ухе23 или задней конечности7 мышей. Покрытие раны с помощью стеклянного покрывала предотвращает инфекции и травмы тканей и ограничивает высыхание раны. Камера наблюдения, покрытая стеклянным покрытием, может быть открыта в любое время в процессе заживления, что позволяет местное применение различных фармакологически активных соединений (например, siRNA для Cav'3 в качестве растворов или мази) и камера может быть снова закрыт. Murine раны кожи процесс заживления состоит как из сокращения и эпителиизации24. Использование складной сыщика сыщика камеры у мышей сводит к минимуму сокращение кожи и дает возможность изучать в основном процесс эпителиализации. Он также обеспечивает четкое окно для наблюдения и контроля процесса закрытия раны. Одним из недостатков титановой камеры является то, что мышь должна нести титановую камеру, которая имеет вес около 2 г (7,7% от веса 26 г мыши), в течение 14 дней. Это может вызвать некоторый дискомфорт для мыши, хотя кажется, что мыши хорошо переносят эту камеру, и они удобны и могут легко достичь пищи и воды. Модель заживления ран кожи, представленная в этой статье, может изучать только одну рану на мышь. Другие опубликованные методы25,26 предлагают применять две раны на мышь, которая позволит уменьшить количество животных, необходимых для исследования. Очень важно создать круговую рану аналогичного размера для всех мышей, чтобы получить объективную информацию, а также надежные и воспроизводимые результаты. Чтобы сделать снимки ран с течением времени, мышей фиксировали на ласфолителе мыши, помещали на сцену, а кожная камера расположена под стереомикроскопом. Использование удерживающего помогает избежать анестезии и минимизации стресса для мышей. Мышей можно принести в жертву, а ткани из раненой области можно высаживать и собирать на разных стадиях процесса заживления (либо после полного заживления, либо в более ранние моменты времени) для гистологического анализа, сбора РНК или биохимии белка.
Таким образом, мы показали два метода, в пробирке нуля анализ с использованием первичных фибробластов и in vivo кожи раны заживления анализ у мышей. В обоих анализах, заживление ран / разрыв закрытия увеличивается в отсутствие Cav'3 подразделение напряжения-gated кальциевых каналов. Как и в случае с дикими и Cav'3-дефицитных мышей или клеток, оба анализы вполне может коррелировать в отсутствие или наличие других конкретных молекул.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ра Петру Вайсгербер и подразделение Transgene животного комплекса SPF (проект P2 SFB 894) медицинского факультета и животное в Институте клинической и экспериментальной хирургии на медицинском факультете Саарлендского университета в Хомбурге. Мы благодарим доктора Андреаса Бека за критическое чтение рукописи. Это исследование было профинансировано Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, проектом A3 для A.B. и V.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
References
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T.
- Martin, P. Wound healing--aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
- Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro. Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).
- Belkacemi, A., et al. IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3. Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).
- Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment. Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).
- Vagesjo, E., et al. Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria. Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).
- Eming, S. A., et al. Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10. American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K.
- Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels. Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Chen, L., et al. Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway. Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).
- Dewor, M., et al. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro. FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).
- Handly, L. N., Wollman, R. Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism. Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).
- Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration. Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).
- Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics. PLoS One. 11, 0167583 (2016).
- Reinhart-King, C. A. Endothelial cell adhesion and migration. Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).
- Treloar, K. K., Simpson, M. J. Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays. PLoS One. 8, 67389 (2013).
- Pirkmajer, S., Chibalin, A. V.
- Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold. Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).
- Deoliveira, D., et al. An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing. International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).
- Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).
- Dunn, L., et al.
- Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway. Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).
