Summary
We demonstreren een methode om de succesvolle of mislukte bevruchting te bepalen op basis van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting met behulp van een epifluorescentie Microscoop.
Abstract
Bloeiende planten hebben een uniek seksueel reproductie systeem dat ' dubbele bevruchting ' wordt genoemd, waarbij elk van de spermacellen nauwkeurig met een eicel of een centrale cel smelt. Zo vinden er bijna gelijktijdig twee onafhankelijke bevruchting gebeurtenissen plaats. De bevruchte eicel en de centrale cel ontwikkelen respectievelijk zygote en endosperm. Daarom is nauwkeurige controle van dubbele bevruchting essentieel voor de daaruit voortvloeiende ontwikkeling van zaaizaad. Dubbele bemesting treedt op in de vrouwelijke gametofyt (embryo SAC), die diep verborgen is en bedekt is met dikke ovalen en Eier weefsels. Deze stamper weefsel constructie maakt observatie en analyse van dubbele bevruchting heel moeilijk en heeft de huidige situatie gecreëerd waarin veel vragen over het mechanisme van dubbele bevruchting onbeantwoord blijven. Voor de functionele evaluatie van een potentiële kandidaat voor bevruchting regulator is fenotypische analyse van bemesting belangrijk. Om te oordelen over de voltooiing van de bevruchting in Arabidopsis thaliana, de vormen van fluorescentie signalen labelen van sperma kernen worden gebruikt als indicatoren. Een zaadcel die niet bevruchten wordt, wordt aangegeven door een gecondenseerd fluorescentie signaal buiten de vrouwelijke gameten, terwijl een zaadcel die met succes bemesten wordt aangegeven door een gedegecondenseerd signaal als gevolg van karyogamie met de Nucleus van de vrouwelijke gameten. De hier beschreven methode biedt een hulpmiddel om de succesvolle of mislukte bevruchting onder in vivo condities te bepalen.
Introduction
Bloeiende planten produceren zaden door dubbele bevruchting, een proces dat rechtstreeks wordt beheerst door interacties tussen eiwitten gelokaliseerd op gameten plasma membraan1,2. Bloeiende plant mannelijke gameten, een paar spermacellen, Ontwikkelen in pollen. Een pollen buis die groeit na bestuiving levert een paar spermacellen aan vrouwelijke gameten, een eicel en een centrale cel, die in een embryo-zak ontwikkelen. Nadat de mannelijke en vrouwelijke gameten elkaar ontmoeten, bevorderen eiwitten op het gameten-oppervlak herkenning, gehechtheid en fusie om dubbele bevruchting te voltooien. In eerdere studies werden de mannelijke gameten membraan eiwitten generatieve celspecifieke 1 (GCS1)/hapless2 (HAP2)3,4 en gameten uitgedrukt 2 (GEX2)5 geïdentificeerd als bevruchting regulatoren die betrokken zijn bij gameten fusie en bijlage, respectievelijk. Onlangs identificeerden we een mannelijk gameten-specifiek membraan proteïne, DUF679 DOMAIN membraan PROTEIN 9 (DMP9), als een bemesting regulator die betrokken is bij gameten interactie. We constateerden dat een afname van DMP9 expressie resulteert in significante remming van de bemesting van eicellen tijdens dubbele bevruchting in a. thaliana6.
Aangezien dubbele bevruchting optreedt in een embryo-zak, die is ingebed in een eicel die verder is verpakt met ovariumweefsel, is het moeilijk om de toestanden van dubbele bevruchting processen te observeren en te analyseren. Om deze reden zijn er nog steeds veel onduidelijke punten die een volledig begrip van het hele mechanisme van dubbele bevruchting controle belemmeren. De vaststelling van observatie technieken om het gedrag van gameten te traceren tijdens dubbele bevruchting onder in vivo omstandigheden is onmisbaar voor de functionele analyse van potentiële kandidaten voor bemesting regulatoren. Recente studies hebben markeringslijnen opgeleverd waar gameten subcellulaire structuren gelabeld zijn met fluorescerende eiwitten. In dit artikel tonen we een eenvoudig en snel protocol voor het observeren van dubbele bevruchting die heeft plaatsgevonden in een embryo-zak die is afgeleid van kunstmatig bestuikte stampers. Met behulp van sperma Cell Nucleus marker lijn HTR10-mRFP7, de bevruchting staat van elke vrouwelijke gameten kan worden gediscrimineerd op basis van sperma nucleaire signaal morfologie. Ons protocol gericht op een dergelijke morfologische verandering van de sperma kernen bij bevruchting kan efficiënt een voldoende hoeveelheid gegevens verkrijgen voor statistisch bewijs. Een DMP9-knockdown lijn met HTR10-mrfp achtergrond (DMP9KD/HTR10-mrfp) werd gebruikt als mannelijke planten om een enkele bevruchting patroon tonen. Het protocol is ook geschikt voor de functionele analyse van andere bemesting regulatoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kunstmatige bestuiving
Opmerking: Voor aanvang van het proces is een paar No. 5 Tang nodig.
- Kweek a. thaliana (Col-0) bij 22 °c onder een 16-h licht/8-h donkere cyclus in een groei kamer.
Opmerking: Snijd en verwijder de eerste ontwikkelde bloemsteel met een schaar ter bevordering van de ontwikkeling van de oksel toppen. Sterk groeiende planten (2-3 weken na het snijden van de eerste Steel; plant hoogte ongeveer 25 cm) zijn geschikt voor analyse. - Om te emasculeren, verwijderen kelk (Figuur 1b), Petal(figuur 1c), en meeldraden (figuur 1d) van bloemknoppen in fase 118 (Figuur 1a) met behulp van No. 5 Tang. Bud met stukjes bloemblaadjes die bovenaan te zien is, is het beste.
Opmerking: Gebruik een geschikte vrouwelijke gameten marker lijn. In dit protocol gebruikten we een wild type plant als de vrouwelijke ouder. - Vijftien tot achttien uur na de emasculation, neem de meeldraad van een DMP9KD/HTR10-mrfp bloem in fase 138 door het filament met een tang te knijpen.
- Om te bestuiven, DEP het stigma van een schuimen meerdere malen zachtjes met een en Anther.
2. bereiding van de ovule voor observatie
Opmerking: De volgende items zijn vereist: een glaasje met dubbelzijdige tape, No. 5 Tang, een injectienaald van 27 G en een ontleed Microscoop.
- 7 tot 8 h na bestuiving (hap), verzamel de stamper en plaats deze op de dubbelzijdige tape, druk vervolgens zachtjes met een tang om de stamper op de tape te bevestigen (Figuur 2a, A ').
Opmerking: De meeste zaadknoppen in een stamper krijgen ten minste één stuifmeel buis 10 hap9. Als beide of een van de spermacellen uit de eerste stuifmeel buis niet te bevruchten, een tweede pollen buis zou worden aangetrokken door de eicel als gevolg van de bevruchting herstel systeem10. Om de morfologie van de sperma kernen uit de eerste pollen buis te analyseren, wordt het aanbevolen om de eicel voorbereiding met 10 hap ten laatste te voltooien. - Snijd de bovenste en onderste uiteinden van de eierstok met behulp van een injectienaald onder een ontleed Microscoop (Figuur 2b, B ').
- Spleet de eierstok aan beide zijden van de replum (figuur 2c, C ') door de punt van de injectienaald te bewegen.
Opmerking: Steek de injectienaald ondiep om te voorkomen dat de eicel scheiden van het septum. - Evert de eierstok met behulp van de injectienaald (figuur 2D, D ').
- Knijp in de basis van het septum waarop de eicellen zijn aangesloten en til deze voorzichtig op met een tang (figuur 2e).
- Breng de zaadknoppen over in een druppel water op een glaasje, en bedek zachtjes met een afdekglas voor observatie onder een fluorescentiemicroscoop (figuur 2e, E ').
3. microscopie
Opmerking: In dit protocol gebruikten we een epifluorescentie Microscoop met een fluorescentie filter kubus (Zie tabel met materialen), een digitale camera en de bijbehorende software.
- Verkrijg afbeeldingen van zaadknoppen met sperma kernen gelabeld met mrfp met behulp van een 20x of 40x objectief lens en de uitgeruste digitale camera.
- Bevestig het aantal met mRFP gelabelde sperma kernen in een embryo-zak.
Opmerking: Ovules met twee mRFP-gelabelde sperma kernen kunnen worden opgenomen in de populatiegrootte voor statistische analyse. - Bevestig de vorm en de positie van elke met mRFP gelabelde sperma kern in een embryo SAC.
Opmerking: Onmiddellijk na het vrijkomen van een pollen buis, zijn een paar gecondenseerde mRFP-gelabelde sperma kernen gelokaliseerd tussen het ei en de centrale cel. Een degecondenseerde mRFP-gelabelde sperma kern gedetecteerd aan de zijkant van chalazaal einde geeft bijvoorbeeld de bemesting van de centrale cel aan. Door gebruik te maken van een geschikte vrouwelijke gameten membraan marker lijn, zoals weergegeven in aanvullende Figuur 1, of de zaadcel ondergaat plasmogamie (na membraan fusie maar vóór karyogamie) kan duidelijk worden gecontroleerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ovules van een stamper bestuikte met DMP9KD/HTR10-mrfp werden verzameld op 7-8 hap en waargenomen.
De meeste zaadknoppen bevatten twee degecondenseerde mrfp-gelabelde sperma kernen in de eicel (micropylar Side) en de centrale cel (charazal end Side) Nucleus posities (Figuur 3a), wat duidt op een geslaagde dubbele bevruchting. Bovendien werden zaadknoppen met een degecondenseerde mrfp-gelabelde sperma kern in de centrale celkern en een gecondenseerde mrfp-gelabelde sperma kern buiten de eicel (Figuur 3b) waargenomen, wat duidt op enkelvoudige bevruchting. In het geval van mislukte dubbele bevruchting werden twee gecondenseerde mRFP-gelabelde sperma kernen waargenomen op de grens van de eicel en de centrale cel (figuur 3c), zoals in gcs1 Mutante spermacellen (figuur 3D)3,4 .
In de analyse met behulp van DMP9KD/HTR10-mrfp stuifmeel, werden zaadknoppen met één gecondenseerde mrfp-gelabelde sperma kern (figuur 4a) of drie of meer mrfp-gelabelde sperma kernen (figuur 4b) zelden waargenomen.
Figuur 1: bloemknoppen geschikt voor emasculation. A) eenbloem dopje in fase 11, met stukjes van de bloemblaadjes bovenaan. (B-D) Een bloem knop waarin de kelk (B) en de bloemblaadjes (C) werd verwijderd en die vervolgens volledig werd afgemaakt (D). De helmknop dehiscentie is nog niet gebeurd. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: stroom van de voorbereiding van de eicel. De procedures worden weergegeven door illustraties (a-e) en foto's (a '-e '). (a, a ') Een stamper wordt geplaatst op dubbelzijdige tape bevestigd aan een glaasje, en de bovenste en onderste uiteinden worden afgesneden met een injectienaald. (b, b ') Aan beide zijden van de replos wordt de eierstok ingesneden. (c, c ') Beide zijden van de eierstokken worden geopend, gejaagd en op de tape gedrukt om te worden vastgeklikt. (d, d ') Het septum waar de zaadknoppen zijn verbonden in arrays wordt blootgesteld. (e, e ') Een uiteinde van het septum wordt geknepen en gehesen met pincet. Het septum met aansluitende zaadknoppen wordt overgebracht naar een druppel water op een glij glas. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: bemesting fenotypes beoordeeld door sperma nucleaire signaal morfologie in ovule. A) succesvolle dubbele bevruchting, aangegeven door twee Gedegecondenseerde mrfp-gelabelde sperma kernen (pijlpunten). B) enkelvoudige bevruchting door DMP9KD/HTR10-mrfp -spermacellen, aangeduid met één degecondenseerde mrfp-gelabelde sperma kern (pijlpunt) en één gecondenseerde mrfp-gelabelde sperma kern (Arrow). C) mislukte dubbele bevruchting door DMP9KD/HTR10-mrfp spermacellen aangegeven door twee gecondenseerde mrfp-gelabelde sperma kernen (pijlen). D) een voorbeeld van mislukte dubbele bevruchting door Gcs1HTR10-mrfp spermacellen. Er is een markeringslijn gebruikt waar de eicelkern (EN) is gelabeld met RFP. Twee gecondenseerde mRFP-gelabelde sperma kernen (pijlen) worden gearresteerd zonder bevruchting bij 18 HAP. E) Schematische illustratie van een ovule. EC = eicel, CC = centrale cel, SC = synergid-cellen, ES = embryo SAC, MP = micropyle, CHZ = chalazaal uiteinde. Schaal staven = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: ander potentieel bemesting fenotypes. Ovules van een stamper bestuikte met DMP9KD/HTR10-mrfp bevatten zelden één gecondenseerde mrfp-gelabelde sperma kern (a), of drie of meer gecondenseerde mrfp-gelabelde sperma kernen (B) (pijlen). Schaal staven = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1: gecondenseerde sperma kernen bij plasmogamie tijdens de bevruchting, beoordeeld door een combinatie met een vrouwelijke plasma membraan marker lijn. Pfwa:: GFP-PIP waarbij het centrale celmembraan wordt gevisualiseerd, werd gebruikt als vrouwelijk ouder (GFP). GFP-PIP ook etiketten Endo membranen12. De eicel bevat twee gecondenseerde mrfp-gelabelde sperma kernen (pijlen; RFP). Het RFP-signaal aan charazal end Side (Arrow) wordt weergegeven in de centrale cel (samenvoegen), wat aangeeft dat de kern van het sperma in celversmelting is (na gameten membraan fusie, maar vóór karyogamie). Het paneel aan de rechterkant is een vergroting van het gebied omgeven door onderbroken lijnen in de samengevoegde afbeelding. Een leeg gebied dat met een sterretje is gemarkeerd, komt overeen met de positie van de centrale celkern. De onderbroken lijn geeft de omtrek van de centrale cel aan die naar de eicel kijkt. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HTR10-mrfp labels vaderlijke chromatine (dat wil zeggen, visualiseert sperma celkernen), en de dynamiek in dubbele bevruchting is gemeld7. Onmiddellijk na het vrijkomen van een stuifmeel buis, HTR10-mRFP-gelabelde sperma kernen zijn nog steeds gecondenseerd. Echter, elk van de zaad kernen is gedegecondenseerd bij het samenvoegen met een bevruchte vrouwelijke gameten Nucleus op karyogamie drie tot vier uur na gameten membraan fusie7. Onbevruchte spermacellen blijven gecondenseerd, zoals weergegeven in een embryo SAC waarin gcs1 spermacellen zonder bevruchting worden gearresteerd (figuur 3D). Meestal, wanneer de vruchtbare HTR10-mrfp wordt gebruikt als de vaderplant, 57,9% ± 17,8% (gemiddelde ± s.d.; n = 16 pistils) van ovariinen in een stamper bij 7-8 hap bevatten twee mrfp-gelabelde sperma kernen signalen, en bijna alle signalen (97,2%) worden gedegecondenseerd, die een geslaagde dubbele bevruchting reflecteren (een soortgelijk signaal patroon wordt weergegeven in Figuur 3a). In het geval van DMP9KD/HTR10-mrfp, werden zaadknoppen met twee mrfp-gelabelde sperma kernen waargenomen op een vergelijkbare frequentie als die van HTR10-mrfp, maar 17,6% van hen toonde enkelvoudige bevruchting6. We hebben de HTR10-mrfp-dynamiek goedgekeurd voor observatie van een groot aantal zaadknoppen onder in vivo omstandigheden met behulp van een epifluorescentie Microscoop. Het protocol is eenvoudig en snel, wat het verzamelen van voldoende gegevens mogelijk maakt voor statistisch bewijs. Met behulp van dit protocol als eerste instantie, de betekenis van enkelvoudige bevruchting van de centrale cel door DMP9KD/HTR10-mrfp spermacellen werd bewezen6.
Op basis van de morfologische verschillen van HTR10-mRFP-gelabelde sperma kernen afgeleid van een pollen buis, worden de bevruchting patronen ingedeeld in drie fenotypes: (1) succesvolle dubbele bevruchting, die wordt gekenmerkt door twee degecondenseerde HTR10-mRFP-gelabelde sperma kernen (Figuur 3a); (2) enkelvoudige bevruchting, met één gecondenseerde HTR10-mRFP-gelabelde sperma kern en één degecondenseerde HTR10-mRFP-gelabelde sperma kern (Figuur 3b); en (3) mislukte dubbele bevruchting, die twee gecondenseerde HTR10-mRFP-gelabelde sperma kernen heeft (figuur 3c).
Andere mogelijke oorzaken van fenotypes (2) en (3) moeten worden overwogen. Er is gemeld dat zaadcellen respectievelijk beginnen plasmogamie met een eicel of centrale cel enkele minuten nadat ze zijn vrijgelaten in een embryo SAC onder de omstandigheden van de semi-in-vitro cultuur11. Daarnaast bestaat er een tijdsvertraging van enkele minuten tussen de eerste en tweede bevruchting, hoewel er geen voorkeur is voor de volgorde van bemesting van de eicel en de centrale cel11. Daarom kan een combinatie van gecondenseerde en gedevererde sperma kernen in fenotype (2) duiden op een tijdsvertraging tussen de bemesting in plaats van enkelvoudige bevruchting. Om het optreden van enkelvoudige bevruchting met een significante frequentie bij fenotype (2) te bevestigen, dient een aantal monsters te worden onderzocht die voldoende zijn voor statistische analyse. Fenotype (3), dat twee gecondenseerde sperma kernen (figuur 3c) heeft, kan een periode van immobiliteit van spermacellen weerspiegelen voorafgaand aan plasma membraan fusie12 of de periode tussen plasmogamie en karyogamie. Daarom, twee gecondenseerde sperma kernen bij 7-8 hap niet volledig reflecteren ' falen ' van dubbele bevruchting, en het is noodzakelijk om de zaadknoppen op een later tijdstip na bestuiving te observeren om het succes of falen van dubbele bevruchting te beoordelen. In dit opzicht wordt eicel observatie op 16-18 hap aanbevolen, omdat de meeste van de eicellen dubbele bevruchting zouden hebben met spermacellen geleverd door de eerste pollen buis, en HTR10-mrfp-signalen van onbevruchte sperma kernen zouden blijven tot de volgende dag van bestuiving, zoals weergegeven in figuur 3D.
Een patroon van één gecondenseerde HTR10-mRFP-gelabelde sperma kern (figuur 4a) werd zelden gedetecteerd, wat waarschijnlijk te wijten was aan het snel verdwijnen van een ander VADERLIJKE HTR10-mrfp-signaal in de bevruchte vrouwelijke gameten als gevolg van een enkelvoudige bevruchting. In deze analyse, drie of meer HTR10-mRFP-gelabelde sperma kernen werden ook gedetecteerd als een zeldzaam geval (figuur 4b), als gevolg van de tweede pollen buis aanvaarding door de bevruchting herstel systeem10. In dit protocol werden deze gevallen uitgesloten van de gegevens, omdat het traceren van het gedrag van twee spermacellen die zijn afgeleid van een pollen buis essentieel is voor een nauwkeurige beoordeling.
Aangezien de polariteit voor de posities van de vrouwelijke gameten in een embryo SAC goed gereguleerd is (d.w.z. de eicel en de centrale celdifferentiatie bij respectievelijk de micropylar en de chalazale kant), kan de vrouwelijke gameten bevlozing worden beoordeeld door de relatieve posities van de mRFP-gelabelde sperma kernen. Er is echter een beperking in het onderscheiden tussen onbevruchte en plasmogamie toestanden, omdat beide toestanden worden aangegeven door het gecondenseerde sperma kernen signaal. Om precies te beoordelen of plasmogamie na de gameten membraan fusie heeft plaatsgevonden of niet wanneer de sperma kernen gecondenseerd zijn, is het nodig om vrouwelijke gameten membraan markeringslijnen te gebruiken, zoals gerapporteerd door Takahashi et al. (2018)6. Bijvoorbeeld, wanneer een pfwa:: GFP-PIP plant12 waarin het centrale celmembraan werd gevisualiseerd werd gebruikt als een vrouwelijke ouder, het is duidelijk dat een sperma cel gesmolten met de centrale cel was in celversmelting (aanvullende Figuur 1 ).
Samengevat, ons protocol hier beschreven kan worden gebruikt voor statistische beoordeling van succes of falen van de bevruchting in elke vrouwelijke gamete. Hoewel de tewerkstelling van de vrouwelijke plasma membraan marker nodig is om de plasmogamie te beoordelen, is onze methode nuttig voor de functionele analyse van de bevruchting regulator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Japan Society voor de promotie van Science KAKENHI Grant (JP17H05832 to T. I.) en door financiering van het strategisch prioriteits onderzoek promotieprogramma voor fytochemische planten moleculaire wetenschappen, Universiteit van Chiba (Japan).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
||
| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
||
| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 G |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA 0.75), dry |
References
- Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H.
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M.
- Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
- von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
- Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
- Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076 (2018).
- Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M.
- Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690 (2013).
- Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
- Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).
