Summary
Wir zeigen eine Methode zur Bestimmung einer erfolgreichen oder fehlgeschlagenen Befruchtung auf Basis der Spermien-Kernmorphologie in Arabidopsis Doppelbefruchtung mit einem Epifluoreszenzmikroskop.
Abstract
Blühende Pflanzen haben ein einzigartiges sexuelles Reproduktionssystem namens "Doppelte Befruchtung", in dem jede der Spermien präzise mit einer Eizelle oder einer zentralen Zelle verschmilzt. So finden fast gleichzeitig zwei unabhängige Düngeereignisse statt. Die befruchtete Eizelle und die Zentralzelle entwickeln sich zu Zygoten bzw. Endospermen. Daher ist eine präzise Kontrolle der Doppeldüngung für die anschließende Saatgutentwicklung unerlässlich. Die doppelte Befruchtung erfolgt im weiblichen Gametophyten (Embryosack), der tief versteckt und mit dicken Eizellen und Eierstockgeweben bedeckt ist. Diese Stempelgewebekonstruktion erschwert die Beobachtung und Analyse der Doppeldüngung und hat die gegenwärtige Situation geschaffen, in der viele Fragen zum Mechanismus der Doppeldüngung unbeantwortet bleiben. Für die funktionelle Bewertung eines potenziellen Kandidaten für die Düngungsregulierer ist eine phänotypische Analyse der Befruchtung wichtig. Um den Abschluss der Befruchtung in Arabidopsis thalianazu beurteilen, werden die Formen von Fluoreszenzsignalen, die Spermienkerne kennzeichnen, als Indikatoren verwendet. Eine Spermienzelle, die nicht befruchtet, wird durch ein kondensiertes Fluoreszenzsignal außerhalb der weiblichen Gameten angezeigt, während eine Spermienzelle, die erfolgreich befruchtet, durch ein dekondensiertes Signal aufgrund von Karyogamie mit dem Weiblichen Gametenkern angezeigt wird. Die hier beschriebene Methode stellt ein Werkzeug zur Bestimmung einer erfolgreichen oder fehlgeschlagenen Befruchtung unter in vivo-Bedingungen dar.
Introduction
Blühende Pflanzen produzieren Samen durch doppelte Befruchtung, ein Prozess, der direkt durch Wechselwirkungen zwischen Proteinen gesteuert wird, die auf Gamete Plasmamembran1,2lokalisiert sind. Blühende Pflanzenmännchen gameten, ein Paar Spermien, entwickeln sich in Pollen. Ein Pollenrohr, das nach der Bestäubung wächst, liefert ein Paar Spermien an weibliche Gameten, eine Eizelle und eine zentrale Zelle, die sich in einem Embryosack entwickeln. Nachdem sich die männlichen und weiblichen Gameten treffen, fördern Proteine auf der Gamete-Oberfläche Die Erkennung, Anhaftung und Fusion, um eine doppelte Befruchtung zu vollenden. In früheren Studien wurden die männlichen Gamete-Membranproteine GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 und GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 als Befruchtungsregulatoren identifiziert, die an der Gamete-Fusion und Anlage. Kürzlich haben wir ein männliches Gamete-spezifisches Membranprotein, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), als Düngeregulator identifiziert, der an der Gamete-Interaktion beteiligt ist. Wir fanden heraus, dass eine Abnahme der DMP9-Expression zu einer signifikanten Hemmung der Befruchtung von Eizellen während der Doppelbefruchtung in A. thaliana6führt.
Da die Doppelbefruchtung in einem Embryosack auftritt, der in eine Eizelle eingebettet ist, die weiter mit Eierstockgewebe umwickelt ist, ist es schwierig, die Zustände von Doppelbefruchtungsprozessen zu beobachten und zu analysieren. Aus diesem Grund gibt es noch viele unklare Punkte, die ein vollständiges Verständnis des gesamten Mechanismus der doppelten Düngungskontrolle behindern. Die Etablierung von Beobachtungstechniken zur Verfolgung des Verhaltens von Gameten während der Doppelten Befruchtung unter in vivo-Bedingungen ist für die funktionelle Analyse potenzieller Kandidaten für Diebesregulatoren unerlässlich. Jüngste Studien haben Markerlinien ergeben, in denen subzelluläre Strukturen von Gamete mit fluoreszierenden Proteinen gekennzeichnet sind. In diesem Artikel zeigen wir ein einfaches und schnelles Protokoll zur Beobachtung der doppelten Befruchtung, das in einem Embryosack aufgetreten ist, der aus künstlich bestäubten Stempeln stammt. Mit Spermienkern MarkerLinie HTR10-mRFP7, kann der Befruchtungszustand jeder weiblichen Gamete auf der Grundlage der Spermien Kernsignal Morphologie diskriminiert werden. Unser Protokoll, das sich auf eine solche morphologische Veränderung der Spermienkerne bei der Befruchtung konzentriert, kann effizient eine ausreichende Menge an Daten für den statistischen Nachweis erhalten. Eine DMP9-Knockdown-Linie mit HTR10-mRFP-Hintergrund (DMP9KD/HTR10-mRFP) wurde als männliche Pflanzen verwendet, um ein einzelnes Düngemuster zu zeigen. Das Protokoll eignet sich auch für die funktionelle Analyse anderer Düngeregler.
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Protocol
1. Künstliche Bestäubung
HINWEIS: Vor Beginn des Prozesses ist ein Paar Nr. 5 Zangen erforderlich.
- A. thaliana (Col-0) bei 22 °C unter einem 16-h-Licht-/8-h-Dunkelzyklus in einer Wachstumskammer anbauen.
HINWEIS: Schneiden und entfernen Sie den ersten entwickelten Blütenstiel mit der Schere, um die Entwicklung von Achselknospen zu fördern. Kräftig wachsende Pflanzen (2-3 Wochen nach dem Schneiden des ersten Stiels; Pflanzenhöhe ca. 25 cm) sind für die Analyse geeignet. - Entfernen Sie Sepal (Abbildung 1B), Blütenblatt (Abbildung 1C) und Stamen (Abbildung 1D) der Blütenknospen im Stadium 118 (Abbildung 1A) mit Nr. 5 Zangen. Bud mit Flecken von Blütenblättern an der Spitze zu sehen ist am besten.
HINWEIS: Verwenden Sie eine geeignete weibliche Gamete-Marker-Linie. In diesem Protokoll haben wir eine Wild-Typ-Pflanze als weibliches Elternteil verwendet. - Fünfzehn bis achtzehn Stunden nach der Entschämung, nehmen Sie das Stamen einer DMP9KD/HTR10-mRFP Blume in Stufe 138, indem Sie das Filament mit Zangen kneifen.
- Um zu bestäuben, klopfen Sie das Stigma eines entstickten Stempels mehrmals mit einem dehiscent Anther.
2. Vorbereitung von Ovule zur Beobachtung
HINWEIS: Folgende Gegenstände sind erforderlich: ein Gleitglas mit doppelseitigem Klebeband, Nr. 5 Zangen, eine 27 G Injektionsnadel und ein Sezieren des Mikroskops.
- 7 bis 8 h nach der Bestäubung (HAP), sammeln Sie den Stempel und legen Sie ihn auf das doppelseitige Band, dann drücken Sie sanft mit Zangen, um den Stempel auf dem Band zu befestigen (Abbildung 2A,A').
HINWEIS: Die meisten Eizellen in einem Stempel erhalten mindestens ein Pollenrohr 10 HAP9. Wenn beide oder eine der Spermien aus dem ersten Pollenrohr nicht befruchtet, würde ein zweites Pollenrohr durch die Eizelle aufgrund des Düngungsrückgewinnungssystemsangezogen werden 10. Um die Spermienkernmorphologie aus dem ersten Pollenrohr zu analysieren, wird empfohlen, die Ovule-Vorbereitung spätestens um 10 HAP abzuschließen. - Schneiden Sie die oberen und unteren Enden des Eierstocks mit einer Injektionsnadel unter einem Sezierendes Mikroskop ab (Abbildung 2B,B').
- Schlitzen Sie die Eierstockwand entlang beider Seiten des Replum (Abbildung 2C,C') durch Bewegen der Spitze der Injektionsnadel.
HINWEIS: Setzen Sie die Injektionsnadel flach ein, um eine Ovuletrennung vom Septum zu verhindern. - Evert die Eierstockwand mit der Injektionsnadel (Abbildung 2D,D').
- Kneifen Sie die Basis des Septums, mit dem die Ovules verbunden sind, und heben Sie sie vorsichtig mit Zangen an (Abbildung 2E).
- Übertragen Sie die Eizellen in einen Tropfen Wasser auf einem Gleitglas, und decken Sie vorsichtig mit einem Deckglas zur Beobachtung unter einem Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 2E,E').
3. Mikroskopie
HINWEIS: In diesem Protokoll verwendeten wir ein Epifluoreszenzmikroskop, das mit einem Fluoreszenzfilterwürfel (siehe Materialtabelle),einer Digitalkamera und der dazugehörigen Software ausgestattet ist.
- Erfassen Sie Bilder von Eizellen, die Mit mRFP beschriftete Spermakerne enthalten, mit einem 20-fachen oder 40-fachen Objektiv und der mitgelieferten Digitalkamera.
- Bestätigen Sie die Anzahl der mRFP-markierten Spermakerne in einem Embryosack.
HINWEIS: Ovules, die zwei mRFP-markierte Spermakerne enthalten, können für statistische Analysen in die Populationsgröße einbezogen werden. - Bestätigen Sie die Form und Position jedes mRFP-markierten Spermakerns in einem Embryosack.
HINWEIS: Unmittelbar nach der Freigabe aus einem Pollenrohr wird ein Paar kondensierter mRFP-markierter Spermakerne zwischen dem Ei und der Zentralzelle lokalisiert. Ein dekondensierter mRFP-markierter Spermakern, der an der Seite des Chalazal-Endes nachgewiesen wurde, weist beispielsweise auf eine zentrale Zellbefruchtung hin. Durch die Verwendung einer geeigneten weiblichen Gamete-Membran-Markerlinie, wie in DerErgänzungsabbildung 1dargestellt, kann die Frage, ob die Spermien plasmogamie (nach Membranfusion, aber vor Karyogamy) durchlaufen, eindeutig überwacht werden.
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Representative Results
Ovules aus einem mit DMP9KD/HTR10-mRFP bestäubten Stempel wurden bei 7-8 HAP gesammelt und beobachtet.
Die meisten Eizellen enthielten zwei dekondensierte mRFP-markierte Spermakerne an der Eizelle (Mikropylarseite) und zentralen Zellkernpositionen (Abbildung3A),was auf eine erfolgreiche Doppelbefruchtung hindeutet. Darüber hinaus wurden Ovule beobachtet, die einen dekondensierten mRFP-markierten Spermakern am zentralen Zellkern sowie einen kondensierten mRFP-markierten Spermakern außerhalb der Eizelle enthielten (Abbildung 3B), was auf eine einzelne Befruchtung hindeutet. Bei einer fehlgeschlagenen Doppelbefruchtung wurden zwei kondensierte mRFP-markierte Spermakerne an der Grenze der Eizelle und der Zentralzelle beobachtet (Abbildung 3C), wie in gcs1 mutierte Spermien (Abbildung 3D)3,4 .
Bei der Analyse mit DMP9KD/HTR10-mRFP-Pollen wurden selten Ovule beobachtet, die einen einzelnen kondensierten mRFP-markierten Spermakern (Abbildung 4A) oder drei oder mehr mRFP-markierte Spermienkerne (Abbildung 4B) enthielten.
Abbildung 1: Blütenknospen, die für die Entkernung geeignet sind. (A) Eine Blütenknospe in Stufe 11, die Teile der Blütenblätter an der Spitze zeigt. (B-D) Eine Blütenknospe, in der die Kelchblätter (B) und Blütenblätter (C) entfernt wurden und die dann vollständig entschärmt wurde (D). Die Anther-Dehiszenz ist noch nicht eingetreten. Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Fluss der Ovuleprobenvorbereitung. Die Verfahren werden durch Abbildungen (A-E) und Fotografien (A'-E'gezeigt. (A, A') Ein Stempel wird auf doppelseitiges Klebeband auf einem Gleitglas angebracht, und seine oberen und unteren Enden werden mit einer Injektionsnadel abgeschnitten. (B, B') Die Ovarialwand ist auf beiden Seiten des Replum siniert. (C, C') Beide Seiten der Eierstockwände werden geöffnet, immert und zur Befestigung auf das Band gedrückt. (D, D') Das Septum, in dem Ovules in Arrays verbunden sind, wird exponiert. (E, E') Ein Ende des Septums wird eingeklemmt und mit Zange angehoben. Das Septum mit verbindenden Eizellen wird auf einen Tropfen Wasser auf einem Gleitglas übertragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Düngephänotypen, die durch die Kernsignalmorphologie der Spermien beurteilt werden in Ovule. (A) Erfolgreiche Doppelbefruchtung, die durch zwei verdichtete mRFP-markierte Spermakerne (Pfeilspitzen) angezeigt wird. (B) Einzelbefruchtung durch DMP9KD/HTR10-mRFP-Spermien, die durch einen dekondensierten mRFP-markierten Spermakern (Pfeilspitze) und einen kondensierten mRFP-markierten Spermakern (Pfeil) angezeigt werden. (C) Fehlgeschlagene Doppelbefruchtung durch DMP9KD/HTR10-mRFP-Spermien, die durch zwei kondensierte mRFP-markierte Spermakerne (Pfeile) angezeigt werden. (D) Ein Beispiel für eine fehlgeschlagene Doppelbefruchtung durch gcs1HTR10-mRFP-Spermienzellen. Es wurde eine Markerlinie verwendet, in der der Eizellkern (EN) mit RFP beschriftet ist. Zwei kondensierte mRFP-markierte Spermakerne (Pfeile) werden ohne Befruchtung bei 18 HAP verhaftet. (E) Schematische Darstellung einer Eizelle. EC = Eizelle, CC = Zentralzelle, SC = Synergidzellen, ES = Embryosack, MP = Mikropyle, CHZ = Chalazalende. Skalenbalken = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Sonstiges Potenzial Befruchtungsphänotypen. Ovules aus einem mit DMP9KD/HTR10-mRFP bestäubten Stempel enthalten selten einen einzelnen kondensierten mRFP-markierten Spermakern (A), oder drei oder mehr kondensierte mRFP-markierte Spermakerne (B) (Pfeile). Skalenbalken = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Kondensierte Spermakerne bei Plasmogie während der Befruchtung, gemessen in Kombination mit einer weiblichen Plasmamembran-Markerlinie. pFWA::GFP-PIP, wo die zentrale Zellplasmamembran visualisiert wird, wurde als weibliches Elternteil (GFP) verwendet. GFP-PIP beschriftet auch Endomembranen12. Die Ovule enthält zwei kondensierte mRFP-markierte Spermakerne (Pfeile; RFP). Das RFP-Signal an der Charazal-Endseite (Pfeil) wird in der zentralen Zelle (Merge) angezeigt, was darauf hinweist, dass sich der Spermakern in Plasmogamie befindet (nach Gamete-Membranfusion, aber vor Karyogamy). Das Panel auf der rechten Seite ist eine Vergrößerung des Bereichs, der von gestrichelten Linien im zusammengeführten Bild umgeben ist. Ein leerer Bereich, der durch ein Sternchen gekennzeichnet ist, entspricht der Position des zentralen Zellkerns. Die gestrichelte Linie zeigt den Umriss der zentralen Zelle zur Eizelle an. Skalenbalken = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
HTR10-mRFP-Etiketten väterliches Chromatin (d. h. visualisiert Spermienkerne), und die Dynamik bei der Doppelbefruchtung wurde berichtet7. Unmittelbar nach der Freisetzung aus einem Pollenrohr werden HTR10-mRFP-markierte Spermakerne noch kondensiert. Jedoch, jeder der Spermienkerne wird bei der Verschmelzung mit einem befruchteten weiblichen Gamete-Kern bei Karyogamy drei bis vier Stunden nach Gamete Membranfusion7dekondensiert. Unbefruchtete Spermien bleiben kondensiert, wie in einem Embryosack gezeigt, in dem gcs1-Spermien ohne Befruchtung verhaftet werden (Abbildung 3D). In der Regel, wenn das fruchtbare HTR10-mRFP als Pollen-Elternteil verwendet wird, enthalten 57,9 % bei 17,8 % (Mittelwert s.d.; n = 16 Stempel) von Ovuls in einem Stempel bei 7-8 HAP zwei mRFP-markierte Spermakernsignale und fast alle Signale (97,2%) sind dekondensiert, was eine erfolgreiche Doppeldüngung widerspiegelt (ein ähnliches Signalmuster ist in Abbildung 3Adargestellt). Im Fall von DMP9KD/HTR10-mRFPwurden Ovules mit zwei mRFP-markierten Spermikernen in einer ähnlichen Häufigkeit wie HTR10-mRFPbeobachtet, aber 17,6% von ihnen zeigten eine einzige Befruchtung6. Wir haben die HTR10-mRFP-Dynamik zur Beobachtung einer großen Anzahl von Ovulen unter in vivo-Bedingungen mit einem Epifluoreszenzmikroskop übernommen. Das Protokoll ist einfach und schnell, was die Erfassung ausreichender Daten für den statistischen Nachweis ermöglicht. Mit diesem Protokoll als erste Instanz wurde die Bedeutung der Einzelbefruchtung der Zentralzelle durch DMP9KD/HTR10-mRFP-Spermien nachgewiesen6.
Basierend auf den morphologischen Unterschieden von HTR10-mRFP-markierten Spermakernen, die aus einem Pollenrohr abgeleitet sind, werden die Düngemuster in drei Phänotypen eingeteilt: (1) erfolgreiche Doppeldüngung, die durch zwei dekondensierte HTR10-mRFP-markierte Spermakerne (Abbildung 3A); (2) Einzelbefruchtung mit einem kondensierten HTR10-mRFP-markierten Spermakern und einem dekondensierten HTR10-mRFP-markierten Spermakern (Abbildung 3B); und (3) fehlgeschlagene Doppelbefruchtung, die zwei kondensierte HTR10-mRFP-markierte Spermakerne enthält (Abbildung 3C).
Andere mögliche Ursachen von Phänotypen (2) und (3) sollten in Betracht gezogen werden. Es wurde berichtet, dass Spermien bzw. Plasmogmie mit einer Eizelle oder einer zentralen Zelle mehrere Minuten nach der Freigabe in einen Embryosack unter semi-in vitro Kulturbedingungen11beginnen. Darüber hinaus besteht zwischen der ersten und der zweiten Befruchtung eine Zeitverzögerung von wenigen Minuten, obwohl die Reihenfolge der Befruchtung der Eizelle und der Zentralzelle11nicht bevorzugt wird. Daher könnte ein Paar kondensierter und dekondensierter Spermakerne im Phänotyp (2) auf eine Zeitverzögerung zwischen den Befruchtungen anstelle einer einzelbefruchtung hinweisen. Um das Auftreten einer Einzeldüngung in signifikanter Häufigkeit im Phänotyp (2) zu bestätigen, sollte eine Reihe von Proben untersucht werden, die für eine statistische Analyse ausreichen. Der Phänotyp (3), der zwei kondensierte Spermienkerne hat (Abbildung3C), könnte eine Periode der Immobilität von Spermien vor der Plasmamembranfusion12 oder den Zeitraum zwischen Plasmogie und Karyogamy widerspiegeln. Daher spiegeln zwei kondensierte Spermakerne bei 7-8 HAP das "Versagen" der Doppelbefruchtung nicht vollständig wider, und es ist notwendig, die Eizellen zu einem späteren Zeitpunkt nach der Bestäubung zu beobachten, um den Erfolg oder Misserfolg der Doppeldüngung zu beurteilen. In diesem Zusammenhang wird die Ovulebeobachtung bei 16-18 HAP empfohlen, da die meisten Ovules eine doppelbefruchtende Befruchtung mit Spermien abgeschlossen hätten, die von der ersten Pollenröhre geliefert wurden, und HTR10-mRFP-Signale von unbefruchteten Spermikernen bis zum nächsten Tag der Bestäubung, wie in Abbildung 3Ddargestellt.
Ein Muster von einzelnen kondensierten HTR10-mRFP-markierten Spermakern (Abbildung 4A) wurde selten nachgewiesen, was wahrscheinlich auf das schnelle Verschwinden eines anderen väterlichen HTR10-mRFP-Signals in der befruchteten weiblichen Gamete als Folge einer einzelnen Befruchtung zurückzuführen war. In dieser Analyse wurden drei oder mehr HTR10-mRFP-markierte Spermakerne auch als seltener Fall nachgewiesen (Abbildung 4B), aufgrund der zweiten Pollenrohrakzeptanz durch das Dünge-Recovery-System10. In diesem Protokoll wurden diese Fälle aus den Daten ausgeschlossen, da die Rückverfolgung des Verhaltens von zwei Spermien, die aus einem Pollenrohr abgeleitet wurden, für eine genaue Bewertung von entscheidender Bedeutung ist.
Da die Polarität für die Positionen der weiblichen Gameten in einem Embryosack gut reguliert ist (d.h. die Eizelle und die Zentralzelle unterscheiden sich an der Mikropylar- bzw. Chalazal-Seite), kann die weibliche Gamet-Befruchtung nach dem relativen Positionen der mRFP-markierten Spermakerne. Es gibt jedoch eine Einschränkung bei der Unterscheidung zwischen unbefruchteten und plasmogamie Zuständen, da beide Zustände durch das kondensierte Spermakernsignal angezeigt werden. Um genau zu beurteilen, ob Plasmogamie nach Gamete-Membranfusion aufgetreten ist oder nicht, wenn die Spermienkerne kondensiert sind, ist es erforderlich, weibliche Gamete-Membran-Markerlinien zu verwenden, wie von Takahashi et al. (2018)6berichtet. Wenn beispielsweise eine pFWA::GFP-PIP-Pflanze 12, in der die zentrale Zellplasmamembran visualisiert wurde, als weibliches Elternteil verwendet wurde, ist klar, dass eine mit der Zentralzelle verschmolzene Spermienin in der Plasmogie war (Zusatzabbildung 1 ).
Zusammenfassend kann unser hier beschriebenes Protokoll für die statistische Bewertung des Erfolgs oder Desintersten der Befruchtung in jeder weiblichen Gamete verwendet werden. Obwohl der Einsatz des weiblichen Plasmamembranmarkers erforderlich ist, um die Plasmogamie zu beurteilen, ist unsere Methode nützlich für die funktionelle Analyse des Düngereglers.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant (JP17H05832 to T. I.) und durch die Förderung des Strategic Priority Research Promotion Program on Phytochemical Plant Molecular Sciences, Chiba University (Japan) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
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| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
||
| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 G |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA 0.75), dry |
References
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