Summary
该协议描述了使用大分子挤拥创建体外人类肥肥疤痕组织模型,类似于在体内条件。在拥挤的大分子环境中培养时,人类皮肤成纤维细胞表现出类似疤痕组织的表型、生物化学、生理学和功能特性。
Abstract
研究表明,体内组织中蛋白质、核酸、核糖蛋白、多糖等非常拥挤。以下协议应用大分子挤拥 (MMC) 技术,通过在体外添加中性聚合物(挤出体)来模拟这种生理挤拥。以前使用Ficoll或dextran作为人群的研究表明,使用MMC技术,在WI38和WS-1细胞系中胶原蛋白I和纤维素的表达得到显著增强。然而,这种技术尚未在原发肥疤源人类皮肤成纤维细胞(hHSFs)中得到验证。由于胶原蛋白的过度沉积会产生肥大疤痕,该协议旨在通过将MMC技术与hHSF一起应用,构建富含胶原蛋白的体外增肥疤痕模型。与传统二维(2-D)细胞培养系统相比,这种优化的MMC模型与体内疤痕组织具有更多的相似性。此外,与动物模型相比,它具有成本效益、时间高效且合乎道德。因此,此处报告的优化模型为肥肥疤痕相关研究提供了先进的"体内类似"模型。
Introduction
疤痕组织代表组织修复的终点。然而,在许多个人,特别是那些遭受烧伤或创伤1,疤痕可能是过度的,并施加不良的影响,愈合的皮肤的形态和功能。虽然病理(肥大疤痕和酮)疤痕形成的确切机制尚未完全理解,但胶原蛋白在伤口愈合过程中的过度沉积已被证明是一个必不可少的贡献2。
众所周知,转化生长因子β 1 (TGF-+1) 和 α 平滑肌肉作用素 (#SMA) 在增肥疤痕的形成中起着关键作用。有证据表明,升高的TGF-β1通过调节SMAD信号通路3直接刺激胶原蛋白的过度沉积。此外,在伤口愈合过程中,通过调节细胞收缩和重皮化,发现αSMA有助于肥大疤痕的形成。缺乏适当的体外和体内模型是开发和评估疤痕补救干预措施和疗法的主要障碍。本研究的目的是利用现有的MMC技术,构建一个"体内类似"肥肥疤痕模型,适合评估新的和新兴的疤痕相关干预。
多年来,在科学界,在身体外复制活组织一直是一个目标。二十世纪初体外技术的发展部分实现了这一目标。目前的体外技术从Roux最初的证明中略有进化,即胚胎细胞可以在温暖的盐水5中存活几天。然而,体外方法大多限于在二维培养的单细胞类型,并且不能准确地重述体内的细胞组织。虽然可用于检查细胞生物化学、生理学和遗传学,但原生组织是三维组织,并包含多种细胞类型。简单的二维体外系统将哺乳动物细胞置于高度人工的环境中,其中原生组织特定的结构在6中丢失。反过来,这影响细胞内和细胞外事件,导致异常细胞形态,生理和行为7。
该协议背后的兴趣在于肥肥疤痕和酮类物的开发和临床管理。虽然众所周知,皮肤纤维细胞在很大程度上是导致疤痕组织中存在胶原蛋白的大量生产的原因,但使用二维体外系统培育皮肤纤维细胞不能重现体内8中观察到的胶原蛋白的周转。当代体外方法基本上仍然使用"暖盐水",这种环境与活体组织中的环境完全不同。体内组织非常拥挤,蛋白质、核酸、核糖蛋白和多糖,占总体积的5%-40%。由于没有两个分子可以同时占据相同的空间,因此几乎没有可用的可用空间,而且几乎完全没有自由水9。
MMC 技术施加了影响细胞溶质和间质流体热力学特性的限制。分子相互作用、受体-配体信号复合物、酶和细胞器被限制和限制自由相互作用。近细胞环境中的相互作用(即间室)也受到限制。近期证据证实,高浓度惰性大分子在拥挤的溶液扰动扩散,物理关联,粘度和水动力特性10。
有趣的是,几种流行的挤水剂(即菲科尔、dextran、聚乙烯丙酮[PVP]和钠4苯乙烯硫化酸[PSS])在应用于不同的细胞类型和不同设置时不等效。在以前的一项研究中,菲科尔与PVP相比,中质干细胞的细胞毒性较小。这些结果被解释为其中性电荷和相对较小的水动力半径11的结果。与此相反,第二项研究发现,与Ficoll12相比,dextran在刺激人肺成纤维细胞的胶原蛋白I沉积方面更有效。来自我们自身研究的数据表明,Ficoll通过肥大疤痕衍生成纤维细胞增强胶原蛋白沉积,而PVP对这些细胞13有毒。
实践证明,在高度拥挤的体内环境中,原胶原蛋白转化为胶原蛋白的速度更快,而生物反应的速度在稀释的二维培养系统15中延迟。我们在这里优化了体外方案,纳入了MMC,以表明皮肤纤维成纤维细胞的培养,作为皮肤纤维化和疤痕形成更"体内"的模型。与常见的二维培养系统相比,用MMC培养hHSF能显著刺激胶原蛋白的生物合成和沉积。值得注意的是,纤维化的其他特性(即,增加基质金属蛋白酶[MP]和亲炎细胞因子的表达)也在这个优化的MMC协议13下明显。使用这种方法培养时,结果表明,皮肤细胞重述了体内测量的生理、生化和功能参数。
优化的MMC体外方案已用于评估胶原蛋白和其他ECM蛋白的表达,通过从肥大疤痕真皮分离的皮肤成纤维细胞和未介入的相邻真皮。在体外MMC环境中培养时,观察到hHSFs具有某些特性(即mRNA、生物化学、生理学和表型),类似于体内皮肤增生性疤痕组织。证据表明,物理和化学特性是选择挤出体和优化MMC条件进行体外培养的重要考虑因素。
为了证明原理,MMC协议在这里应用,以定性和定量评估Shikonin及其模拟诱导凋亡的能力。这允许评估这些天然中药(TCM)化合物在管理皮肤疤痕方面的潜在应用。尽管如此,这项体外MMC协议的简单性、成本效益和及时性也满足了欧盟指令2010/63/EU和美国环境保护署(EPA)最近关于消除哺乳动物实验的规定。
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Protocol
1. 细胞培养
- 在Dulbecco的改良鹰介质(DMEM)中,在含有10%胎儿小牛血清(FCS)和1%v青霉素/链霉素溶液(P/S)的培养箱中,在37°C下,在5%CO2/95%空气中,保持从非病理组织(hNSFs)衍生的hHSF和正常皮肤2纤维细胞。
- 从相应的公司购买菲科尔70,菲科尔400,抗坏血酸。
2. 构建MMC肥大疤痕模型
- 将 hHSF 或 hNSF(50,000/well)放入 24 孔板中,每个井中含有 1 mL 介质。
- 以 5% CO2放入 37°C 孵化器,并过夜。
- 准备 MMC 介质。根据实验所需的总体积,通过混合Ficoll 70(18.75mg/mL)、菲科尔400(12.5毫克/米升)和抗坏血酸(100 μM),产生10%的FCS/DMEM介质。
- 将混合物放入 37°C 水浴中 1 小时,将挤出机分散到溶液中,然后使用 0.2 μm 过滤器对 MMC 介质进行消毒。
- 吸气已用介质,代之以刚制作的 MMC 介质。
- 在37°C和5%CO2下孵育细胞6天,2每3天更换一次介质。
3. 表达胶原蛋白总量
- 准备天狼星红色解决方案(0.1%/v)。将 0.2 克直接红 80 粉末溶解在 200 mL 蒸馏脱离子水 (ddH2O) 与 1 mL 醋酸。
- 吸气 MMC 介质,并将 300 μL 的天狼星红溶液添加到每个井中。在37°C孵育90分钟。
- 用自来水轻轻冲洗天狼星红溶液,让盘子在一夜之间风干。
- 通过在每口井中加入200μL氢氧化钠(0.1 M)来提取天狼星红渍。将板放在轨道摇床上 5-10 分钟,以完全提取天狼星红色污渍。
- 将提取的天狼星红渍的100 μL转移到96个透明孔板中,并使用微板读取器测量620nm的吸收度。
4. 胶原蛋白I的表达(免疫染色)
- 使用 200 μL 磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH = 7.35)清洗井。
- 使用甲醇(500 μL/well)在4°C下固定10分钟。
- 在室温 (RT) 下,与 3% 牛血清白蛋白阻止非特异性相互作用 30 分钟。
- 在RT中吸气阻塞溶液,用200μL的抗胶原I抗体(10μg/mL)孵育90分钟。
- 吸气原抗体,用PBS洗3x,每次5分钟。
- 用200μL的山羊抗兔-FITC二次抗体(1:400稀释)和4',6-二胺-2-苯胺醇(DAPI;1:2000稀释)在RT中孵育30分钟。用铝箔盖住板。
- 将二次抗体和DAPI同时丢弃,用PBS洗涤3倍,每次5分钟。
- 直接在显微镜下可视化荧光染色。
5. 西方印迹
- 用PBS清洗2倍的细胞。
- 在每个孔中加入 40 μL 的碎块缓冲液,用移液器尖端刮取细胞层。裂解缓冲液含有RIPA缓冲液、蛋白酶抑制剂鸡尾酒(PIC)、2 mM钠烷酸钠和10 mM氟化钠。
- 将蛋白质液化酶转移到微离心管中,按照制造商的说明16,使用蛋白质测定测量蛋白质浓度。
- 将每组10μg的蛋白质装入4%-12%的Bis-Tris蛋白凝胶的井中。在200 V下进行多代硫酸钠聚丙烯酰凝胶电泳(SDS-PAGE),30分钟。
- 将蛋白质转移到硝基纤维素膜上,在90V处运行一个西印布90分钟,避免凝胶和硝基纤维素膜之间形成气泡。
- 用10 mL的阻塞缓冲液阻塞膜。
- 在4°C下孵育原抗体过夜。主要抗体有:抗胶原I、抗胶原体III、抗胶原体IV、抗βSMA、抗MMP-1、抗MMP-2、抗MMP-9、抗MMP-13和抗甘油醛3-磷酸盐脱氢酶(GAPDH)。
- 用 0.1% TBS-Tween 20(每部 5x 5 分钟)清洗膜。TBS/Tween 20 (1 L) 包含以下内容:50 mL 的 1 M Tris (pH = 7.4), 30 mL 的 5 M 氯化钠, 1 mL 的 Tween 20, 和 920 mL 的 ddH2O.
- 在RT与一种合适的二次抗体孵育1小时。
- 重复步骤 5.8 并使用成像系统可视化荧光。
6. RT-PCR
- 使用与RNA提取测定试剂盒中包括的2-mercapto乙醇混合的液化缓冲液收集总RNA。
- 按照制造商的说明17纯化RNA。
- 使用微量分光光度计测量RNA浓度。
- 按照制造商的说明,使用 cDNA 合成套件进行第一链 cDNA 合成。
- RT-PCR寡核苷酸底漆在96孔板中提供(预涂)。将 100 纳克的 cDNA 样品与 10 μL 的 SYBR 绿色超级混合混合到定制板中。
- 使用 ddH2O 将总体积增加到 20 μL/井。
- 按照制造商的说明,使用热循环器运行 RT-PCR:在 98°C 下 40 次变性 15 s,在 60°C 下 60°C 进行 60 s 的退火/延长。在RT-PCR中测试的基因包括:COL1A1、COL3A1、ACTA2、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD7、IL1A、IL1B、IL6、IL8、MMP1、MMP2、MMP3、TGFB1和VEGF。 COL1A1 COL3A1 ACTA2 SMAD2 SMAD3 SMAD4 SMAD7 IL1A IL1B IL6 IL8 MMP1 MMP2 MMP3 TGFB1,
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Representative Results
在每个实验中进行三重样本,每个实验使用三个个体患者的细胞重复3倍。数据以控制组的百分比表示。应用单向 ANOVA 和 Tukey 的事后测试来分析统计差异(=p = 0.05)。
MMC使用Ficoll在9%FVO(分数体积占用)提高胶原蛋白和胶原蛋白I沉积在hHSF13的总量。如图1A所示,与使用PVP的对照和MMC相比,使用Ficoll在培养后,hHSF的细胞密度显著增加,为9%和18%的FVO。图1B,C表明,与其他MMC配方相比,菲科尔(9%的FVO)显著增强了胶原蛋白(包括胶原蛋白I)的沉积。定量分析 (图 1D, E) 进一步证明,菲科尔(在 9% FVO) 最有效地改善了胶原蛋白的沉积。
在MMC环境中栽培的hHSF和hNSF,除了胶原蛋白13外,还用于调节ECM物种的表达。图2中报告的数据显示,当使用MMC培养hHSF和hNSF时,胶原蛋白IV的表达也显著增加。基质金属蛋白酶(MP)在伤口愈合和疤痕形成、调节ECM组装和改造18中起着重要的作用。MP还有助于细胞增殖,细胞迁移,血管生成和凋亡19。值得注意的是,与原生组织20相比,MP的表达在肥大疤痕组织中积聚。观察到,在MMC环境中培养的hNSF和hHSF培养物中,MMP-2、-9和-13的表达明显增强。
我们还探讨了白蛋白-6(IL-6)和血管内皮生长因子(VEGF)的合成;然而,在西方的污点中,这些是无法察觉的。相比之下,RT-PCR分析表明IL6的表达明显受到控制,而在MMC条件下培养的hNSF和hHSF中,VEGF的表达被降低。Figure 3IL-6的表达增加已被证明有助于肥大疤痕形成21。矛盾的是,也有报道说,肥大疤痕的形成与VEGF22的表达升高有关。此处进行的RT-PCR分析表明,在MMC条件下培养的hNSF和hHSF中,VEGF的表达被大大衰减。
最后,结果表明,1)胶原蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、MMP-2、MMP-9和MMP-13 de novo和2)在hHSFs和hNSF中增加IL6 mRNA的表达。综合起来,这些数据表明,在包括MMC在内的介质配方中培养原发性hHSFs和hNSF,可以保留在体内原生肥肥疤痕组织中观察到的特征基因表达、生物化学和表型,从而形成一个健壮的"疤痕在一罐"模型。
图1:MMC可增强hHSF中胶原蛋白和胶原蛋白I沉积的总量。(A)细胞形态学,(B)总胶原蛋白,沾有天狼星红,(C)胶原蛋白I表达,通过免疫荧光、(D)总胶原蛋白定量分析以及(E)胶原蛋白I沉积定量分析进行证明。hHSF在介质中培养,辅以Ficoll(9%和18%FVO)、PVP40(18% FVO)或PVP360(54%和72%FVO),6天。选择了代表性图像。使用 ImageJ 执行图像量化,并表示为控件的平均百分比。所有实验都使用从三个不相关的捐赠者分离的细胞重复3倍。统计分析使用单向 ANOVA 与 Tukey 的后测试 (=p < 0.05 vs. 对照组, 误差条表示 SEM).刻度杆 = (A) 0.5 毫米,(B) 2 毫米,(C) 0.5 毫米。这个数字是从先前的研究13修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2:MMC对细胞蛋白表达的影响。hHSF和hNSF在MMC条件下培养6天。全细胞裂解剂是用含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒、烷酸钠和氟化钠的RIPA缓冲液制备的。蛋白质浓度是用蛋白质测定测量的。提供代表性图像。定量分析时,利用密度测定测量单个蛋白带的强度,并归化为GAPDH,并使用ImageJ软件在正常介质中转换为hNSF的百分比。所有实验都是使用三个不相关的捐赠者的细胞进行3倍的。统计分析使用单向 ANOVA 与 Tukey 的后测试 (=p < 0.05, 误差条表示 SEM) 执行。这个数字是从先前的研究13修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3:MMC对细胞基因表达的影响。hHSF和hNSF在MMC条件下栽培6天。使用检测试剂盒采集了总RNA,并使用cDNA合成试剂盒合成了第一链cDNA。靶基因表达被规范化为GAPDH,并转换为正常介质中hNSF的百分比。所有实验都使用三个不相关的捐赠者的细胞重复3倍。统计分析使用单向 ANOVA 与 Tukey 的后测试 (=p < 0.05, 误差条表示 SEM) 执行。这个数字是从先前的研究13修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
该协议旨在优化和验证人类皮骨疤组织改进的"疤痕在一罐"体外模型。此前的研究曾报告将MMC技术应用于人类肺成纤维细胞12个,人类骨髓中皮干细胞23个,以及人类皮肤纤维细胞23个,使用dextran12、Ficoll12和PVP23作为23人群。在此报道的研究中,先前公布的肥大疤痕衍生人类皮肤成纤维细胞协议用Ficoll或PVP作为人群进行了优化。
大分子挤出器的选择和浓度是关键参数,因为它们不能产生等效的结果。先前的研究报告,PVP40(18% FVO)和PVP360(54%FVO)显著增强皮肤纤维细胞中的胶原蛋白沉积和细胞增殖23(PVP在FV >54%的影响未经测试)。但是,这两个条件不能始终如一地适用于使用此协议的 hHSF。
如图 1所示,与对照相比,Ficoll 显著增强胶原蛋白 I 沉积,而 PVP 没有显著效果。与18%的FVO相比,9%的FVO菲科尔显著增加了胶原蛋白和胶原蛋白I型的总量。此外,使用低通道的细胞至关重要,因为原性皮肤纤维细胞在培养24中寿命有限。它被选择只使用新鲜隔离的hHSF来保留体内的表型。长期栽培后,原质hHSF表现出异常形态和非典型功能反应。还建议MMC介质补充抗坏血酸,在hHSF25中胶原蛋白合成的关键诱导剂。此外,其他研究人员建议将材料表中所列的相同抗体用于与hHSF相关的研究;但是,如果将该协议应用于其他细胞类型,则需要验证抗体。
正如代表结果所报告的那样,与使用经典非MMC条件培养的hHSF相比,发现大分子挤出剂可以刺激hHSF中胶原蛋白(即胶原蛋白I、胶原蛋白IV、MP和IL6)的表达。认为优化的MMC模型保留了hHSFs体内表型的方面,重述了其特征形态、生物化学、生理学和体内角疤组织丰富的细胞外基质(与现有的二维培养方法相反)。我们无法确定任何类似的体外模型,能够重述类似的"体内类似"属性。与现有动物模型相比,此 MMC 协议更快、更用户友好、经济高效且更耗时。Cuttle等人建立了一种利用热损伤的猪肥增肥疤痕模型,其特征似乎与人类肥肥疤痕26相似。然而,除了维持动物所需的成本和时间外,实验还需要3个月以上才能完成26个。此优化的 MMC 模型需要大约 1 周的准备才能投入使用。
该协议为检查新型抗疤痕疗法提供了先进的体外模型。MMC模型已用于评估Shikonin,一种分子,先前报道抑制脱氧核酸形成疤痕,以修复成熟的肥肥疤痕27,28。27,对新型化合物和采用传统方法进行药物发现和概念验证的类似评价将需要大量资源、资金和时间。这项研究需要最少的资金,可以在几个月内完成。该协议灵活且易于适应动物研究前新型肥肥疤痕处理的开发和评估应用。
此外,还可以进一步修改此协议,以开发更多"类似体内"的属性。例如,富含TGF-β1的存在是肥大疤痕组织的一致发现,通过刺激胶原蛋白合成和沉积来调解疤痕的形成。TGF-#1 可随时纳入 MMC 协议,并进一步改善体内病理学的重述。我们尚未探索该模型的全部潜力,这可能对其他胶原蛋白和ECM相关疾病(即硬皮病、肺纤维化、子宫内性纤维化等)有用。此外,在较长的培养期(如2或3周)观察MMC对细胞的影响是很有趣的。进一步评估MMC对细胞和ECM分层架构和对齐的影响,特别是胶原蛋白的方向,也是值得的,因为这些表征对体内疤痕组织的形成至关重要。
该协议的主要限制之一是限制单元格类型。肥大疤痕的形成涉及不同细胞群的参与,不同细胞类型之间的相互作用在疤痕形成中起着至关重要的作用。例如,角膜细胞在皮骨伤口愈合和疤痕形成中也起着重要作用。将更多的细胞群纳入这个模型将大大改善其在未来研究中的重要性。
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Disclosures
提交人没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了新加坡科学、技术和研究机构"SPF 2013/004:皮肤生物学基础研究"和"热带病护理创新"IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009 的资助。作者感激地感谢保拉·本尼博士和迈克尔·拉古纳博士的建议和帮助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
RIPA buffer | Merck | R0278 | |
RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
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