Summary
Ce protocole décrit l’utilisation de l’encombrement macromoléculaire pour créer un modèle de tissu cicatriciel hypertrophique humain in vitro qui ressemble à des conditions in vivo. Lorsqu’ils sont cultivés dans un environnement macromoléculaire surpeuplé, les fibroblastes de peau humaine présentent des phénotypes, de la biochimie, de la physiologie et des caractéristiques fonctionnelles ressemblant au tissu cicatriciel.
Abstract
Il a été démontré que les tissus in vivo sont fortement encombrés par les protéines, les acides nucléiques, les ribonucléoprotéines, les polysaccharides, etc. Le protocole suivant applique une technique d’encombrement macromoléculaire (MMC) pour imiter cette encombrement physiologique par l’ajout de polymères neutres (crowders) aux cultures cellulaires in vitro. Des études antérieures utilisant Ficoll ou dextran comme crowders démontrent que l’expression du collagène I et de la fibronectine dans les lignées cellulaires WI38 et WS-1 sont considérablement améliorées à l’aide de la technique MMC. Cependant, cette technique n’a pas été validée dans les fibroblastes humains de peau hypertrophiques primaires dérivés de cicatrices (hHSF). Comme la cicatrisation hypertrophique résulte du dépôt excessif du collagène, ce protocole vise à construire un modèle de cicatrice hypertrophique in vitro riche en collagène en appliquant la technique MMC avec des HHSF. Ce modèle MMC optimisé a été montré pour posséder plus de similitudes avec le tissu cicatriciel in vivo par rapport aux systèmes traditionnels de culture cellulaire 2 dimensions (2-D). En outre, il est rentable, rentable et souhaitable sur le plan éthique par rapport aux modèles animaux. Par conséquent, le modèle optimisé rapporté ici offre un modèle avancé "in vivo-like" pour les études hypertrophiques liées aux cicatrices.
Introduction
Le tissu cicatriciel représente le critère final de la réparation des tissus. Cependant, chez de nombreuses personnes, en particulier celles souffrant de brûlures ou detraumatismes 1, les cicatrices peuvent être excessives et imposer des effets indésirables sur la morphologie et le fonctionnement de la peau guérie. Bien que les mécanismes exacts de la formation pathologique (cicatrices hypertrophiques et chéloïdes) ne soient pas entièrement compris, le dépôt excessif du collagène pendant la cicatrisation des plaies a été démontré comme une contribution essentielle2.
Il est bien établi que la transformation du facteur de croissance bêta 1 (TGF-1) et de l’actine alpha lisse du muscle (SMA) jouent un rôle clé dans la formation de cicatrices hypertrophiques. Les preuves suggèrent que le TGF-1 élevé stimule directement le dépôt excessif de collagène par la régulation de la voie de signalisation SMAD3. En outre, il a été constaté que la SAS a contribué à la formation de cicatrices hypertrophiques en régulant la contraction et la réépithelialisation des cellules dans le processus de cicatrisationdes plaies 4. L’absence de modèles in vitro et in vivo appropriés est un obstacle majeur au développement et à l’évaluation des interventions et des thérapies pour l’assainissement des cicatrices. L’objectif de cette étude est d’utiliser la technique MMC existante pour construire un modèle de cicatrice hypertrophique « in vivo » qui convient à l’évaluation des interventions nouvelles et émergentes liées aux cicatrices.
Reproduire des tissus vivants à l’extérieur du corps a été un objectif pendant des années dans la communauté scientifique. Le développement de techniques in vitro au début du XXe siècle a en partie atteint cet objectif. Les techniques in vitro actuelles ont légèrement évolué à partir de la démonstration originale de Roux que les cellules embryonnaires peuvent survivre ex vivo pendant plusieurs jours dans la saline chaude5. Cependant, les méthodologies in vitro sont principalement limitées aux types de cellules individuelles cultivés en 2-D et ne récapitulent pas avec précision les tissus in vivo. Bien qu’ils soient utiles pour examiner la biochimie cellulaire, la physiologie et la génétique, les tissus indigènes sont 3D et intègrent plusieurs types de cellules. Les systèmes in vitro simples en 2D soumettnt les cellules mammifères à des environnements hautement artificiels dans lesquels l’architecture spécifique aux tissus indigènes est perdue6. À son tour, cela affecte les événements intracellulaires et extracellulaires, ayant pour résultat la morphologie anormale de cellules, la physiologie, et le comportement7.
L’intérêt derrière ce protocole réside dans le développement et la gestion clinique des cicatrices hypertrophiques et des chéloïdes. Bien qu’il soit bien établi que les fibroblastes dermiques sont en grande partie responsables de la production abondante de collagènes présents dans le tissu cicatriciel, cultiver des fibroblastes dermiques à l’aide de systèmes in vitro 2-D ne parvient pas à reproduire le chiffre d’affaires du collagène observé in vivo8. Les méthodes in vitro contemporaines utilisent encore essentiellement le « salin chaud », un environnement complètement différent de celui des tissus vivants. Les tissus in vivo sont extrêmement encombrés, avec des protéines, des acides nucléiques, des ribonucléoprotéines et des polysaccharides, occupant 5% à 40% du volume total. Comme il n’y a pas deux molécules pouvant occuper le même espace en même temps, il y a peu d’espace libre disponible et une absence presque totale d’eau libre9.
La technique MMC impose des contraintes affectant les propriétés thermodynamiques des cytosols et des fluides interstitiels. Les interactions moléculaires, les complexes de signalisation récepteur-ligand, les enzymes et les organites sont confinés et interdits d’interagir librement9. Les interactions dans l’environnement périellulaire (c.-à-d. interstitium) sont également limitées. Des preuves récentes confirment que des concentrations élevées de macromolécules inertes dans les solutions bondées perturbent la diffusion, l’association physique, la viscosité et les propriétés hydrodynamiques10.
Fait intéressant, plusieurs agents de crowding populaires (c.-à-d. Ficoll, dextran, polyvinylpyrrolidone [PVP] et sodium 4-styrenesulfonate [PSS]) ne sont pas équivalents lorsqu’ils sont appliqués à différents types de cellules et dans différents contextes. Dans une étude précédente, Ficoll a été rapporté pour être moins cytotoxique pour les cellules souches mésenchymales comparées à PVP. Ces résultats ont été interprétés comme la conséquence de sa charge neutre et du rayon hydrodynamique relativement faible11. En revanche, une deuxième étude a constaté que dextran est plus efficace en stimulant le collagène I dépôt par les fibroblastes pulmonaires humains par rapport à Ficoll12. Les données de notre propre étude suggèrent que Ficoll améliore le dépôt de collagène par les fibroblastes hypertrophiques dérivés de cicatrice, tandis que PVP est toxique pour ces cellules13.
Il a été démontré que la conversion du procollagen en collagène est plus rapide dans un environnement in vivo très encombré14, tandis que le taux de réactions biologiques est retardée dans un système de culture 2D dilué15. Nous avons optimisé le protocole in vitro ici, incorporant MMC pour montrer la culture de fibroblastes dermiques servant de modèle plus " in vivo- comme pour la fibrose cutanée et la formation de cicatrices. Contrairement au système de culture 2D commun, cultiver des HHSF avec MMC stimule la biosynthèse et le dépôt de collagène de manière significative13. Notamment, d’autres caractéristiques de la fibrose (c.-à-d., l’expression accrue des métalloprotéinases matrices [MMPs] et des cytokines proinflammatoires) sont également évidentes en vertu de ce protocole MMC optimisé13. Lorsqu’elles sont cultivées à l’aide de cette méthode, il est démontré que les cellules cutanées récapitulent les paramètres physiologiques, biochimiques et fonctionnels mesurés in vivo.
Le protocole in vitro optimisé MMC a été utilisé pour évaluer l’expression du collagène et d’autres protéines ECM par des fibroblastes dermal isolés du derme de cicatrice hypertrophique et des dermis adjacents non impliqués. Lorsqu’ils sont cultivés dans des environnements MMC in vitro, il a été observé que les HHSF expriment certaines caractéristiques (c.-à-d. l’ARNm, la biochimie, la physiologie et le phénotype) semblables au tissu cicatriciel hypertrophique dermique in vivo. Les preuves indiquent que les propriétés physiques et chimiques sont des considérations importantes lors de la sélection des foules et l’optimisation des conditions MMC pour la culture in vitro.
Pour preuve de principe, le protocole MMC est appliqué ici pour évaluer qualitativement et quantitativement la capacité de Shikonin et de ses analogues à induire l’apoptose. Cela permet l’évaluation des applications potentielles de ces composés de médecine traditionnelle chinoise (TCM) d’origine naturelle pour la gestion des cicatrices cutanées13. Malgré tout, la simplicité, la rentabilité et la rapidité de ce protocole MMC in vitro satisfont également aux réglementations récentes visant à éliminer l’expérimentation chez les mammifères par la directive de l’UE 2010/63/EU et l’Environmental Protection Agency (EPA) des États-Unis.
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Protocol
1. Culture cellulaire
- Maintenir les hHSF et les fibroblastes cutanées fiques normaux dérivés de tissus non pathologiques (hNSF) dans le milieu modifié de l’aigle (DMEM) de Dulbecco contenant 10 % de sérum foetal de veau2(FCS) et 1 % v/v solution de pénicilline/streptomycine (P/S) à 37 oC dans un incubateur avec 5 % de CO 2/95% d’air.
- Achetez Ficoll 70, Ficoll 400 et acide ascorbique auprès des entreprises appropriées.
2. Construction du modèle de cicatrice hypertrophique MMC
- Ensemencer les hHSF ou les FSN (50 000/puits) dans une plaque de puits de 24 contenant 1 ml de support dans chaque puits.
- Placer dans un incubateur de 37 oC à 5 % de CO2 et laisser passer la nuit.
- Préparer les médias MMC. Sur la base du volume total requis pour l’expérience, produisez 10 % de supports FCS/DMEM en mélangeant ficoll 70 (18,75 mg/mL), Ficoll 400 (12,5 mg/mL) et acide ascorbique (100 m.).
- Placer le mélange dans un bain d’eau de 37 oC pendant 1 h pour disperser les foules dans la solution, puis stériliser le support MMC à l’aide d’un filtre de 0,2 m.
- Aspirer les médias dépensés et remplacer par les médias MMC fraîchement faits.
- Incuber les cellules pendant 6 jours à 37oC et 5% de CO2, changer les médias tous les 3 jours.
3. Expression de la quantité totale de collagène
- Préparer la solution rouge Sirius (0,1% w/v). Dissoudre 0,2 g de poudre de 80 rouge direct dans 200 ml d’eau déionisée distillée (ddH2O) avec 1 ml d’acide acétique.
- Aspirez le support MMC et ajoutez 300 L de solution Sirius Red dans chaque puits. Incuber à 37 oC pendant 90 min.
- Rincer délicatement la solution Sirius Red avec de l’eau du robinet et laisser sécher la plaque pendant la nuit.
- Extraire la tache Sirius Red en ajoutant 200 L d’hydroxyde de sodium (0,1 M) dans chaque puits. Placer la plaque sur un shaker orbital pendant 5 à 10 minutes pour extraire complètement la tache Sirius Red.
- Transférer 100 l’une de la tache Sirius Red extraite dans une plaque transparente de 96 et mesurer l’absorption à 620 nm à l’aide d’un lecteur de microplaque.
4. Expression du collagène I (immunostaining)
- Laver les puits à l’aide de 200 l de saline tamponnée par le phosphate (PBS, pH à 7,35).
- Fixer les cellules à l’aide de méthanol (500 l/puits) à 4 oC pendant 10 min.
- Bloquer les interactions non spécifiques avec l’albumine de sérum bovin à 3 % pendant 30 minutes à température ambiante (RT).
- Aspirez la solution de blocage et incuber avec 200 L d’anticorps anti-collagène I (10 g/mL) pendant 90 min à RT.
- Aspirer l’anticorps primaire et laver 3x avec PBS pendant 5 minutes chacun.
- Incubate avec 200 l d’anticorps secondaires de chèvre anti-Rabbit-FITC (1:400 dilution) et 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1: 2000 dilution) pour 30 min à RT. Couvrir la plaque avec du papier d’aluminium.
- Jetez à la fois l’anticorps secondaire et DAPI et lavez 3x avec PBS pendant 5 minutes chacun.
- Visualisez la coloration de fluorescence directement au microscope.
5. Ballonnement occidental
- Laver les cellules 2x avec PBS.
- Ajouter 40 L de tampon de lyse dans chaque puits et gratter la couche cellulaire avec une pointe de pipette. Le tampon de lyse contient du tampon RIPA, un cocktail inhibiteur de la protéase (PIC), un vanadate de sodium de 2 mM et un fluorure de sodium de 10 mM.
- Transférer la protéine lysate dans les tubes de microcentrifuge et mesurer la concentration de protéines à l’aide d’un essai de protéine selon les instructions du fabricant16.
- Charger 10 g de protéines de chaque groupe dans les puits de 4 % à 12 % de gels protéinés Bis-Tris. Effectuer le gel de polyacrylamide de sulfate de sodium électrophoresis (SDS-PAGE) à 200 V pendant 30 min.
- Transférer la protéine dans la membrane de nitrocellulose en exécutant une tache occidentale à 90 V pendant 90 min. Évitez la formation de bulles d’air entre le gel et la membrane de nitrocellulose.
- Bloquez la membrane avec 10 ml de tampon de blocage.
- Incuber avec des anticorps primaires à 4 oC pendant la nuit. Les anticorps primaires sont : anti-collagène I, anti-collagène III, anti-collagène IV, anti-SMA, anti-MMP-1, anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-MMP-13, et déshydrogénase anti-glyceraldéhyde 3-phosphate (GAPDH).
- Laver la membrane avec 0,1% TBS-Tween 20 (5x pour 5 minutes chacun). TBS/Tween 20 (1 L) contient ce qui suit : 50 ml de Tris de 1 M (pH à 7,4), 30 ml de chlorure de sodium de 5 M, 1 ml de Tween 20 et 920 ml de ddH2O.
- Incuber avec une espèce anticorps secondaire approprié à RT pour 1 h.
- Répétez l’étape 5.8 et visualisez la fluorescence à l’aide d’un système d’imagerie.
6. RT-PCR
- Recueillir l’ARN total à l’aide de la mémoire tampon de lyse mélangé avec 2-mercaptoethanol inclus dans le kit d’analyse d’extraction d’ARN.
- Purifier l’ARN selon les instructions du fabricant17.
- Mesurer la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume.
- Effectuez la synthèse de l’ADNC de premier brin à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNC selon les instructions du fabricant.
- Les amorces d’oligoucucléotide RT-PCR sont fournies (précoated) dans des plaques de puits personnalisées de 96. Mélanger 100 ng des échantillons d’ADN avec 10 L de supermix vert SYBR dans la plaque personnalisée.
- Augmenter le volume total à 20 L/puits à l’aide de ddH2O.
- Exécuter RT-PCR à l’aide d’un cycle thermique suivant les instructions du fabricant: 40 cycles de dénaturage à 98 oC pour 15 s et annealing /extension à 60 'C pour 60 s. Les gènes testés dans RT-PCR comprennent: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1, et VEGF.
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Representative Results
Des échantillons de triplicate ont été effectués dans chaque expérience, et chaque expérience a été répétée 3x utilisant des cellules de trois patients individuels. Les données sont exprimées en pourcentage du groupe témoin. Le test post-hoc d’ANOVA et Tukey a été appliqué pour analyser les différences statistiques(p - 0,05).
MMC utilisant Ficoll à 9% FVO (occupation fractionnelle du volume) améliore la quantité totale de collagène et de collagène I dépôt dans hHSF13. Comme l’illustre la figure 1A, la densité cellulaire des HHSF a considérablement augmenté après s’être culturée avec Ficoll à 9 % et 18 % de L’OAV par rapport au contrôle et au MMC à l’aide de PVP. La figure 1B,C indique que Ficoll (à 9 % de FVO) a considérablement amélioré le dépôt du collagène (y compris le collagène I) par rapport à d’autres formulations de MMC. L’analyse quantitative(figure 1D,E) a en outre démontré que Ficoll (à 9 % de LF) a le plus efficacement amélioré le dépôt du collagène.
hHSFs et hNSFs cultivés dans les environnements MMC ont été trouvés pour réguler l’expression des espèces ECM en plus de collagène13. Les données rapportées à la figure 2 indiquent que lorsque les FSH et les FNSH ont été cultivés avec MMC, l’expression du collagène IV a également augmenté de façon significative. Les métalloproteinases de matrice (MMPs) jouent un rôle important pendant la cicatrisation des plaies et la formation de cicatrices, régulant l’assemblage d’ECM, et transformant18. Les MMP contribuent également à la prolifération cellulaire, à la migration cellulaire, à l’angiogenèse et à l’apoptose19. Notamment, une expression élevée des MMP s’est avérée s’accumuler dans les tissus cicatriciels hypertrophiques comparés aux tissus indigènes20. On a observé que l’expression de MMP-2, -9, et -13 ont été sensiblement augmentées dans les cultures hNSF et hHSF cultivées dans les environnements MMC.
Nous avons également sondé pour la synthèse de l’interleukine-6 (IL-6) et du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF); cependant, ceux-ci étaient indétectables dans une tache occidentale. En revanche, l’analyse RT-PCR(figure 3) a révélé que l’expression de l’IL6 était considérablement régulée, tandis que l’expression du VEGF était régulée dans les FSN et les FSH cultivés dans des conditions de MMC. Une expression accrue de l’IL-6 a été démontrée pour contribuer à la formation hypertrophique de cicatrice21. Paradoxalement, il est également rapporté que la formation de cicatrices hypertrophiques est associée à une expression élevée de VEGF22. L’analyse RT-PCR effectuée ici a indiqué que l’expression du VEGF a été grandement atténuée dans les FSF et les FSH cultivés dans des conditions MMC.
Enfin, les résultats ont démontré à la fois 1) synthèses accrues de collagène, collagène I, collagène IV, MMP-2, MMP-9, et MMP-13 de novo et 2) l’expression accrue de l’ARNM IL6 dans les HHSF et les FNSH. Prises ensemble, ces données indiquent que la culture de hHSF primaires et de FNSH dans les formulations des médias qui incluent des résultats de MMC a comme conséquence la conservation de l’expression génique caractéristique, la biochimie, et les phénotypes observés dans le tissu hypertrophique indigène de tissu crénel, menant à un modèle robuste de « cicatrice dans un pot ».
Figure 1 : MMC augmente la quantité totale de collagène et de collagène I dépôt dans les HHSF. (A) Morphologie cellulaire, (B) collagènes totaux, tachés de Sirius Red, (C) d’expression de collagène I, démontrés par immunofluorescence, (D) analyse quantitative du collagène total, et (E) analyse quantitative du dépôt de collagène I. hHSFs ont été cultivés dans les médias complétés par Ficoll (9% et 18% FVO), PVP40 (18% FVO), ou PVP360 (54% et 72% FVO), pendant 6 jours. Des images représentatives ont été sélectionnées. La quantitation d’image a été effectuée à l’aide d’ImageJ et est exprimée comme le pourcentage moyen du contrôle. Toutes les expériences ont été répétées 3x utilisant des cellules isolées de trois donneurs indépendants. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’ANOVA à sens unique avec le test post-test de Tukey(p 'lt; 0,05 vs groupe témoin, les barres d’erreur indiquent SEM). Barres d’échelle (A) 0,5 mm, (B) 2 mm et (C) 0,5 mm. Ce chiffre a été modifié à partir d’une étude précédente13. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Effets de MMC sur l’expression des protéines cellulaires. hHSFs et hNSFs ont été cultivés sous les conditions MMC pendant 6 jours. Des lysates de cellules entières ont été préparés avec le tampon RIPA contenant le cocktail d’inhibiteur de protéase, le vanadate de sodium, et le fluorure de sodium. La concentration de protéines a été mesurée à l’aide de l’analyse de protéine. Des images représentatives sont présentées. Pour l’analyse quantitative, les intensités des bandes de protéine individuelles ont été mesurées avec la densitométrie, normalisées au GAPDH, et converties en pourcentage du hNSF dans le milieu normal utilisant le logiciel ImageJ. Toutes les expériences ont été réalisées 3x à l’aide de cellules de trois donneurs indépendants. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’ANOVA à sens unique avec le test post-test de Tukey(p 'lt; 0,05, barres d’erreur indiquent SEM). Ce chiffre a été modifié à partir d’une étude précédente13. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Effets de MMC sur l’expression des gènes cellulaires. hHSFs et hNSFs ont été cultivés dans des conditions MMC pendant 6 jours. L’ARN total a été récolté à l’aide d’un kit de test, et le premier brin cDNA a été synthétisé à l’aide du kit de synthèse de l’ADNC. L’expression de gène cible a été normalisée au GAPDH et convertie au pourcentage du hNSF dans le milieu normal. Toutes les expériences ont été répétées 3x utilisant des cellules de trois donneurs indépendants. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’ANOVA à sens unique avec le test post-test de Tukey(p 'lt; 0,05, barres d’erreur indiquent SEM). Ce chiffre a été modifié à partir d’une étude précédente13. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ce protocole vise à optimiser et à authentifier un modèle in vitro amélioré : cicatrice-dans-un-jar " pour le tissu cicatriciel cutané humain. Des études antérieures ont rapporté l’application de la technique MMC aux fibroblastes pulmonaires humains12, les cellules souches mésenchymales de moelle osseuse humaine23, et les fibroblastes cutanées humains23 utilisant dextran12, Ficoll12, et PVP23 en tant que crowders. Dans l’étude rapportée ici, le protocole précédemment édité pour les fibroblastes humains hypertrophiques de peau d’cicatrice-dérivés a été optimisé avec Ficoll ou PVP en tant que crowders.
La sélection et la concentration des crowders macromoléculaires sont des paramètres critiques, car ils ne donnent pas de résultats équivalents. Une étude précédente a rapporté que PVP40 (18% FVO) et PVP360 (54% FVO) améliorent considérablement le dépôt de collagène et la prolifération cellulaire dans les fibroblastes dermiques23 (effets de PVP à FVOs -gt;54% ne sont pas testés). Cependant, ces deux conditions ne fonctionnent pas uniformément pour les HHSF utilisant ce protocole.
Comme le montre la figure 1, Ficoll améliore considérablement le dépôt de collagène I par rapport au contrôle, tandis que PVP n’a pas d’effets significatifs. Ficoll à 9% FVO augmente considérablement la quantité totale de collagène et de collagène de type I par rapport à Ficoll à 18% FVO. En outre, il est essentiel d’utiliser des cellules d’un faible passage, car les fibroblastes dermals primaires ont une durée de vie limitée dans la culture24. Il a été choisi pour utiliser seulement des HHSF fraîchement isolés pour conserver le phénotype in vivo. Après une culture prolongée, les HHSF primaires présentent une morphologie peu commune et des réponses fonctionnelles atypiques. Il est également recommandé que le milieu MMC soit complété par de l’acide ascorbique, un inducteur clé de la synthèse du collagène dans hHSF25. En outre, d’autres chercheurs suggèrent d’utiliser les mêmes anticorps énumérés dans le Tableau des matériaux pour des études liées au FSH; cependant, les anticorps doivent être validés si l’application de ce protocole à d’autres types de cellules.
Comme indiqué dans les résultats représentatifs, l’inclusion de crowders macromoléculaires s’est avérée pour stimuler l’expression du collagène (c.-à-d., collagène I, collagène IV, MMPs, et IL6) dans les hHSF par rapport aux HHSF qui ont été cultivés en utilisant des conditions classiques non-MMC. On soutient que le modèle optimisé MMC conserve des aspects du phénotype in vivo des HHSF, récapitulant leur morphologie caractéristique, leur biochimie, leur physiologie et leur abondante matrice extracellulaire de tissu cicatriciel cutané in vivo (contrairement aux approches de culture 2D existantes). Nous ne sommes pas en mesure d’identifier un modèle in vitro similaire qui est capable de récapituler des propriétés similaires "in vivo-like". Par rapport aux modèles animaux existants, ce protocole MMC est plus rapide ainsi que plus convivial, rentable et plus efficace dans le temps. Cuttle et coll. ont établi un modèle de cicatrice hypertrophique porcine utilisant des dommages thermiques, qui semble avoir des caractéristiques similaires à celles des cicatrices hypertrophiques humaines26. Cependant, en plus des coûts et du temps nécessaires à l’entretien des animaux, l’expérience nécessite plus de 3 mois pour terminer26. Ce modèle MMC optimisé nécessite environ 1 semaine de préparation avant d’être prêt à l’emploi.
Le protocole offre un modèle in vitro avancé pour l’examen de nouvelles thérapies anti-scarring. Le modèle MMC a été utilisé pour évaluer Shikonin, une molécule précédemment signalée pour inhiber la formation de novo de cicatrices, pour l’assainissement des cicatrices hypertrophiques matures27,28. Une évaluation semblable de nouveaux composés et d’interventions utilisant des approches classiques de la découverte de médicaments et une preuve de concept nécessiterait des ressources, des fonds et du temps considérables. Cette étude a nécessité des finances minimales et peut être complétée dans un délai de plusieurs mois. Le protocole est flexible et facilement adaptable pour les applications dans le développement et l’évaluation de nouveaux traitements de cicatrice hypertrophique avant des études animales.
En outre, ce protocole peut être modifié pour développer plus de propriétés « in vivo ». Par exemple, la présence de TGF-1 surabondant est une conclusion constante dans les tissus cicatriciels hypertrophiques, la formation de cicatrices de médiation en stimulant la synthèse de collagène et le dépôt28. Le TGF-1 pourrait être facilement incorporé dans le protocole MMC et améliorer encore la récapitulation de la pathologie in vivo. Nous n’avons pas encore exploré le plein potentiel du modèle, qui peut être utile pour d’autres pathologies liées au collagène et à l’ECM (c.-à-d. sclérodermie, fibrose pulmonaire, fibrose endomyocardiale, etc.). En outre, il serait intéressant d’observer les effets de MMC sur les cellules sur une période de culture plus longue, comme 2 ou 3 semaines. Il est également utile d’évaluer davantage les effets de MMC sur l’architecture et l’alignement hiérarchiques des cellules et de l’ECM, en particulier l’orientation du collagène, car ces caractérisations sont essentielles à la formation in vivo de tissu cicatriciel.
L’une des principales limites de ce protocole est la restriction des types de cellules. La formation de cicatrices hypertrophiques implique la participation de diverses populations cellulaires, et les interactions entre les différents types de cellules jouent un rôle essentiel dans la formation de cicatrices. Par exemple, les kératinocytes jouent également un rôle important dans la cicatrisation des plaies cutanées et la formation des cicatrices29. L’intégration de populations cellulaires supplémentaires dans ce modèle améliorera considérablement son importance dans la recherche future.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par le financement de l’Agence singapourienne pour la science, la technologie et la recherche "SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research" et de l’IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Les auteurs reconnaissent avec gratitude les conseils et l’aide du Dr Paula Benny et du Dr Michael Raghunath.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
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