Summary
Apresentamos um protocolo usando imagens de tomografia microcomputísica de alta resolução para determinar se o voo espacial induziu danos em estruturas oculares. O protocolo mostra a medição micro-CT-derivada de estruturas oculares ex vivo roedores. Demonstramos a capacidade de avaliar alterações morfológicas oculares após o voo espacial usando uma técnica tridimensional não destrutiva para avaliar danos oculares.
Abstract
Relatórios mostram que a exposição prolongada a um ambiente de voo espacial produz alterações oftalmológicas e funcionais nos astronautas durante e após uma missão da Estação Espacial Internacional (ISS). No entanto, os mecanismos subjacentes dessas mudanças induzidas por voos espaciais são atualmente desconhecidos. O objetivo do presente estudo foi determinar o impacto do ambiente de voo espacial nas estruturas oculares, avaliando a espessura da retina do camundongo, o epitélio pigmento da retina (RPE), o coroide e a camada de esclera utilizando imagens microcâmicas. Camundongos machos C57BL/6 de dez semanas foram alojados a bordo da ISS para uma missão de 35 dias e depois retornaram à Terra vivos para análise de tecidos. Para comparação, os camundongos de controle de solo (GC) na Terra foram mantidos em condições ambientais e hardware idênticos. Amostras de tecido ocular foram coletadas para análise microcsicular dentro de 38(±4) horas após o respingo. As imagens da seção transversal da retina, do RPE, do coroide e da camada esclera do olho fixo foram registradas em uma visão axial e sagital utilizando um método de aquisição de imagens microcácticas. A análise do microcânico mostrou que as áreas transversais da retina, RPE e espessura da camada coroóide foram alteradas em amostras de voo espacial em comparação com GC, com amostras de voo espacial mostrando seções e camadas transversais significativamente mais finas em comparação com os controles. Os achados deste estudo indicam que a avaliação da microCcidade é um método sensível e confiável para caracterizar alterações na estrutura ocular. Espera-se que esses resultados melhorem a compreensão do impacto do estresse ambiental nas estruturas oculares globais.
Introduction
No ambiente de microgravidade do voo espacial, o aumento da pressão intracraniana (ICP) causada pela mudança de fluido pode ter contribuído para a síndrome neuro-ocular associada ao voo espacial (SANS)1,,2,,3,,4,5. De fato, mais de 40% dos astronautas experimentaram a SANS durante e após uma missão6da Estação Espacial Internacional (ISS), incluindo o tema do voo espacial do Nasa Twins Study7. A fisiopatologia atual da SANS inclui alterações fisiológicas como edema de disco óptico, achatamento do globo, dobras choroidais e retina, mudanças de erro refrativo hiperópicas e infartos da camada de fibra nervosa (ou seja, manchas de lã de algodão) e são bem documentados5,,8. No entanto, os mecanismos subjacentes das mudanças e fatores que contribuem para o desenvolvimento dos danos não são claros. Para ter uma melhor compreensão da SANS, modelos animais estão disponíveis para caracterizar as alterações associadas ao voo espacial na estrutura e função da retina.
Em uma investigação anterior sobre os mesmos animais, relatamos o impacto de 35 dias de voo espacial na retina do rato. Os resultados elucidam que o voo espacial induz danos significativos na retina e vasculatura da retina, e algumas proteínas/vias associadas à morte celular, inflamação e estresse metabólico foram significativamente alteradas após o voo espacial9.
Atualmente, existem uma variedade de técnicas de imagem não invasivas estabelecidas para monitorar o desenvolvimento e a progressão da doença, bem como respostas fisiológicas a vários estressores ambientais, que também são amplamente utilizados em pequenos modelos de roedores. Uma dessas técnicas é a microC, que avalia estruturas anatômicas e processos patológicos, e tem sido utilizada com sucesso em organismos tão pequenos quanto camundongos10.
A microcsctura pode alcançar uma resolução microdimensionada, podendo fornecer alto contraste para análise volumosa de tecidos moles com a adição do agente de contraste adequado10,,11,,12,,13,,14. A tecnologia microcânica é vantajosa em comparação com métodos tradicionais como anatomia bruta, microscopia leve e exame de histologia, pois minimiza danos físicos ao perfil geométrico dos espécimes e não altera a relação espacial entre as estruturas. Além disso, modelos tridimensionais (3D) de estruturas podem ser reconstruídos a partir de imagens microcC12,14. Até o momento, apesar das evidências mostrarem comprometimento visual após a exposição ao ambiente espacial, poucos dados em modelos animais estão disponíveis para uma melhor compreensão das mudanças associadas ao voo espacial na estrutura e função da retina. No presente estudo, os camundongos foram voados em uma missão de 35 dias a bordo da ISS para determinar o impacto do ambiente de voo espacial nas estruturas de tecidos oculares, quantificando a microestrutura da retina, do RPE e das camadas coroides usando micro-TC.
Protocol
O estudo seguiu as recomendações descritas no Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e foi aprovado tanto pelo Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Loma Linda (LLU) quanto pela Administração Nacional de Aeronáutica e Espaço (NASA). Informações mais detalhadas sobre este experimento de voo podem ser encontradas em outros lugares9,15.
1. Condições de voo e controle
NOTA: Uma 12ª carga de reabastecimento comercial (CRS-12) foi lançada pela SpaceX no Kennedy Space Center (KSC) em uma missão de 35 dias em agosto de 2017 que incluiu a bordo de 10 semanas de ratos C57BL/6 masculinos (n = 20) para o nono experimento de pesquisa de roedores da NASA (RR-9).
- Antes de retornar à Terra através da cápsula Dragon da SpaceX, os ratos vivem nos Habitats roedores (RH) da NASA a bordo da ISS por 35 dias a uma temperatura ambiente de 26-28 °C com um ciclo claro/escuro de 12 horas durante todo o voo.
- Coloque os ratos do Controle de Solo (GC) no mesmo hardware de habitação usado no voo e corresponda aos parâmetros ambientais, como níveis de temperatura e dióxido de carbono (CO2) o mais próximo possível com base em dados de telemetria.
- Alimentar camundongos GC a mesma dieta de barras de alimentos da NASA como seus homólogos espaciais. Forneça aos ratos de voo espacial e gc o mesmo acesso ad libitum à água e à comida.
2. Avaliação pós-vôo dos ratos
- Dentro de 28 horas após o respingo na Terra, transporte os ratos para a Universidade de Loma Linda (LLU). Uma vez lá, remova os ratos das ferragens do recinto animal e avalie a sobrevivência e a saúde.
NOTA: Após observação, o pessoal de inspeção informou que todos os camundongos sobreviveram à missão espacial de 35 dias e estavam em boas condições, ou seja, sem deficiências/anormalidades perceptíveis.
3. Dissecação e preservação dos olhos do rato após o voo espacial
- Dentro de 38 (±4) horas de splashdown (n=20/grupo), eutanize os ratos em 100% DE CO2 e colete seus olhos.
- Disseque as retinas do olho direito e coloque individualmente em criovias estéreis, congele em nitrogênio líquido e mantenha-se a −80 °C antes de usar.
- Fixar os olhos esquerdos inteiros em 4% de paraformaldeído em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) por 24 h e depois enxágue com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) para ensaios microcáceis.
4. Preparação da amostra para digitalização de microcsagem
- Após a fixação, desidrata os olhos dos ratos no etanol. Para evitar qualquer redução adicional ou abrupta da amostra fixa, utilize uma série de soluções de etanol classificadas: começando com 50% de etanol por 1 hora e depois aumentando as concentrações das soluções de etanol da seguinte forma por 1 hora cada: 70, 80, 90, 96 e 100%.
NOTA: Os olhos dos ratos devem ser manuseados em uma câmara de capô. - Coloração do ácido fosfomlídico (PMA)
ATENÇÃO: Por se ter um pma corrosivo, cancerígeno e tóxico para órgãos, é necessário equipamento pessoal de proteção adequado, incluindo o uso de um capuz de fumaça.- Prepare a solução de coloração: 10 mg de PMA em 100 mL de etanol absoluto.
- Colora os olhos dos camundongos (10 wt. % ácido fosfomólico - PMA dissolvido em etanol absoluto) por 6 dias.
- Antes da digitalização, primeiro lave as amostras oculares em etanol absoluto e, em seguida, coloque cada olho em recipientes de plástico individuais de 2 mL que são preenchidos com etanol 100% absoluto. Adicione uma almofada de algodão a amostras estabilizadas durante a varredura.
5. Micro-CT de digitalização e análise
NOTA: O scanner SkyScan 1272, um sistema de micro-CT de raios-X de desktop, foi usado para avaliação de danos na retina nos olhos dos camundongos
- Monte a amostra de tecido mole em um suporte de amostra apropriado. Para evitar qualquer movimento durante as medições da tomografia de raios-X, certifique-se de um ajuste apertado da amostra em seu suporte (Figura 1).
- Após um alinhamento meticuloso de cada amostra, escaneie individualmente a amostra através de raios-X.
- Depois de abrir o software, centralize a amostra no quadro. No protocolo, não use filtro e defina a matriz para aumentar o pixel em 4 μm. Use micro-posicionamento para manter a amostra central no quadro.
- Depois disso, verifique o parâmetro para maximizar o agente de contraste. Para realizar a calibração, remova a amostra e verifique se a correção do campo plano é superior a 80%.
- Após a calibração, reinsira a amostra na câmara de varredura. Para a varredura, use uma etapa de rotação de 0,400, uma média de quadro de 4, um movimento aleatório de 30 e gire as amostras 180°.
- Use um gabarito de posicionamento para medições repetidas. Devido ao aprimoramento de contraste de fase realizado como descrito, detalhes do objeto tão pequenos quanto 4 μm podem ser detectados a partir de raios-x gerados por um tubo de raio-X microfoto selado (ânodo de tungstênio) a 50 keV e 80 mA com um tempo de integração de 90 minutos.
NOTA: Os parâmetros de aquisição estabelecidos nesta seção para seleção para produzir tomografias com visão geral com a mais alta qualidade de imagem. - Após a varredura, use software (por exemplo, NRecon) para reconstruir os dados.
- Ajuste o histograma e utilize a mesma faixa (0 – 0,24) para todas as amostras. Reconstruir a região de interesse era um círculo, e não foram utilizadas escalas ou rótulos.
- Para reduzir os artefatos durante a varredura, use uma correção de endurecimento do feixe de 20, uma correção de suavização de 1, uma redução de artefato de anel de 6, e não realize nenhuma alteração na compensação de desalinhamento. Após a reconstrução, foi confirmado que a amostra estava dentro da região de interesse.
- Reposicione imagens usando um plano paralelo ao nervo óptico e lente dos olhos.
- Após a digitalização, use software (por exemplo, DataViewer) para visualizar as imagens reconstruídas nas três visualizações.
NOTA: Se necessário, com este software, as imagens podem ser re posicionadas usando um plano paralelo ao nervo óptico e à lente dos olhos para realizar uma análise padronizada. - Análise descritiva
- Meça as estruturas utilizando uma ferramenta de medição no software (por exemplo, CTAn). Use o nervo óptico para delimitar a região de interesse para análise. Pelo cálculo, o protocolo usou a fatia do meio para realizar as medições. Essa avaliação foi realizada por análise descritiva (Figura 2 e Figura 3).
- Realizar medições da retina, pigmento de retina epitélio (RPE), coroide e camada esclera na sagidura(Figura 2) e visão axial(Figura 3). Faça três medições de cada estrutura para calcular uma média.
Representative Results
A espessura média da camada de retina, RPE, coroide e esclera foi registrada utilizando-se as microc tomografias após seguir o protocolo acima(Figura 1). A técnica mostrou uma reconstrução multiplanar dos olhos em três pontos de vista diferentes. Durante a análise, o observador foi capaz de percorrer toda a amostra para padronizar a análise bem no meio da amostra.
A análise microcsiciclista mostrou as áreas transversais dos olhos na visão sagital e axial(Figura 2 e Figura 3) nas quais foram realizadas as medidas lineares. RPE e camada coroide foram significativamente ou tendência menor no grupo de voo espacial quando comparado com o grupo GC (Figura 3).
Figura 1: Procedimento microcálático de tecido mole. (A) Amostra de tecido mole (olho de rato). (B) As amostras foram fixadas em 4% de formaldeído na solução tampão fosfato (PBS). Após a fixação, os olhos dos camundongos estavam desidratados no etanol. Para evitar um encolhimento ainda maior e abrupto da amostra fixa, foram utilizadas uma série de soluções etanolicas classificadas, começando com 50% de etanol para 1h e as seguintes soluções de etanol nas concentrações listadas, por 1 hora cada: 70, 80, 90, 96 e 100%. (C) Os olhos dos camundongos ficaram manchados em ácido fosfomólico (PMA) por 6 dias, lavados em etanol absoluto e, em seguida, colocados em recipientes plásticos individuais de 2 mL cheios de etanol absoluto. (D) Um scanner de sistema micro-CT de raios-X de desktop foi usado para avaliar a lesão da retina nos olhos dos camundongos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão sagital de um rato de controle de solo. As camadas do olho no lado direito da imagem são anotadas, de cima para baixo, retina (0,077 mm), camada de pigmento de retina (RPE, 0,038 mm), coroide (0,041 mm), esclera (0,059 mm). Este número foi retirado de Overbey et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Visão axial de um rato de controle de solo. As camadas do olho no lado direito da imagem são anotadas, de cima para baixo, retina (0,144 mm), camada de pigmento de retina (RPE, 0,051 mm), coroide (0,041 mm), esclera (0,073 mm). Este número foi retirado de Overbey et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Espessura média da camada de retina, camada RPE e a camada coroide medida por microCC nos grupos de voo espacial e controle. As contagens foram médias em cinco retinas por grupo. Os valores foram representados como espessura média ± erro padrão (SEM). A média é marcada com barras de erro. Significativamente menor em espessura de seção transversal no grupo de voo espacial (FLT) em comparação com o grupo de controle de solo (GC) é denotado '*' (p < 0,05). Este número foi retirado de Overbey et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Os resultados deste estudo mostraram que houve alterações estruturais no olho do rato de voo espacial utilizando a técnica de micro-TC quando comparada aos grupos de GC, particularmente da retina, do RPE e das camadas coroides do olho, como evidenciado pela sua espessura reduzida. A microcsição fornece uma técnica eficiente e não destrutiva para caracterizar as mudanças sem necessidade de manipulação. O uso da coloração pma aumentou a qualidade das imagens microcturas para obter com sucesso imagens tomográficas 3D claras após a reconstrução, esquecendo qualquer necessidade de alterar fisicamente a estrutura do espécime. Um benefício adicional dessas imagens é que elas exibem toda a região de interesse digitalmente, aumentando assim a acessibilidade, bem como a reprodutibilidade dos achados. Através das imagens microcibidas produzidas durante este estudo, o espécime-alvo mostrou diferenciação das múltiplas estruturas como a retina, RPE, coroide e camada esclera para determinação da espessura de cada camada.
Um passo crítico dentro do protocolo é a manipulação das amostras devido ao seu tamanho e textura. O manuseio da amostra deve ser cuidadosamente feito sem pressionar o espécime durante a preparação. O microcsindo tem algumas limitações: resolução e falta de valores padronizados para os parâmetros. Durante a varredura, os diferentes scanners microcácdis podem ter algoritmos de processamento de imagem diversos; ainda calibração para uma escala de cinza pode ser perseguido para superar qualquer problema. Após a varredura, a reconstrução das imagens deve ser baseada no tecido e na análise que será realizada. Pode ser crítico, pois a qualidade da imagem depende do sistema tomográfico, das configurações, do tamanho da amostra, bem como dos métodos de preparação16,17.
Devido à sua aplicação bem sucedida no estudo de vários tipos de tecidos normais e patológicos, as capacidades de imagem micro-CT devem ser usadas em pesquisas futuras para compilar dados volumosos para outras análises. Assim, com base na finalidade do presente estudo, foi aceitável o uso de medições bidimensionais, mas a segmentação da estrutura bruta 3D também pode ser benéfica para fornecer um contorno preciso de toda a amostra. Mesmo com todas as vantagens de uma técnica não destrutiva, a microC não substituirá outros métodos, como a imunohistoquímica, mas complementará e permitirá análises de histologia subsequentes, se desejar.
Uma condição prolongada de voo espacial produz uma série de mudanças oculares estruturais e funcionais nos astronautas durante e após a missão espacial definida como SANS. Os achados incluem mudanças hiperópicas, achatamento do globo, dobras choroidais/retinas e pontos de lã de algodão19. Em contraste com a tomografia de coerência óptica (OCT) dos astronautas, o achado da camada de fibra nervosa da retina, o afinamento da retina e da camada coroidal foi documentado neste estudo de micro-TC animal. Esses resultados foram inesperados. Essa discrepância pode ser devido a fatores de confusão. Camundongos têm mudança limitada de fluido cefálico em comparação com humanos. Essa falta de mudança de fluido pode ter evocado diferentes respostas às mudanças gravitacionais. Em segundo lugar, os camundongos foram dissecados dentro de 38 horas após o respingo, e uma resposta aguda para a readaptação também pode contribuir para alterações morfológicas na retina e coroide. A confirmação dessa possibilidade requer novas medições durante o voo espacial e a longo prazo após a missão.
Os resultados deste estudo indicam que as condições de voo espacial, especialmente as mudanças gravitacionais, podem induzir uma resposta aguda e de curto prazo no olho. Uma investigação mais aprofundada é necessária para determinar as consequências das mudanças agudas no ocular na função da retina e no mecanismo de mudanças na estrutura induzidas pelo voo espacial.
Disclosures
Todos os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela bolsa de Biologia Espacial da NASA # NNX15AB41G e llu Departamento de Ciências Básicas. Sungshin Choi, Dennis Leveson e Rebecca Klotz contribuíram significativamente para o sucesso do nosso estudo de voo espacial e agradecemos muito o apoio deles. Os autores também gostariam de agradecer a todo o grupo do Programa de Compartilhamento de Bioespecimen da NASA por sua grande ajuda.
Os autores também gostariam de agradecer ao Centro de Pesquisa Odontológica para o Serviço de Microch.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 wt. % phosphomolybdic | Sigma | 12026-57-2 | |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | |
| X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner | Bruker |
References
- Dawson, L. The New Space Race. The Politics and Perils of Space Exploration. , Springer Praxis Books. 1-24 (2017).
- Mao, X. W., et al. Spaceflight environment induces mitochondrial oxidative damage in ocular tissue. Radiation Research. 180, 340-350 (2013).
- Overbey, E. G., et al. Mice Exposed to Combined Chronic Low-Dose Irradiation and Modeled Microgravity Develop Long-Term Neurological Sequelae. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4094 (2019).
- Nelson, E. S., Mulugeta, L., Myers, J. G. Microgravity-induced fluid shift and ophthalmic changes. Life. 4, 621-665 (2014).
- Lee, A. G., Mader, T. H., Robert Gibson, C., Brunstetter, T. J., Tarver, W. J. Space flight-associated neuro-ocular syndrome (SANS). Eye. 32, 1164-1167 (2018).
- Stenger, M. B., et al. Evidence Report: Risk of Spaceflight Associated Neuro-ocular Syndrome (SANS). , (2017).
- Garrett-Bakelman, F. E., et al. The NASA Twins Study: A multidimensional analysis of a year-long human spaceflight. Science. 364, (2019).
- Mader, T. H., et al. Optic disc edema, globe flattening, choroidal folds, and hyperopic shifts observed in astronauts after long duration space flight. Ophthalmology. 118, 2058-2069 (2011).
- Mao, X. W., et al. Characterization of mouse ocular response to a 35-day spaceflight mission: Evidence of blood-retinal barrier disruption and ocular adaptations. Science Reports. 9 (1), 8215 (2019).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. , 632-640 (2009).
- Silva, J. M. S., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Science Reports. 5, 14088 (2015).
- Descamps, E., et al. Soft tissue discrimination with contrast agents using micro-CT scanning. Belgian Journal of Zoology. , 20-40 (2014).
- Wu, J., Yin, N. Anatomy research of nasolabial muscle structure in fetus with cleft lip: an iodine staining technique based on microcomputed tomography. Journal of Craniofacial Surgery. 25 (3), 1056-1061 (2014).
- Roque-Torres, G. D. Application of Micro-CT in Soft Tissue Specimen Imaging. In: Orhan K. (eds) Micro-computed Tomography (micro-CT) in Medicine and Engineering. , Springer. 139-170 (2020).
- Overbey, E. G., et al. Spaceflight influences gene expression, photoreceptor integrity, and oxidative stress-related damage in the murine retina. Science Reports. 9 (1), 13304 (2019).
- Elkhoury, J. E., Shankar, R., Ramakrishnan, T. S. Resolution and Limitations of X-Ray Micro-CT with Applications to Sandstones and Limestones. Transport in Porous Media. 129, 413-425 (2019).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: A methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
- Huang, A. S., Stenger, M. B., Macias, B. R. Gravitational Influence on Intraocular Pressure: Implications for Spaceflight and Disease. Journal of Glaucoma. 28 (8), 756-764 (2019).
- Lee, A. G., et al. Spaceflight associated neuro-ocular syndrome (SANS) and the neuro-ophthalmologic effects of microgravity: a review and an update. NPJ Microgravity. 6, 7 (2020).
