Summary
Мы представляем протокол с использованием микро-компьютерной томографии высокого разрешения, чтобы определить, является ли космический полет индуцированных повреждений глазных структур. Протокол показывает микро-CT-производные измерения ex vivo грызунов глазных структур. Мы демонстрируем способность оценивать глазные морфологические изменения после космических полетов с помощью неразрушающей трехмерной техники для оценки глазного повреждения.
Abstract
Отчеты показывают, что длительное воздействие космической среды приводит к морфологическим и функциональным офтальмологическим изменениям у астронавтов во время и после миссии Международной космической станции (МКС). Однако основные механизмы этих космических полетов, вызванных изменениями, в настоящее время неизвестны. Целью настоящего исследования было определение влияния космической среды на глазные структуры путем оценки толщины сетчатки мыши, эпителия пигмента сетчатки (RPE), хороидного и склерового слоя с использованием микро-КТ-изображения. Десятинедельные мыши C57BL/6 были размещены на борту ISS для 35-дневной миссии, а затем вернулись на Землю живыми для анализа тканей. Для сравнения, наземные мыши контроля (ГК) на Земле поддерживались в одинаковых условиях окружающей среды и оборудования. Образцы глазной ткани были собраны для анализа микро-КТ в течение 38 (±4) часов после брызг. Изображения поперечного сечения сетчатки, RPE, хороида и слоя склеры фиксированного глаза были записаны в осяном и сагиттном виде с помощью метода микро-КТ изображения. Анализ микро-КТ показал, что поперечные области толщины слоя сетчатки, RPE и хороидного слоя были изменены в образцах космических полетов по сравнению с GC, при этом образцы космических полетов показали значительно более тонкие поперечные сечения и слои по сравнению с управлением. Результаты этого исследования показывают, что микро-КТ оценка является чувствительным и надежным методом для характеристики глазных изменений структуры. Ожидается, что эти результаты улучшат понимание воздействия экологической нагрузки на глобальные глазные структуры.
Introduction
В условиях микрогравитации космических полетов повышенное внутричерепное давление (МСП), вызванное смещением жидкости, возможно, способствовало возникновению связанного с космическим полетом нервно-глазного синдрома (SANS)1,,2,,3,,4,,5. Действительно, более 40% астронавтов испытали SANS во время и после Миссии Международной космическойстанции (МКС) 6, в том числе космического полета предмет НАСА БлизнецыИсследование 7. Текущая патофизиология SANS включает в себя физиологические изменения, такие как отек зрительного диска, уплощение земного шара, хороидные и сетчатки складки, гиперопические рефракционные сдвиги ошибок, и нервные волокна слоя инфарктов (т.е. пятна ваты)и хорошо документированы 5,8. Однако основные механизмы изменений и факторов, способствующих развитию ущерба, неясны. Для того, чтобы лучше понять SANS, животные модели доступны для характеристики космических полетов связанных изменений в структуре и функции сетчатки.
В предыдущем исследовании на тех же животных, мы сообщили о влиянии 35 дней космических полетов на сетчатке мыши. Результаты показывают, что космические полеты вызывает значительные повреждения в сетчатке и сетчатке сосудов, и некоторые белки / пути, связанные со смертью клеток, воспаление и метаболический стресс были значительно изменены после космического полета9.
В настоящее время существует целый ряд неинвазивных методов визуализации, созданных для мониторинга развития и прогрессирования заболеваний, а также физиологических реакций на различные экологические стрессоры, которые также широко используются в моделях мелких грызунов. Одним из таких методов является микро-КТ, который оценивает анатомические структуры и патологические процессы, и успешно используется на организмы, как малые, какмыши 10.
Микро-КТ может достичь микросхемного разрешения, и это может обеспечить высокий контраст для объемного анализа мягких тканей сдобавлением соответствующего контрастного агента 10,,11,,12,,13,,14. Технология micro-CT выгодна по сравнению с традиционными методами, такими как валовая анатомия, световая микроскопия и гистологическое исследование, так как она сводит к минимуму физический ущерб геометрическому профилю образцов и не изменяет пространственные отношения между структурами. Кроме того, трехмерные (3D) модели структур могут быть реконструированы на основе микроКТ-изображений12,,14. На сегодняшний день, несмотря на данные, показывающие ухудшение зрения после воздействия космической среды, имеется мало данных в моделях животных для лучшего понимания связанных с космическими полетами изменений в структуре и функции сетчатки. В текущем исследовании мышей летели на 35-дневной миссии на борту ISS, чтобы определить влияние космической среды полета на структуры глазных тканей путем количественной микроструктуры сетчатки, RPE, и хороидных слоев с помощью микро-КТ.
Protocol
Исследование проводилось в соответствии с рекомендациями, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения (НИЗ), и было одобрено Как Институциональным комитетом по уходу за животными, так и Комитетом по уходу за животными (IACUC) Университета Лома-Линды (LLU) и Национальным управлением по аэронавтике и исследованию космического пространства (НАСА). Более подробную информацию об этом лете эксперимента можно найти вдругом месте 9,15.
1. Условия полета и управления
ПРИМЕЧАНИЕ: 12-я коммерческая служба снабжения (CRS-12) полезная нагрузка была запущена SpaceX в Космическом центре Кеннеди (KSC) на 35-дневной миссии в августе 2017 года, которая включала на борту 10-недельного самца C57BL/6 мышей (n No 20) для девятого эксперимента НАСА по исследованию грызунов (RR-9).
- Перед возвращением на Землю через капсулу Dragon компании SpaceX, мышей живут в НАСА грызунов Хабитат (RH) на борту ISS в течение 35 дней при температуре окружающей среды 26-28 градусов по Цельсию с 12-часовой свет / темный цикл на протяжении всего полета.
- Поместите мышей наземного контроля (GC) в одно и то же оборудование, используемое в полете, и сопривести экологические параметры, такие как температураи уровень двуокиси углерода(CO 2) как можно ближе на основе данных телеметрии.
- Кормите мышей GC же НАСА питание бар диеты, как их космические аналоги. Обеспечить как космические полеты и GC мышей с той же ad libitum доступ к воде и пище.
2. После полетной оценки мышей
- В течение 28 часов после всплеска на Земле, транспортировать мышей в Университет Лома Линда (LLU). Оказавшись там, удалить мышей из животного корпуса оборудования и оценить для выживания и здоровья.
ПРИМЕЧАНИЕ: При наблюдении инспекционый персонал сообщил, что все мыши пережили 35-дневную космическую миссию и находились в хорошем состоянии, т.е. никаких заметных недостатков/аномалий.
3. Рассечение и сохранение глаз мыши после космических полетов
- В течение 38 (±4) часов после брызг (n'20/group), усыпляйте мышей в 100% CO2 и собирайте их глаза.
- Рассекаете сетчатку правого глаза и поместите индивидуально в стерильные криовиалы, оснастки замораживания в жидком азоте, и держать на 80 градусов по Цельсию до использования.
- Исправить все левые глаза в 4% параформальдегида в фосфат-буферный солевой раствор (PBS) в течение 24 ч, а затем промыть фосфат-буферный солевой раствор (PBS) для микро-CT анализы.
4. Пример подготовки к микро-КТ сканирования
- После фиксации обезвоживать глаза мышей в этаноле. Чтобы предотвратить дальнейшее или резкое сокращение фиксированной выборки, используйте градуированную серию растворов этанола: начиная с 50% этанола в течение 1 часа, а затем увеличивая концентрацию растворов этанола следующим образом в течение 1 часа каждый: 70, 80, 90, 96 и 100%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Глаза мышей должны быть обработаны в камере капота. - Окрашивание фосфомолибной кислоты (ПМА)
ВНИМАНИЕ: Из-за того, что PMA является коррозионным, канцерогенным и токсичным для органов, необходимо соответствующее защитное личное оборудование, включая использование дымового капота.- Приготовьте окрашивающий раствор: 10 мг ПМА в 100 мл абсолютного этанола.
- Пятно глаз мышей (10 вт. % фосфомолибной кислоты - PMA растворяется в абсолютном этаноле) в течение 6 дней.
- Перед сканированием, сначала мыть образцы глаз в абсолютном этанола, а затем поместить каждый глаз в отдельных 2 мл пластиковых контейнеров, которые заполнены 100% абсолютного этанола. Добавьте ватную палочку для стабилизации образцов во время сканирования.
5. Микро-КТ сканирование и анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Сканер SkyScan 1272, настольная рентгеновская система Micro-CT, был использован для оценки повреждений сетчатки глаза мышей
- Примонтировать образец мягких тканей к соответствующему держателю образца. Чтобы предотвратить любое движение во время рентгеновских измерений КТ, обеспечить плотную подгонку образца на его держателе(рисунок 1).
- После тщательного выравнивания каждого образца, индивидуально сканировать образец с помощью рентгеновских лучей.
- После открытия программного обеспечения центр образца в кадре. В протоколе не используйте фильтр и установите матрицу для увеличения пикселя на 4 мкм. Используйте микро-позиционирование, чтобы сохранить центр выборки на раме.
- После этого проверьте параметр, чтобы максимизировать контрастный агент. Для выполнения калибровки удалите образец и убедитесь, что коррекция плоского поля превышает 80%.
- После калибровки можно восстановить образец в сканирующей камере. Для сканирования используйте шаг вращения 0,400, рамку в среднем 4, случайное движение 30, и поверните образцы на 180 градусов.
- Используйте позиционирование джиг для повторных измерений. Из-за повышения фазового контраста, выполненного, детали объекта в размере до 4 мкм могут быть обнаружены с помощью рентгеновских лучей, генерируемых герметичной микрофокусной рентгеновской трубкой (вольфрамовый анод) на уровне 50 кВ и 80 мА со временем интеграции 90 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры приобретения, изложенные в этом разделе для выбора для получения обзора КТ с высоким качеством изображения. - После сканирования используйте программное обеспечение (например, NRecon) для восстановления данных.
- Отрегулируйте гистограмму и используйте один и тот же диапазон (0 - 0,24) для всех образцов. Область, представляющий интерес для реконструкции, была кругом, и никакие весы или этикетки не использовались.
- Чтобы уменьшить артефакты во время сканирования, используйте коррекцию затвердевания луча 20, сглаживание коррекции 1, уменьшение артефакта кольца на 6, и не выполняй никаких изменений в компенсации неупокоения. После реконструкции было подтверждено, что образец находится в районе, который представляет интерес.
- Перепозиционирование изображений с помощью плоскости параллельно зрительного нерва и хрусталика глаз.
- После сканирования используйте программное обеспечение (например, DataViewer) для визуализации реконструированных изображений во всех трех видах.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости, с помощью этого программного обеспечения, изображения могут быть повторно расположены с помощью плоскости параллельно зрительного нерва и хрусталика глаз для выполнения стандартизированного анализа. - Описательный анализ
- Измерьте структуры с помощью измерительного инструмента в программном обеспечении (например, CTAn). Используйте оптический нерв, чтобы разграничить область интереса для анализа. При расчете протокол использовал средний срез для выполнения измерений. Эта оценка была выполнена с помощью описательного анализа(рисунок 2 и рисунок 3).
- Выполните измерения сетчатки, эпителия пигмента сетчатки (RPE), хороидного и склерового слоя в сагиттале(рисунок 2)и аксиальноговида (рисунок 3). Для расчета среднего показателя сделайм три измерения каждой структуры.
Representative Results
Средняя толщина слоя сетчатки, RPE, хороида и склеры была зарегистрирована с помощью микро-КТ после следовать протоколу выше(рисунок 1). Техника показала многопланарную реконструкцию глаз в трех разных видах. В ходе анализа наблюдатель смог прокрутить весь образец, чтобы стандартизировать анализ прямо в середине выборки.
Анализ микро-КТ показал поперечные области глаз в сагиттальной и осью(рисунок 2 и рисунок 3),в которых проводились линейные измерения. RPE и хороидный слой были значительно или тенденция ниже в группе космических полетов по сравнению с группой GC(рисунок 3).
Рисунок 1: Микро-КТ процедура мягких тканей. (A)Образец мягких тканей (мышь глаза). (B)Образцы были зафиксированы в 4% формальдегиде в фосфатной буферной растворе (PBS). После фиксации глаза мышей были обезвожены этанолом. Для предотвращения дальнейшего и резкого сокращения фиксированной выборки, градуированные серии этанолических растворов были использованы, начиная с 50% этанола в течение 1 ч и следующие решения этанола в перечисленных концентрациях, в течение 1 часа каждый: 70, 80, 90, 96 и 100%. (C)Глаза мышей были окрашены в фосфомолибдиновой кислоты (PMA) в течение 6 дней, промывают в абсолютном этанола, а затем помещены в отдельные 2 мл пластиковых контейнеров заполнены абсолютным этанолом. (D)для оценки повреждения сетчатки глаза мышей был использован настольный рентгеновский микро-КТ системный сканер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Sagittal вид мыши наземного управления. Слои глаза на правой стороне изображения аннотированы, сверху вниз, сетчатка (0,077 мм), пигментный слой сетчатки (RPE, 0,038 мм), хороид (0,041 мм), склера (0,059 мм). Эта цифра была взята из Overbey и др.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Axial вид мыши управления землей. Слои глаза на правой стороне изображения аннотированы, сверху вниз, сетчатка (0,144 мм), пигментный слой сетчатки (RPE, 0,051 мм), хороид (0,041 мм), склера (0,073 мм). Эта цифра была взята из Overbey и др.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Средняя толщина слоя сетчатки, слоя RPE и слоя хороида, измеряемого микро-КТ в космических полетах и контрольных группах. Количество в среднем по пяти сетчаткам на группу. Значения были представлены как средняя толщина ± стандартной ошибки (SEM). SEM среднего отмечен барами ошибок. Значительно ниже толщина поперечного сечения в группе космических полетов (FLT) по сравнению с группой управления землей (GC) обозначается 'q' (p lt; 0.05). Эта цифра была взята из Overbey и др.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Результаты этого исследования показали, что были структурные изменения в космическом полете мыши глаза с использованием микро-КТ техники по сравнению с группами GC, особенно сетчатки, RPE, и хороидных слоев глаза, о чем свидетельствует их снижение толщины. Micro-CT обеспечивает эффективный и неразрушаемый метод для характеристики изменений без необходимости манипуляций. Использование Окрашивания PMA повысило качество микро-КТ изображений для успешного получения четких 3D томографических изображений после реконструкции, что не говорит о необходимости физически изменять структуру образца. Дополнительным преимуществом этих изображений является то, что они отображают весь регион, представляющий интерес в цифровом виде, тем самым повышая доступность, а также воспроизводимость полученных результатов. С помощью микро-КТ изображений, сделанных в ходе этого исследования, целевой образец показал дифференциацию нескольких структур, таких как сетчатка, RPE, хороид и склера слой для определения толщины каждого слоя.
Важным шагом в протоколе является манипуляция образцами из-за их размера и текстуры. Обработка образца должна быть тщательно сделана без давления на образец во время подготовки. Микро-КТ имеет некоторые ограничения: разрешение и отсутствие стандартизированных значений для параметров. Во время сканирования различные микро-КТ сканеры могут иметь различные алгоритмы обработки изображений; однако калибровка серых масштабов может быть продолжена для преодоления любой проблемы. После сканирования, реконструкция изображений должна быть основана на ткани и анализ, который будет выполнен. Это может иметь решающее значение, так как качество изображения зависит от томографической системы, настроек, размера образца, а такжеметодов подготовки 16,,17.
Благодаря успешному применению в изучении нескольких типов нормальных и патологических тканей, возможности микро-КТ визуализации должны быть использованы в будущих исследованиях для компиляции объемных данных для других анализов. Таким образом, исходя из цели настоящего исследования, было приемлемо использовать двухмерные измерения, но сегментация валовой 3D-структуры также может быть полезной для обеспечения точного контура всего образца. Даже при всех преимуществах неразрушаемой техники, микро-КТ не заменит другие методы, такие как иммуногистохимия, но при желании дополнит и позволит продать последующий гистологический анализ.
Длительное состояние космических полетов производит ряд структурных и функциональных глазных изменений в астронавтов во время и после космической миссии определяется как SANS. Выводы включают гиперопические сдвиги, уплощение глобуса, хороидные/ сетчатки складки, и вата пятна19. В отличие от оптической слаженности астронавтов томографии (OCT) обнаружение утолщения слоя нервно-паралитического волокна сетчатки, истончение сетчатки и хороидного слоя было задокументировано в этом исследовании микро-КТ животных. Эти результаты были неожиданными. Это несоответствие может быть связано со смешанными факторами. Мыши имеют ограниченный сдвиг головоногих жидкости по сравнению с человеком. Это отсутствие изменения жидкости, возможно, вызвало различные реакции на гравитационные изменения. Во-вторых, мышей вскрыли в течение 38 часов после брызг, и острая реакция на реадаптаку может также способствовать морфологическим изменениям в сетчатке и хороиде. Подтверждение такой возможности требует дальнейших измерений во время космических полетов и долгосрочной перспективе после миссии.
Результаты этого исследования показывают, что условия космических полетов, особенно гравитационные изменения, могут вызвать острую и краткосрочную реакцию в глазу. Необходимы дальнейшие исследования для определения последствий острых изменений глаз на функции сетчатки и механизма космических полетов, вызванных изменениями структуры.
Disclosures
Всем авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом НАСА по космической биологии No NNX15AB41G и кафедрой фундаментальных наук LLU. Суншин Чой, Деннис Левесон и Ребекка Клотц внесли значительный вклад в успех нашего исследования космических полетов, и мы высоко ценим их поддержку. Авторы также хотели бы поблагодарить всю группу НАСА Biospecimen Обмена программы за их большую помощь.
Авторы также хотели бы поблагодарить Центр стоматологических исследований за micro-CT службы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 wt. % phosphomolybdic | Sigma | 12026-57-2 | |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | |
| X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner | Bruker |
References
- Dawson, L. The New Space Race. The Politics and Perils of Space Exploration. , Springer Praxis Books. 1-24 (2017).
- Mao, X. W., et al. Spaceflight environment induces mitochondrial oxidative damage in ocular tissue. Radiation Research. 180, 340-350 (2013).
- Overbey, E. G., et al. Mice Exposed to Combined Chronic Low-Dose Irradiation and Modeled Microgravity Develop Long-Term Neurological Sequelae. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4094 (2019).
- Nelson, E. S., Mulugeta, L., Myers, J. G. Microgravity-induced fluid shift and ophthalmic changes. Life. 4, 621-665 (2014).
- Lee, A. G., Mader, T. H., Robert Gibson, C., Brunstetter, T. J., Tarver, W. J. Space flight-associated neuro-ocular syndrome (SANS). Eye. 32, 1164-1167 (2018).
- Stenger, M. B., et al. Evidence Report: Risk of Spaceflight Associated Neuro-ocular Syndrome (SANS). , (2017).
- Garrett-Bakelman, F. E., et al. The NASA Twins Study: A multidimensional analysis of a year-long human spaceflight. Science. 364, (2019).
- Mader, T. H., et al. Optic disc edema, globe flattening, choroidal folds, and hyperopic shifts observed in astronauts after long duration space flight. Ophthalmology. 118, 2058-2069 (2011).
- Mao, X. W., et al. Characterization of mouse ocular response to a 35-day spaceflight mission: Evidence of blood-retinal barrier disruption and ocular adaptations. Science Reports. 9 (1), 8215 (2019).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. , 632-640 (2009).
- Silva, J. M. S., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Science Reports. 5, 14088 (2015).
- Descamps, E., et al. Soft tissue discrimination with contrast agents using micro-CT scanning. Belgian Journal of Zoology. , 20-40 (2014).
- Wu, J., Yin, N. Anatomy research of nasolabial muscle structure in fetus with cleft lip: an iodine staining technique based on microcomputed tomography. Journal of Craniofacial Surgery. 25 (3), 1056-1061 (2014).
- Roque-Torres, G. D. Application of Micro-CT in Soft Tissue Specimen Imaging. In: Orhan K. (eds) Micro-computed Tomography (micro-CT) in Medicine and Engineering. , Springer. 139-170 (2020).
- Overbey, E. G., et al. Spaceflight influences gene expression, photoreceptor integrity, and oxidative stress-related damage in the murine retina. Science Reports. 9 (1), 13304 (2019).
- Elkhoury, J. E., Shankar, R., Ramakrishnan, T. S. Resolution and Limitations of X-Ray Micro-CT with Applications to Sandstones and Limestones. Transport in Porous Media. 129, 413-425 (2019).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: A methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
- Huang, A. S., Stenger, M. B., Macias, B. R. Gravitational Influence on Intraocular Pressure: Implications for Spaceflight and Disease. Journal of Glaucoma. 28 (8), 756-764 (2019).
- Lee, A. G., et al. Spaceflight associated neuro-ocular syndrome (SANS) and the neuro-ophthalmologic effects of microgravity: a review and an update. NPJ Microgravity. 6, 7 (2020).
