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Genetics

Detección de variantes genéticas en el gen CALR mediante análisis de fusión de alta resolución

Published: August 26, 2020 doi: 10.3791/61642
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1, 1, 1, 1
1Department of Hematology, University Medical Centre Ljubljana, 2Clinical Institute for Genomic Medicine, University Medical Centre Ljubljana, 3Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana

Summary

El análisis de fusión de alta resolución (HRM) es una solución sensible y rápida para la detección de variantes genéticas. Depende de las diferencias de secuencia que dan lugar a heterodúplex que cambian la forma de la curva de fusión. Al peinar la HRM y la electroforesis en gel de agarosa, se pueden identificar diferentes tipos de variantes genéticas como los indels.

Abstract

El análisis de fusión de alta resolución (HRM) es un método poderoso para el genotipado y el escaneo de variación genética. La mayoría de las aplicaciones de HRM dependen de colorantes de ADN saturados que detectan diferencias de secuencia y heterodúplex que cambian la forma de la curva de fusión. Se necesita una excelente resolución del instrumento y un software especial de análisis de datos para identificar las pequeñas diferencias de la curva de fusión que identifican una variante o genotipo. Se pueden observar diferentes tipos de variantes genéticas con diversas frecuencias en el gen específico para pacientes con una enfermedad específica, especialmente cáncer y en el gen CALR en pacientes con neoplasias mieloproliferativas negativas para el cromosoma Filadelfia. Los cambios de nucleótido único, las inserciones y/o deleciones (indels) en el gen de interés pueden ser detectados por el análisis HRM. La identificación de diferentes tipos de variantes genéticas se basa principalmente en los controles utilizados en el ensayo qPCR HRM. Sin embargo, a medida que aumenta la longitud del producto, la diferencia entre las curvas de tipo salvaje y heterocigoto se hace más pequeña, y el tipo de variante genética es más difícil de determinar. Por lo tanto, cuando los indels son la variante genética prevalente esperada en el gen de interés, se puede utilizar un método adicional como la electroforesis en gel de agarosa para la aclaración del resultado de la HRM. En algunos casos, un resultado no concluyente debe volver a verificarse/volver a diagnosticarse mediante la secuenciación estándar de Sanger. En este estudio retrospectivo, aplicamos el método a pacientes JAK2 V617F negativos con MPN.

Introduction

Las variantes genéticas somáticas en el gen de la calreticulina(CALR)fueron reconocidas en 2013 en pacientes con neoplasias mieloproliferativas (MPN) como trombocitemia esencial y mielofibrosis primaria1,2. Desde entonces, se han descubierto más de 50 variantes genéticas en el gen CALR, induciendo un desplazamiento de marco +1 (−1+2)3. Las dos variantes genéticas CALR más frecuentes son una deleción de 52 pb (NM_004343.3 (CALR):c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)), también llamada mutación tipo 1, y una inserción de 5 pb (NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)), también llamada mutación tipo 2. Estas dos variantes genéticas representan el 80% de todas las variantes genéticas de CALR. Los otros se han clasificado como tipo 1 o tipo 2 utilizando algoritmos basados en la preservación de una hélice α cercana al tipo salvaje CALR4. Aquí, presentamos uno de los métodos altamente sensibles y rápidos para la detección de variantes genéticas CALR, el método de análisis de fusión de alta resolución (HRM). Este método permite la detección rápida de variantes genéticas tipo 1 y tipo 2, que representan la mayoría de las mutaciones CALR 5. HrM se introdujo en combinación con la »reacción en cadena de la polimerasa« en tiempo real (qPCR) en 1997 como una herramienta para detectar la mutación en el factor V Leiden6. En comparación con la secuenciación de Sanger que representa la técnica estándar de oro, la HRM es un método más sensible y menos específico5. El método HRM es un buen método de cribado que permite un análisis rápido de un gran número de muestras con un gran coste-beneficio5. Es un método de PCR simple realizado en presencia de un tinte fluorescente y no requiere habilidades específicas. Otro beneficio es que el procedimiento en sí no daña ni destruye la muestra analizada que nos permite reutilizar la muestra para electroforesis o secuenciación de Sanger después del procedimiento HRM7. La única desventaja es que a veces es difícil interpretar los resultados. Además, la HRM no detecta la mutación exacta en pacientes con mutaciones no tipo 1 o tipo 28. En estos pacientes, se debe realizar la secuenciación de Sanger (Figura 1).

La HRM se basa en la amplificación de la región específica del ADN en presencia de un colorante fluorescente de ADN saturado, que se incorpora en el ADN de doble cadena (dsDNA). El colorante fluorescente emite luz cuando se incorpora en el dsDNA. Después de un aumento progresivo de la temperatura, el dsDNA se descompone en ADN monocatenario, que se puede detectar en la curva de fusión como una disminución repentina en la intensidad de la fluorescencia. La forma de la curva de fusión depende de la secuencia de ADN que se utiliza para detectar la mutación. Las curvas de fusión de las muestras se comparan con las curvas de fusión de mutaciones conocidas o CALR de tipo salvaje. Las curvas de fusión distintas representan una mutación diferente que no es tipo 1 o tipo 29.

El algoritmo para la detección de variantes genéticas somáticas en el gen CALR mediante HRM, electroforesis en gel de agarosa y método de secuenciación(Figura 1)fue utilizado y validado en el estudio retrospectivo publicado antesdel 10.

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Protocol

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Médica de la República de Eslovenia. Todos los procedimientos se ajustaban a la declaración de Helsinki.

1. PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia (qPCR) y análisis post-qPCR por HRM

  1. Imprimaciones resuspend enumeradas en la Tabla de Materiales a 100 μM con H2O estéril, RNasa y Libre de DNasa (ver Tabla de Materiales). Haga una imprimación de concentración de trabajo de 10 μM. Los cebadores utilizados en el protocolo se publicaron antesdel 2.
  2. Cuantificar el ADN de los granulocitos mediante el método de tinción por fluorescencia siguiendo las instrucciones del fabricante11 (ver Tabla de Materiales). Preparar una solución de ADN de 20 ng/μL utilizando 10 mM Tris-Cl, 0,5 mM EDTA, pH 9,0 (ver Tabla de Materiales).
    1. Además de las muestras de ADN, prepare al menos tres controles de ADN: dos controles positivos con el NM_004343.3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46) (deleción de 52 pb o mutación tipo 1) y NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47) (inserción de 5 pb o mutación tipo 2) variante genética, así como ADN de tipo salvaje y control negativo como control sin plantilla (NTC).
      NOTA: Antes de realizar la configuración de HRM, confirme que el instrumento qPCR está calibrado para experimentos de HRM.
  3. Prepare qPCR HRM Master Mix de acuerdo con el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de Materiales) dela siguiente manera: 10 μL de 2x qPCR Master Mix con colorante, 0.2 μL de 10 μM Forward Primer, 0.2 μL de 10 μM Reverse Primer, 8.6 μL de estéril, RNasa y DNasa libre de H2O. Utilice los cebadores de la Tabla de Materiales. Ejecute tres réplicas para cada muestra de ADN y control.
    1. Prepare el qPCR HRM Master Mix de acuerdo con el número de muestras que se procesan. Incluya un exceso de volumen de al menos el 10% en los cálculos para proporcionar un exceso de volumen para la pérdida que se produce durante las transferencias de reactivos.
  4. Mezcle el contenido de la reacción golpeando e invirtiendo suavemente el tubo y el vórtice durante 2-3 s. Recoge todas las gotas dispersas desde la pared del tubo hasta la parte inferior con un breve giro.
  5. Preparar una placa de reacción apropiada para el instrumento y el experimento hrM (ver Tabla de Materiales). Transfiera 19 μL de la mezcla maestra qPCR HRM a los pocillos apropiados de la placa de reacción óptica de 96 pocillos.
  6. Pipeteo 1 μL de los controles negativos, controles positivos y muestras en los pocillos apropiados de la placa de reacción óptica. Para el NTC, transfiera 1 μL de H2O estéril, libre de RNasa y DNasa utilizado para preparar la mezcla maestra qPCR HRM en lugar de ADN.
  7. Selle la placa de reacción con la película adhesiva óptica. Hazlo con firmeza para evitar la evaporación durante la carrera. Compruebe que la película adhesiva óptica esté plana a través de todos los pocillos de la placa de reacción para garantizar la correcta detección de fluorescencia.
  8. Gire la placa de reacción a 780 x g a temperatura ambiente (RT) durante 1 minuto. Compruebe que el líquido está en el fondo de los pocillos en la placa de reacción. Proceda a ejecutar el ensayo.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Conservar la placa a 4 °C durante un máximo de 24 h. Deje que la placa almacenada a 4 °C se caliente a RT y luego gire la placa brevemente antes de ejecutarla.
  9. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, prepare y comience la ejecución para amplificar y fundir el ADN y generar datos de fluorescencia HRM en el instrumento qPCR. En el software del sistema de instrumentos, asigne los controles y las muestras a los pozos apropiados.
  10. Para la detección de variantes genéticas CALR, cambie el protocolo de amplificación del instrumento predeterminado y amplifique el ADN utilizando el siguiente protocolo de ciclo térmico: 95 °C durante 10 minutos, seguido de 50 ciclos de 95 °C durante 10 s y 62,5 °C durante 60 s.
  11. Realice la etapa de curva de fusión/disociación (HRM) inmediatamente después de qPCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante12 de la siguiente manera: 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 1 min, y luego una velocidad de rampa de 0.025 °C/s hasta 95 °C. Mantenga la temperatura a 95 °C durante 15 s y a 60 °C durante 15 s.
  12. La ejecución finaliza automáticamente. Primero, revise y verifique la gráfica de amplificación(Figura 2).
  13. En el menú de experimento del software del sistema de instrumentos, seleccione la opción de gráfico de amplificación. Si no se muestra ningún dato, haga clic en el botón verde Analizar.
    1. En la pestaña gráfica de amplificación, en el menú desplegable Tipo de gráfica, seleccione la gráfica que muestra los datos de amplificación como las lecturas de fluorescencia sin procesar normalizadas a la fluorescencia de la referencia pasiva (ΔRn) en función del número de ciclo (ΔRn vs Ciclo). En el menú desplegable Color de trazado, seleccione Ejemplo.
  14. En el menú desplegable Tipo de gráfico, seleccione el tipo de gráfico de amplificación lineal. Para mostrar el ciclo de inicio y fin de la línea base en el gráfico de amplificación lineal, seleccione la opción de inicio de la línea base. Compruebe que la línea base está configurada correctamente. El ciclo final debe establecerse unos pocos ciclos antes del número de ciclo donde se detecta una señal fluorescente significativa. La línea de base generalmente se establece de 3 a 15 ciclos(Figura 2).
  15. En el menú desplegable Tipo de gráfico, seleccione el tipo de gráfico de amplificación log10. Muestre la línea de umbral en el gráfico seleccionando la opción de umbral. Ajuste el umbral en consecuencia si no se establece correctamente. El umbral establecido correctamente significa que la línea de umbral cruza la fase exponencial de las curvas qPCR (Figura 2).
  16. Verifique que las curvas de amplificación normales estén en todos los pozos de control positivo y de muestra. Verifique que no haya amplificación en los pozos NTC antes del ciclo 40. Una gráfica de amplificación normal muestra un aumento exponencial de la fluorescencia que supera el umbral entre los ciclos 15 y 35(Figura 2). Excluya los pozos de muestra del análisis si no hay amplificación en la posición del pozo.
    NOTA: Si la gráfica de amplificación parece anormal o el NTC indica bien la amplificación, identifique y resuelva el problema de acuerdo con la guía de solución de problemas del fabricante.
  17. Excluya el valor atípico con el valor del ciclo de cuantificación (Cq) que difiere de las réplicas por más de 2 en el software del sistema deinstrumentos 12. Los valores atípicos pueden producir resultados erróneos de HRM.
  18. En las curvas de fusión derivadas, revise las regiones/líneas de temperatura previas y posteriores a la fusión. Las regiones previas y posteriores a la fusión deben estar dentro de un área plana donde no haya grandes picos o pendientes en los niveles fluorescentes (Figura 3). Si es necesario, ajústelo en consecuencia. Configure el inicio y la parada de las líneas de temperatura previas y posteriores a la fusión con una separación de aproximadamente 0,5 °C entre sí (Figura 3). Reinicie el análisis si los parámetros se ajustan haciendo clic en el botón Analizar.
  19. En la pestaña de gráfico de diferencia, en la pestaña configuración del gráfico, elija uno de los controles de tipo salvaje (homocigoto) que se replica como ADN de referencia y reinicie el análisis haciendo clic en el botón Analizar.
  20. En la pestaña Curvas de fusión alineadas, confirme que todos los controles positivos tienen el genotipo correcto y que NTC no pudo amplificarse(Figura 4). En la tabla de pozos, seleccione los pozos que contienen un control positivo para resaltar la curva de fusión correspondiente en los gráficos de análisis. Confirme que el color de la línea corresponde al genotipo correcto. Repita los pasos para los pozos que contienen los otros controles positivos y NTC.
  21. En la pestaña Curvas de fusión alineadas, revise cuidadosamente las visualizaciones de trazado para los ejemplos desconocidos y compárelos con los gráficos para los controles (Figura 4). En la tabla de pozos, seleccione los pozos que contienen las réplicas de muestras desconocidas, verifique el color de la curva de fusión y alinee con los controles en una secuencia ordenada seleccionando los pozos que contienen controles positivos uno por uno. Repita el proceso para todas las muestras desconocidas.
    NOTA: La muestra desconocida contiene la variante de uno de los controles si su curva de fusión está estrechamente alineada con ella. Se podrían mostrar diferentes grupos de variantes (diferentes colores) que indican que la muestra desconocida consiste en una variante desconocida, que no corresponde a los controles (Figura 8). Un nivel bajo de la variante genética somática puede estar presente en la muestra del paciente. Esto podría influir en la interpretación del resultado de la HRM, particularmente en el límite de detección del ensayo (Figura 9). En estos casos, el color o incluso la forma de la línea podrían parecerse mucho a la del genotipo de tipo salvaje.
    1. Cuando el resultado no sea concluyente, combine los resultados de hrM con los resultados de la electroforesis en gel de agarosa y los métodos de secuenciación. Vuelva a probar la muestra o solicite y vuelva a probar una nueva muestra si es necesario.
    2. Revise cuidadosamente el conjunto de datos para las curvas de réplica y verifique que la alineación de cada réplica dentro del grupo sea ajustada. Excluya la réplica si no se alinea estrechamente con las otras muestras del grupo (valor atípico). Vuelva a probar la muestra si hay más valores atípicos presentes y los resultados no son concluyentes. Tenga en cuenta que la cantidad y la calidad de la muestra de ADN influyen en los resultados de la HRM.
  22. Analice el resultado de la muestra desconocida en la ficha Gráfica de diferencia. Repita el procedimiento descrito en el paso 1.21 y compruebe que los resultados obtenidos para la muestra desconocida son los mismos.
  23. Luego, ejecute los productos qPCR HRM en el gel de agarosa.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Guarde la placa a 4 °C durante no más de 24 horas o a -20 °C durante un período de tiempo más largo, pero no más de 7 días. Deje que la placa almacenada a 4 °C se caliente a RT y luego gire la placa brevemente antes de ejecutarla. Deje que la placa almacenada a - 20 ° C se descongele y se caliente a RT, y luego gire la placa brevemente antes de ejecutarla.

2. Electroforesis en gel de agarosa

  1. Ejecute los productos qPCR HRM en un gel prefabricado de agarosa al 4% que contenga una tinción fluorescente de ácido nucleico utilizando el sistema de electroforesis en gel apropiado (consulte la Tabla de materiales, Figura 5). Ejecute solo una réplica positiva, negativa, NTC y qPCR HRM de muestra.
    NOTA: Siempre se deben usar guantes al manipular geles. Cualquier otro sistema de electroforesis en gel puede cumplir este propósito si se elige el porcentaje equivalente de agarosa, la tinción de ácido nucleico fluorescente y el formato del pozo.
  2. Ejecute el sistema de electroforesis en gel de acuerdo con el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Retire el gel prefabricado en el cassette del paquete, retire el peine e insértelo en el aparato de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: Cargue el gel dentro de los 15 minutos posteriores a la apertura del paquete.
  3. Diluir una muestra de 10 μL a 20 μL con H2O estéril, RNasa y libre de DNasa. Cargar cada pozo con 20 μL de muestra diluida.
  4. Diluir 3 μL de solución estándar de tamaño de ADN a 20 μL con H2O estéril, libre de RNasa y DNasa (ver Tabla de Materiales). Cargue el pozo M con 20 μL de solución estándar de tamaño de ADN diluido (Figura 6).
  5. Llene los pocillos vacíos con 20 μL de H2O estéril, libre de RNasa y DNasa.
  6. Seleccione inmediatamente el programa de acuerdo con el porcentaje del gel que se está ejecutando y establezca el tiempo de ejecución en el aparato en 10 minutos.
  7. Inicie la electroforesis dentro de 1 minuto de la carga de la muestra presionando el botón GO. El tiempo de electroforesis puede extenderse si no se obtiene una resolución suficiente.
    NOTA: No exceda el tiempo máximo recomendado de funcionamiento de la electroforesis de agarosa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  8. Cuando se complete la electroforesis, visualice el ADN en el gel utilizando una luz azul o transiluminación UV. La visualización, el análisis y el almacenamiento de las imágenes de electroforesis se realizan principalmente mediante un generador de imágenes de gel con sistema de fotodocumentación(Figura 5).
  9. Analizar e interpretar el patrón de gel de productos qPCR HRM visualizado comparando los resultados de la muestra desconocida con los controles positivos(Figura 7 y Figura 8).
  10. Si los resultados desconocidos de la muestra hrM y electroforesis en gel indican que existe una variante genética desconocida, secuenciar el producto qPCR HRM utilizando cebadores descritos en la Tabla de materiales de acuerdo con el protocolo descrito13.
    PRECAUCIÓN: Los geles de agarosa que contienen una mancha fluorescente de ácido nucleico deben eliminarse adecuadamente según las regulaciones de la institución.

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Representative Results

La región de interés del ADN amplificada con éxito con un aumento exponencial de la fluorescencia que supera el umbral entre los ciclos 15 y 35 y valores muy estrechos del ciclo de cuantificación (Cq) en todas las muestras y controles replicados(Figura 2)es un requisito previo para la identificación fiable de variantes genéticas mediante análisis HRM. Esto se logra mediante el uso de una determinación precisa de ADN con tinción de fluorescencia y una cantidad igual de ADN en el experimento qPCR HRM (ver paso 1.2). La Figura 2 muestra la amplificación exitosa de la región de ADN de interés donde los valores de Cq de todas las muestras y controles están en un intervalo muy estrecho. No hay amplificación en los pozos NTC.

La etapa de HRM se realiza inmediatamente después de la qPCR utilizando el protocolo descrito en el paso 1.11. Las regiones de fusión activas (Figura 3, etiqueta (c)) de las muestras, los controles y el NTC se utilizan para crear sus gráficas de curva de fusión alineadas (Figura 4). Por lo tanto, las regiones/líneas de temperatura pre y post-fusión correctamente establecidas(Figura 3A)son importantes para visualizar e identificar adecuadamente las variantes genéticas en las muestras. La Figura 4A y la Figura 4B muestran las curvas de fusión alineadas y las gráficas de diferencia, respectivamente, donde es posible la identificación de variantes genéticas. Las muestras desconocidas están estrechamente alineadas con uno de los controles positivos. La Figura 3B muestra regiones/líneas de temperatura pre y post-fusión configuradas incorrectamente. Esto da como resultado una curva de fusión alineada y gráficos de diferencia donde la identificación correcta de las variantes genéticas es más difícil(Figura 4C y Figura 4D).

Para confirmar los resultados de la HRM y detectar si se requiere un método de secuenciación estándar o de próxima generación para identificar la variante genética presente en la muestra, se utiliza la electroforesis en gel de agarosa. La Figura 7 muestra la electroforesis en gel de agarosa de las mismas muestras y controles que se muestran en la Figura 4. La variante genética en la muestra se puede identificar comparando el patrón de banda de la muestra con los controles y combinando la HRM y la electroforesis en gel de agarosa. Sin embargo, la correcta identificación de la variante genética solo se puede hacer para las muestras que contienen la misma variante genética que uno de los controles utilizados en el ensayo HRM (Figura 7). Las muestras que contienen variantes genéticas raras de CALR difieren en el resultado de la HRM y el patrón de banda de electroforesis(Figura 8). En este caso, se utiliza la secuenciación de Sanger o incluso el método de secuenciación de próxima generación para identificar la variante genética exacta.

Figure 1
Figura 1: Representación esquemática del algoritmo para la detección de variantes genéticas somáticas en el gen CALR mediante HRM, electroforesis en gel de agarosa y métodos de secuenciación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Diagrama de amplificación del ensayo qPCR HRM para la detección de las variantes genéticas en el gen CALR. La gráfica de amplificación se muestra como la fluorescencia bruta normalizada a la fluorescencia de la referencia pasiva (ΔRn) y en función de un número de ciclo. La línea de base se establece de 3 a 15 ciclos cuando la región de ADN de interés se amplificó de manera eficiente utilizando 20 ng de ADN de alta calidad en la reacción qPCR. Las gráficas de amplificación normales de la región de ADN de interés de todas las muestras se muestran como líneas verdes. Las gráficas muestran un aumento exponencial de la fluorescencia que supera el umbral entre los ciclos 15 y 35 en el experimento utilizando 20 ng de ADN de alta calidad en la reacción qPCR. El gráfico no muestra amplificación en los pozos de muestra sin plantilla (NTC). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Curvas de fusión derivadas en el ensayo qPCR HRM para la detección de las variantes genéticas en el gen CALR.  A) Un ejemplo de regiones/líneas de temperatura pre y post-fusión correctamente establecidas. La línea de temperatura de parada previa a la fusión debe estar adyacente al inicio de la región de transición de la fusión. La línea de temperatura de inicio posterior a la fusión debe estar adyacente al final de la región de transición de la fusión. La etiqueta (a) indica el par de líneas a la izquierda de los picos donde se establecen las temperaturas de inicio y parada previas a la fusión. Cada amplicón es de doble cadena. La etiqueta (b) indica los picos de datos de la región de fusión activa utilizada para crear la gráfica de curvas de fusión alineadas. La etiqueta (c) indica el par de líneas a la derecha de los picos donde se establecen las temperaturas de inicio y parada posteriores a la fusión. Cada amplicón es monocatenario. B)Un ejemplo de regiones/líneas de temperatura pre y post-fusión mal establecidas. Las líneas de temperatura de inicio y parada de las líneas de temperatura previas y posteriores a la fusión no son adyacentes a las regiones de transición de la fusión y están separadas entre sí a más de 0,5 °C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Las curvas de fusión alineadas y las gráficas de diferencia en el ensayo qPCR HRM para la detección de las variantes genéticas en el gen CALR.  A) y B) muestran las curvas de fusión alineadas y las gráficas de diferencia después de que las regiones / líneas de temperatura previas y posteriores a la fusión estén configuradas correctamente. A)Las curvas de fusión alineadas de los controles positivos con deleción de 52 pb (mutación tipo 1), inserción de 5 pb (mutación tipo 2) y un tipo salvaje se muestran como de color naranja, púrpura y rojo, respectivamente. B)El gráfico de diferencia de las mismas muestras descritas en el panel A. C) y D) muestran las curvas de fusión alineadas y las gráficas de diferencia después de las regiones / líneas de temperatura pre y post fusión configuradas incorrectamente para el mismo conjunto de muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: El sistema de electroforesis en gel. A) Las unidades básicas del sistema de electroforesis en gel (ver Tabla de Materiales). B)Generador de imágenes en gel con sistema de fotodocumentación que consiste en una cámara CCD, una cámara con luces trans/iluminadoras adecuadas y un filtro fotográfico (ver Tabla de Materiales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Carga del gel con muestras diluidas y solución estándar de tamaño de ADN o RNasa y DNasa libre de H2O para pozos vacíos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Análisis de los productos qPCR HRM en electroforesis en gel. El gel fue expuesto al transiluminador UV. La imagen fue tomada por el sistema de foto-documentación (Figura 5B). Los pocillos de 1 a 3 muestran controles: deleción de 52 pb (mutación tipo 1), inserción de 5 pb (mutación tipo 2) y variante de tipo salvaje, respectivamente. El patrón de banda de las muestras desconocidas en los pozos 4-10 las indica como la variante genética de tipo salvaje. El pozo M representa la solución estándar de tamaño de ADN diluido (100 a 2.000 pb). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Análisis de HRM y electroforesis en gel de las variantes genéticas en el gen CALR.  A) Análisis de gestión de recursos humanos. Las curvas de fusión alineadas de los controles positivos con deleción de 52 pb (mutación tipo 1), inserción de 5 pb (mutación tipo 2) y un tipo salvaje se muestran como color naranja, púrpura y rojo, respectivamente. La muestra desconocida con la variante genética diferente se indica como color azul oscuro. B)Análisis de electroforesis en gel. Los pocillos de 1 a 3 muestran controles: deleción de 52 pb (mutación tipo 1), inserción de 5 pb (mutación tipo 2) y variante de tipo salvaje, respectivamente. El patrón de banda de la muestra desconocida en el carril 9 indica las diferentes variantes genéticas como controles. Otras muestras desconocidas son la variante de tipo salvaje. El pozo M representa la solución estándar de tamaño de ADN diluido (100 a 2.000 pb). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: El límite de detección del ensayo de GESTIÓN DE RECURSOS. Se presenta una dilución en serie de una muestra de una deleción de 52 pb (mutación tipo 1) y una inserción de 5 pb (mutación tipo 2) que muestra una carga de alelos variante genética de aproximadamente el 50% según el análisis de secuenciación de Sanger y el ensayo hrM qPCR de acuerdo con el protocolo descrito en este artículo. A) y B) muestran las curvas de fusión alineadas y las gráficas de diferencia para diluciones de tipo salvaje y serie de una deleción de 52 pb (mutación tipo 1). C) y D) muestran las curvas de fusión alineadas y las gráficas de diferencia para diluciones de tipo salvaje y serie de una inserción de 5 pb (mutación tipo 2). En cualquier caso, la variante genética CALR podría detectarse en una dilución de hasta el 1,56%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La fusión de ADN de alta resolución es una solución simple para el genotipado y el escaneo de variantes genéticas14. Depende de las diferencias de secuencia que dan lugar a heterodúplex que cambian la forma de la curva de fusión. Se pueden observar diferentes tipos de variantes genéticas con diversas frecuencias en el gen específico para un determinado grupo de pacientes con cáncer1,2,15,16,10. Las deleciones o inserciones en el gen de interés pueden ser detectadas mediante el análisis HRM como hemos mostrado en la Figura 4A. En la implementación del ensayo qPCR HRM en las pruebas de rutina, hemos realizado un estudio de evaluación inicial que incluyó a 21 pacientes con ET JAK2 V617F negativo con una mediana de edad de 63 años (rango de 24 a 90 años). Se detectó una variante genética en el gen CALR en 12 de los 21 pacientes con ET JAK2 V617F negativo (proporción 0,57). Se detectó una deleción de 52 pb (mutación tipo 1) en 9 de 21 (proporción 0,43), se detectó una inserción de 5 pb (mutación tipo 2) en 3 de los 21 (proporción 0,143) pacientes con ET JAK2 V617F negativo. Los resultados son consistentes con los datos de la literatura1,2,17.

La identificación confiable de variantes genéticas mediante el análisis de HRM se puede lograr a través del desarrollo adecuado del ensayo que garantiza que el experimento esté optimizado para HRM. Los factores distintos de la secuencia pueden ser una fuente de pequeñas diferencias en las curvas HRM, como el diseño de la imprimación, la longitud del amplicón, la selección del tinte, la elección del reactivo qPCR HRM y los perfiles de temperatura y tiempo de los pasos qPCR HRM. Esta es la parte del desarrollo y optimización muy temprano del ensayo qPCR HRM y ya se ha discutido en otra parte12,14,18. Sin embargo, la identificación fiable de variantes genéticas en el gen CALR con una sensibilidad comparable de los ensayos podría lograrse en diferentes plataformas de HRM utilizando las mismas secuencias de cebadores19. El punto más crítico en el proceso de optimización del ensayo qPCR HRM fue la optimización de la temperatura de fusión y elongación en el paso qPCR del ensayo qPCR HRM. No fue necesaria ninguna modificación para el paso12de HRM. En las pruebas de rutina, otros factores que influyen en los resultados de la gestión de recursos humanos se vuelven más importantes de seguir.

El ADN de alta calidad resuspendido en un tampón bajo en sal como TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA o menor concentración) y la misma cantidad de ADN en el ensayo qPCR HRM son factores importantes para amplificar con éxito la región de interés del ADN con una meseta de alta señal en la fase de amplificación de qPCR(Figura 2). Esto conduce a la identificación fiable de variantes genéticas mediante análisis hrm (Figura 4A,4B)12,14. Un tampón con alto contenido de sal utilizado para la elución del ADN en el protocolo de extracción puede cambiar sutilmente la termodinámica de la transición de fusión del ADN. La precipitación y la resuspensión en TE tampón bajo en sal o la dilución de la muestra pueden resolver el problema de las impurezas en la muestra de ADN. El ADN de baja calidad puede producir productos de PCR inespecíficos o amplificación fallida. Todo esto puede resultar en una menor reproducibilidad y una mayor tasa de error en la detección de variantes hrm. Se podría necesitar una optimización adicional para las muestras desafiantes, como el ADN extraído de muestras incrustadas en parafina, para obtener un resultado óptimo de HRM15.

Las grandes diferencias en la cantidad de ADN utilizada en el ensayo qPCR HRM pueden afectar la temperatura de fusión (Tm) resultante y, en consecuencia, conducir a resultados no concluyentes. Por lo tanto, la determinación precisa de la concentración de ADN y la dilución de todas las muestras de ADN son obligatorias20. Los métodos de absorción ultravioleta (UV) y tinción por fluorescencia determinan con precisión las concentraciones de soluciones de ADN de alta pureza21. El método de absorbancia UV podría utilizarse para evaluar la pureza de las soluciones de ADN mediante la realización de mediciones de absorbancia de relación en A260/A280 y A260/230. Sin embargo, el método de tinción fluorescente es más sensible a la degradación del ADN que el método de absorción UV y puede determinar con mayor precisión la concentración de ADN21. Por lo tanto, es más apropiado para la estandarización de la cuantificación y dilución de todas las muestras de ADN en el análisis HRM20,21.

Los indels son las principales variantes genéticas en el gen CALR observadas en pacientes con MPN1. A medida que la longitud del producto cambia y aumenta, la diferencia entre las curvas de tipo salvaje y heterocigota se hace más pequeña, y la detección de variantes se vuelve más difícil7. Por lo tanto, se debe utilizar un método adicional para la clarificación de dicha variante genética.

Un buen ejemplo es la electroforesis en gel de agarosa. Este es un método simple y efectivo para separar fragmentos de ADN de diferentes tamaños22,23. Las moléculas de ADN están separadas por tamaño dentro del gel de agarosa de modo que la distancia recorrida es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular24. La Figura 4A, la Figura 4B y la Figura 7 muestran ejemplos en los que los dos tipos más comunes de variante genética CALR, la deleción de 52 pb y la inserción de 5 pb, se identifican combinando los resultados de la electroforesis en gel de qPCR HRM y agarosa. Sin embargo, cuando el resultado de la HRM y el patrón de banda de electroforesis en gel de agarosa indican una variante genética diferente (incluido el cambio de un solo nucleótido) como en los controles(Figura 8),la secuenciación de Sanger sigue siendo necesaria para identificar la variante genética exacta10.

Un bajo nivel de variante genética somática en el gen CALR puede estar presente en la muestra del paciente haciendo más exigente una interpretación de la qPCR HRM, la electroforesis en gel de agarosa y la secuenciación de Sanger, particularmente en el límite de detección del ensayo (Figura 9). Cualquier línea de forma de curva de fusión que difiera del tipo salvaje indica que la variante genética está presente en la muestra. La sensibilidad del ensayo qPCR HRM es inferior al 5%(Figura 9 y referencia19)y es más sensible que el método de secuenciación de Sanger, cuya sensibilidad se informó que era del 15-20%19. En estos casos, se podría aplicar el método de secuenciación profunda de próxima generación que detecta indels más grandes y confirmar el resultado de HRM. En conclusión, el análisis HRM es un método poderoso para el genotipado y el escaneo de la variación genética de variantes genéticas somáticas en el gen CALR. La identificación de diferentes tipos de variantes genéticas se basa principalmente en los controles utilizados en el ensayo qPCR HRM. Se obtienen resultados más fiables combinando los resultados de la HRM con los resultados de la electroforesis en gel de agarosa. En caso de resultados no concluyentes, se puede utilizar la secuenciación estándar de Sanger o incluso un método de secuenciación de próxima generación más sensible para identificar adecuadamente la variante genética.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a todos los expertos académicos y empleados del Laboratorio Especializado de Hematología, Departamento de Hematología, División de Medicina Interna, Centro Médico Universitario de Liubliana.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E-Gel EX 4% Agarose Invitrogen, Thermo Fischer Scientific G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit Invitrogen, Thermo Fischer Scientific G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific 4415440 Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4346907
MicroAmp Optical adhesive film Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4311971
NuGenius Syngene NG-1045 Gel documentation systems
Primer CALRex9 Forward Eurofins Genomics Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 Reverse Eurofins Genomics Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51306 DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.
Qubit Assay Tubes Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q32856
QUBIT dsDNA HS assay Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder Invitrogen, Thermo Fischer Scientific 10488058 Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR System Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4453534
Water nuclease free VWR, Life Science 436912C RNase, DNase and Protease free water

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References

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Genética Número 162 Análisis de fusión de alta resolución reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia variante genética electroforesis en gel de agarosa prefabricada mutación somática indel exploración heterodúplex CALR
Detección de variantes genéticas en el gen <em>CALR</em> mediante análisis de fusión de alta resolución
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