Summary
ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה (HRM) הוא פתרון רגיש ומהיר לגילוי וריאנטים גנטיים. זה תלוי בהבדלי רצף שגורמים להטרודלקסים לשנות את צורת עקומת ההיתוך. על ידי סירוק אלקטרופורזה HRM וג'ל אגרוז, ניתן לזהות סוגים שונים של וריאנטים גנטיים כגון indels.
Abstract
ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה (HRM) הוא שיטה רבת עוצמה לגנוטיפינג וסריקה גנטית. רוב יישומי HRM תלויים בצבעי דנ"א רוויים המזהים הבדלי רצף, והטרודלקסים שמשנים את צורת עקומת ההיתוך. רזולוציית מכשיר מעולה ותוכנה לניתוח נתונים מיוחדים נדרשים כדי לזהות את ההבדלים הקטנים בעקומה נמסה המזהים גרסה או גנוטיפ. סוגים שונים של וריאנטים גנטיים עם תדרים מגוונים ניתן לראות בגן ספציפי עבור חולים עם מחלה ספציפית, במיוחד סרטן בגן CALR בחולים עם כרומוזום פילדלפיה שלילי neoplasms מיאלופרופרטיבי. ניתן לזהות שינויים נוקלאוטידים בודדים, הוספות ו/או מחיקות (indels) בגן העניין על-ידי ניתוח HRM. הזיהוי של סוגים שונים של וריאנטים גנטיים מבוסס בעיקר על הפקדים המשמשים לבדיקת QPCR HRM. עם זאת, ככל שאורך המוצר גדל, ההבדל בין עקומות מסוג בר והטרוזיגוטה הופך לקטן יותר, וסוג הגרסה הגנטית קשה יותר לקבוע. לכן, כאשר indels הם הגרסה הגנטית הנפוצה הצפויה בגן העניין, שיטה נוספת כגון אלקטרופורזה ג'ל אגרוז יכול לשמש להבהרת התוצאה HRM. במקרים מסוימים, יש לבדוק מחדש/לאבחן מחדש תוצאה חד משמעית על-ידי רצף סנגר רגיל. במחקר רטרוספקטיבי זה, יישמנו את השיטה על JAK2 V617F-שלילי חולים עם MPN.
Introduction
וריאנטים גנטיים סומטיים בגן calreticulin (CALR) הוכרו בשנת 2013 בחולים עם ניופלסטים מיאלופריפירפיים (MPN) כגון תרומבוציטמיה חיונית ומיאלופיברוזיס ראשוני1,2. מאז, יותר מ -50 וריאנטים גנטיים בגן CALR התגלו, גרימת +1 (−1+2) frameshift3. שתי הווריאנטים הגנטיים הנפוצים ביותר של CALR הם מחיקה של 52 bp (NM_004343.3(CALR):c.1099_1150del52, עמ' (Leu367Thrfs*46)), הנקראת גם מוטציה מסוג 1, והכנסת 5 bp (NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)), הנקראת גם מוטציה מסוג 2. שתי וריאנטים גנטיים אלה מייצגים 80% מכל הווריאנטים הגנטיים של CALR. האחרים סווגו כסוג 1 או סוג 2 - כמו שימוש באלגוריתמים המבוססים על שימור של α סליל קרוב לסוג פראי CALR4. כאן, אנו מציגים את אחת השיטות הרגישות והמהירות ביותר לגילוי וריאנטים גנטיים של CALR, שיטת ניתוח ההיתוך ברזולוציה גבוהה (HRM). שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר של וריאנטים גנטיים מסוג 1 וסוג 2, המייצגים את רוב מוטציות CALR 5. HRM הוצג בשילוב עם זמן אמת »תגובת שרשרת פולימראז« (qPCR) בשנת 1997 ככלי לזיהוי המוטציה בגורם V Leiden6. בהשוואה לרצף סנגר המייצג את הטכניקה הסטנדרטית המוזהבת, HRM היא שיטה רגישה יותר ופחות ספציפית5. שיטת HRM היא שיטת סינון טובה המאפשרת ניתוח מהיר של מספר רב של דגימות עם עלות-תועלת גדולה5. זוהי שיטת PCR פשוטה המבוצעת בנוכחות צבע פלואורסצנטי ואינה דורשת מיומנויות ספציפיות. יתרון נוסף הוא כי ההליך עצמו אינו פוגע או להרוס את המדגם המנותח המאפשר לנו לעשות שימוש חוזר במדגם עבור אלקטרופורזה או רצף סנגר לאחר הליך HRM7. החיסרון היחיד הוא שלפעמים קשה לפרש את התוצאות. בנוסף, HRM אינו מזהה את המוטציה המדויקת בחולים עם מוטציות שאינן מסוג 1 או סוג 28. בחולים אלה, יש לבצע רצף סנגר(איור 1).
HRM מבוסס על הגברה של אזור ה- DNA הספציפי בנוכחות צבע פלואורסצנטי DNA רווי, המשולב ב- DNA כפול גדילים (dsDNA). הצבע הפלואורסצנטי פולט אור כאשר הוא משולב ב- dsDNA. לאחר עלייה הדרגתית בטמפרטורה, dsDNA מתפרק לדנ"א נטוש יחיד, אשר ניתן לזהות על עקומת ההיתוך כירידה פתאומית בעוצמת הפלואורסצנטיות. צורת עקומת ההיתוך תלויה ברצף הדנ"א המשמש לזיהוי המוטציה. עקומות נמסות של דגימות מושוות לעקומות נמסות של מוטציות ידועות או CALR מסוג פראי. עקומות התכה נפרדות מייצגות מוטציה שונה שאינה מסוג 1 או סוג 29.
האלגוריתם לזיהוי וריאנטים גנטיים סומטיים בגן CALR על ידי HRM, אלקטרופורזה ג'ל אגרוז ושיטת רצף (איור 1) שימש ואומת במחקר רטרוספקטיבי שפורסם לפני10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחקר אושר על ידי הוועדה לאתיקה רפואית של הרפובליקה של סלובניה. כל ההליכים היו בהתאם להצהרת הלסינקי.
1. PCR כמותי מבוסס פלואורסצנטיות בזמן אמת (qPCR) וניתוח לאחר qPCR על ידי HRM
- פריימרים resuspend המפורטים בטבלת החומרים כדי 100 מיקרומטר עם סטרילי, RNase ו DNase חינם H2O (ראה טבלת חומרים). הפוך פריימר ריכוז עבודה 10 מיקרומטר. פריימרים המשמשים בפרוטוקול פורסמו לפני2.
- כמות גרנולוציטים DNA על ידי שיטת הכתמת פלואורסצנטיות בעקבות הוראת היצרן11 (ראה טבלת חומרים). הכן פתרון DNA 20 ננוגרם / μL באמצעות 10 mM Tris-Cl, 0.5 מ"מ EDTA, pH 9.0 (ראה טבלת חומרים).
- בנוסף לדגימות DNA, הכינו לפחות שלושה פקדי DNA: שני פקדים חיוביים עם NM_004343.3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46) (מחיקה של 52 bp או מוטציה מסוג 1), ו- NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47) (5 bp כניסה או מוטציה מסוג 2) גרסה גנטית, כמו גם DNA מסוג בר ושליטה שלילית כבקרה שאינה תבנית (NTC).
הערה: לפני ביצוע ההתקנה של HRM, ודא שמכשיר ה- qPCR מכויל לניסויי HRM.
- בנוסף לדגימות DNA, הכינו לפחות שלושה פקדי DNA: שני פקדים חיוביים עם NM_004343.3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46) (מחיקה של 52 bp או מוטציה מסוג 1), ו- NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47) (5 bp כניסה או מוטציה מסוג 2) גרסה גנטית, כמו גם DNA מסוג בר ושליטה שלילית כבקרה שאינה תבנית (NTC).
- הכן תערובת מאסטר QPCR HRM לפי פרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים) כדלקמן: 10 μL של 2x qPCR מאסטר לערבב עם צבע, 0.2 μL של 10 μM פריימר קדימה, 0.2 μL של 10 μM פריימר הפוך, 8.6 μL של סטרילי, RNase ו- DNase חינם H2O. השתמש בפריימרים מטבלת החומרים. תריץ שלושה שכפולים לכל דגימת דנ"א ושליטה.
- הכן את תערובת המאסטר HRM של qPCR בהתאם למספר הדגימות המעובדות. כלול נפח עודף של לפחות 10% בחישובים כדי לספק נפח עודף עבור האובדן המתרחש במהלך העברות ריאגנט.
- מערבבים את תוכן התגובה על ידי הקשה עדינה והפכת הצינור ומערבולת עבור 2-3 s. לאסוף את כל טיפות מפוזרות מקיר הצינור לתחתית על ידי סיבוב קצר.
- הכן לוח תגובה המתאים לניסוי המכשיר וה- HRM (ראה טבלת חומרים). העבר 19 μL של תערובת מאסטר QPCR HRM לבארות המתאימות של לוח התגובה האופטי 96-well.
- Pipet 1 μL של הפקדים השליליים, פקדים חיוביים, ודגימות לתוך בארות המתאימות של צלחת התגובה האופטית. עבור NTC, להעביר 1 μL של סטרילי, RNase ו- DNase חינם H2O המשמש להכנת תערובת מאסטר HRM qPCR במקום DNA.
- אוטמים את לוח התגובה עם סרט הדבקה אופטי. עשה זאת היטב כדי למנוע אידוי במהלך הריצה. בדוק כי סרט הדבק האופטי הוא מישור על פני כל בארות בצלחת התגובה כדי להבטיח זיהוי פלואורסצנטיות נכון.
- סובבו את צלחת התגובה ב-780 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) למשך דקה אחת. בדוק כי הנוזל הוא בתחתית בארות בצלחת התגובה. תמשיך להריץ את ההסתערות.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. לאחסן את הצלחת ב 4 °C (55 °F) עבור לא יותר מ 24 שעות. אפשר את הצלחת המאוחסנת ב 4 °C (5 °F) להתחמם RT, ולאחר מכן לסובב את הצלחת לזמן קצר לפני הפעלתו. - על פי ההוראה של היצרן להכין ולהתחיל את הריצה כדי להגביר ולהמיס את ה- DNA וליצור נתוני פלואורסצנטיות HRM במכשיר qPCR. בתוכנת מערכת המכשירים, הקצה את הפקדים והדוגמאות לבארות המתאימות.
- לגילוי וריאנט גנטי CALR, לשנות את פרוטוקול הגברת המכשיר ברירת המחדל ולהגביר את ה- DNA באמצעות פרוטוקול הרכיבה התרמית הבאה: 95 °C (55 °F) במשך 10 דקות, ואחריו 50 מחזורים של 95 °C (55 °F) עבור 10 s ו 62 °C (60 °F) עבור 60 °C (60 s).
- בצע את עקומת ההיתוך / ניתוק (HRM) שלב מיד לאחר qPCR על פי הוראות היצרן12 כדלקמן: 95 °C (10 s), 60 °C (50 °F) למשך דקה אחת ולאחר מכן קצב הרמפה של 0.025 °C (55 °F) עד 95 °C (70 °F). החזק את הטמפרטורה ב 95 °C (5 °F) במשך 15 °C (60 °F) במשך 15 °C (55 °F)
- הריצה מסתיימת באופן אוטומטי. ראשית, סקור ואמת את עלילת ההגברה(איור 2).
- בתפריט הניסוי של תוכנת מערכת המכשירים, בחר באפשרות עלילת הגברה. אם לא מוצגים נתונים, לחץ על הלחצן הירוק נתח.
- בכרטיסיה התוויית הגברה, מהתפריט הנפתח סוג העלילה, בחר את התוויה המציגה את נתוני ההגברה כקריאות הפלואורסצנטיות הגולמיות מנורמלות לפלורסצנטיות מההפניה הפסיבית (ΔRn) כפונקציה של מספר מחזור (ΔRn לעומת מחזור). בתפריט הנפתח צבע התוויית התוויה, בחר דוגמה.
- מהתפריט הנפתח סוג התרשים, בחרו בסוג גרף ההגברה הליניארי. הצג את מחזור ההתחלה והסיום הבסיסי בגרף ההגברה הליניארי על-ידי בחירת אפשרות ההתחלה הבסיסית. ודא שקו הבסיס מוגדר כראוי. מחזור הסיום צריך להיות מוגדר כמה מחזורים לפני מספר המחזור שבו אות פלואורסצנטי משמעותי מזוהה. קו הבסיס מוגדר בדרך כלל מ- 3 ל- 15 מחזורים (איור 2).
- מהתפריט הנפתח סוג התרשים, בחר את סוג גרף ההגברה של log10. הצג את קו הסף בגרף על-ידי בחירת אפשרות הסף. התאם את הסף בהתאם אם לא הוגדר כראוי. הסף שנקבע כהלכה פירושו שקו הסף חוצה את השלב המעריכי של עקומות qPCR (איור 2).
- ודא כי עקומות הגברה רגילות נמצאות בכל בארות הדגימה והבקרה החיובית. ודא שאין הגברה בבארות NTC לפני מחזור 40. עלילת הגברה רגילה מראה עלייה מעריכית בפלואורסצנטיות החורגת מהסף שבין מחזורים 15 ל- 35 (איור 2). אל תכלול את בארות המדגם מהניתוח אם אין הגברה במצב הבאר.
הערה: אם עלילת ההגברה נראית חריגה או שהבאר NTC מציינת את ההגברה, זהה ופתור את הבעיה בהתאם למדריך לפתרון בעיות של היצרן. - אל תכלול את החריג עם ערך מחזור הכימות (Cq) השונה משכפולים ביותר מ- 2 בתוכנת מערכתהמכשירים 12. החצאים עשויים להפיק תוצאות HRM שגויות.
- בעקומות ההמסה הנגזרות, סקור את קווי הטמפרטורה/אזורים לפני ההמסה. האזורים שלפני ההמסה וההמסה צריכים להיות בתוך אזור שטוח שבו אין פסגות או מדרונות גדולים ברמות הפלואורסצנטיות(איור 3). במידת הצורך להתאים אותו בהתאם. הגדר את ההתחלה והתחנה של קווי הטמפרטורה לפני ולאחר ההמסה בערך 0.5 °C(איור 3). הפעל מחדש את הניתוח אם הפרמטרים מותאמים על-ידי לחיצה על לחצן נתח.
- בכרטיסיה התוויית הפרשים, בכרטיסיה הגדרות התוויה, בחר אחד מהפקדים מסוג פראי (homozygote) המשכפל כ- DNA של ההפניה והפעל מחדש את הניתוח על-ידי לחיצה על לחצן נתח.
- בכרטיסיה עקומות המסה מיושרות, ודא שלכל הפקדים החיוביים יש את הגנוטיפ הנכון ו- NTC לא הצליח להגביר (איור 4). מתוך טבלת הבאר, בחר את הבארות המכילות פקד חיובי כדי להדגיש את עקומת ההיתוך המתאימה בפותלות הניתוח. ודא שצבע הקו תואם לגנוטיפ הנכון. חזור על שלבים עבור הבארות המכילות את הפקדים החיוביים האחרים ואת NTC.
- בכרטיסיה עקומות המסה מיושרות, סקור בקפידה את צגי התוויית הנתונים עבור הדוגמאות הלא ידועות והשווה אותן לתצוגות התוויה עבור פקדים (איור 4). מתוך טבלת הבאר, בחר את הבארות המכילות את המדגם הלא ידוע משכפל, בדוק את צבע עקומת ההמסה ויישר אותם עם הפקדים ברצף מסודר על-ידי בחירת הבארות המכילות פקדים חיוביים בזה אחר זה. חזור על התהליך עבור כל הדגימות הלא ידועות.
הערה: המדגם הלא ידוע מכיל את הגרסה של אחד הפקדים אם עקומת ההיתוך שלו מיושרת אליו בחוזקה. ניתן להציג קבוצות משתנים שונות (צבעים שונים) המציינות שהדגימה הלא ידועה מורכבת מגרסה לא ידועה, שאינה תואמת לפקדים (איור 8). רמה נמוכה של גרסה גנטית סומטית יכולה להיות נוכחת במדגם של המטופל. הדבר עשוי להשפיע על הפרשנות של תוצאת ה-HRM, במיוחד במגבלת הזיהוי של ה-Assay (איור 9). במקרים אלה, הצבע או אפילו צורת הקו יכולים להידמות מאוד לזה של הגנוטיפ הפראי.- כאשר התוצאה אינה חד משמעית, לשלב את תוצאות HRM עם התוצאות של אלקטרופורזה ג'ל אגרוז ושיטות רצף. יש לתנות מחדש את הדגימה או לבקש ולבקש מחדש דגימה חדשה במידת הצורך.
- סקור בקפידה את ערכת הנתונים עבור עקומות שכפול ובדוק שהיישור של כל שכפול בתוך הקבוצה הוא הדוק. אל תכלול את השכפול אם הוא אינו מתיישר בחוזקה עם הדוגמאות האחרות בקבוצה (חריגות). תציין שוב את המדגם אם קיימים חריגים נוספים והתוצאות אינן חד משמעיות. שים לב כי הכמות והאיכות של דגימת ה- DNA משפיעים על תוצאות HRM.
- נתח את התוצאה עבור הדוגמה הלא ידועה בכרטיסיה התוויית הפרש. חזור על ההליך המתואר בשלב 1.21 וודא שהתוצאות שהושגו עבור המדגם הלא ידוע זהות.
- לאחר מכן, הפעל את מוצרי HRM qPCR על ג'ל אגרוז.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. לאחסן את הצלחת ב 4 °C (5 °F) במשך לא יותר מ 24 שעות או ב -20 °C (5 °F) במשך תקופה ארוכה יותר אבל לא יותר מ 7 ימים. אפשר את הצלחת המאוחסנת ב 4 °C (5 °F) להתחמם RT, ולאחר מכן לסובב את הצלחת לזמן קצר לפני הפעלתו. אפשר את הצלחת המאוחסנת ב - 20 °C (20 °F) להפשיר ולחמם ל RT, ולאחר מכן לסובב את הצלחת לזמן קצר לפני הפעלתו.
2. אלקטרופורזה ג'ל אגרוז
- הפעל מוצרי QPCR HRM על ג'ל טרום יצוק 4% המכיל כתם חומצת גרעין פלואורסצנטית באמצעות מערכת אלקטרופורזה ג'ל המתאימה (ראה טבלה של חומרים, איור 5). הפעל רק שכפול חיובי אחד, שלילי, NTC ו- qPCR לדוגמה HRM.
הערה: כפפות תמיד צריך להיות משוחק בעת טיפול ג'לים. כל מערכת אלקטרופורזה ג'ל אחרת יכולה למלא מטרה זו אם אחוז אגרוז המקביל, כתם חומצת גרעין פלואורסצנטית ופורמט טוב נבחרים. - הפעל את מערכת אלקטרופורזה ג'ל על פי פרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים). הסר את ג'ל יצוק מראש בקלטת מהחבילה, להסיר את המסרק ולהכניס אותו לתוך המנגנון על פי הוראות היצרן (ראה טבלה של חומרים).
הערה: לטעון את הג'ל בתוך 15 דקות מפתיחת החבילה. - לדלל מדגם 10 μL כדי 20 μL עם סטרילי, RNase ו DNase חינם H2O. לטעון כל טוב עם 20 μL של מדגם מדולל.
- לדלל 3 μL של פתרון סטנדרטי בגודל DNA ל 20 μL עם סטרילי, RNase ו DNase חינם H2O (ראה טבלה של חומרים). טען את ה- M היטב עם 20 μL של פתרון סטנדרטי בגודל DNA מדולל (איור 6).
- מלאו את כל בארות ריקות עם 20 μL של סטרילי, RNase ו DNase חינם H2O.
- בחר מיד את התוכנית לפי אחוז הג'ל מופעל והגדר את זמן הריצה על המנגנון ל -10 דקות.
- התחל את האלקטרופורזה תוך דקה אחת מדגם הטעינה על ידי לחיצה על לחצן GO. זמן אלקטרופורזה יכול להיות מורחב אם רזולוציה מספקת מתקבלת.
הערה: אין לחרוג מזמן הריצה המרבי המומלץ של אלקטרופורזה אגרוז בהתאם להוראות היצרן. - כאשר האלקטרופורזה הושלמה, דמיינו דנ"א בג'ל באמצעות אור כחול או טרנסילנציה UV. הדמיה, ניתוח ואחסון של תמונות האלקטרופורזה נעשים בעיקר על ידי צלם ג'ל עם מערכת תיעוד תמונות(איור 5).
- נתח ופרש את תבנית הג'ל של מוצרי QPCR HRM החזותיים על-ידי השוואת התוצאות של המדגם הלא ידוע לבקרות חיוביות (איור 7 ואיור 8).
- אם תוצאות האלקטרופורזה HRM וג'ל המדגם לא ידועות מצביעות על כך שיש גרסה גנטית לא ידועה, רצף את מוצר ה- QPCR HRM באמצעות פריימרים המתוארים בטבלת החומרים על פי הפרוטוקול המתואר13.
זהירות: יש להיפטר כראוי מג'לים אגרוז המכילים כתם חומצת גרעין פלואורסצנטית לפי תקנות המוסד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אזור ה- DNA המוגבר בהצלחה של עניין עם עלייה מעריכית בפלואורסצנטיות החורגת מהסף בין מחזורים 15 ו -35 וערכים צרים מאוד של מחזור הכימות (Cq) בכל הדגימות והפקדים המשוכפלים (איור 2) הוא תנאי מוקדם לזיהוי אמין של וריאנטים גנטיים על ידי ניתוח HRM. זה מושג באמצעות קביעה מדויקת של DNA עם כתמי פלואורסצנטיות וכמות שווה של DNA בניסוי qPCR HRM (ראה שלב 1.2). איור 2 מציג את ההגברה המוצלחת של אזור ה- DNA של העניין שבו ערכי Cq של כל הדגימות והפקדים נמצאים במרווח זמן צר מאוד. אין הגברה בבארות NTC.
שלב HRM מבוצע מיד לאחר qPCR באמצעות הפרוטוקול המתואר בשלב 1.11. אזורי ההיתוך הפעילים (איור 3, תווית (ג)) של הדגימות, הפקדים וה- NTC משמשים ליצירת התוויות העקומות המיושרות שלהם(איור 4). לכן, האזורים/קווי הטמפרטורה שנקבעו כהלכה לפני ההמסה(איור 3A)חשובים להדמיה נכונה ולזיהוי של וריאנטים גנטיים בדגימות. איור 4A ואיור 4B מציגים את עקומות ההיתוך והתווייות המיושרות, בהתאמה, שבהן זיהוי של וריאנטים גנטיים אפשרי. הדגימות הלא ידועות מיושרות היטב עם אחד הפקדים החיוביים. איור 3B מציג קווים/אזורים/טמפרטורה מוגדרים באופן שגוי לפני ההמסה. התוצאה היא עקומת היתוך מיושרת וחלוקות שונות שבהן הזיהוי הנכון של הווריאנטים הגנטיים קשה יותר(איור 4C ואיור 4D).
כדי לאשר את תוצאות HRM ולזהות אם שיטת רצף סטנדרטית או הדור הבא נדרשת לזהות את הגרסה הגנטית הקיימת במדגם, נעשה שימוש באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. איור 7 מציג את אלקטרופורזה ג'ל אגרוז של אותן דגימות ובקרות המוצגות באיור 4. ניתן לזהות את הגרסה הגנטית במדגם על ידי השוואת דפוס הרצועה של המדגם לבקרות ועל ידי שילוב האלקטרופורזה של ג'ל HRM ואגורוז. עם זאת, זיהוי הגרסה הגנטית הנכונה יכול להיעשות רק עבור הדגימות המכילות את אותה גרסה גנטית כמו אחד הפקדים המשמשים לבדיקת HRM (איור 7). דגימות המכילות וריאנטים גנטיים נדירים של CALR שונות זו מזו בתוצאה של HRM ובתבנית הלהקה האלקטרופורזה(איור 8). במקרה זה, ריצוף סנגר או אפילו שיטת הרצף של הדור הבא משמשים לזיהוי הגרסה הגנטית המדויקת.
איור 1: ייצוג סכמטי של האלגוריתם לגילוי וריאנטים גנטיים סומטיים בגן CALR על ידי HRM, אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ושיטות רצף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עלילת הגברה של בדיקת ה-QPCR HRM לאיתור הווריאנטים הגנטיים בגן CALR. עלילת ההגברה מוצגת כשירור הפלואורסצנטיות הגולמית לפלואורסצנטיות מההתייחסות הפסיבית (ΔRn) וכפונקציה של מספר מחזור. קו הבסיס מוגדר מ 3 עד 15 מחזורים כאשר אזור ה- DNA של עניין הוגבר ביעילות באמצעות 20 ננוגרם של DNA באיכות גבוהה בתגובת qPCR. חלקות ההגברה הרגילות של אזור הדנ"א של העניין של כל הדגימות מוצגות כקווים ירוקים. עלילות מראות עלייה מעריכית בפלואורסצנטיות החורגת מהסף שבין מחזורים 15 ו-35 בניסוי באמצעות 20 ננוגרם של דנ"א באיכות גבוהה בתגובת qPCR. הגרף אינו מציג הגברה בבארות לדוגמה שאינן בתבנית (NTC). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: עקומות המסה נגזרות ב-qPCR HRM לאיתור הווריאנטים הגנטיים בגן CALR. A) דוגמה של אזורים/קווי טמפרטורה מוגדרים כהלכה לפני ולאחר ההמסה. קו טמפרטורת העצירה לפני ההמסה חייב להיות צמוד לתחילת אזור המעבר להמסה. קו טמפרטורת ההתחלה שלאחר ההמסה חייב להיות צמוד לסוף אזור המעבר להמסה. התווית (א) מציינת את זוג הקווים משמאל לפסגות שבהן הטמפרטורות שלפני ההיתוך מתחילות ומוגדרות טמפרטורות עצירה. כל אמפליסון הוא כפול גדילים. התווית (b) מציינת את פסגות הנתונים של אזור ההמסה הפעיל המשמש ליצירת התוויית עקומות ההיתוך המיושרות. התווית (c) מציינת את זוג הקווים מימין לפסגות שבהן נקבעות הטמפרטורות שלאחר ההמסה והפסקתן. כל אמפליסון הוא חד-גדילי. B) דוגמה של אזורים/קווי טמפרטורה מוגדרים מראש ולאחר הפשרה. ההתחלה והתחנה של קווי הטמפרטורה לפני ולאחר ההמסה אינם סמוכים לאזורי המעבר להמסה והם יותר מ 0.5 °C (5 °F) זה מזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: עקומות ההיתוך המסודרות ותיחות ההבדלים ב-qPCR HRM לגילוי הווריאנטים הגנטיים בגן CALR. A) ו- B) הצג את עקומות ההיתוך המיושרות ואת קווי ההפרש לאחר שהוגדרו כראוי אזורי קדם ואחרי ההמסה/קווי הטמפרטורה. A) עקומות ההיתוך המיושרות של הפקדים החיוביים עם מחיקה של 52 bp (מוטציה מסוג 1), הכנסת 5 bp (מוטציה מסוג 2) וסוג פראי מוצגים כצבע כתום, סגול ואדום, בהתאמה. ב) התוויית ההבדל של אותן דוגמאות כמתואר בלוח א '. C) ו- D) הצג את עקומות ההיתוך המיושרות ואת התוויות ההבדל לאחר שהוגדרו באופן שגוי באזורים/קווי טמפרטורה לפני ואחרי ההמסה עבור אותה קבוצה של דוגמאות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מערכת אלקטרופורזה ג'ל. A) היחידות הבסיסיות של מערכת אלקטרופורזה ג'ל (ראה טבלת חומרים). B) צלם ג'ל עם מערכת תיעוד תמונות המורכבת ממצלמת CCD, תא עם אורות טראנס /מאירים מתאימים,ומסנן צילום מוצג (ראה שולחן חומרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: טעינת הג'ל עם דגימות מדוללות ופתרון סטנדרטי בגודל DNA או RNase ו- DNase חינם H2O עבור בארות ריקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: ניתוחים של מוצרי ה-HRM של qPCR על אלקטרופורזה של ג'ל. הג'ל נחשף לטרנזילומינטור UV. התמונה צולמה על ידי מערכת תיעוד התמונות(איור 5B). בארות מ- 1 עד 3 מציגות פקדים: מחיקה של 52 bp (מוטציה מסוג 1), הכנסת 5 bp (מוטציה מסוג 2) ווריאנט מסוג בר, בהתאמה. תבנית הלהקה של הדגימות הלא ידועות בבארות 4-10 מציינת אותן כגרסה גנטית מסוג בר. באר M מייצגת פתרון סטנדרטי בגודל DNA מדולל (100 עד 2,000 bp). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: ניתוחי אלקטרופורזה HRM וג'ל של הווריאנטים הגנטיים בגן CALR. A) ניתוחי HRM. עקומות ההיתוך המיושרות של הפקדים החיוביים עם מחיקה של 52 bp (מוטציה מסוג 1), הכנסת 5 bp (מוטציה מסוג 2) וסוג פראי מוצגים כצבע כתום, סגול ואדום, בהתאמה. המדגם הלא ידוע עם הגרסה הגנטית השונה מצוין כצבע כחול כהה. B) ניתוחי אלקטרופורזה ג'ל. בארות מ- 1 עד 3 מציגות פקדים: מחיקה של 52 bp (מוטציה מסוג 1), הכנסת 5 bp (מוטציה מסוג 2) ווריאנט מסוג בר, בהתאמה. תבנית הלהקה של המדגם הלא ידוע בנתיב 9 מציינת את הגרסה הגנטית השונה כפקדים. דגימות לא ידועות אחרות הן גרסה מסוג פראי. באר M מייצגת את הפתרון הסטנדרטי בגודל DNA מדולל (100 עד 2,000 bp). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: מגבלת הזיהוי של אסיפת HRM. דילול טורי של מדגם של מחיקה של 52 bp (מוטציה מסוג 1) והכנסה של 5 bp (מוטציה מסוג 2) מוצגת המציגה נטל אלל וריאנט גנטי של כ-50% על פי ניתוח רצף Sanger ובדיקת ה- QPCR HRM בהתאם לפרוטוקול המתואר במאמר זה. A) ו- B) מציגים את עקומות ההיתוך וההפרש המיושרות עבור דילולים מסוג פראי וטורי של מחיקה של 52 bp (מוטציה מסוג 1). C) ו- D) מציגים את עקומות ההיתוך וההפרש המיושרות עבור דילולים מסוג פראי וטורי של הכנסה של 5 bp (מוטציה מסוג 2). בכל מקרה, ניתן לזהות את הגרסה הגנטית CALR בדילול של עד 1.56%. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המסה ברזולוציה גבוהה של DNA היא פתרון פשוט עבור genotyping וריאנט גנטי סריקה14. זה תלוי בהבדלי רצף שגורמים להטרודלקסים שמשנים את צורת עקומת ההיתוך. סוגים שונים של וריאנטים גנטיים עם תדרים מגוונים ניתן לראות בגן ספציפי עבור קבוצה מסוימת שלחוליםעם סרטן 1,2,15,16,10. ניתן לזהות מחיקות או הוספות בגן העניין על-ידי ניתוח HRM כפי שהראינו באיור 4A. ביישום בדיקת QPCR HRM לתוך הבדיקות השגרתיות, ביצענו מחקר הערכה ראשוני הכולל 21 חולי ET שליליים JAK2 V617F עם גיל חציוני של 63 שנים (טווח בין 24 ל 90 שנים). גרסה גנטית בגן CALR זוהתה ב-12 מתוך 21 חולי ET שליליים JAK2 V617F (שיעור 0.57). מחיקה של 52 bp (מוטציה מסוג 1) זוהתה ב-9 מתוך 21 (פרופורציה 0.43), זוהתה הכנסת 5 bp (מוטציה מסוג 2) ב-3 מתוך 21 (פרופורציה 0.143) חולי ET שליליים JAK2 V617F. התוצאות עולות בקנה אחד עם הנתונים מהספרות1,2,17.
זיהוי אמין של וריאנטים גנטיים על ידי ניתוח HRM ניתן להשיג באמצעות פיתוח הבדיקה הנכונה המבטיח כי הניסוי מותאם ל- HRM. גורמים שאינם רצף יכולים להיות מקור להבדלים קטנים בעקומות HRM כגון עיצוב פריימר, אורך אמפליסון, בחירת צבע, בחירה של ריאגנט QPCR HRM ופרופילי טמפרטורה וזמן של שלבי ה- HRM של qPCR. זהו החלק של פיתוח מוקדם מאוד ואופטימיזציה של qPCR HRM תיקון כבר נדון במקום אחר12,14,18. עם זאת, זיהוי אמין של וריאנטים גנטיים בגן CALR עם רגישות דומה של בדיקות יכול להיות מושגת על פלטפורמות HRM שונות באמצעות אותם רצפי פריימר19. הנקודה הקריטית ביותר בתהליך האופטימיזציה של בדיקת ה- QPCR HRM הייתה אופטימיזציה של טמפרטורת ההיתוך והארכות בשלב qPCR של בדיקת ה- HRM של qPCR. לא היה צורך בשינוי עבור שלבHRM 12. בבדיקה השגרתית, גורמים אחרים המשפיעים על תוצאות HRM הופכים חשובים יותר לעקוב.
דנ"א באיכות גבוהה המוצב מחדש במאגר דל מלח כגון TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA או ריכוז נמוך יותר) ואותה כמות דנ"א בבחינה של qPCR HRM הם גורמים חשובים לאזור ה- DNA המוגבר בהצלחה של תחומי עניין עם רמת אות גבוהה בשלב הגברת qPCR (איור 2). זה מוביל לזיהוי אמין של וריאנטים גנטיים על ידי ניתוח HRM (איור 4A,4B)12,14. מאגר מלח גבוה המשמש לתפנית דנ"א בפרוטוקול החילוץ עשוי לשנות בעדינות את התרמודינמיקה של מעבר המסת הדנ"א. משקעים וניצול מחדש בTE של מאגר מלח נמוך או דילול של המדגם יכולים לפתור את בעיית ה זיהומים בדגימת ה- DNA. דנ"א באיכות נמוכה יכול לייצר מוצרי PCR לא מיניים או הגברה כושלת. כל זה יכול לגרום לשחזור נמוך יותר ושיעור שגיאה גבוה יותר בזיהוי וריאנט HRM. אופטימיזציה נוספת עבור דגימות מאתגרות כגון DNA שחולץ מדגימות מוטבע פרפין עשוי להידרש כדי לקבל תוצאה HRM אופטימלית15.
הבדלים גדולים בכמות ה- DNA המשמשת בדיקת QPCR HRM יכול להשפיע על טמפרטורת ההיתוך וכתוצאה מכך להוביל לתוצאות חד משמעיות. לכן, הקביעה המדויקת של ריכוז DNA ודילול של כל דגימות ה- DNA הםחובה 20. שיטות ספיגה אולטרה סגולות (UV) והכתמת פלואורסצנטיות קובעות במדויק את הריכוזים של פתרונות DNA בעלי טוהר גבוה21. שיטת ספיגת UV יכולה לשמש להערכת טוהר פתרונות ה- DNA על ידי ביצוע מדידות ספיגת יחס ב- A260/A280 ו- A260/230. עם זאת, שיטת הכתמת הפלואורסצנטי רגישה יותר להשפלה של DNA מאשר שיטת ספיגת UV ויכולה לקבוע בצורה מדויקת יותר את ריכוז ה- DNA21. לכן, זה מתאים יותר לתקנון של כימות ודילול של כל דגימות ה- DNA בניתוח HRM20,21.
indels הם הווריאנטים הגנטיים העיקריים בגן CALR שנצפו בחולי MPN1. ככל שאורך המוצר משתנה ומגדל, ההבדל בין עקומות מסוג בר לבין עקומות הטרוזיגוטה הופך לקטן יותר, וזיהוי הגרסאות הופך לקשה יותר7. לכן, יש להשתמש בשיטה נוספת להבהרה של גרסה גנטית כזו.
דוגמה טובה היא אלקטרופורזה ג'ל אגרוז. זוהי שיטה פשוטה ויעילה להפריד שברי DNA בגדלים שונים22,23. מולקולות DNA מופרדות על ידי גודל בתוך ג'ל אגרוז, כך המרחק נסע הוא פרופורציונלי הפוך הלוגריתם של המשקל המולקולרי שלה24. איור 4A, איור 4B ואיור 7 מציגים דוגמאות שבהן שני הסוגים הנפוצים ביותר של גרסה גנטית של CALR, מחיקה של 52 bp והכנסת 5 bp, מזוהים על-ידי שילוב תוצאות qPCR HRM וג'ל אגרוז. עם זאת, כאשר תוצאת HRM ותבנית רצועת האלקטרופורזה של ג'ל אגרוז מצביעות על גרסה גנטית שונה (כולל שינוי נוקלאוטיד יחיד) כמו בפקדים (איור 8),עדיין יש צורך ברצף סנגר כדי לזהות את הגרסה הגנטית המדויקת10.
רמה נמוכה של גרסה גנטית סומטית בגן CALR יכולה להיות נוכחת במדגם של המטופל מה שהופך פרשנות של qPCR HRM, אלקטרופורזה ג'ל אגרוז ותוצאות ריצוף סנגר תובעניות יותר, במיוחד במגבלת הזיהוי של בדיקת ה- Assay (איור 9). כל קו צורת עקומה נמסה השונה מסוג הפראי מציין את הגרסה הגנטית להיות נוכח במדגם. הרגישות של מבדיקת ה-QPCR HRM נמוכה מ-5%(איור 9 ואזכור19)והיא רגישה יותר משיטת הרצף של סנגר, שרגישותה דווחה כ-15%-20%19. במקרים אלה, ניתן להחיל את שיטת הרצף העמוק של הדור הבא המזהה מקרים גדולים יותר ולאשר את תוצאת HRM. לסיכום, ניתוח HRM הוא שיטה רבת עוצמה לגנוטיפינג וסריקת וריאציות גנטיות של וריאנטים גנטיים סומטיים בגן CALR. הזיהוי של סוגים שונים של וריאנט גנטי מבוסס בעיקר על הפקדים המשמשים לבדיקת HRM qPCR. תוצאות אמינות יותר מתקבלות על ידי שילוב תוצאות HRM עם תוצאות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז. במקרה של תוצאות חד משמעיות, רצף סנגר סטנדרטי או אפילו יותר רגיש הדור הבא רצף שיטה יכול לשמש כדי לזהות כראוי את הגרסה הגנטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לכל המומחים והעובדים האקדמיים במעבדה ההמטולוגית המיוחדת, במחלקה להמטולוגיה, במחלקה לרפואה פנימית, במרכז הרפואי האוניברסיטאי לובליאנה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-Gel EX 4% Agarose | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G401004 | |
| Fuorometer 3.0 QUBIT | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G6465EU | |
| MeltDoctor HRM MasterMix 2X | Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific | 4415440 | Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp Optical adhesive film | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4311971 | |
| NuGenius | Syngene | NG-1045 | Gel documentation systems |
| Primer CALRex9 Forward | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| Primer CALRex9 Reverse | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51306 | DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution. |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32856 | |
| QUBIT dsDNA HS assay | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32854 | |
| Trackit 100bp DNA Ladder | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | 10488058 | Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp. |
| ViiA7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4453534 | |
| Water nuclease free | VWR, Life Science | 436912C | RNase, DNase and Protease free water |
References
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
- Klampfl, T., et al.
- Vainchenker, W., Kralovics, R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 129, 667-679 (2017).
- Pietra, D., et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 30, 431-438 (2016).
- Lim, K. H., et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).
- Lay, M. J., Wittwer, C. T. Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR. Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA) - More than just sequence variant screening. Human Mutation. 30, 860-866 (2009).
- Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).
- Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms. Scientific Reports. 9, 19838 (2019).
- Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (last accessed 16 August 2020) (2015).
- Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (last accessed 16 August 2020) (2011).
- Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , http://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/cms_070934.pdf (last accessed16 August 2020) (2010) (2010).
- Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).
- Gonzalez-Bosquet, J., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 6, 14522 (2011).
- Van Der Stoep, N., et al. Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner. Human Mutation. 30, 899-909 (2009).
- Singdong, R., et al. Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).
- Erali, M., Wittwer, C. T. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50, 250-261 (2010).
- Bilbao-Sieyro, C., et al. High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations. PLoS One. 9, 103511 (2014).
- Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).
- Li, X., et al. Comparison of three common DNA concentration measurement methods. Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).
- Voytas, D.
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis. Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).
