Summary
O protocolo aqui apresentado destina-se a demonstrar a ocorrência de interações heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residente em Golgi com n- e/ou C-termini expostos citoplasma em células de mamíferos vivos usando a variante mais recente do ensaio de complementação da luciferase dividida.
Abstract
O objetivo deste protocolo é explorar a aplicabilidade da variante mais recente da complementação da luciferase dividida para demonstrar complexos heterologos formados por transportadores de açúcar nucleotídeos (NSTs). Essas proteínas multitransmembrana residentes em ER e Golgi carregam os açúcares nucleotídeos citoplasmicamente sintetizados através de membranas organelas para fornecer enzimas que mediam a glicosiloção com seus substratos. Os NSTs existem como dimers e/ou oligômeros superiores. Interações heterólogas entre diferentes NSTs também foram relatadas. Para verificar se a técnica é adequada para estudar o fenômeno da heteromerização do NST, testamos-a contra uma combinação dos dois NSTs residentes em Golgi que foram previamente mostrados para associar por vários outros meios. O ensaio de complementação da luciferase parece ser particularmente adequado para estudar interações entre proteínas de membrana residente em Golgi, pois não requer altos níveis de expressão, que muitas vezes desencadeiam a deslocalização da proteína e aumentam o risco de falsos positivos.
Introduction
Este manuscrito descreve um protocolo passo-a-passo para verificar a presença de interações heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residentes em Golgi em células humanas transitóriamente transfectadas usando a variante mais recente do ensaio de complementação da luciferase dividida. O procedimento foi mais extensivamente testado contra transportadores de açúcar nucleotídeos (NSTs), mas também conseguimos resultados positivos para outras proteínas de membrana tipo III residentes em Golgi cujas proteínas de membrana N e/ou C-termini estão enfrentando o citoplasma.
Nosso grupo de pesquisa explora o papel dos NSTs na glicosilação de macromoléculas. Os NSTs são proteínas de membrana tipo III residentes em Golgi e/ou ER com n-e C-termini voltados para o lado citoplasmásmico da membrana organellar1. Acredita-se que os NSTs carreguem açúcares ativados por nucleotídeos através de membranas organela para fornecer glicosilatransferases com seus substratos. Os NSTs formam dimers e/ou maiores oligômeros2,3,4,5,6,7,8,9,10. Além disso, também foram relatadas interações heterólogas entre diferentes NSTs. Os NSTs também foram demonstrados para formar complexos com enzimas de glicosilação funcionalmente relacionadas12,13,14. Buscamos uma alternativa à técnica atualmente utilizada, a abordagem FRET baseada em fluorescência (FLIM), para estudar interações de NSTs e proteínas residentes em Golgi, então decidimos testar o ensaio de complementação da luciferase dividida. Permitiu identificar uma nova interação entre um NST e uma enzima de glicosylation funcionalmente relacionada9.
A modificação mais recente do ensaio de complementação da luciferase split, NanoBiT, é utilizada no protocolo aqui apresentado. Ela se baseia na reconstituição da enzima luciferase (por exemplo, NanoLuc) dos dois fragmentos - o grande, denominado como BiT grande ou LgBiT, uma proteína de 17,6 kDa, e o pequeno, composto por apenas 11 aminoácidos, denominados como pequenos BiT ou SmBiT. As duas proteínas de interesse são fundidas com os fragmentos complementares e transitavelmente expressas em uma linha celular humana. Se as duas proteínas de fusão interagirem, uma luminescência é produzida in situ após a adição de um substrato permeável celular. Esses dois fragmentos foram otimizados para que se associem à afinidade mínima, a menos que sejam reunidos por uma interação entre as proteínas de interesse a que se fundem.
Em geral, os métodos baseados em bioluminescência têm algumas vantagens sobre os baseados na fluorescência. Os sinais bioluminescentes têm uma maior relação sinal-ruído porque a luminescência de fundo é insignificante em comparação com o sinal derivado da luciferase16. Em contraste, abordagens baseadas em fluorescência geralmente sofrem de um fundo relativamente alto causado pelo fenômeno da autofluorescência. Além disso, a bioluminescência é menos prejudicial às células analisadas do que a fluorescência, pois no primeiro caso não há necessidade de excitar a amostra. Por essas razões, abordagens bioluminescentes para estudar PPIs in vivo superam os métodos fluorescentes comumente usados como Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ou Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC).
Nosso protocolo se baseia em referir a luminescência obtida para a combinação proteica de interesse à luminescência obtida para a combinação de controle. Esta última inclui uma das proteínas testadas que é fundida com um fragmento maior e uma proteína de controle (por exemplo, HaloTag), fundida com um fragmento menor. Esta última é uma proteína de origem bacteriana que não se espera que interaja com nenhuma das proteínas mamíferas. O uso dessa proteína como controle coloca limitações à topologia dos pares de proteínas residentes em Golgi a serem analisados. Uma vez que nas células de mamíferos essa proteína é sintetizada no citoplasma, ambas as proteínas de interesse devem ter pelo menos uma cauda citoplasmática.
Esta abordagem pode ser particularmente útil para a triagem inicial de PPIs. Pode se tornar o método de escolha quando as proteínas de fusão de interesse são expressas em níveis que são simplesmente insuficientes para que outras abordagens sejam aplicadas. Da mesma forma, o ensaio de complementação da luciferase dividido pode ser a melhor opção se as proteínas de interesse forem expressas em níveis elevados, mas isso afeta negativamente sua localização subcelular ou é conhecido por forçar interações não específicas. Como o fragmento menor tem apenas 11 aminoácidos, o ensaio de complementação da luciferase dividido pode ser aplicado ao usar tags maiores é impossível. Por fim, pode ser empregado para confirmar ainda mais os dados obtidos utilizando outras técnicas, como no caso aqui apresentado.
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Protocol
1. Geração de plasmídeos de expressão
- Examine a topologia da membrana das proteínas de interesse usando uma ferramenta de previsão de topologia.
- Projete a estratégia de clonagem para que os fragmentos maiores e menores enfrentem o citoplasma uma vez que as proteínas de fusão tenham sido inseridas nas membranas golgi. Se, como no caso aqui apresentado, tanto n- quanto C-termini das proteínas de interesse são citoplasmicamente orientados, marque as proteínas de oito maneiras possíveis (ver Figura 1B). Se n ou C-terminus de uma ou ambas as proteínas de interesse forem luminally orientadas, exclua-a da marcação.
- Subclone os genes de interesse em vetores de expressão apropriados (ver Tabela de Materiais) seguindo protocolos de clonagem padrão.
NOTA: O teste de todas as orientações possíveis é recomendado, uma vez que algumas opções de marcação podem não funcionar devido à proximidade insuficiente, orientação subótima ou restrições espaciais.
2. Transfecção transitória da expressão plasmídeos nas células
- Colher a cultura celular hek293T aderente por experimentação e resuspensar as células em um meio de crescimento completo dedicado. Coloque as células (2 x 104/100 μL/bem) em uma placa de fundo claro, lado branco de 96 poços. Ajuste o número total de poços para acomodar todas as combinações e controles testados, incluindo réplicas.
NOTA: Tente usar apenas os 60 poços internos da placa para minimizar as mudanças térmicas e evitar a evaporação durante a noite. O uso de placas revestidas de poli-D-lysina é altamente recomendado, como as indicadas na Tabela de Materiais, caso contrário as células podem se desprender durante as etapas subsequentes de lavagem. - Cultura as células durante a noite em condições padrão (37 °C, 5% CO2).
- No dia seguinte transfectam as células com as combinações desejadas de plasmídeos de expressão obtidos no ponto 1.1.
- Plasmídeos de expressão diluídos em um meio livre de soro (ver Tabela de Materiais) a 6,25 ng/μL para cada construção.
- Adicione o reagente de transfecção à base de lipídio em uma proporção lipídica-DNA apropriada e incubar de acordo com a instrução do fabricante.
- Adicione 8 μL de mistura lipídica:DNA aos poços designados. Misture o conteúdo da placa por rotação suave. Isso resulta na transfecção de ambas as construções de expressão a 50 ng/bem.
- Cultura as células por 20-24 h em condições padrão (37 °C, 5% CO2).
NOTA: A colheita das células por mais tempo pode resultar em níveis mais elevados de expressão proteica de fusão, o que pode promover uma associação não específica entre os fragmentos.
3. Troca média
- No dia seguinte substitua o meio condicionado por 100 μL de um meio livre de soro em cada poço. Certifique-se de que as células não se separaram em troca média.
NOTA: Esta etapa deve ser feita 2-3 h antes da adição da solução de trabalho furimazine. A retirada do soro minimiza o fundo causado pela autoluminescência da furimazina.
4. Preparação da solução de trabalho furimazine
- Pouco antes da medição, misture 1 volume de furimazine com 19 volumes de um tampão de diluição (uma diluição de 20 vezes).
NOTA: O volume total da solução de trabalho furimazine a ser preparada depende do número de poços individuais a serem analisados (a solução de trabalho furimazine é adicionada ao meio de cultura celular em uma proporção de 1:5, portanto, a cada poço previamente preenchido com 100 μL de um meio sem soro 25 μL da solução de trabalho furimazine deve ser adicionado). - Adicione a solução de trabalho furimazine aos poços designados (25 μL/well). Misture suavemente a placa à mão ou usando um agitador orbital (por exemplo, 15 s a 300-500 rpm).
5. Medir a luminescência
- Insira a placa em um leitor de microplaca de luminescência.
- Para experimentos que devem ser realizados a 37 °C equilibre a placa por 10-15 min na temperatura indicada.
- Selecione os poços a serem analisados.
- Leia a luminescência com tempo de integração de 0,3 s. Continue monitorando a luminescência por até 2 h quando necessário.
6. Análise de dados
- Calcular valores médios e desvios padrão para todas as combinações testadas e de controle.
- Analise os dados usando ANOVA unidirecional com várias comparações.
- Calcule os valores de alteração do fold dividindo uma luminescência média obtida para combinações de interesse por uma luminescência média obtida para os controles negativos correspondentes. Avalie os resultados.
NOTA: A abordagem da análise de dados aqui proposta pressupõe que a interação pode ser reivindicada se a luminescência obtida para a combinação testada for estatisticamente significativamente maior do que a luminescência obtida para a combinação de controle correspondente e, ao mesmo tempo, a razão desses dois valores excede 10.
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Representative Results
Para obter os dados mais confiáveis nesta abordagem, todas as combinações possíveis devem ser testadas (ver Figura 1). Em paralelo, devem ser incluídos controles positivos e negativos. O controle positivo deve consistir nas duas proteínas que são conhecidas por interagir, das quais uma é fundida com o fragmento maior e a outra é fundida com o fragmento menor. O controle negativo, idealmente, deve consistir nas duas proteínas de membrana tipo III não interagindo marcadas da mesma forma. No entanto, estabelecer tal controle pode ser desafiador, uma vez que a falta de interação das duas proteínas de controle deve ser completamente confirmada usando várias abordagens alternativas. Portanto, pode-se empregar uma proteína citosolica de origem não humana que não se espera que interaja com qualquer proteína humana (por exemplo, HaloTag) como um controle negativo, se N e/ou C-termini das proteínas, cuja interação deve ser determinada, estão citoplasmasticamente expostas como no caso aqui apresentado. Recomendamos uma verificação adicional dos resultados obtidos usando este tipo de controle por co-expressão das variantes não grampeadas de qualquer uma das proteínas de interesse combinadas com a titulação dos plasmídeos correspondentes. Se as duas proteínas interagirem especificamente, uma cópia extra de qualquer uma delas sem o fragmento de luciferase deve resultar em uma diminuição específica da luminescência.
Os valores relativos das Unidades de Luminescência (RLU) típicos de combinações positivas e negativas estão listados na Tabela 1. Os resultados foram obtidos para os dois NSTs, SLC35A2 e SLC35A3, que foram mostrados associados por co-imunoprecipitação e FLIM-FRET6, bem como no ensaio de ligadura de proximidade situ11. Ambas as proteínas de membrana SLC35A2 e SLC35A3 são proteínas de membrana tipo III residentes em Golgi com N- e C-termini voltadas para o citoplasma (Figura 1A). Portanto, existem oito opções possíveis de marcação e as proteínas de fusão resultantes podem ser definidas juntas também de oito maneiras possíveis (Figura 1B). Os valores médios de RLU correspondentes a todas as combinações testadas e de controle são retratados na Figura 2A. O controle positivo também está incluído. Um requisito inicial para que um resultado selecionado seja considerado indicativo de uma interação é que o valor RLU obtido para a combinação de juros é estatisticamente significativamente maior do que o valor RLU obtido para a combinação de controle correspondente. Na Figura 2A são vistas três combinações desse tipo (LgBiT-SLC35A2 + SLC35A3-SmBiT, SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 e SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3). O próximo passo na análise dos resultados envolve a obtenção de valores de razão para as combinações de juros, dividindo os valores correspondentes de RLU por valores RLU obtidos para os respectivos controles. Os resultados dessa análise são mostrados na Figura 2B. De acordo com as sugestões do fabricante, as relações entre 10 e 1000 são altamente indicativas de interações específicas. Existem duas combinações que atendem a esses critérios (SmBiT-SLC35A2 + LgBiT-SLC35A3 e SLC35A2-SmBiT + LgBiT-SLC35A3) e suportam a ideia de que sLC35A2 e SLC35A3 interagem. No entanto, o fato de as outras seis combinações serem negativas não significa que não haja interações entre as respectivas proteínas de fusão, mas sugere que a estratégia de marcação não foi a ideal nesses casos. Este exemplo mostra como é importante testar todas as combinações possíveis.
Os dados apresentados na Figura 2 foram ainda confirmados pela co-expressão do SLC35A2 ou SLC35A3 com a combinação que resultou na maior luminescência relativa, ou seja, SLC35A2-LgBiT + SmBiT-SLC35A3. Quantidades variadas de plasmídeos codificando variantes NST marcadas por HA foram usadas para a co-transfecção. Isso resultou em uma diminuição estatisticamente significativa e dependente de dose nos valores da RLU (Figura 3). A interrupção específica e dependente de dose da interação entre SLC35A2-LgBiT e SmBiT-SLC35A3 pela co-expressão simultânea das variantes NST marcadas por HA é mostrada na Tabela 2.
O problema mais comum associado ao método aqui apresentado é a baixa eficiência da transfecção. Para verificar se esta é a causa dos resultados abaixo do oótimo, inclua controle positivo em todos os experimentos. O controle positivo que utilizamos para obter os dados aqui apresentados consiste nas duas proteínas de fusão interativas: proteína dependente de cAPM quinase subunidade catalítica alfa (PRKACA) fundida com o fragmento menor e proteína dependente de cAPM quinase tipo II-alfa subunidade regulatória (PRKAR2A) fundida com o fragmento maior. Em nossas mãos, o valor RLU correspondente atingiu ~6 x 105. Uma queda significativa (2-3 ordens de magnitude) neste número pode ser indicativa da eficiência subótimal da transfecção realizada. Nesse caso, recomendamos verificar o bem-estar das células cultivadas e certificar-se de que o número apropriado de células está sendo banhado para transfecção.
Figura 1: Esquemas de topologia de membrana e marcação. (A) Topologia de membrana das proteínas SLC35A2 e SLC35A3. (B) Possibilidades de marcação de proteínas SLC35A2 e SLC35A3 com os fragmentos de ensaio de complementação de luciferase split e combinando as proteínas de fusão resultantes para o ensaio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados do ensaio de complementação da luciferase dividido realizado em células HEK293T para as combinações de proteínas selecionadas e os controles negativos correspondentes (dados processados). (A) Valores de RLU obtidos para as combinações de proteínas selecionadas e os correspondentes controles negativos. Negativo, HaloTag marcado com SmBiT; PRKAR2A, subunidade regulatória de proteína dependente da CAPM tipo II-alfa; PRKACA, proteína dependente da CAPM quinase subunidade catalítica alfa. Os dados foram analisados utilizando-se ANOVA unidirecional com múltiplas comparações e apresentados como um desvio padrão ± (SD) de três réplicas técnicas. p < 0,1 *, p < 0,05 **, p < 0,01 ***. (B) Alterações do fold calculadas dividindo uma luminescência média obtida para a combinação testada (RLU SAMPLE) por uma luminescência média obtida para o controle negativo correspondente (RLU CONTROL). O valor do limiar considerado indicativo de uma interação foi definido em 10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Interrupção específica e dependente de dose da interação entre SLC35A2-LgBiT e SmBiT-SLC35A3 por co-expressão simultânea das variantes NST com marca HA. As células HEK293T foram transfeinadas com plasmídeos codificando SLC35A2-LgBiT e SmBiT-SLC35A3 e, adicionalmente, com um plasmídeo pSelect vazio (mock) ou com quantidades crescentes de plasmídeos pSelect codificando SLC35A2 (painel esquerdo) e SLC35A3 (painel direito). Os dados foram analisados utilizando-se ANOVA unidirecional com múltiplas comparações e apresentados como um desvio padrão ± (SD) de três réplicas técnicas. p < 0,05 **, p < 0,001 ****. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Resultados do ensaio realizado em células HEK293T para as combinações de proteínas selecionadas e os controles negativos correspondentes (dados brutos). Valores RLU não processados obtidos para as combinações de proteínas selecionadas e os controles negativos correspondentes são mostrados. Negativo, HaloTag marcado com SmBiT; PRKAR2A, subunidade regulatória de proteína dependente da CAPM tipo II-alfa; PRKACA, proteína dependente da proteína cAPM quinase subunnit catalítico alfa, TR, réplica técnica. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Interrupção específica e dependente de dose da interação entre SLC35A2-LgBiT e SmBiT-SLC35A3 por co-expressão simultânea das variantes NST com marca HA (dados brutos). São mostrados valores RLU não processados obtidos para as combinações de proteínas selecionadas. Simulados, células expressando SLC35A2-LgBiT e SmBiT-SLC35A3 co-transfilidas com um vetor pSelect vazio; HA-SLC35A2, células expressas SLC35A2-LgBiT e SmBiT-SLC35A3 co-transfetídas com as quantidades indicadas de uma codificação plasmida pSelect SLC35A2 marcada com o epítope HA no N-terminus; HA-SLC35A3, células expressas SLC35A2-LgBiT e SmBiT-SLC35A3 co-transfiliram com as quantidades indicadas de uma codificação plasmida pSelect SLC35A3 marcada com o epítope HA no N-terminus; TR, replicação técnica. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Aqui fornecemos um protocolo detalhado que permite a demonstração de complexos heterologos formados entre proteínas de membrana tipo III residente em Golgi, como NSTs, utilizando o ensaio de complementação da luciferase split. A abordagem proposta para análise e interpretação de dados envolve relacionar a luminescência obtida para a combinação proteica de interesse à luminescência obtida para a combinação de controle correspondente, que é composta por uma das proteínas de interesse fundidas com o fragmento maior e a proteína de controle de uma origem bacteriana fundida com o fragmento menor. Este último é expresso no citoplasma das células mamíferas; portanto, usá-lo como referência requer que n-e/ou C-termini das proteínas, cuja interação deve ser analisada, estejam no lado citoplasmado da membrana Golgi.
Os passos críticos do protocolo são o design plasmídeo, o revestimento das células a serem transfeccionadas, a transfecção em si, a troca média, a preparação da solução de trabalho furimazine e a adição às células. O design plasmídeo deve ser feito de tal forma que ambos os fragmentos de luciferase estejam voltados para o citoplasma, caso contrário as combinações de controle não funcionarão e os valores de referência RLU estarão faltando. As células a serem transfeccionadas devem ser banhadas conforme especificado no protocolo, caso contrário, a eficiência de transfecção pode ser subótimal. Recomendamos o uso de placas multiwell com a superfície revestida de poli-L-lysina para suportar o acessório celular enquanto o meio está sendo trocado. Finalmente, a solução de trabalho furimazine deve ser recém-preparada e imediatamente adicionada às células. Uma vez adicionado, a leitura deve ser realizada o mais rápido possível.
Para evitar resultados inconclusivos, devem ser sempre incluídos controles positivos e negativos. O controle positivo deve ser sempre utilizado para que a eficiência da transfecção seja monitorada. É muito importante que todas as proteínas de fusão possíveis que são topologicamente compatíveis entre si, bem como com o controle negativo baseado em HaloTag sejam geradas e combinadas. Se possível, deve ser utilizado o controle negativo composto por uma proteína de membrana que não interage com nenhuma das proteínas de interesse. Aqui, não empregamos tal controle, pois seu desenvolvimento ainda está a caminho. Em vez disso, forçamos uma desmontagem específica dos complexos de interesse, co-expressando uma cópia extra e não grampeada de uma das proteínas analisadas. Os vetores de expressão que usamos carregam o promotor de herpes simplex relativamente fraco-thymidine quinase (HSV-TK), que garante baixos níveis de expressão que são ideais para obter resultados específicos. No entanto, no caso de resultados subótimos, pode ser benéfico usar os vetores baseados em CMV ou, alternativamente, otimizar a quantidade de plasmídeos utilizados para transfecção.
O método apresentado, embora poderoso e conveniente, tem algumas limitações. Em primeiro lugar, este método não permite concluir se os complexos identificados correspondem a dimers ou oligômeros de alta ordem. Além disso, a localização subcelular das proteínas interativas não pode ser monitorada. Isso é, no entanto, possível após a extensão do protocolo básico com imagens bioluminescentes, embora a resolução espacial de tais imagens seria significativamente menor quando comparada com abordagens baseadas em fluorescência.
O método apresentado é muito rápido e eficiente (a medição leva até vários minutos e os dados são obtidos a partir de milhares de células). O processamento e interpretação de dados também é relativamente simples. Pouca ou nenhuma otimização do protocolo básico é necessária. O único equipamento específico necessário é um luminômetro. O ensaio de complementação da luciferase dividida e o BiFC trabalham com o mesmo princípio essencial, ou seja, a reconstituição de uma proteína funcional de seus fragmentos não funcionais. As vantagens gerais das abordagens baseadas em bioluminescência sobre as baseadas na fluorescência já estavam listadas na Introdução. Uma vantagem específica do ensaio de complementação da luciferase dividido sobre o BiFC é que o primeiro é totalmente reversível15. No BiFC, uma vez que uma proteína fluorescente é reconstituída, ela não se dissociaria de volta aos fragmentos não fluorescentes correspondentes17. Em contraste, a montagem das subunidades NanoLuc é reversível, o que cria uma oportunidade única para estudar a dinâmica dos PPIs. Finalmente, a sensibilidade excepcional do método apresentado permite assumir que essa abordagem deve funcionar mesmo com as linhas celulares de difícil transfeto.
O protocolo aqui apresentado permite determinar se as duas proteínas de membrana tipo III residentes em Golgi interagem. Como já mencionado, a configuração básica do método pode ser acoplada com imagens de bioluminescência para confirmar a localização subcelular do PPI de interesse. A reversibilidade desse ensaio de complementação de luciferase dividido permite estudar a dinâmica dos PPIs em tempo real. O sinal luminescente derivado da furimazina é mantido por cerca de 2 horas. No entanto, substratos para o ensaio de complementação da luciferase dividido garantindo uma duração substancialmente maior (horas a dias) do sinal resultante também estão disponíveis. Este método permite a identificação dos fatores que acionam ou impedem o PPI de interesse. Alguns dos exemplos mais recentes de sua aplicação incluem estudos sobre interações entre proteínas G e receptores acoplados à proteína G18, alterações conformais de proteína19, ubiquitina de proteína20, internalização dos receptores de superfície celular21 e identificação de fatores que modulam OS22,23. Portanto, este método parece ser uma ferramenta versátil com alto potencial para cumprir metas experimentais ainda muito desafiadoras.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela concessão nº 2016/23/D/NZ3/01314 do Centro Nacional de Ciência (NCN), Cracóvia, Polônia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
References
- Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
- Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
- Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
- Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
- Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
- Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
- Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
- Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657 (2019).
- Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599 (2020).
- Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).
- Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
- Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
- Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
- Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Inoue, A., et al.
- White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
- Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
- Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
- Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275 (2020).
- Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).
