Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

زرع تحت الشبكية لأنسجة الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في نموذج حيواني كبير للقطط

Published: August 5, 2021 doi: 10.3791/61683
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1
1College of Veterinary Medicine, Department of Small Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Lineage Cell Therapeutics, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

تظهر هنا تقنية جراحية لزرع أنسجة شبكية مشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) في الفضاء تحت الشبكية لنموذج حيواني كبير.

Abstract

تتسبب الحالات التنكسية للشبكية (RD) المرتبطة بفقدان مستقبلات الضوء مثل التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) والتهاب الشبكية الصباغي (RP) وداء ليبر الخلقي (LCA) في فقدان البصر التدريجي والمنهك. هناك حاجة غير ملباة للعلاجات التي يمكن أن تعيد الرؤية بمجرد فقدان المستقبلات الضوئية. إن زرع أنسجة الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) (المواد العضوية) في الفضاء تحت الشبكية للعين باستخدام RD المتقدم يجلب صفائح أنسجة الشبكية مع الآلاف من المستقبلات الضوئية الصحية الخالية من الطفرات ولديه القدرة على علاج معظم / جميع الأمراض المسببة للعمى المرتبطة بتنكس المستقبلات الضوئية ببروتوكول واحد معتمد. تم تطوير زرع أنسجة شبكية الجنين في الفضاء تحت الشبكية للنماذج الحيوانية والأشخاص الذين يعانون من RD المتقدم بنجاح ولكن لا يمكن استخدامه كعلاج روتيني بسبب المخاوف الأخلاقية ومحدودية إمدادات الأنسجة. تعتبر النماذج الحيوانية لتنكس الشبكية الموروث للعين الكبيرة (IRD) ذات قيمة لتطوير علاجات استعادة الرؤية باستخدام الأساليب الجراحية المتقدمة لزرع خلايا / أنسجة الشبكية في الفضاء تحت الشبكية. إن أوجه التشابه في حجم الكرة الأرضية ، وتوزيع المستقبلات الضوئية (على سبيل المثال ، وجود منطقة مركزية تشبه البقعة) وتوافر نماذج IRD التي تلخص عن كثب IRD البشري من شأنه أن يسهل الترجمة السريعة للعلاج الواعد إلى العيادة. تظهر هنا تقنية جراحية لزرع أنسجة شبكية مشتقة من hPSC في الفضاء تحت الشبكية لنموذج حيواني كبير يسمح بتقييم هذا النهج الواعد في النماذج الحيوانية.

Introduction

يتأثر ملايين الأشخاص حول العالم بتنكس الشبكية (RD) مع ضعف البصر الناتج أو العمى المرتبط بفقدان المستقبلات الضوئية المستشعرة للضوء (PRs). التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) هو سبب رئيسي للعمى الناتج عن مجموعة من عوامل الخطر الوراثية والعوامل البيئية / نمط الحياة. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على أكثر من 200 جين وموضع تسبب RD الموروث (IRD) 1. التهاب الشبكية الصباغي (RP) ، وهو IRD الأكثر شيوعا ، غير متجانس وراثيا مع أكثر من 3000 طفرة جينية في حوالي 70 جينا تم الإبلاغ عنها2،3،4. Leber Congenital Amaurosis (LCA) ، الذي يسبب العمى في مرحلة الطفولة هو أيضا غير متجانس وراثيا 5,6. تم تطوير علاج زيادة الجينات وهو في التجارب السريرية لعلاج عدد صغير من IRDs 3,7. ومع ذلك ، يجب تطوير علاج منفصل لعلاج كل شكل وراثي مميز من IRD وبالتالي علاج مجموعة فرعية صغيرة فقط من المرضى. علاوة على ذلك ، تعتمد زيادة الجينات على وجود مجموعة من المستقبلات الضوئية القابلة للإنقاذ ، وبالتالي فهي لا تنطبق على التنكس المتقدم.

لذلك ، هناك حاجة سريرية ملحة وغير ملباة بعد لتطوير علاجات تعالج وتعالج RDs المتقدمة والعمى العميق إلى النهائي. على مدى العقدين الماضيين ، تم تطوير الغرسات الاصطناعية العصبية واختبارها في نماذج حيوانية كبيرة ، مثل القط ، قبل الاستخدام البشري8،9،10،11،12،13،14. وبالمثل ، في السنوات ال 20 الماضية ، تم تطوير علاجات استبدال الشبكية باستخدام صفائح من شبكية العين الجنينية أو حتى الناضجة للثدييات المطعمة تحت الشبكية 15،16،17،18،19،20،21،22 وحتى تم اختبارها بنجاح في مرضى RD 23،24،25. يستخدم كلا النهجين فكرة إدخال مستشعرات جديدة (الثنائيات الضوئية السيليكونية الكهروضوئية في حالة الأجهزة العصبية التعويضية26،27 ، والمستقبلات الضوئية الصحية الخالية من الطفرات المنظمة في صفائح ، في حالة زرع صفائح الشبكية) في شبكية العين مع العلاقات العامة المتدهورة. بحثت الدراسات الحديثة في استخدام الأساليب القائمة على الخلايا الجذعية مثل زرع أسلاف الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC)28،29 ، ومستقبلات hPSCالضوئية 30 ، وعضويات hPSC الشبكية31،32،33. تمكن عضويات الشبكية من تكوين أنسجة الشبكية في طبق واشتقاق صفائح مستقبلات الضوء مع الآلاف من العلاقات العامة الخالية من الطفرات ، والتي تشبه طبقة مستقبلات الضوء في شبكية العين الجنينية البشرية النامية34،35،36،37،38،39،40. يعد زرع أنسجة الشبكية المشتقة من hPSC (المواد العضوية) في الفضاء تحت الشبكية للمرضى الذين يعانون من حالات RD أحد أساليب العلاج بالخلايا البحثية الجديدة والواعدة ، والتي يتبعها عدد من الفرق 31،32،41،42. بالمقارنة مع زرع معلق الخلية (للمستقبلات الضوئية الشابة أو أسلاف الشبكية) ، ثبت أن الأوراق المزروعة من المستقبلات الضوئية الجنينية تؤدي إلى تحسينات في الرؤية في التجارب السريرية23،24.

يصف البروتوكول المقدم هنا ، بالتفصيل ، إجراء زرع لتوصيل الشبكية تحت الشبكية لعضويات الشبكية بأكملها (بدلا من الحافات العضوية33,41) كطريقة أفضل محتملة لإدخال صفائح شبكية سليمة مع العلاقات العامة ، لزيادة بقاء الكسب غير المشروع وتحسين الحفاظ على الورقة. على الرغم من أنه تم تطوير إجراءات إدخال قطعة مسطحة من شبكية العين البشرية وكذلك بقع RPE43،44،45 ، لم يتم التحقيق في زرع الطعوم ثلاثية الأبعاد الأكبر. توفر عضويات الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية مصدرا لا ينضب من صفائح المستقبلات الضوئية لتطوير تقنيات استعادة الرؤية ، وهي خالية من القيود الأخلاقية ، وتعتبر مصدرا ممتازا لأنسجة الشبكية البشرية للعلاجات التي تركز على علاج RD المتقدم والعمى النهائي46. يعد تطوير الأساليب الجراحية للزرع الدقيق تحت الشبكية لعضويات الشبكية مع الحد الأدنى من إصابة مكانة الشبكية المضيفة (الشبكية العصبية ، ظهارة الشبكية الصبغية والشبكية والأوعية الدموية المشيمية) إحدى الخطوات الحاسمة لتطوير هذا العلاج نحو التطبيقات السريرية31،32. أثبتت النماذج الحيوانية الكبيرة مثل القطط والكلاب والخنازير والقرود أنها نماذج جيدة للتحقيق في طرق التسليم الجراحي وكذلك لإثبات سلامة صفائح الأنسجة المزروعة (خلايا ظهارة الشبكية الصبغية (RPE)) والتحقيق في استخدام المواد العضوية41،44،45،47،48،49،50. عين الحيوان الكبيرة لها حجم كرة أرضية مشابه للإنسان بالإضافة إلى تشريح مشابه بما في ذلك وجود منطقة ذات كثافة عالية لمستقبلات الضوء ، بما في ذلك المخاريط (المنطقة المركزية) ، تشبه البقعة البشرية6،51،52.

في هذه المخطوطة ، تم وصف تقنية لزرع أنسجة الشبكية المشتقة من hPSC (المواد العضوية) في الفضاء تحت الشبكية لنماذج الحيوانات الكبيرة القطط (كل من القطط البرية و CrxRdy / + ) ، والتي ، جنبا إلى جنب مع نتائج الفعالية الواعدة32،53 يبني أساسا لمزيد من التطوير لمثل هذا العلاج البحثي نحو التطبيقات السريرية لعلاج حالات RD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء الإجراءات وفقا لبيان جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية. كما تمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة ولاية ميشيغان. تم استخدام القطط من النوع البري و CrxRdy / + من مستعمرة من القطط التي تم الاحتفاظ بها في جامعة ولاية ميشيغان في هذه الدراسة. تم إيواء الحيوانات تحت 12 ساعة: 12 ساعة دورات الضوء والظلام وتغذت على نظام غذائي تجاري كامل للقطط.

1. إجراءات ما قبل الزرع والإعداد الجراحي

  1. حدد القطط من النوع البري أو CrxRdy / + اعتمادا على تصميم الدراسة. إجراء فحص العيون قبل الجراحة ، بما في ذلك الفحص المجهري الحيوي للمصباح الشقي وتنظير العين غير المباشر. استبعاد أي بها تشوهات في قاع العين لا تتعلق بأنماطها الوراثية.
  2. قبل أسبوع واحد من الزرع ، ابدأ الحيوانات في بروتوكول مثبط للمناعة من السيكلوسبورين الفموي 2 مجم / كجم وبريدنيزولون 1 مجم / كجم مرتين يوميا للمساعدة في منع رفض الزرع.
  3. صوم الحيوانات التي يزيد عمرها عن 4 أشهر بين عشية وضحاها (8 ساعات على الأقل). قدم كمية محدودة من الطعام الرطب طوال الليل للحيوانات التي يقل عمرها عن 4 أشهر ، ثم قم بصيامها لمدة 2 ساعة قبل الجراحة.
  4. إجراء فحص بدني عام ، بما في ذلك تسمع الصدر (باستخدام سماعة الطبيب). سجل معدل ضربات القلب والتنفس ودرجة الحرارة ولون الغشاء المخاطي ووقت إعادة ملء الشعيرات الدموية.
  5. قبل علاج الحيوانات أقل من 4 أشهر من العمر مع البوبرينورفين (0.02 ملغ / كغ) ، وأولئك الذين تزيد أعمارهم عن 4 أشهر مع البوبرينورفين (0.02 ملغ / كغ) جنبا إلى جنب مع الاسيبرومازين (0.02 ملغ / كغ) تحت الجلد أو في العضل 30-45 دقيقة قبل تحريض التخدير العام.
  6. ضع محلول تروبيكاميد موضعي للعيون بنسبة 1٪ ومحلول فينيليفرين للعيون بنسبة 10٪ على سطح العين مرتين على الأقل لتوسيع حدقة العين. كرر إذا لم يتم توسيع حدقة العين بشكل جيد.
  7. ضع قسطرة وريدية 22 G في الوريد الرأسي في جميع الحيوانات: أول قص الشعر من منطقة 2 × 3 سم فوق الوريد الرأسي. تحضير الجلد عن طريق فركه أولا بنسبة 70٪ من الإيثانول ثم باستخدام مقشر الكلورهيكسيدين ؛ ضع القسطرة وثبتها بشريط طبي واغسلها بمحلول ملحي هيبارين. في الحيوانات أقل من 4 أشهر ، يمكن القيام بذلك بعد تحريض التخدير.
  8. تحفيز التخدير العام بعد 30-45 دقيقة من التخدير المسبق: يتم تحفيز الحيوانات التي تقل أعمارها عن 4 أشهر باستخدام الأيزوفلوران الذي يتم إعطاؤه بواسطة القناع ، ويتم تحفيز الحيوانات التي تزيد أعمارها عن 4 أشهر باستخدام البروبوفول الوريدي (4-6 ملغ/كغ).
  9. التنبيب مع حجم مناسب من أنبوب القصبة الهوائية. تصور الحنجرة باستخدام ضوء الفحص أو منظار الحنجرة. رش 0.1 مل من يدوكائين 2٪ على الحنجرة ، وانتظر بضع ثوان ثم قم بالتنبيب.
  10. الحفاظ على التخدير باستخدام الأيزوفلوران (بين 2٪ - 3.5٪) في الأكسجين (300-600 مل / كجم / دقيقة) عبر نظام Bain.
  11. ضع الحيوان في راقد ظهري على وسادة تحديد المواقع التي يتم وضع بطانية ماء ساخن مغطاة بالمناشف عليها. قم بتوصيل جهاز مراقبة المريض ومراقبة معدل ضربات القلب ومخطط كهربية القلب (ECG) ومعدل التنفس وضغط الدم وتشبع الأكسجين وثاني أكسيد الكربون في نهاية المد والجزر. مراقبة درجة حرارة الجسم بانتظام أثناء العملية. الشخص المدرب بشكل مناسب مسؤول عن صيانة ومراقبة التخدير.
  12. ضع الحيوان بمساعدة وسادة تحديد المواقع بحيث يكون سطح القرنية أفقيا عندما يتم تدوير العين في وضع النظرة الأولية. ثبت الرأس في مكانه باستخدام شريط طبي.
  13. قم بتغطية الحيوان بالبطانيات للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة الجسم.
  14. اغسل القسطرة الوريدية بمحلول ملحي هيبارين وابدأ في التسريب الوريدي لاكتات رينغر الموردة بمعدل 2-5 مل / كجم / ساعة طوال مدة الإجراء.
  15. قم بإعداد سطح العين وكيس الملتحمة والجفون للجراحة المعقمة باستخدام 0.2٪ بوفيدون اليود وأدوات تطبيق مسحة القطن المعقمة وكرات القطن.
  16. ضع مجهر التشغيل مع تعديل العدسات أيضا بشكل مناسب. ضع التحكم في القدم للمجهر (التركيز والتكبير والتحكم في المحور XY) وآلة استئصال الزجاجية بحيث يمكن للجراح تشغيلها.
  17. الاستعداد للجراحة المعقمة: يجب على جميع الأفراد ارتداء الدعك الجراحية وقبعة جراحية وقناع. تأكد من أن الجراح والمساعد (المساعدين) ينظفون ويرتدون الرداء والقفاز كما هو الحال في الجراحة المعقمة الروتينية. يجب أن يكون جميع الموظفين على دراية بتقنيات التعقيم.
  18. بمجرد تنظيف الأفراد ، وارتداء الملابس ، وارتداء الملابس ، افتح العبوات الجراحية ، وضع الأدوات. ضع مقابض معالجة معقمة على مقابض ضبط المجهر للسماح للجراح أو المساعد بالتعديل دون كسر التعقيم. ثنى الحيوان بطريقة روتينية لجراحة العين.
  19. قم بإعداد آلة استئصال الزجاجية باتباع تعليمات الشركة المصنعة لاستئصال الزجاجية ثنائي المنفذ.
    1. ضع عدسة لاصقة لاستئصال الزجاجية ومنفذين لاستئصال الزجاجية 23 G على طاولة المساعد. نعلق الكي الحقل الرطب. قم بتوصيل وتجهيز أنبوب التسريب وقبضة استئصال الزجاجية 23 G.
    2. ضع أدوات استئصال الزجاجية وخطوط السوائل فوق الستارة المعقمة وحافظ عليها في موضعها باستخدام مشابك المنشفة. اضبط آلة استئصال الزجاجية في وضع الفراغ النسبي بين 1500 و 2500 عملية قطع في الدقيقة (CPM) وأقصى تفريغ يبلغ 500 مم زئبق. يتم تنفيذ ذلك عن طريق الضغط على أزرار الأسهم (لأعلى أو لأسفل) الموجودة على اللوحة الأمامية لجهاز استئصال الزجاجية.

2. تحضير المواد العضوية لزرع تحت الشبكية (الشكل 1)

  1. اشتق عضويات الشبكية كما هو موضح سابقا31 ، وإذا لزم الأمر ، اشحنها طوال الليل عند 37 درجة مئوية كما ورد سابقا54.
  2. امسح الأسطح في غرفة زراعة الأنسجة في المختبر المتلقي بمطهر وحافظ على نفس المستوى العالي من تقنية التعقيم كما هو الحال في الجناح الجراحي لجراحات العين ، لتجنب التلوث البكتيري أو الفطري ، وانتقل إلى غرفة الجراحة لتجنب عدوى موقع الجراحة.
  3. ارتداء أغطية الأحذية الجراحية ، ومعاطف المختبر التي تستخدم لمرة واحدة ، وأغطية الرأس ، والأقنعة الجراحية ، والأكمام ، والدعك الجراحي داخل غرفة زراعة الأنسجة المخصصة لإعداد الأعضاء لجراحات العين.
  4. قم بموازنة الوسائط العصبية مسبقا مع 20 نانوغرام / مل من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) و 20 نانوغرام / مل من عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) لمدة 1 ساعة في حاضنة زراعة الأنسجة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2). ضع المواد العضوية في الوسائط في ألواح التصاق منخفضة للغاية باستخدام ما يقرب من ربع حجم الوسط المكيف (من الشحن الليلي) وثلاثة أرباع حجم الوسط الطازج31,54. الحفاظ على لمدة 24-48 ساعة.
  5. قم بإعداد وموازنة عدة ألواح جديدة مقاس 60 مم مع وسط عصبي (كما تم تحضيره في الخطوة 2.4) لمدة 1 ساعة على الأقل في حاضنة زراعة الأنسجة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) قبل تخدير الحيوان الأول. لاحظ أن هذه اللوحات تستخدم لنقل المواد العضوية لكل عملية جراحية فردية ، مع افتراض أنه سيتم الحفاظ على ظروف الأس الهيدروجيني وتشبع CO2 في الوسائط لمدة 20 دقيقة على الأقل ، وهو ما يكفي لنقل اللوحة إلى غرفة الجراحة وتحميل المواد العضوية في القنية.
  6. استخدم صفيحة جديدة مقاس 60 مم مع وسائط عصبية مشبعة مسبقا لكل حالة زرع ، مع الحفاظ على الألواح المتبقية في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية.
  7. انقل 6-9 عضويات إلى طبق واحد مقاس 60 مم (مع وسائط معاد تشبعها) عن طريق سحبها باستخدام ماصة يدوية أحادية القناة (20-200 ميكرولتر) مع طرف مرشح معقم سعة 200 ميكرولتر له فتحة واسعة (~ 0.7 مم). يمكن تحضير هذه النصائح مسبقا أو أثناء الإجراء عن طريق قص ~ 3-4 مم من الطرف بمقص معقم (يتم إجراؤه في غطاء زراعة الأنسجة لتجنب التلوث). ضع الطبق مقاس 60 مم داخل طبق زراعة الأنسجة مقاس 100 مم (لتجنب التلوث أثناء النقل من غرفة إلى غرفة) وانقله بسرعة إلى جناح الجراحة.
  8. ضع الطبق مع المواد العضوية على وسادة تسخين كهربائية 37 درجة مئوية مغطاة بستارة معقمة.
  9. قم بالتغيير إلى زوج جديد من القفازات المعقمة قبل تحضير المواد العضوية.
  10. شطف المواد العضوية في محلول ملح متوازن معقم (BSS) (اختياري) ، ثم قم بتحميله في الحاقن ، والذي يتكون من قنية زجاجية من البورسليكات رقيقة الجدران (القطر الخارجي ، OD 1.52 مم ؛ القطر الداخلي ، معرف 1.12 مم) مع نهاية حادة مصقولة متصلة بأنبوب بلاستيكي معقم إلى حقنة هاملتون معقمة سعة 500 ميكرولتر مملوءة مسبقا ب BSS معقم.
  11. مرر القنية إلى الفريق الجراحي بطريقة معقمة عندما يكونون مستعدين لحقن المواد العضوية.
  12. حافظ على طول الإجراء بأكمله (من إزالة المواد العضوية من وسائط زراعة الأنسجة إلى تحميل القنية) إلى 20 دقيقة أو أقل.
  13. إذا كان هناك تأخير في زرع المواد العضوية ، ضعها مرة أخرى في حاضنة زراعة الأنسجة ، لتجنب التغيرات في تشبع الأس الهيدروجيني / CO2 داخل الطبق.
  14. الاحتفاظ بالمواد العضوية غير المستخدمة لمدة 1 أسبوع في نفس حاضنة زراعة الأنسجة ومراقبة أي دليل على التلوث.

3. زرع المواد العضوية تحت الشبكية

  1. قم بإجراء بضع الكانتوميل الجانبي 0.5-1 سم باستخدام مقص ستيفنز للوتر. ضع منظار جفن باراكير بحجم مناسب لإبقاء الجفون مفتوحة. تأكد من أن المساعد الجراحي يروي القرنية بانتظام باستخدام BSS طوال مدة الإجراء.
  2. ضع 2 خيوط إقامة من 6-0 خياطة حريرية في الملتحمة المجاورة مباشرة للطرف في مواضع الساعة 4 و 8 لإبقاء العين في النظرة الأولية وسحب الجفن الثالث. استخدم 0.5 ملقط ربط القرنية Castroviejo ومرقئ صغير للبعوض للإمساك بلطف بالملتحمة البصلية بجوار الطرف. اترك الغرز طويلة وقم بتثبيت الأطراف باستخدام مرقئ البعوض الصغير للمساعدة في التلاعب بها.
    ملاحظة: وضع الخيط تحت الجفن الثالث أكثر صعوبة. تأكد من وضعه بجوار الحافة مباشرة.
  3. ضع خيطا آخر في موضع الساعة 12 عند الحافة جزئيا من خلال سمك الحافة مع الحرص على عدم اختراق العين. عقدة هذا خياطة فضفاضة وقطع نهايات قصيرة. يوفر هذا خياطة مرساة قوية ، والتي تستخدم أثناء الجراحة ك "مقبض" لتدوير العين للسماح للجراح بالوصول إلى أجزاء مختلفة من الكرة الأرضية خلال مراحل مختلفة من الإجراء.
    ملاحظة: يمكن عكس الخطوتين 3.2 و3.3. تسلسل وضع خيوط البقاء هو تفضيل الجراح.
  4. تعكس الملتحمة البصلية بين الساعة 10-2 (محيط). باستخدام مقص بضع الوتر ، شق الملتحمة 2-3 مم من الطرف. تقويضها ومسح كبسولة تينون لفضح الصلبة في مواقع منافذ استئصال الزجاجية الساعة 2 و 10 ، والتي سيتم وضعها على بعد حوالي 3-5 مم من النسيان اعتمادا على عمر الحيوان. استخدم رماح السليلوز الجراحية للإرقاء ولإزالة أي دم.
  5. تحديد مواقع بضع التصلب بعد انعكاس الملتحمة وكبسولة تينون باستخدام الفرجار. اختر مواقع بضع التصلب (عند الساعة 2 و 10 بهدف المرور عبر pars plana) ، لتجنب الأوعية الصلبة الرئيسية التي يمكن أن تكون بارزة في القط. استخدم الكي في المجال الرطب على الصلبة في مواقع بضع الصلبة المخطط لها لتقليل نزيف الصلبة ، والتخطيط لمنطقة ~ 3 مم في منفذ الجهاز (منفذ الساعة 10 للجراح الأيمن) حيث سيتم تكبير هذا بعد استئصال الزجاجية للسماح بإدخال قنية الزرع.
  6. ضع خيوط النمط الصليبي مسبقا (6-0 أو 7-0 خياطة بوليجلاكتين) دون ربط العقدة في موقع عمليات استئصال التصلب المقترحة قبل وضع منافذ استئصال الزجاجية.
    ملاحظة: هذا يسهل الإغلاق السريع لعمليات التصلب في نهاية الإجراء. يحتاج خياطة منفذ الجهاز المخطط له إلى لدغة أطول من الصلبة لأن هذا سيكون شقا طويلا.
  7. بمجرد وضع الغرز ، اطلب من المساعد المساعدة في وضع الكرة الأرضية عن طريق الإمساك بخيوط الساعة 12 عن طريق ربط أو استخدام ملقط Bishop-Harmon. دع الجراح يثبت الكرة الأرضية أيضا ، باستخدام ملقط Castroviejo 0.12 مم لتثبيت الأنسجة بجوار موقع بضع التصلب.
    1. أدخل منفذ استئصال الزجاجية 23 G باستخدام مبزل من خلال الصلبة في كل من موضع الساعة 2 والساعة 10 موجه بزاوية نحو العصب البصري لتجنب ملامسة العدسة.
    2. تأكد من أن منفذ الري في الجسم الزجاجي عن طريق الضغط برفق على المنفذ باستخدام ملقط ربط بحيث يمكن تصور الطرف في الجسم الزجاجي. بمجرد تأكيد الموضع الصحيح ، قم بتوصيل خط الري بالمنفذ وضع الخط باستخدام ضمادات لاصقة رفيعة لتثبيته في مكانه. اضبط ضخ استئصال الزجاجية للمخزن المؤقت BSS مبدئيا عند 30-35 مم زئبق بالضغط على أزرار الأسهم (لأعلى أو لأسفل) الموجودة على اللوحة الأمامية لجهاز استئصال الزجاجية.
  8. دع المساعد يحمل عدسة استئصال الزجاجية المكبرة للري من Machemer على القرنية للسماح بتصور الجزء الخلفي من العين خلال المراحل التالية. قم بتوصيل عدسة استئصال الزجاجية المروية بمجموعة بالتنقيط لتوفير إمداد مستمر بالسوائل لإقران العدسة بالقرنية.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام أشكال أخرى من عدسات استئصال الزجاجية اللاصقة. قم بتعتيم أو إطفاء أضواء الغرفة للمساعدة في التصور من خلال مجهر التشغيل.
  9. أدخل مسبار / قاطع استئصال الزجاجية 23 G (2500 نسخة في الدقيقة) من خلال منفذ الجهاز (بجوار اليد المهيمنة للجراح ، أي منفذ الساعة 10 للجراح الأيمن) وقم بإجراء استئصال الزجاجية الأساسية الجزئية.
    1. بعد ذلك ، قم بإزالة الجسم الزجاجي تماما من سطح الشبكية في المنطقة التي ستتلقى عملية الزرع (وهذا مهم لنجاح الإجراء) عن طريق فصل الوجه الزجاجي عن شبكية العين.
    2. ضع مسبار استئصال الزجاجية فوق رأس العصب البصري بحيث يكون المنفذ مواجها بعيدا عن سطح الشبكية وقم بتطبيق فراغ أعلى لبدء انفصال الوجه الزجاجي.
  10. تحضير بلورات تريامسينولون للاستخدام داخل العين. إذا لم يكن تعليق تريامسينولون مخصصا للاستخدام داخل الجسم الزجاجي ، اغسل البلورات ثم أعد تعليقها في BSS.
    1. في البداية ، قم بتصفية التعليق بمساعدة مرشح حقنة مسام معقم 0.22 ميكرومتر مع غشاء PES (متصل بحقنة 1 مل) لاحتجاز البلورات.
    2. ثم اغسل بلورات التريامسينولون المحاصرة عن طريق استنشاق BSS في حقنة 1 مل والتنظيف عبر المرشح (تظل البلورات محاصرة في الفلتر). هذا يزيل المواد الحافظة في الحل. كرر الغسيل 3 مرات وبعد ذلك يتم إعادة تعليق البلورات في 1 مل BSS.
  11. أدخل إبرة المحقنة التي تحمل التريامسينولون من خلال منفذ الجهاز. احرص على عدم لمس العدسة من خلال مشاهدة طرف الإبرة من خلال التلميذ أثناء إدخال الإبرة من خلال منفذ الجهاز. حقن 0.25 إلى 0.5 مل من تعليق الكريستال. ثم أدخل مسبار استئصال الزجاجية من خلال منفذ الجهاز وقم بدفعه بالقرب من رأس العصب البصري مع المنفذ بعيدا عن سطح الشبكية واستخدم فراغا عاليا للمساعدة في فصل الوجه الزجاجي عن الشبكية.
    ملاحظة: تلتصق بلورات تريامسينولون بالجسم الزجاجي المتبقي وبالتالي تبرزه. قم بإزالة أي جسم زجاجي بعناية أعلى وبجوار موقع زرع الأعضاء المخطط له (على سبيل المثال ، قاع الشريط المركزي بالقرب من المنطقة المركزية ).
  12. قم بإنشاء فقاعة انفصال شبكية بؤرية صغيرة في موقع الزرع المطلوب باستخدام حاقن تحت الشبكية ، على سبيل المثال ، حاقن تحت الشبكية 23 G مع قنية 41 G قابلة للتمديد متصلة بحقنة قفل Luer محكمة الغاز معقمة سعة 250 ميكرولتر مملوءة ب BSS معقم.
    1. قبل إنشاء الفقاعة تحت الشبكية ، قلل ضغط التسريب إلى 10 مم زئبق لتسهيل تكوين الفقاعة.
    2. أدخل الحاقن من خلال منفذ الجهاز وقم بدفعه نحو سطح الشبكية. قذف طرف القنية واضغط عليه برفق على سطح الشبكية. اطلب من المساعد إعطاء دفعة سريعة طفيفة على مكبس المحقنة لبدء انفصال الشبكية الذي يقلل من ضغط الحقن للسماح بزيادة بطيئة في انفصال الشبكية حتى يتم تحقيق الحجم المطلوب (يتم استخدام حوالي 100 إلى 200 ميكرولتر من BSS).
  13. إذا كان بضع الشبكية الذي تم إنشاؤه في وضع مناسب ، مما يتجنب قطع الشبكية بين موقع الزرع ورأس العصب البصري لمنع تقسيم طبقة الألياف العصبية المشتقة من موقع الزرع وتجنب الأوعية الدموية الرئيسية في شبكية العين (يتم تحديد ذلك أيضا من خلال تصميم الدراسة ، في حالتنا تم اختيار الشبكية المركزية) ، ثم ، قم بتكبيره قليلا باستخدام قنية 41 G من الحاقن ، بهدف تسهيل إدخال مقص الشبكية.
  14. أخرج الحاقن من العين وقم بإزالة منفذ الصلبة عند الساعة 10. قم بتكبير بضع التصلب في هذا الموقع باستخدام سكين / قرقرية مستقيم 2.85 مم موجه نحو العصب البصري لتجنب لمس العدسة. الحفاظ على ضغط التسريب عند 10-15 مم زئبق.
  15. قم بتمديد بضع الشبكية باستخدام مقص عمودي 80 درجة في الجسم الزجاجي بمقبض ضغط ، وتجنب قطع أوعية الشبكية لمنع نزيف الشبكية وتأكد من قطع الشبكية على حافة الفقاعة بعيدا عن رأس العصب البصري لتجنب قطع الألياف العصبية المؤدية من شبكية العين في منطقة الزرع إلى العصب البصري. يجب أن يكون بضع الشبكية بعرض كاف لاستقبال المواد العضوية.
  16. أدخل الشعيرات الدموية الزجاجية المحملة مسبقا التي تحتوي على المواد العضوية (انظر الخطوة 2.10) من خلال بضع التصلب الموسع وقم بدفعها نحو موقع بضع الشبكية تحت التصور المباشر.
    1. استخدم طرف الشعيرات الدموية الزجاجية لفتح بضع الشبكية قليلا للوصول إلى الفتحة في الفقاعة تحت الشبكية.
    2. اطلب من المساعد الضغط ببطء على مكبس الحاقن ، أثناء المشاهدة من خلال المجهر ، وحقن المواد العضوية في الفقاعة تحت الشبكية. يجب أن يسبق BSS المواد العضوية ويطرد بضع الشبكية مفتوحا.
    3. ادفع المواد العضوية برفق داخل الفقاعة بطرف الشعيرات الدموية الزجاجية إذا كانت على حافة بضع الشبكية.
  17. أمسك الشعيرات الدموية الزجاجية عند بضع الشبكية لبضع ثوان لمحاولة إغلاق بضع الشبكية ومنع الكائنات العضوية من الهروب إلى الجسم الزجاجي.
  18. قم بإزالة الشعيرات الدموية الزجاجية من العين ببطء شديد لتجنب أي إطلاق مفاجئ للسوائل من العين لتجنب حركة السوائل داخل العين التي قد تطرد الكائنات العضوية من الفقاعة تحت الشبكية.
  19. قم بزيادة ضغط التسريب ببطء إلى 20-30 مم زئبق للمساعدة في منع النزيف داخل العين مع الحرص على عدم غسل سائل التسريب مباشرة على الفقاعة. يتم تنفيذ ذلك عن طريق الضغط على أزرار الأسهم لأعلى الموجودة على اللوحة الأمامية لجهاز استئصال الزجاجية.
  20. أغلق بضع التصلب باستخدام الخيط الموضوعة مسبقا في نمط صليبي (6-0 أو 7-0 polyglactin). أضف خيوطا إضافية بسيطة متقطعة حسب الحاجة لإغلاق بضع التصلب.
  21. اطلب من المساعد إزالة منفذ التسريب والسماح للجراح بربط الخيط الموضوع مسبقا بسرعة لإغلاق بضع التصلب ومنع فقدان ضغط العين.
  22. أغلق شق الملتحمة (الصفاق) باستخدام 6-0 أو 7-0 بوليجلاكتين في نمط مستمر بسيط.
  23. قم بتصوير قاع العين (على سبيل المثال ، باستخدام كاميرا قاع الفيديو RetCam II أو Clarity أو ما شابه) وسجل الموضع الفوري للعضويات داخل الفضاء تحت الشبكية.
  24. أعد تحضير سطح العين بعد التصوير باستخدام محلول اليود البوفيدون 0.2٪ بمساعدة أدوات تطبيق أطراف القطن وكرات القطن. قم بإزالة خيوط البقاء الثلاثة ومنظار الغطاء.
  25. أغلق بضع الكانتوتومي الجانبي بخياطة بوليجلاكتين 6-0. ضع خيطا مدفونا واحدا متبوعا برقم 8 خيوط جلدية لإصلاح الكانثوس الجانبي ثم استخدم خيوط جلدية بسيطة متقطعة لإغلاق بقية الجرح.
  26. بعد اكتمال العملية الجراحية ، قم بإعطاء حقنة تحت الملتحمة من مزيج من الستيرويد والمضادات الحيوية (2 ملغ من أسيتات ميثيل بريدنيزولون ، 0.1 ملغ من ديكساميثازون ، و 1 ملغ جنتاميسين). ضع مزلق للعين (دموع اصطناعية) على القرنية.
  27. استعادة الحيوان من التخدير ومراقبته عن كثب أثناء التعافي بحثا عن أي علامات ألم تتطلب علاجا إضافيا ، مثل تشنج الجفن الملحوظ ، والإحجام الشديد عن التلاعب ، والخمول أو انخفاض الشهية ، وزيادة معدل ضربات القلب والتنفس. توفير تسكين ما بعد الجراحة حسب الحاجة ومراقبة عن كثب لأي إزعاج.
    ملاحظة: يجب أن يكون الموظفون المدربون تدريبا جيدا فقط مسؤولين عن تخدير ومراقبة مرضى القطط قبل الجراحة وأثناءها وبعدها. اتبع توصيات لجنة أخلاقيات الحيوان المحلية لرعاية ما بعد الجراحة.

4. إجراءات ما بعد الزرع ، والعلاج بعد الجراحة ، والتقييم

  1. استمر في العلاج بالأدوية المثبطة للمناعة عن طريق الفم (1 ملغ/كغ بريدنيزولون و2 ملغ/كغ من السيكلوسبورين عن طريق الفم مرتين في اليوم) للمساعدة في السيطرة على الالتهاب ورفض الكائنات العضوية. توفير تغطية شاملة بالمضادات الحيوية (على سبيل المثال، دوكسيسيكلين 5 ملغ/كغ عن طريق الفم مرتين يوميا - تم اختيار هذا المضاد الحيوي بسبب خطر العدوى الميكوبلازمية الانتهازية في الحيوانات المثبطة للمناعة).
  2. إجراء فحوصات العيون المنتظمة لمراقبة الالتهاب أو تطور الأحداث السلبية. راقب فقاعة الشبكية بحثا عن التسطيح ، والذي يحدث خلال الأيام القليلة الأولى بعد الجراحة على الرغم من بضع الشبكية الكبير المطلوب لحقن المواد العضوية في الفضاء تحت الشبكية. سجل صور قاع العين في كل فحص لتسجيل موضع ومظهر الكائنات العضوية المزروعة.
  3. تصوير الحيوانات تحت التخدير العام عن طريق تنظير العين بالليزر المسح البؤري (cSLO) والمجال الطيفي - التصوير المقطعي للتماسك البصري (SD-OCT) 5,31 خلال فترة المراقبة وقبل إنهاء التجربة.
  4. القتل الرحيم إنسانيا للحيوانات عند انتهاء التجربة باستخدام طريقة معتمدة من AVMA ، على سبيل المثال ، إعطاء 85 مجم / كجم من بنتوباربيتال عن طريق الوريد. بعد التخدير ، ضع قسطرة في الوريد لإدارة بنتوباربيتال لتقليل الإجهاد. تأكيد الوفاة عن طريق وقف ضربات القلب وجعل شق في الصدر لإنشاء استرواح الصدر.
  5. قم بإزالة العينين عن طريق نهج قياسي عبر الملتحمة وقم بإصلاحه كما هو مطلوب. بالنسبة للكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) ، اغمر العينين على الفور في محلول بارافورمالدهايد بنسبة 4٪ بعد حقن 0.3 مل من المحلول المثبت في الجزء الخلفي من خلال 3 شقوق مصنوعة من خلال pars plana بشفرة باركر 11 (~ 3-4 مم من الطرف).
  6. تشريح أكواب العين بعد 3.5 ساعة من التثبيت عند 4 درجات مئوية. إزالة الجسم الزجاجي المتبقي مع التأكد من الحفاظ على شبكية العين والمواد العضوية سليمة. ضعيه مرة أخرى في المثبت لمدة 30 دقيقة إضافية عند 4 درجات مئوية ثم اشطفي أكواب العين 3 مرات لمدة 10 دقائق في برنامج تلفزيوني. انقل فنجان العين إلى 15٪ سكروز لمدة ساعتين ، ثم إلى 30٪ سكروز لمدة ساعتين أخريين.
  7. اشطف فنجان العين مرتين باستخدام PBS وقم بتضمينه في وسط OCT (مركب درجة حرارة القطع الأمثل) وقم بتجميده ثم قم بتخزينه في -80 درجة مئوية حتى يتم تقسيمه لعلم الأنسجة والكيمياء المناعية.
  8. حدد الأجسام المضادة للمدينة العالمية للخدمات الإنسانية بناء على بروتوكول الدراسة والأهداف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتيح هذا الإجراء الزرع الناجح والقابل للتكرار لعضويات الشبكية المشتقة من hPSC في الفضاء تحت الشبكية لنموذج عين كبير (موضح هنا باستخدام أمثلة 2: القطط من النوع البري مع مستقبلات ضوئية صحية (PRs) وقطط CrxRdy / + مع العلاقات العامة المتدهورة وشبكية العين). باستخدام الخطوات الموضحة في الشكل 1 ، قم بإعداد وتحميل عضويات الشبكية المشتقة من hPSC في قنية زجاج البورسليكات لجهاز الحقن حتى لا تتلف الكائنات العضوية. يمكن تأكيد ذلك عن طريق التصور المباشر أثناء تحميل الكائنات العضوية (الخطوة 2.10) وأثناء الجراحة (الخطوة 3.16) (الشكل 2 أ ، ب) وكذلك عن طريق تصوير قاع العين في نهاية الجراحة (الخطوة 3.23 ، الشكل 2 ج). يتم تأكيد وجود الكائنات العضوية في الفضاء تحت الشبكية باستخدام هذه التقنية بعد الجراحة عن طريق فحص العيون وتصوير قاع العين (الشكل 3 أ) ، والذي يسجل موضع ومظهر الكائنات العضوية. تعد معرفة موضع عملية الزرع مهمة جدا عند معالجة الكرات الأرضية للأنسجة المجمدة والكيمياء الهيستولوجية المناعية وتقلل بشكل كبير من عبء العمل ، حيث يستغرق تقسيم عين كبيرة عند 12-14 ميكرومتر (سمك التشريح بالتبريد) وقتا. قبل القتل الرحيم ، يتم أيضا إجراء تنظير العين بالليزر بالمسح البؤري (cSLO) والمجال الطيفي - التصوير المقطعي للتماسك البصري (SD-OCT) لتقييم موضع الكائنات العضوية في الفضاء تحت الشبكية (الشكل 3A-D). توضح هذه التقنيات استمرار عضويات الشبكية في الفضاء تحت الشبكية (بين الشبكية العصبية و RPE) للعين المتلقية (الشكل 3E). بعد القتل الرحيم (يتم إجراؤه بشكل إنساني وفقا لتوصيات AVMA) ، يتم إجراء الأنسجة والكيمياء المناعية (IHC) بشكل روتيني (انظر التفاصيل في الورقةالمنشورة سابقا 31). توضح الأنسجة و IHC بقاء الطعوم الغريبة (عضويات شبكية مشتقة من hPSC) في الفضاء تحت الشبكية لعين كبيرة عندما تم تثبيط مناعة الحيوانات (كما هو موضح سابقا31) ، انظر الشكل 4.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لخطوات تحضير العضويات قبل الزرع.
يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: عمليات الزرع الجراحي تحت الشبكية للعضويات. (أ) التصور المباشر للعضويات التي يتم توصيلها إلى الفضاء تحت الشبكية من خلال قنية زجاجية دون أن تتلف ، (ب) التصور المباشر للعضويات في الفقاعة تحت الشبكية ، (ج) صورة ملونة واسعة الزاوية لقاع العين للعضويات المزروعة تحت الشبكية مباشرة بعد الجراحة. يشار إلى حواف الفقاعة برؤوس الأسهم السوداء وموقع بضع الشبكية بالنجوم السوداء.
يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تقييم ما بعد الجراحة للعضويات المزروعة تحت الشبكية بعد 3 أشهر من الزرع في قطة CrxRdy / + . (أ) صورة ملونة لقاع العين للعضويات المزروعة تحت الشبكية ، (ب) صورة قاع العين cSLO للعضويات المزروعة تحت الشبكية ، (ج) إعادة بناء حجم المسح الضوئي 3D للمنطقة التي تحتوي على المواد العضوية ، (د) صورة cSLO للمنطقة التي تحتوي على عضويات تحت الشبكية ، (ه) صورة مقطع عرضي عالية الدقة SD-OCT للعضويات المزروعة تحت الشبكية. يشار إلى موقع بضع الشبكية بالنجوم السوداء.
يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: صفائح مستقبلات الضوء المشتقة من الشبكية العضوية البشرية (علامة PR RCVRN) في الفضاء تحت الشبكية ل CrxRdy / + cat ، بعد 3 أشهر من التطعيم.  * عروة متشابكة (hSYP = Synaptophysin) في الطبقة النووية الداخلية للقطط (INL).
يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد زرع أنسجة الشبكية المشتقة من hPSC (عضويات الشبكية) في الفضاء تحت الشبكية نهجا تجريبيا واعدا لاستعادة الرؤية للأمراض التنكسية الشبكية في المرحلة المتأخرة الناجمة عن موت خلايا العلاقات العامة (العمى العميق أو النهائي). يعتمد النهج المقدم على علاج تجريبي تم تطويره واختباره بنجاح في وقت سابق يعتمد على التطعيم تحت الشبكية لقطعة من أنسجة شبكية الجنين البشري23،24،25. يقدم استخدام مصدر أنسجة شبكية بديل وقابل للتجديد ومقبول أخلاقيا مشتق من hPSCs. هناك حاجة إلى إثبات الجدوى الجراحية وسلامة العين للعلاج في نماذج العيون الكبيرة51,55 للنهوض بهذا النهج الواعد نحو التطبيقات السريرية. تقدم هذه المخطوطة طريقة مفصلة لزرع أنسجة الشبكية hPSC-3D (عضويات الشبكية) في نموذج حيواني كبير مع كل من شبكية العين الطبيعية والمتدهورة (نموذج CrxRdy / + cats نموذج LCA). على الرغم من أنه تم تطوير إجراءات إدخال قطعة مسطحة من شبكية العين البشرية وكذلك بقع RPE43،44،45 ، إلا أنه لم يتم التحقيق في زرع الطعوم ثلاثية الأبعاد الأكبر (اللازمة لاستعادة الرؤية في ظروف RD المتقدمة). البروتوكول الموصوف هنا بالتفصيل هو لإجراء عملية زرع لتوصيل تحت الشبكية لعضويات الشبكية بأكملها (بدلا من الحافات العضوية33,41) تحمل أيضا بعض RPE كطريقة أفضل محتملة لإدخال صفائح شبكية سليمة مع العلاقات العامة ، لزيادة بقاء الكسب غير المشروع وتحسين الحفاظ على الورقة. لاحظ أن أجزاء مختلفة من هذا البروتوكول راسخة. على سبيل المثال ، يستخدم استئصال الزجاجية على نطاق واسع من قبل جراحي الشبكية والجسم الزجاجي أثناء جراحة إعادة ربط الشبكية56،57،58،59،60. أصبحت الحقن تحت الشبكية أكثر شيوعا ، على سبيل المثال ، في علاج زيادة الجينات3،7،61،62،63،64. هناك أوصاف محدودة لإنشاء بضع شبكية مناسب وحقن عضويات كبيرة نسبيا في الفضاء تحت الشبكية.

تشمل الخطوات الحاسمة تحديد المواقع بعناية وأداء بضع التصلب لتجنب العدسة ، والإزالة الكاملة للقشرة الزجاجية من سطح الشبكية فوق موقع الزرع ، وتشكيل متحكم فيه للفقاعة تحت الشبكية ، وتوليد بضع الشبكية بالحجم الأمثل لاستيعاب عرض قنية الزرع ، والحفاظ على ضغط التسريب المحدد خلال خطوات مختلفة ، وسحب القنية. اختيار قنية الزرع المناسبة ذات القطر الداخلي والخارجي الأمثل (ID و OD) والطول ، والتحكم في نزيف العين ، وعقم الإجراء بأكمله من المواد العضوية إلى غرفة الجراحة والأدوات ، ومدة الجراحة (30-45 دقيقة /) لضمان أفضل النتائج. وجد المؤلفون أنه يتم الحصول على أفضل النتائج مع استئصال الزجاجية 23 G بسبب سمك / لزوجة القط الزجاجي ، مما يخلق فقاعة مع حاقن مع قنية 41 G ، ثم تمديد بضع الشبكية على حافة الفقاعة باستخدام مقص شبكية بزاوية 80 درجة. تشمل العوامل المهمة الأخرى تمديد بضع التصلب باستخدام كيراتوم 2.85 مم ليناسب قنية زجاج البورسليكات (القطر الخارجي OD 1.52 مم ؛ القطر الداخلي ، ID 1.12 مم ؛ والطول 10.16 سم) والسماح بزرع عضويات أكبر في عين كبيرة بطول محوري حوالي 20.5 مم (20.91 مم ± 0.53 مم)55. كان استخدام الشعيرات الدموية الزجاجية هو الأفضل حاليا لتحميل وتوصيل المواد العضوية بحجم النسب دون إتلافها أثناء عملية الزرع. وقد وجد أن تقليل ضغط التسريب من 20-30 مم زئبق أثناء استئصال الزجاجية إلى 10 مم زئبق أثناء خطوة تكوين الفقاعة هو الأمثل لتوليد انفصال الشبكية ، اللازم لخلق مساحة لعضويات الشبكية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن صلاحية أنسجة الشبكية hPSC-3D (المواد العضوية) أثناء الشحن لمسافات طويلة واختيار نظام كبت المناعة الأمثل للحفاظ على الطعوم البشرية الغريبة أمر بالغ الأهمية كما تم الإبلاغ عنه مؤخرا31,54.

وجد المؤلفون أنه بسبب إضاءة Cat tapetum العاكسة للغاية ، لم تكن هناك حاجة لإجراء الجراحة. تتطلب عملية الزرع في الأنواع atapetal (على سبيل المثال ، الخنازير ، الرئيسيات غير البشرية) استئصال الزجاجية من 3 منافذ يتضمن الإضاءة الداخلية. لم يتم إجراء السدادة (على سبيل المثال ، مع الكربون المشبع بالفلور متبوعا بزيت السيليكون) كما تم إجراؤها في جراحة انفصال الشبكية الروتينية لأن الضغط على الفقاعة قد يخاطر ببثق المواد العضوية في الجسم الزجاجي. يمكن أن تشمل التطورات المستقبلية استخدام المواد التي يتم التحقيق فيها حاليا لسد ثقوب الشبكية. يمكن استخدام هذا لمنع أي فقدان بعد الزرع للعضويات في الجسم الزجاجي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام Triescence ، الذي يشبه Kenalog-40 ولكنه يحتوي على تريامسينولون خال من المواد الحافظة ، كبديل لتصور الجسم الزجاجي.

قدم حجم الكرة الأرضية الأصغر في الحيوانات الأصغر سنا (على سبيل المثال ، 1-2 أشهر) تحديات جراحية أكثر مقارنة بالعين الكبيرة (الحيوانات البالغة). ومع ذلك ، باستخدام الطريقة الموضحة هنا ، من الممكن توصيل الطعوم تحت الشبكية. في نموذج CrxRdy / + LCA ، تم العثور على فقاعات شبكية أكبر لا يتم إعادة ربطها دائما. الحفاظ على الفقاعة إلى الحد الأدنى للحجم اللازم للسماح بحقن عضويات الشبكية ، قلل من هذه المضاعفات. يعد الزرع في وقت أقرب في شبكية العين RD (قبل الفقدان الكامل للعلاقات العامة عندما تصبح الشبكية العصبية ضعيفة بشكل ملحوظ) مبدأ توجيهيا آخر ، بما يتماشى مع العمل السابق مع ترقيع شبكية العين الجنينيةالبشرية 20. ملاحظة أخرى - لا تعتمد التقنية التفصيلية على وضع ورقة الشبكية في الاتجاه الصحيح لأنه يتم زرع عضويات الشبكية بأكملها. مع تطور صفائح شبكية العين المسطحة hESC ، سيكون هذا مهما. ومع ذلك ، فهو ليس محور هذا البروتوكول ، الذي يهدف إلى تقديم صفائح أنسجة شبكية hESC سليمة وتحسين الحفاظ على أوراق العلاقات العامة تحت الشبكية. بمجرد تطوير هذه التقنية ، كانت قابلة للتكرار في كل من شبكية العين الطبيعية و RD.

هناك العديد من المضاعفات المحتملة لهذا الإجراء الجراحي. فقط أولئك المهرة في جراحة الشبكية والجسم الزجاجي (على سبيل المثال ، أطباء العيون البيطريين المدربين أو جراحي الشبكية والجسم الزجاجي المطلعين على اختلافات الأنواع في عين القط مقارنة بالعين البشرية) يجب أن يقوموا بهذا الإجراء. تشمل المضاعفات المحتملة لمس العدسة أثناء وضع المبزل ، ونزيف الصلبة أثناء تكبير بضع التصلب ، ونزيف تحت الشبكية أو الشبكية. من الممكن حدوث مضاعفات أخرى مثل الاستجابة المناعية للمضيف للطعوم العضوية البشرية الغريبة التي تؤدي إلى تدمير الكسب غير المشروع بمرور الوقت أو التهاب باطن المقلة ؛ يساعد استخدام الأدوية المثبطة للمناعة والمضادات الحيوية عن طريق الفم على منع حدوثها. من المهم أيضا ملاحظة أن هناك فرقا بين الزرع في القطط البرية و CrxRdy / + . عندما يكون هناك تنكس متقدم في الشبكية ، تميل فقاعة الشبكية إلى الانتشار على نطاق أوسع مما هي عليه في النوع البري ، وفي بعض الحالات ، يمكن أن يمنع ذلك إعادة ربط الشبكية بالكامل بعد الجراحة. التقنية المعروضة هنا قابلة للتطبيق لزرع المواد العضوية في عيون النماذج الحيوانية الكبيرة من IRDs. ستكون هناك حاجة إلى مزيد من التحسين بمجرد أن تصبح عملية الزرع جاهزة للترجمة إلى العيادة.

استنادا إلى خبرة المؤلفين في إجراء العمليات الجراحية المعقدة للشبكية والجسم الزجاجي في نماذج العين الكبيرة ، يجب أن تكون التقنية المقدمة في هذه المخطوطة قابلة للتطبيق على نماذج حيوانية كبيرة أخرى (مع تضمين الإضاءة الداخلية في الأنواع atapetal) التي تستخدم لترجمة التقنيات الجراحية للشبكية والجسم الزجاجي إلى العيادة43،44،45.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

راتنش ك. سينغ ، دكتوراه ، فرانسوا بينيت ، دكتوراه ، وإيغور أو ناسونكين دكتوراه هم موظفون في شركة Lineage Cell Therapeutics، Inc. يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل منحة NEI Fast-track SBIR R44-EY027654-01A1 ومنحة SBIR 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N. ، علاجات خلايا النسب ؛ الدكتور بيترسن جونز هو باحث رئيسي مشارك). يود المؤلفون أن يشكروا السيدة جانيس كيروبين (MSU RATTS) على مساعدتها في التخدير والرعاية العامة للحيوانات المدرجة في هذه الدراسة بالإضافة إلى المساعدة في الإعداد الجراحي وإعداد / تعقيم الأدوات. يود المؤلفون أن يشكروا الدكتورة بايج وينكلر على المساعدة في تلقي المواد العضوية ووضعها في وسائل الإعلام في اليوم السابق للزرع وللمساعدة في يوم الزرع. كما يعرب المؤلفون عن امتنانهم للسيد راندي غارشار (LCTX) لشحنه الدؤوب لعضويات شبكية العين ، وتجميع الشاحن ، وتنزيل سجلات درجة الحرارة والإجهاد G بعد كل شحنة. تم تنفيذ هذا العمل بينما كان المؤلف إيغور ناسونكين يعمل لدى Biotime (الآن Lineage).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm pore syringe filter with PES membrane Cameo NA can be found through various suppliers
23G subretinal injector with extendable 41 G cannula DORC 1270.EXT
250 µL hamilton gas tight luer lock syringe Hamilton NA can be found through various suppliers
6-0 Silk suture Ethicon 707G
6-0/7-0 polyglactin suture Ethicon J570G
Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject) Henry Schein Animal Health NA can be found through various suppliers
Buprenorphine 0.3 mg/mL Par Pharmaceutical NA can be found through various suppliers
cSLO + SD-OCT Heidelberg Engineering Spectralis HRA+ OCT
Cyclosporine Novartis NA can be found through various suppliers
Dexamethasone 2mg/mL (Azium) Vetone NA can be found through various suppliers
Doxycyline 25mg/5mL Cipla NA can be found through various suppliers
Fatal Plus solution (pentobarbital solution) Vortech NA can be found through various suppliers
Gentamicin 20mg/2mL Hospira NA can be found through various suppliers
Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing World Precision Instruments TW150-4
Methylprednisolone actetate 40 mg/mL Pfizer NA can be found through various suppliers
Microscope Zeiss NA
OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound) Sakura 4583
Olympic Vac-Pac Size 23 Natus NA can be found through various suppliers
Paraformaldehyde 16% solution EMS 15719
Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution Akorn NA can be found through various suppliers
Prednisolone 15mg/5mL Akorn NA can be found through various suppliers
Propofol 500mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28) Zoetis NA can be found through various suppliers
RetCam II video fundus camera Clarity Medical Systems NA can be found through various suppliers
Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40) Bristol -Myers Squibb Company NA can be found through various suppliers
Tropicamide 1% ophthalmic solution Akorn NA can be found through various suppliers
Vitrectomy 23G port Alcon Accurus systems
Vitrectomy machine Alcon Accurus systems
Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle Frimen FT170206T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veleri, S., et al. Biology and therapy of inherited retinal degenerative disease: insights from mouse models. Disease Models and Mechanisms. 8 (2), 109-129 (2015).
  2. Dias, M. F., et al. Molecular genetics and emerging therapies for retinitis pigmentosa: Basic research and clinical perspectives. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 107-131 (2018).
  3. Petersen-Jones, S. M., et al. Patients and animal models of CNGbeta1-deficient retinitis pigmentosa support gene augmentation approach. The Journal of Clinical Investigation. 128 (1), 190-206 (2018).
  4. Winkler, P. A., et al. A large animal model for CNGB1 autosomal recessive retinitis pigmentosa. PLoS One. 8 (8), 72229 (2013).
  5. Occelli, L. M., Tran, N. M., Narfstrom, K., Chen, S., Petersen-Jones, S. M. CrxRdy Cat: A large animal model for CRX-associated leber congenital amaurosis. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (8), 3780-3792 (2016).
  6. Mowat, F. M., et al. Early-onset progressive degeneration of the area centralis in RPE65-deficient dogs. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (7), 3268-3277 (2017).
  7. Occelli, L. M., et al. Gene supplementation rescues rod function and preserves photoreceptor and retinal morphology in dogs, leading the way towards treating human PDE6A-retinitis pigmentosa. Human Gene Therapy. 28 (12), 1189-1201 (2017).
  8. Eckhorn, R., et al. Visual resolution with retinal implants estimated from recordings in cat visual cortex. Vision Research. 46 (17), 2675-2690 (2006).
  9. Pardue, M. T., et al. Status of the feline retina 5 years after subretinal implantation. Journal of Rehabilitation Research and Development. 43 (6), 723-732 (2006).
  10. Chow, A. Y., et al. Subretinal implantation of semiconductor-based photodiodes: durability of novel implant designs. Journal of Rehabilitation Research and Development. 39 (3), 313-321 (2002).
  11. Volker, M., et al. In vivo assessment of subretinally implanted microphotodiode arrays in cats by optical coherence tomography and fluorescein angiography. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 242 (9), 792-799 (2004).
  12. Chow, A. Y., et al. Implantation of silicon chip microphotodiode arrays into the cat subretinal space. Institute of Electrical and Electronics Engineering Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 9 (1), 86-95 (2001).
  13. Sachs, H. G., et al. Subretinal implantation and testing of polyimide film electrodes in cats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 243 (5), 464-468 (2005).
  14. Villalobos, J., et al. A wide-field suprachoroidal retinal prosthesis is stable and well tolerated following chronic implantation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (5), 3751-3762 (2013).
  15. Bragadottir, R., Narfstrom, K. Lens sparing pars plana vitrectomy and retinal transplantation in cats. Veterinary Ophthalmology. 6 (2), 135-139 (2003).
  16. Narfstrom, K., Holland Deckman, K., Menotti-Raymond, M. The domestic cat as a large animal model for characterization of disease and therapeutic intervention in hereditary retinal blindness. Journal of Ophthalmology. , 906943 (2011).
  17. Seiler, M. J., et al. Functional and structural assessment of retinal sheet allograft transplantation in feline hereditary retinal degeneration. Veterinary Ophthalmology. 12 (3), 158-169 (2009).
  18. Aramant, R. B., Seiler, M. J. Transplanted sheets of human retina and retinal pigment epithelium develop normally in nude rats. Experimental Eye Research. 75 (2), 115-125 (2002).
  19. Lin, B., McLelland, B. T., Mathur, A., Aramant, R. B., Seiler, M. J. Sheets of human retinal progenitor transplants improve vision in rats with severe retinal degeneration. Experimental Eye Research. 174, 13-28 (2018).
  20. Seiler, M. J., Aramant, R. B. Cell replacement and visual restoration by retinal sheet transplants. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (6), 661-687 (2012).
  21. Seiler, M. J., et al. Vision recovery and connectivity by fetal retinal sheet transplantation in an immunodeficient retinal degenerate rat model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (1), 614-630 (2017).
  22. Lorach, H., et al. Transplantation of mature photoreceptors in rodents with retinal degeneration. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 30 (2019).
  23. Radtke, N. D., et al. Vision improvement in retinal degeneration patients by implantation of retina together with retinal pigment epithelium. American Journal of Ophthalmology. 146 (2), 172-182 (2008).
  24. Radtke, N. D., Aramant, R. B., Seiler, M. J., Petry, H. M., Pidwell, D. Vision change after sheet transplant of fetal retina with retinal pigment epithelium to a patient with retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 122 (8), 1159-1165 (2004).
  25. Radtke, N. D., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Petry, H. M., Pidwell, D. J. Transplantation of intact sheets of fetal neural retina with its retinal pigment epithelium in retinitis pigmentosa patients. American Journal of Ophthalmology. 133 (4), 544-550 (2002).
  26. Lorach, H., Palanker, E. Retinal prostheses: High-resolution photovoltaic implants. Medical Science (Paris). 31 (10), 830-831 (2015).
  27. Mathieson, K., et al. Photovoltaic retinal prosthesis with high pixel density. Nature Photonics. 6 (6), 391-397 (2012).
  28. Banin, E., et al. Retinal incorporation and differentiation of neural precursors derived from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24 (2), 246-257 (2006).
  29. Hambright, D., et al. Long-term survival and differentiation of retinal neurons derived from human embryonic stem cell lines in un-immunosuppressed mouse retina. Molecular Vision. 18, 920-936 (2012).
  30. Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
  31. Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye. Stem Cells and Development. 28 (17), 1151-1166 (2019).
  32. McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
  33. Assawachananont, J., et al. Transplantation of embryonic and induced pluripotent stem cell-derived 3D retinal sheets into retinal degenerative mice. Stem Cell Reports. 2 (5), 662-674 (2014).
  34. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  35. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  36. Singh, R. K., et al. Characterization of three-dimensional retinal tissue derived from human embryonic stem cells in adherent monolayer cultures. Stem Cells and Development. 24 (23), 2778-2795 (2015).
  37. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
  38. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
  39. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
  40. Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (39), 16698-16703 (2009).
  41. Shirai, H., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 81-90 (2016).
  42. Mandai, M., et al. iPSC-derived retina transplants improve vision in rd1 end-stage retinal-degeneration mice. Stem Cell Reports. 8 (4), 1112-1113 (2017).
  43. Scruggs, B. A., et al. Optimizing donor cellular dissociation and subretinal injection parameters for stem cell-based treatments. Stem Cells Translational Medicine. 8 (8), 797-809 (2019).
  44. Singh, R., et al. Pluripotent stem cells for retinal tissue engineering: Current status and future prospects. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (4), 463-483 (2018).
  45. Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Science Translational Medicine. 11, 475 (2019).
  46. Ghosh, F., Engelsberg, K., English, R. V., Petters, R. M. Long-term neuroretinal full-thickness transplants in a large animal model of severe retinitis pigmentosa. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (6), 835-846 (2007).
  47. Koss, M. J., et al. Subretinal implantation of a monolayer of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium: a feasibility and safety study in Yucatan minipigs. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (8), 1553-1565 (2016).
  48. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  49. Kashani, A. H., et al. Subretinal implantation of a human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer in a porcine model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1185, 569-574 (2019).
  50. Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: Experience from a Phase 1/2a study. Ophthalmology. Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
  51. Petersen-Jones, S. M., Komaromy, A. M. Dog models for blinding inherited retinal dystrophies. Human Gene Therapy. Clinical Development. 26 (1), 15-26 (2015).
  52. Beltran, W. A., et al. Canine retina has a primate fovea-like bouquet of cone photoreceptors which is affected by inherited macular degenerations. PLoS One. 9 (3), 90390 (2014).
  53. Nasonkin, I. O., et al. Transplantation of human embryonic stem cell derived retinal tissue in the subretinal space of immunodeficient rats with retinal degeneration (RD). Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (9), 3109 (2019).
  54. Singh, R. K., et al. Development of a protocol for maintaining viability while shipping organoid-derived retinal tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (2), 388-394 (2020).
  55. Petersen-Jones, S. M. Drug and gene therapy of hereditary retinal disease in dog and cat models. Drug Discovery Today. Disease Models. 10 (4), 215-223 (2013).
  56. Machemer, R., Buettner, H., Norton, E., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1972).
  57. Machemer, R., Norton, E. W. Vitrectomy, a pars plana approach. II. Clinical experience. Modern Problems in Ophthalmology. 10, 178-185 (1972).
  58. Machemer, R., Parel, J., Norton, E. Vitrectomy: a pars plana approach. Technical improvements and further results. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 76 (2), 462-466 (1972).
  59. O'Malley, C., Heintz, R. M. Vitrectomy with an alternative instrument system. Annals of Ophthalmology. 7 (4), 585-588 (1975).
  60. Machemer, R., Hickingbotham, D. The three-port microcannular system for closed vitrectomy. American Journal of Ophthalmology. 100 (4), 590-592 (1985).
  61. Petersen-Jones, S. M., et al. AAV retinal transduction in a large animal model species: comparison of a self-complementary AAV2/5 with a single-stranded AAV2/5 vector. Molecular Vision. 15, 1835-1842 (2009).
  62. Annear, M. J., et al. Successful gene therapy in older Rpe65-deficient dogs following subretinal injection of an adeno-associated vector expressing RPE65. Human Gene Therapy. 24 (10), 883-893 (2013).
  63. Beltran, W. A., et al. Optimization of retinal gene therapy for X-linked retinitis pigmentosa due to RPGR mutations. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (8), 1866-1880 (2017).
  64. Bainbridge, J. W. B., et al. Long-term effect of gene therapy on Leber's Congenital Amaurosis. The New England Journal of Medicine. 372 (20), 1887-1897 (2015).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 174 ، عضويات الشبكية ، القط ، نموذج العين الكبيرة ، زرع تحت الشبكية ، تنكس الشبكية ، التقنية الجراحية
زرع تحت الشبكية لأنسجة الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في نموذج حيواني كبير للقطط
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Occelli, L. M., Marinho, F., Singh,… More

Occelli, L. M., Marinho, F., Singh, R. K., Binette, F., Nasonkin, I. O., Petersen-Jones, S. M. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model. J. Vis. Exp. (174), e61683, doi:10.3791/61683 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter