Summary
Vi beskriver produktionen af blandede kulturer af astrocytter og oligodendrocyt prækursorceller afledt af føtale eller voksne neurale stamceller differentiere i modne oligodendrocytter, og in vitro modellering af skadelige stimuli. Koblingen med en cellebaseret screeningsteknik med højt indhold opbygger et pålideligt og robust lægemiddelscreeningssystem.
Abstract
Den største hindring for udviklingen af lægemiddelscreeningsteknikker til vurdering af effektiviteten af terapeutiske strategier for komplekse sygdomme er at finde en balance mellem in vitro-forenkling og genskabelse af det komplekse in vivo-miljø sammen med det hovedformål, der deles af alle screeningsstrategier, om at opnå robuste og pålidelige data, der er meget prædiktive for in vivo-oversættelse.
Inden for demyelinerende sygdomme er de fleste lægemiddelscreeningsstrategier baseret på udødeliggjorte cellelinjer eller rene kulturer af isolerede primære oligodendrocytprækursorerceller (OPCs) fra nyfødte dyr, hvilket fører til stærke fordomme på grund af manglen på aldersrelaterede forskelle og af enhver reel patologisk tilstand eller kompleksitet.
Her viser vi opsætningen af et in vitro-system, der har til formål at modellere den fysiologiske differentiering / modning af neurale stamcelle (NSC)-afledte OPCs, let manipuleret til at efterligne patologiske tilstande, der er typiske for demyelinerende sygdomme. Desuden omfatter metoden isolation fra foster- og voksenhjerner, hvilket giver et system, der dynamisk adskiller sig fra OPCs til modne oligodendrocytter (OLs) i en spontan co-kultur, som også omfatter astrocytter. Denne model fysiologisk ligner skjoldbruskkirtlen hormon-medieret myelination og myelin reparation proces, så tilføjelsen af patologiske interferents som model sygdomsmekanismer. Vi viser, hvordan man efterligner de to hovedkomponenter i demyelinerende sygdomme (dvs. hypoxi / iskæmi og betændelse), genskaber deres virkning på udviklingsmæssig myelination og voksen myelin reparation og tager alle systemets cellekomponenter i betragtning hele vejen igennem, samtidig med at der fokuseres på at differentiere OPCs.
Denne spontane blandede model kombineret med cellebaserede screeningsteknologier med højt indhold gør det muligt at udvikle et robust og pålideligt lægemiddelscreeningssystem for terapeutiske strategier, der har til formål at bekæmpe de patologiske processer, der er involveret i demyelination, og at fremkalde remyelination.
Introduction
I centralnervesystemet (CNS), myelin danner celler (oligodendrocytter, OPLs) og deres prækursorer (oligodendrocyt prækursor celler, OPCs) er ansvarlige for udviklingsmæssige myelination, en proces, der opstår i løbet af perioden og efter fødslen perioder, og for myelin omsætning og reparation (remyelination) i voksenalderen1. Disse celler er højt specialiserede, interagerer anatomisk og funktionelt med alle de andre glial og neuronale komponenter, hvilket gør dem til en grundlæggende del af CNS struktur og funktion.
Demyelinating begivenheder er involveret i forskellige CNS skader og sygdomme2, og primært handle på OPCs og OPLs i form af multifaktorielle mekanismer, både under udvikling og voksenalderen. De udifferentierede prækursorer er drevet af differentierende faktorer, hovedsagelig skjoldbruskkirtlen hormon (TH), i en synkroniseret proces3, som fører OPC til at genkende og reagere på specifikke stimuli, som fremkalder spredning, migration til ikke-myelineret axon, og differentiering i modne OPLs, som igen udvikle myelin kappe4. Alle disse processer er fint kontrolleret og forekommer i et komplekst miljø.
På grund af myelinationskompleksitets-, remyelination- og demyelinationshændelser er der et stort behov for en forenklet og pålidelig in vitro-metode til at studere de underliggende mekanismer og udvikle nye terapeutiske strategier med fokus på den vigtigste cellulære aktør: OPC5.
For at et in vitro-system skal være pålideligt, er det nødvendigt at tage hensyn til en række faktorer: kompleksiteten af det cellulære miljø, aldersrelaterede celle-iboende forskelle, fysiologisk TH-medieret differentiering, patologiske mekanismer og dataenes robusthed6. Faktisk er det uopfyldte behov på området en model, der efterligner kompleksiteten af in vivo-tilstanden, som ikke med succes opnås ved brug af isolerede rene OPC-kulturer. Derudover involverer de to hovedkomponenter i demyelinerende hændelser, inflammation og hypoxi/iskæmi (HI), direkte andre cellekomponenter, der indirekte kan påvirke OPCs fysiologisk differentiering og modning, et aspekt, der ikke kan undersøges i oversimplificerede in vitro-modeller.
Med udgangspunkt i et meget prædiktivt kultursystem er den efterfølgende og mere generelle udfordring produktionen af robuste og pålidelige data. I denne sammenhæng er cellebaseret screening med højt indhold (HCS) den mest egnede teknik7, da vores mål for det første er at analysere hele kulturen i en automatisk arbejdsgang, undgå bias ved at vælge repræsentative felter og for det andet at opnå den automatiske og samtidige generering af billedbehandlingsbaserede data med højt indhold8.
I betragtning af at det største behov er at opnå den bedste balance mellem in vitro-forenkling og in vivo-efterligne kompleksitet, præsenterer vi her en meget reproducerbar metode til at opnå OPCs afledt af neurale stamceller (NSC'er), der er isoleret fra fosterhjernen og den voksne subtritrikulær zone (SVZ). Denne in vitro-model omfatter hele OPC-differentieringsprocessen, fra multipotent NSC til moden / myelinerende OL, på en fysiologisk TH-afhængig måde. Den resulterende kultur er et dynamisk differentierende / maturerende system, som resulterer i en spontan co-kultur, der hovedsagelig består af at differentiere OPCs og astrocytter, med en lav procentdel af neuroner. Denne primære kultur efterligner bedre det komplekse in vivo-miljø, mens dets stamcelleafledning gør det muligt at udføre enkle manipulationer for at opnå den ønskede cellelinjeberigelse.
I modsætning til andre lægemiddelscreeningsstrategier ved hjælp af cellelinjer eller rene kulturer af primære OPCs tillader den metode, der er beskrevet her, at undersøge effekten af patologiske interferents eller terapeutiske molekyler i et komplekst miljø uden at miste fokus på den ønskede celletype. Hcs workflow beskrevet tillader en analyse af celle levedygtighed og afstamning specifikation, samt afstamning-specifikke celledød og morfologiske parametre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de koedprotokoller , der er beskrevet heri , blev gennemført i overensstemmelse med Det Europæiske Råds direktiv (86/609/EØF) og i overensstemmelse med retningslinjerne i NIH's vejledning om pleje og anvendelse af laboratoriedyr.
1. Løsninger og reagenser
- Forbered standardmedium: DMEM/F12 GlutaMAX 1x; 8 mmol/L HEPES; 100 U/100 μg Penicillin/Streptomycin (1% P/S); 1x B27; 1x N-2.
- Forbered neurosfæremedium: tilsæt 10 ng/mL bFGF; 10 ng/mL EGF til standardmedium.
- Tilbered oligosfære/OPC-medium: tilsæt 10 ng/mL bFGF; 10 ng/mL PDGF-AA til standard medium.
- Forbered oligodendroctye differentiering medium: tilsæt 50 nM T3; 10 ng/mL CNTF; 1x N-acetyl-L-cystein (NAC) til standard medium.
- Forbered ikke-enzymatisk dissociation buffer: tilsæt 1% P / S til ikke-enzymatisk dissociation buffer og holde iskold.
- Klargør saccharoseopløsning: HBSS, 0,3 g/mL saccharose.
- Klargør BSA-vaskeopløsning: EBSS, 40 mg/mL BSA, 0,02 mL/l HEPES.
- Forbered enzymatisk dissociationsbuffer: HBSS, 5,4 mg/mL D-glukose, 15 mmol/L HEPES, 1,33 mg/mL Trypsin, 0,7 mg/mL Hyaluronidase, 80 U/mL DNase.
- Forbered cytokin mix: TGF-β1, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17, og IFN-γ (20 ng/mL hver).
- Klargør cytokinblandingskøretøj: 0,04 % af bestanden (10 % glycerol/100 nM glycin/25 nM Tris, pH 7.3).
- Forbered ilt-glukose afsavn medium: standard medium ved hjælp af DMEM w / o glukose. Afhængigt af stringensen af den ønskede glukosemangeltilstand er det muligt også at fjerne B27 og/eller N2 fra mediet for at undgå glukoserelaterede forbindelser (f.eks. D-Galactose i B27).
2. Dissektion og NSC isolation
BEMÆRK: Føtal og voksne NSC'er blev isoleret fra E13.5 fosterhjern eller 2,5 måneder gammel voksen sub-ventrikulær zone (SVZ), efter Ahlenius og Kokaia protokol9 med ændringer.
- Føtal NSC kulturer
BEMÆRK: Før dissektionerne påbegyndes, skal der forberedes 1,5 mL rør, der indeholder 150 μL ikke-enzymatisk dissociationsbuffer hver. ren petriskåle og tilsæt iskold HBSS.- Saml embryonerne på E13.5 - 14.5 fra tiderede gravide mus og læg dem i en petriskål, der indeholder kold HBSS.
- Halshugge embryonerne ved hjælp af sammentak.
- Placer embryonernes hoveder i en ren petriskål, der indeholder iskold PBS, og fjern huden fra kraniet med sammenkypninger ved hjælp af forstørrelsesglas eller et stereoskop.
- Når hjernen er synlig og renset for huden, klemme det ud ved at anvende tryk på siderne med sammenkråninger.
- Fjern lillehjernen, hold kun forhjernen og fjern meningerne med sammenkrammer.
- Placer det isolerede væv i den ikke-enzymatiske dissociationsbuffer, og gentag dissektionstrinnene sammen med de andre embryoner. Indsæt vævet fra 2-3 dyr i hvert rør, der indeholder bufferen.
- Inkuberes ved 37 °C i 15 min under kontinuerlig rysten.
- Efter inkubation tilsættes 850 μL standardmedium og blandes ved pipettering, indtil suspensionen er fri for klumper.
- Hvis ikke-dissocieret væv stadig er synligt, skal du vente i 2 min på RT, indtil det deponerer i bunden af røret.
- Når dissociationen er færdig, tælle cellerne og plade dem i suspension ved en densitet på 10-50 celler/μL i en T-25 eller T-45 kolbe indeholdende 10-30 mL af neurosfæren medium, holdes i lodret position for at undgå celle vedhæftning.
-
Voksne NSC kulturer
- Ofre dyr ved cervikal dislokation.
- Saml hjerner fra 4-5 mus i et 50 mL rør, der indeholder iskold HBSS.
- Placer hjernen på en kold steril overflade. Til dette formål anvendes en T-25 kolbe fyldt med vand og anbringes ved -20 °C natten over. På tidspunktet for eksperimentet skal du dække kolben med steril aluminiumsfolie.
- Placer hjernens ventrale side nedad, i rostro-kaukasal retning, og fjern de olfaktoriske pærer ved hjælp af et barberblad.
- Brug et barberblad, skær 2-3 koronar skiver af 1 mm tykkelse, fra cortex til den optiske chiasma.
- Placer skiverne på den kolde overflade i en ventro-dorsal position og identificere corpus callosum og de to laterale hjertekamre.
- Ved hjælp af forstørrelsesglas eller et stereoskop isoleres væggene i de laterale hjertekamre og pas på ikke at bære stykker af corpus callosum.
- Sæt det isolerede væv i den enzymatiske dissociationsbuffer (5-10 mL) og inkuberes ved 37 °C i 15 min.
- Opløsningen blandes, pipetter flere gange (mindst 50), og inkuber igen ved 37 °C i 10 min.
- Neutralisere trypsin ved at tilføje 5 mL standard kultur medium og filtrere opløsningen ved hjælp af en 70 μm filter.
- Centrifugere den filtrerede opløsning i 5 min ved 400 x g.
- Resuspend pellet i saccharoseopløsningen og centrifugen i 10 min ved 500 x g.
- Brugpillen i BSA-vaskeopløsning og centrifuge i 7 min ved 400 x g.
- Brug pelleten i standardkulturmediet igen, tæl cellerne, og udfør plating som beskrevet ovenfor (i trin 2.1.10).
3. Primære neurosfærer
- Tilføj vækstfaktorerne (bFGF/EGF) hver anden dag.
- Hver 4-6 dage (afhængigt af celletæthed), ændre halvdelen af mediet som følger:
- Overfør hele celleaffjedringen til et 15 eller 50 mL rør.
- Centrifuge i 5 min ved 400 x g.
- Fjern halvdelen af diskenheden.
- Tilsæt den samme mængde frisk medium, bland forsigtigt ved pipettering, og tilsæt vækstfaktorer.
4. Oligospheres
BEMÆRK: Oligodendrocyt differentiering udføres efter Chen protokol10 med ændringer.
- Når neurosfærerne når en diameter på 100-150 μm, er de klar til at blive passeret. For at gøre dette skal du overføre hele celleaffjedringen til et 15 eller 50 mL rør og centrifuge i 5 min ved 400 x g.
- Hurtigt evaluere diameteren ved at tage billeder af kuglerne ved hjælp af en omvendt transmitteret lys mikroskop og åbne dem ved ImageJ software.
- Klik på i menuen Analyser , og vælg Skalalinjei vinduet Funktioner .
- Sæt 150 μm som Bredde i mikron og sammenlign skalastangen med kuglerne.
- Fjern hele volumen ved inversion og resuspend pellet i 180 μL af frisk standard kultur medium. Pipette 50 gange for at tillade opdeling af kuglerne.
- Tilsæt 810 μL frisk standard kultur medium, tælle cellerne, og re-plade dem som beskrevet for neurospheres.
- Tilføj bFGF/PDGF-AA 10 ng/mL hver anden dag.
- Hver 4-6 dage (afhængigt af celletæthed), ændre halvdelen af mediet som følger:
- Overfør hele celleaffjedringen til et 15 eller 50 mL rør.
- Centrifuge i 5 min ved 400 x g.
- Fjern halvdelen af diskenheden.
- Tilsæt den samme mængde frisk medium, bland forsigtigt ved pipettering, og tilsæt vækstfaktorer.
5. Pladebelægning
- Poly-D,L-ornithin/laminin belægning: mindst 2 dage før plating OPCs, tilsæt 50 μg/mL poly-D,L-ornithine opløsning, fortyndet i PBS, til hver brønd (40 μL/brønd til 96-brønd plader) og inkubere på RT natten over.
- Den følgende dag skal du fjerne væsken og vaske tre gange med destilleret sterilt vand.
- Lad pladerne tørre på RT natten over. Den følgende dag tilsættes en lamininopløsning fortyndet i PBS (5 μg/mL; 40 μL/brønd til 96-brøndsplader) og inkuberes i 2 timer ved 37 °C.
6. Cellesåning
- Når oligospheres når en diameter på 100-150 μm, er de klar til at blive adskilt og sået på poly-D,L-ornithine/laminine coatede plader. For at gøre dette skal du overføre hele celleaffjedringen til et 15 eller 50 mL rør og centrifuge i 5 min ved 400 x g (som angivet i trin 4.1)
- Fjern hele volumen ved inversion og resuspend pellet i 180 μL af frisk standard kultur medium. Pipette 50 gange for at tillade opdeling af kuglerne.
- Tilsæt 810 μL frisk standard kulturmedium og tæl cellerne.
- Fjern lamininopløsningen fra brøndene, og pladen cellerne ved 3.000 celle/cm2 densitet (100 μL/brønd til 96-brønds plader).
7. OPC differentiering induktion
- Efter 3 dage skal du fjerne hele mediet og tilføje det samme volumen af oligodendrocyt differentiering medium.
- Skift halvdelen af mediet hver 4. dag, og tilsæt frisk differentieringsblanding (T3/CNTF/NAC) hver anden dag.
8. Induktion af inflammation-medieret differentiering blok
- Efter neurosfære dissociation og oligosphere produktion (afsnit 4), tilsæt cytokin mix til kulturmediet og holde oligospheres udsat for cytokiner for hele kugler dannelse trin.
BEMÆRK: Volumenet afhænger af antallet af celler, da der for de kugler, der danner celler, er seedet ved 10-50 celler/μL. - Hvis mediet skal ændres, skal du ændre hele lydstyrken og tilføje cytokinblandingen igen.
9. Induktion af ilt-glukose afsavn celledød
- Ved -1 DIV (2 dage efter cellesåning i multiwellplader) fjernes mediet, og det opbevares i en ny multiwellplade.
- Der tilsættes halvdelen af volumen (50 μL til 96-brøndsplader) af OGD-medium (OGD-gruppen) eller frisk medium (kontrolgruppe). Den halve mængde volumen bruges til at reducere udvekslingen af ilt mellem væsken og luften.
- Placer OGD-gruppekulturerne i et lufttæt hypoxikammer mættet med 95% N2 og 5% CO2. For at opnå mætning af kammeret skal gasblandingen flyde i 6 min ved 25 l/min, før du lukker kammerrørene.
- Inkuber hypoksisk kammer i inkubatoren i 3 timer. Kontrolgruppen og pladerne, der indeholder det medium, der fjernes og opbevares ved trin 9.1, skal også efterlades i inkubatoren.
- Fjern den glukosefri (OGD-gruppe) eller det nye medium (kontrolgruppe), og tilsæt det medium, der er fjernet og bevaret ved trin 9.1.
10. Immuncytokemi
- På det ønskede tidspunkt skal cellerne fastgøres med koldt 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved RT.
- Vask to gange med PBS (10 min inkubation for hver vask på RT).
- Inkuber 1 time ved RT med blokeringsopløsningen (PBS Triton 0,3% indeholdende 1% BSA og 1% æsel / ged normalt serum).
- Inkuberes med primær antistofblanding (tabel 1), fortyndet i PBS triton 0,3%, natten over ved 4 °C.
- Vask to gange med PBS (10 min inkubation for hver vask på RT).
- Inkuberes med sekundært antistof (tabel 1) opløsning fortyndet i PBS triton 0,3% tilsætning af Hoechst 33258 i 30 min ved 37 °C.
- Vask to gange med PBS (10 min inkubation for hver vask på RT).
11. HCS analyse af celle levedygtighed, afstamning sammensætning, og afstamning-specifikke celledød
BEMÆRK: Hcs' repræsentative billeder og arbejdsgange vises i figur 2A,B.
- Vælg algoritmen Til analyse af rum i softwarens hovedmenu (HCS Studio v 6.6.0), og vælg Scan i hovedmenuen Udvikl assay/scan plade.
- Vælg Ny i vinduet iDev, og vælg derefter Målværktøj til generel intensitet i skabelonen Udarbejd assay.
- Klik på Opret i højre side af menuen og vælg 10x-målsætningen.
- Dette åbner menuen Konfigurer anskaffelse. I dette vindue skal du vælge følgende parametre: (a) antal kanaler: den første for Hoechst nukleare farvning (BGRFR_386) og en for hver afstamning-specifikke markør, der anvendes i reaktionen (b) vælge software fokus på kanal 1 og autofokus interval som 1 (c) vælge plademodellen på listen.
- I anskaffelsesmenuen skal du se på kvaliteten af farvningen i forskellige brønde og forskellige felter og manuelt vælge eksponeringstiden ved at vælge Fast eksponeringstid i menuen.
- Når anskaffelsesparametrene er indstillet, skal du vælge Mini Scan øverst i menuen og vælge ti felter pr. brønd i to brønde pr. eksperimentel tilstand. Dette vil gøre det muligt at konfigurere alle analyseparameteren i et undersæt af felter for hele pladen.
- Når miniscanningen er færdig, skal du klikke på den konfigurere assayparameter for at konfigurere analysens algoritme.
- Klik på Konfigurer grupper i højre side af vinduet, og træk og slip miniscanens brønde. Klik på knappen Tilføj i underafsnittet Grupper for at konfigurere de forskellige grupper.
- Følg arbejdsprocessen i venstre side af vinduet trin for trin for at udvikle hele algoritmen. Vælg først Procesbillede for hver kanal, og klik på Fjernelse af baggrund og på det ønskede niveau.
- Først identificere og vælge kerner ved nukleare farvning. Klik på Identificer primær objekt - Kanal 1 for at vælge den virkelige kerner og undgå at analysere artefakt og snavs. Til dette formål skal du zoome ind på et repræsentativt billede af nuklear farvning og kontrollere, om kernerne er godt omgivet af omkredsen bygget af softwaren. Det er muligt at ændre fortæringsværdien og anvende segmenteringsalgoritmer for bedre at identificere enkeltkerner.
- Når kernerne er defineret korrekt, skal du klikke på følgende trin: Valider primært objekt. Vælg Object.BorderObject.Ch1 for at undgå analyse af kerner ved kanten af hvert feltbillede. Vælg Object.Area.Ch1, og fjern alle de identificerede snavs eller store objekter, der svarer til aggregater eller artefakter, ved at flytte søjlerne "lav" og "høj" på histogrammerne.
- Kontroller alle miniscanningsrepræsentantbilleder af alle eksperimentelle forhold for at være sikker på, at de valgte parametre passer til dem alle.
- Klik på Identificer pletter for hver kanal, der svarer til de specifikke linjemærker, og vælg Ringværdierne: Bredde = 3 og Afstand = 0. Dette vil gøre det muligt at identificere den cytoplasmatiske fluorescens. Ifølge celletætheden kan disse værdier tilpasses. Softwaren undgår automatisk overlapning mellem tilstødende ringe.
- Vælg Referenceniveauer i arbejdsprocessen for at opbygge analysen. Fastsættelsen af referenceniveauerne vil gøre det muligt automatisk at tælle kondenserede kerner baseret på den nukleare størrelse og nukleare farvningsintensitet og af specifikke markørpositive celler baseret på den cytoplasmatiske fluorescens, der er identificeret af Ringen.
- Klik først på Object.Area.Ch1. I miniscanningsbillederne skal du vælge en kondenseret kerne og flytte "LOW" bar på histogrammerne for at vælge som "kondenseret" alle kerner under denne størrelse.
- Klik på Object.AvgIntensity.Ch1. I miniscanningsbillederne skal du vælge en kondenseret kerne og flytte "HØJ" bar på histogrammerne for at vælge som "kondenseret" alle kerner over denne fluorescensintensitet.
- Klik på Object.RingAvgIntensity for hver kanal af afstamning specifikke mærker. Vælg i din mini-scanning billeder en positiv celle og flytte "HØJ" bar på histogrammer for at vælge som "positiv" alle cellerne over denne fluorescens intensitet.
- Kontroller alle miniscanningsrepræsentantbilleder af alle eksperimentelle forhold for at være sikker på, at de valgte parametre passer til dem alle.
- Vælg Karakterisering af population i den øverste menu , og vælg Underpopulation af begivenheden.
- Vælg ObjectAreaCh1 på venstre liste som type 1-hændelse, klik derefter på knappen OG >, og vælg til sidst ObjectAvgIntensityCh1. Dette vil gøre det muligt at identificere kondenserede kerner som en kombination af lavt område og høj intensitet.
- Fravælg alle scanningsgrænserne i samme vindue.
- Klik på Vælg funktioner, der skal gemmes i den øverste menu, for at vælge de parametre, der skal gemmes i analysen.
- Vælg Godt funktioner, og flyt kun fra venstre liste til højre de ønskede parametre: (a) SelectedObjectCountPErValidField (b) %EventType1ObjectCount (c) %High_RingAvgIntensity (For hver kanal for de specifikke linjemærker).
BEMÆRK: Denne analyse giver som udlæsning det samlede antal celler, procentdelen af kondenserede kerner og procentdelen af slægtsspecifikke positive celler for hver analyseret markør på det samlede celletal. Hvis procentdelen af de forskellige slægter kun er nødvendig på levende celler, er det muligt enten at beholde værdien "High_RingAvgIntensity" for kanalen (absolut antal positive celler) og genberegne procentdelen af de samlede celletal efter subtraktionen af procentdelen af døde celler.- Alternativt er det muligt at fjerne de døde celler fra analyseindstillingen de samme parametre, der bruges til at identificere kondenserede kerner (trin 11.14-11.15) på kernevalideringen (trin 11.11).
- Vælg Scan Plate i hovedmenuen, og klik på pladesymbolet i undermenuen Scanningsindstilling i den øverste sektion for at identificere brønden til at analysere.
- Skriv navnet på eksperimentet og beskrivelsen, og tryk på afspilningssymbolet, når alle indstillingerne er fuldført.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den første fase af kulturen kan variere i varighed, afhængigt af såningstætheden og om kuglerne er af foster- eller voksen oprindelse. Desuden viser oligosfærer en reduceret fordoblet befolkning i forhold til neurosfærer (Figur 1B). Desuden er sfæreproduktionen fra voksenvæv langsommere, og det kan tage 2-3 uger at generere oligosfærer sammenlignet med foster, der kan tage 1-2 uger, afhængigt af såningstætheden.
Når sået, hele differentiering fase af kulturer kan overvåges ved hjælp af afstamning-specifikke antistoffer. Da formålet med denne protokol er at studere den sidste fase af differentiering, præsenteres kultursammensætningen ved 0 DIV'er ikke. Men i den første kulturfase vil cellerne stadig være nestin-positive, der repræsenterer neurale prækursorer, og de fleste celler er også NG2-positive (OPCs)11. CNPase-positive celler, svarende til preOL-stadiet, vil kunne påvises 3-6 dage efter T3-medieret differentiering induktion, mens MBP-positive celler vil forekomme mellem 6 og 12 DIVs (modne OP'er; se figur 2C for kulturer sammensætning i slutningen af differentieringsfasen).
HCS-analysen gør det muligt at påedrive hver enkelt celle i kulturen gennem den nukleare farvning og analysen af fluorescensintensiteten i de resterende kanaler (figur 2A,B). Kulturens sammensætning ved afslutningen af differentieringsfasen (12 DIVs) varierer afhængigt af, om kulturerne er af foster- eller voksenoprindelse, idet fosterkulturerne er mere lydhøre over for T3-medieret differentiering og når en højere procentdel af modne OP'er12.
Gennem hele kulturprocessen er omkring 40%-50% af cellerne astrocytter (GFAP-positive celler), mens en lille procentdel (mindre end 0%-10%) er neuroner (beta-III-tubulin-positive celler; Figur 2C. Kultursammensætningen kan variere på 10% mellem forskellige kulturpræparater. Voksne og fosterkulturer er forskellige for udbyttet af moden OLs-produktion ved afslutningen af differentieringsfasen, hvor fosterceller viser høj procentdel af modne OP'er, lav procentdel af prækursorer og omkring 30%-40% af astrocytter. På den anden side præsenterer voksne kulturer mere astrocytter (ca. 45%-55%) og mindre differentierede celler efter 12 DIVs af differentiering induktion.
For at gøre det muligt for softwaren at genkende cellerne og give en ordentlig upartisk analyse af kultursammensætningen, er det vigtigt, at såningstætheden er korrekt og undgår overlapning mellem tilstødende celler. Når NSC-afledte OPCs er seedet ved høj densitet, de har tendens til at samle meget hurtigt, hvilket fører til hele overfladen af velværet er besat af astrocytter efter et par dage. Desuden vil modne OP'er med deres karakteristiske edderkoppenetform ikke være synlige på grund af det begrænsede rum (Figur 3A,B).
Den inflammation-medierede differentiering blok er reproducerbar ved denne in vitro assay og genererer et stærkt fald i preOLs og modne OP'er opdaget af CNPase og MBP farvning i både foster-og voksne kulturer. Der sker også en stigning i antallet af OPC'er i voksenkulturer (figur 4A, B). Cytokinblandingssammensætningen blev valgt fra in vivo-eksperimenter i en rottemodel af multipel sklerose13, og blev testet som en in vitro-model for den inflammationsmedierede differentieringsblok, der forekommer i denne sygdom.
Mens føtale og voksne OPCs viser den samme sårbarhed over for inflammatorisk cytokin eksponering, kun foster-afledte kulturer er følsomme over for OGD toksicitet (Figur 5A,B), viser en stigning i celledød og differentiering værdiforringelse på grund af deres forskellige metaboliske profil14.
Figur 1: Neural stamcelle-afledt oligodendrocyt prækursor celle kultur setup og differentiering protokol. (A) Forsøgsprocedurens ordning. (B) Repræsentative billeder af neurosfærer ved 2, 5 og 7 DIV'er og graf, der viser populationen fordobling af neurosfærer og oligosfærer. Skalastang: 100 μm. (C) Repræsentative billeder af seedede oligosfæreafledte OPCs, der viser de forskellige stadier af differentiering, fra nestin- og NG2-positive celler ved 0 DIV (neurale prækursorer/OPCs) gennem CNPase-positive celler ved 6 DIV'er (preOLs) og CNPase/MBP dobbelt positive celler ved afslutningen af differentieringsfasen (12 DIV'er; modne OL'er). GFAP-positive celler (astrocytter) og en lille procentdel af beta-III-tubulin positive celler (neuroner) er til stede i hele kulturen. Skalastænger: 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Cellebaserede arbejdsgange for screening med højt indhold og forventet udlæsning af differentiering. (A) Repræsentative billeder af HCS erhvervelse af en hel brønd (96-brønd plade) og et isoleret enkelt felt erhvervet med et 10x mål om en 12 DIVs kultur NSC-afledte OPCs. (B) HCS-analysearbejdsgange, herunder kerner (objekter) visualisering, identifikation og konstruktion af kernering for at identificere den cytoplasmatiske farvning og markøridentifikation. (C) Graf, der viser den forventede kultursammensætning ved afslutningen af differentieringsfasen (12 DIV'er). Markører for OPCs (PDGFαR, NG2), preOLs (CNPase, APC), modne OPP (MBP), astrocytter (GFAP) og neuroner (β-III-tubulin) er vist for både foster- og voksen-afledte kulturer. Afrundede procenter for hver cellemarkør medtages i grafen, bemærk, at dette er et repræsentativt eksperiment, og at procenterne kan være forskellige omkring 5%-10%. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentativ screening af højt indhold af en kultur med høj densitet. (A) Repræsentativt billede af et brøndbillede (96-brønds plade) er erhvervet med 10x objektivt og mærket for MBP-udtryk ved afslutningen af differentieringsfasen (12 DIV'er). (B) Repræsentativt udtrukket feltbillede, der fremhæver tilstedeværelsen af aggregerede celler og overlappende kerner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Forventet effekt af cytokinbehandling på foster- og voksenafledte OPC-kulturer. (A) Graf, der viser procentdelen af variationen i OPC-kulturer med føtal og voksenudledt sammenlignet med standardkulturer, herunder kvantificering af OPC'er (NG2), præOL'er (CNPase) og modne OPP-kulturer (MBP) ved afslutningen af differentieringsfasen (12 DIV'er). (B) Repræsentative billeder af voksenkulturer ved afslutningen af differentieringsfasen (12 DIV'er), der behandles med køretøjs- eller cytokinblanding og er mærket for NG2 eller CNPase/MBP. Skalalinje: 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Forventet effekt af OGD-eksponering på fosterbaserede OPC-kulturer. (A) Graf, der viser procentdelen af kondenserede kerner kvantificeret ved cellebaseret HCS i kontrol (ctrl) og OGD-eksponerede kulturer. (B) Repræsentative billeder af HCS-behandlede objekter, der fremhæver de identificerede kondenserede kerner (hvide pile). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Antistof | Art | Fortynding | |
| anti-β-III-tubulin (F&D-system) | mus | 1:3000 | |
| anti-GFAP (Dako) | kanin | 1:1000 | |
| anti-NG2 (Millipore) | kanin | 1:350 | |
| anti-PDGFαR (Santa Cruz Bioteknologi) | kanin | 1:300 | |
| anti-CNPase (Millipore) | mus | 1:500 | |
| IgG2b anti-APC, klon CC1 (Calbiochem) | mus | 1:100 | |
| Anti-MBP (Dako) | kanin | 1:250 | |
| Anti-nestin (Millipore) | mus | 1:500 | |
| Alexa Fluor 488-konjugeret anti mus (ThermoFisher Scientific) | æsel | 1:500 | |
| Alexa Fluor 647-konjugeret anti-mus IgG2b (ThermoFisher Scientific) | ged | 1:500 | |
| Alexa 568-konjugeret anti-kanin (ThermoFisher Scientific) | æsel | 1:500 | |
Tabel 1: Liste over primære og sekundære antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den komplekse karakter af myelination / remyelination processer og afmyelinating begivenheder gør udviklingen af prædiktive in vitro-systemer yderst udfordrende. De mest udbredte in vitro-lægemiddelscreeningssystemer er for det meste menneskelige cellelinjer eller primære rene OL-kulturer med stigende brug af mere komplekse samkulturer eller organotypicsystemer15. Selv om sådanne systemer er kombineret med teknologier med højt indhold, er rene OL-kulturer stadig den foretrukne metode, når de udvikler screeningsplatforme16.
Den spontane blandede kultur, der er beskrevet her, repræsenterer et nyttigt in vitro-system, som tager højde for alle de vigtigste variabler: fysiologisk T3-medieret OPC-differentiering, patologiske interferents med processen, andre cellulære komponenter og aldersrelaterede forskelle. Proceduren indeholder en række variabler, der stammer fra cellernes oprindelse (dyrets alder) og spheroids dannelse og manipulation. Faktisk er et kritisk skridt celletætheden af NSC'er såning efter isoleringen fra vævet, fordi en enkelt kugle i optimal tilstand skal stamme fra en enkelt voksende celle. Da vi har set, at isolerede NSC'er har tendens til at samle, og at de har brug for deres egne udskillede parakrine faktorer, såning dem i et interval på 10-50 celler / μL, i en t25 eller t75 kolbe, er det bedste kompromis at undgå cellesammenlægning, men stadig tillader celler at kommunikere ved at udskille faktorer.
De vigtigste begrænsninger af teknikken er manglen på en funktionel axonal myelination og en direkte interaktion med neuroner, da metoden kun tager højde for OPC-differentiering indtil scenen af modne OP'er: CNPase / MBP-dobbelt positive celler med et edderkoppenetmorfologi. Til dette formål er primære OPC'er, der dyrkes på isolerede dorsale rodganglier, stadig den vigtigste metode17. Muligheden for at skelne disse celler fra dyr i enhver alder er imidlertid et grundlæggende punkt i translationel processen, da det tillader test af forbindelser og skadelige stimuli på celler isoleret fra interessealderen. Som beskrevet her kan NSC'er faktisk isoleres fra både fosteret og den voksne hjerne. Da udviklingsmæssig myelination og remyelination i voksenalderen deler det samme mål, dvs. at nå nøgen axonen og skabe myelinskeden, blev det oprindeligt antaget, at de to processer var identiske i alle aspekter, hvilket genererede den såkaldte recapitulation hypotese18. Det står imidlertid nu klart, at de to processer ikke kan betragtes som lige, og at celle iboende aldersrelaterede forskelle er til stede og bør tages i betragtning, når der vælges den mest egnede in vitro-model til forsøgsspørgsmålet19. Voksne NSC'er-afledte OPCs viser faktisk stærke forskelle i fysiologisk TH-drevet differentiering og sårbarhed over for skadelige stimuli14,20 samt primære OPCs21,22. Der er også heterogenitet af OPC'er og OPLs befolkning i voksne væv, af særlig relevans for patologiske tilstande23. Protokoller for primær OPCs isolation fra voksen væv er tilgængelige24 og bør overvejes, når det eksperimentelle spørgsmål er rettet til molekyler, der virker på remyelination i voksenalderen.
Differentieringen af OPC'er fra de nationale tilnics gør det muligt at in vitro-repræsentation af hele differentieringsprocessen, fra udifferentieret prækursor til moden OL. Denne proces ligner in vivo-tilstanden, hvor TH er den vigtigste drivkraft for processen, der virker gennem specifikke nukleare receptorer, og det tillader eksperimentel interferens med denne mekanisme at efterligne patologiske forhold i en translationel visning13.
Modellens sidste grundlæggende kendetegn er den konstante tilstedeværelse af astrocytter gennem hele kulturen. Mens dette gør kulturen vanskeligere at analysere, udgør dens komplekse cellesammensætning en klar fordel. Den måde, hvorpå astrocytter bidrager til reaktionen på skadelige hændelser i blandede neuronale kulturer25, er almindeligt kendt, og fraværet af denne hovedkomponent i CNS gør in vitro-systemet dårligt forudsigeligt og oversætteligt. På den anden side har NSC-afledte kulturer for denne egenskab den ulempe, at de er mindre ensartede end encellede typesystemer, og dette kan føre til en forudindtaget analyse. Imidlertid tillader den cellebaserede HCS-teknik en analyse af hele kulturen og af alle cellepopulationer, hvilket også fjerner randomiseringen af repræsentative felter til analyse. Forudsat at den cellekultur, der anvendes til eksperimentet, er af en pålidelig såkvalitet, vil HCS give et fuldt billede af de eksperimentelle forhold og generere statistisk robuste data og en række automatiske fluorescensbaserede analyser.
Afslutningsvis beskriver den nuværende protokol proceduren for isolering og differentiering af NSC-afledte OPCs fra foster- og voksenhjerne. Hele protokollen tager omkring 30 dage, afhængigt af dyrenes alder og de eksperimentelle mål. Især kan sfæredannelse fra voksen oprindelse tage dobbelt tid sammenlignet med føtale, med samme såningstæthed. Tiden på 15 dage (fra -3 til 12 DIVs) efter såningen på 2D-overfladen for differentiering induktion er dog en fast tid under alle forhold. Den fulde protokol gør det muligt at studere hele TH-medieret differentieringsproces i et komplekst cellemiljø, interferens gennem specifikke patologiske mekanismer (dvs. inflammatoriske cytokiner og HI) og den deraf følgende testning af nye strategier, der har til formål at overvinde disse problemer. Koblingen af kulturmodellen med HCS-teknikken genererer en robust og omsættelig screeningsplatform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Støttet af MIUR National Technology Clustersproject IRMI (CTN01_00177_888744) og Regione Emilia-Romagna, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020.
Særlig tak til IRET Foundation for at være vært for det eksperimentelle arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plates - untreated | NUNC | 267313 | |
| B27 supplement (100x) | GIBCO | 17504-044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | GIBCO | PHG0024 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ciliary Neurotropic Factor (CNTF) | GIBCO | PHC7015 | |
| DMEM w/o glucose | GIBCO | A14430-01 | |
| DMEM/F12 GlutaMAX | GIBCO | 31331-028 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| EBSS | GIBCO | 14155-048 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | GIBCO | PHG6045 | |
| HBSS | GIBCO | 14170-088 | |
| HEPES | GIBCO | 15630-056 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| IFN-γ | Origene | TP721239 | |
| IL-17A | Origene | TP723199 | |
| IL-1β | Origene | TP723210 | |
| IL-6 | Origene | TP723240 | |
| laminin | GIBCO | 23017-051 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| N2 supplement (50x) | GIBCO | 17502-048 | |
| Non-enzymatic dissociation buffer | GIBCO | 13150-016 | |
| PBS | GIBCO | 70011-036 | |
| Penicillin / Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA) | GIBCO | PHG0035 | |
| poly-D,L-ornitine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| TGF-β1 | Origene | TP720760 | |
| TNF-α | Origene | TP723451 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752-1G | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 |
References
- Michalski, J. P., Kothary, R.
- Verden, D., Macklin, W. B. Neuroprotection by central nervous system remyelination: molecular, cellular, and functional considerations. Journal of Neuroscience Research. 94, 1411-1420 (2016).
- Raff, M. C., Lillien, L. E., Richardson, W. D., Burne, J. F., Noble, M. D. Platelet-derived growth factor from astrocytes drives the clock that times oligodendrocyte development in culture. Nature. 333, 562-565 (1988).
- Crawford, A. H., Chambers, C., Franklin, R. J. M. Remyelination: The true regeneration of the central nervous system. Journal of Comparative Pathology. 149, 242-254 (2013).
- Butt, A. M., Papanikolaou, M., Rivera, A.
- Baldassarro, V. A., Giardino, L., Calzà, L. Oligodendrocytes in a dish for the drug discovery pipeline: the risk of oversimplification. Neural Regeneration Research. 16, 291-293 (2021).
- Buchser, W. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. 1, Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. 1-80 (2014).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Ahlenius, H., Kokaia, Z. Isolation and generation of neurosphere cultures from embryonic and adult mouse brain. Methods in Molecular Biology. 633, Clifton, N.J. 241-252 (2010).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse Oligodendrocyte Precursor Cells. Nature Protocols. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
- Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
- Fernández, M., Baldassarro, V. A., Sivilia, S., Giardino, L., Calzà, L. Inflammation severely alters thyroid hormone signaling in the central nervous system during experimental allergic encephalomyelitis in rat: direct impact on OPCs differentiation failure. Glia. 64, 1573-1589 (2016).
- Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. Differential effects of glucose deprivation on the survival of fetal versus adult neural stem cells-derived Oligodendrocyte Precursor Cells. Glia. , 23750 (2019).
- Merrill, J. E. In vitro and in vivo pharmacological models to assess demyelination and remyelination. Neuropsychopharmacology. 34, 55-73 (2009).
- Lariosa-Willingham, K. D., et al. A high throughput drug screening assay to identify compounds that promote oligodendrocyte differentiation using acutely dissociated and purified oligodendrocyte precursor cells. BMC Research Notes. 9, 419 (2016).
- Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 209, 219-226 (2012).
- Fancy, S. P. J., Chan, J. R., Baranzini, S. E., Franklin, R. J. M., Rowitch, D. H.
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS Myelin - from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews Neuroscience. 18, 753-769 (2017).
- Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. PARP activity and inhibition in fetal and adult Oligodendrocyte Precursor Cells: effect on cell survival and differentiation. Stem Cell Research. 22, 54-60 (2017).
- Leong, S. Y., et al. Oligodendrocyte Progenitor Cells (OPCs) from adult human brain expressed distinct microRNAs compared to OPCs in development. Neurology. 82, (2014).
- Bribián, A., et al. Functional heterogeneity of mouse and human brain OPCs: relevance for preclinical studies in multiple sclerosis. Journal of Clinical Medicine. 9, 1681 (2020).
- Jäkel, S., et al. Altered Human Oligodendrocyte Heterogeneity In Multiple Sclerosis. Nature. 566, 543-547 (2019).
- Medina-Rodríguez, E. M., Arenzana, F. J., Bribián, A., de Castro, F. Protocol to isolate a large amount of functional oligodendrocyte precursor cells from the cerebral cortex of adult mice and humans. PloS One. 8, 81620 (2013).
- Baldassarro, V. A., et al. Cell death in pure-neuronal and neuron-astrocyte mixed primary culture subjected to oxygen-glucose deprivation: the contribution of poly(ADP-Ribose) polymerases and caspases. Microchemical Journal. 136, 215-222 (2018).
