Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

भ्रूण और वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल-व्युत्पन्न ओलिगोडेन्ड्रोसाइट अग्रदूत सेल संस्कृतियों की उच्च सामग्री स्क्रीनिंग भेदभाव और परिपक्वता विश्लेषण

Published: March 10, 2021 doi: 10.3791/61988
Automatic Translation
1
1Health Science and Technologies Interdepartmental Center for Industrial Research (HST-ICIR), University of Bologna

Summary

हम भ्रूण या वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त एस्ट्रोसाइट्स और ओलिगोडेन्ड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं की मिश्रित संस्कृतियों के उत्पादन का वर्णन परिपक्व ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स में अंतर करते हैं, और हानिकारक उत्तेजनाओं के विट्रो मॉडलिंग में। सेल-आधारित उच्च सामग्री स्क्रीनिंग तकनीक के साथ युग्मन एक विश्वसनीय और मजबूत दवा स्क्रीनिंग प्रणाली बनाता है।

Abstract

जटिल रोगों में चिकित्सीय रणनीतियों की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए दवा स्क्रीनिंग तकनीकों को विकसित करने में मुख्य बाधा इन विट्रो सरलीकरण और वीवो पर्यावरण में जटिल को पुनः बनाने के बीच संतुलन बना रही है, साथ ही मुख्य उद्देश्य के साथ, सभी स्क्रीनिंग रणनीतियों द्वारा साझा किया गया, मजबूत और विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने का, वीवो अनुवाद में अत्यधिक भविष्य कहनेवाला ।

रोगों के क्षेत्र में, अधिकांश दवा स्क्रीनिंग रणनीतियां अमर कोशिका रेखाओं या नवजात जानवरों से अलग प्राथमिक ओलिगोडेन्ड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं (ओपीसी) की शुद्ध संस्कृतियों पर आधारित होती हैं, जिससे उम्र से संबंधित मतभेदों की कमी और किसी भी वास्तविक रोग की स्थिति या जटिलता के कारण मजबूत पूर्वाग्रह होते हैं।

यहां हम तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) के शारीरिक भेदभाव/परिपक्वता को मॉडलिंग करने के उद्देश्य से एक इन विट्रो प्रणाली के सेटअप को दिखाते हैं, जो आसानी से रोग की स्थिति की नकल करने के लिए हेरफेर किया जाता है जो बीमारियों के विशिष्ट होते हैं । इसके अलावा, विधि भ्रूण और वयस्क दिमाग से अलगाव भी शामिल है, एक प्रणाली है जो गतिशील OPCs से एक सहज सह संस्कृति में परिपक्व ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स (OLs) के लिए अंतर दे रही है जो भी एस्ट्रोसाइट्स भी शामिल है । यह मॉडल शारीरिक रूप से थायराइड हार्मोन-मध्यस्थता वाले माइलियनेशन और मायलिन मरम्मत प्रक्रिया जैसा दिखता है, जिससे रोग इंटरफेरेंट्स के अलावा रोग इंटरफेरेंट्स को शामिल किया जा सकता है जो रोग तंत्र को मॉडल करते हैं। हम दिखाते हैं कि ओपीसी में अंतर करते हुए, विकासात्मक माइलेशन और वयस्क मायलिन मरम्मत पर उनके प्रभाव को पुन: बनाने और सिस्टम के सभी सेल घटकों को ध्यान में रखते हुए, रोगों (यानी, हाइपोक्सिया/इस्केमिया और सूजन) के दो मुख्य घटकों की नकल कैसे करें।

यह सहज मिश्रित मॉडल, सेल-आधारित उच्च सामग्री स्क्रीनिंग प्रौद्योगिकियों के साथ मिलकर, चिकित्सीय रणनीतियों के लिए एक मजबूत और विश्वसनीय दवा स्क्रीनिंग प्रणाली के विकास की अनुमति देता है जिसका उद्देश्य जनसांख्यिकी में शामिल रोग प्रक्रियाओं का मुकाबला करना और रेमाइलेशन को प्रेरित करना है।

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में, माइलिन बनाने वाली कोशिकाएं (ओलिगोडेन्ड्रोसाइटेसाइट्स, ओएलएस) और उनके अग्रदूत (ओलिगोडेन्ड्रोसाइट प्रीकरसोर कोशिकाएं, ओपीसी) विकासात्मक माइलिनेशन के लिए जिम्मेदार हैं, एक प्रक्रिया जो पेरी-और प्रसव के बाद की अवधि के दौरान होती है, और वयस्क1में माइलिन टर्नओवर और मरम्मत (रेमीलेशन) के लिए। ये कोशिकाएं अत्यधिक विशिष्ट हैं, जो अन्य सभी ग्लियल और न्यूरोनल घटकों के साथ शारीरिक रूप से और कार्यात्मक रूप से बातचीत करती हैं, जिससे उन्हें सीएनएस संरचना और कार्य का एक मौलिक हिस्सा मिल जाता है।

Demyelinating घटनाओं विभिन्न सीएनएस चोटों और रोगों 2 में शामिल हैं, और मुख्य रूप से विकास और वयस्कता दोनों केदौरानबहुकारक तंत्र के माध्यम से OPCs और OLs पर कार्य करते हैं । अविभेदित अग्रदूत एक सिंक्रोनाइज्ड प्रक्रिया3 में कारकों में अंतर, मुख्य रूप से थायराइड हार्मोन (टीएच) से प्रेरित होते हैं, जो ओपीसी को विशिष्ट उत्तेजनाओं को पहचानने और उनका जवाब देने के लिए प्रेरित करता है जो प्रसार, गैर-myelinated अक्षतंतु में पलायन, और परिपक्व ओल्स में भेदभाव जो बदले में माइलिन म्यान4विकसित करते हैं। इन सभी प्रक्रियाओं को बारीक नियंत्रित किया जाता है और एक जटिल वातावरण में होते हैं।

माइलियनेशन, रेमाइलेशन और डिमीलेशन इवेंट्स की जटिल प्रकृति के कारण, अंतर्निहित तंत्रों का अध्ययन करने और मुख्य सेलुलर खिलाड़ी पर ध्यान केंद्रित करते हुए नई चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए विट्रो विधि में एक सरलीकृत और विश्वसनीय की बहुत आवश्यकता है: ओपीसी5।

इन विट्रो सिस्टम को विश्वसनीय बनाने के लिए, कई कारकों को ध्यान में रखने की आवश्यकता है: सेलुलर पर्यावरण की जटिलता, उम्र से संबंधित सेल-आंतरिक मतभेद, शारीरिक टीएच-मध्यस्थता भेदभाव, रोग तंत्र, और डेटा की मजबूती6। दरअसल, क्षेत्र में अपूर्ण जरूरत एक मॉडल है जो वीवो स्थिति में की जटिलता की नकल करता है, जो अलग शुद्ध ओपीसी संस्कृतियों के उपयोग के माध्यम से सफलतापूर्वक हासिल नहीं होता है। इसके अलावा, घटनाओं, सूजन और हाइपोक्सिया/इस्केमिया (एचआई) के दो मुख्य घटकों में सीधे तौर पर अन्य सेल घटक शामिल हैं जो अप्रत्यक्ष रूप से ओपीसी के शारीरिक भेदभाव और परिपक्वता को प्रभावित कर सकते हैं, एक ऐसा पहलू जिसका अध्ययन ओवर-सरल इन विट्रो मॉडल में नहीं किया जा सकता है ।

एक अत्यधिक भविष्य कहनेवाला संस्कृति प्रणाली से शुरू, बाद में और अधिक सामान्य चुनौती मजबूत और विश्वसनीय डेटा का उत्पादन है। इस संदर्भ में, सेल-आधारित उच्च सामग्री स्क्रीनिंग (एचसीएस) सबसे उपयुक्त तकनीक7है, क्योंकि हमारा उद्देश्य सबसे पहले एक स्वचालित कार्यप्रवाह में पूरी संस्कृति का विश्लेषण करना है, प्रतिनिधि क्षेत्रों को चुनने के पूर्वाग्रह से बचना है, और दूसरा इमेजिंग-आधारित उच्च सामग्री डेटा8की स्वचालित और एक साथ पीढ़ी प्राप्त करना है।

यह देखते हुए कि मुख्य आवश्यकता विट्रो सरलीकरण और वीवो-नकल करने वाली जटिलता के बीच सबसे अच्छा संतुलन प्राप्त करना है, यहां हम भ्रूण पूर्वाभास और वयस्क उप-वेंट्रिकुलर जोन (एसवीजेड) से अलग तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) से प्राप्त ओपीसी प्राप्त करने के लिए एक अत्यधिक प्रजनन योग्य विधि प्रस्तुत करते हैं। इस इन विट्रो मॉडल में संपूर्ण ओपीसी विभेदन प्रक्रिया शामिल है, मल्टीपॉटेंट एनएससी से परिपक्व/myelinating राजभाषा तक, शारीरिक टीएच-निर्भर तरीके से । परिणामस्वरूप संस्कृति एक गतिशील रूप से अंतर/परिपक्वता प्रणाली है जिसके परिणामस्वरूप एक सहज सह-संस्कृति होती है जिसमें मुख्य रूप से ओपीसी और एस्ट्रोसाइट्स में अंतर करना होता है, जिसमें न्यूरॉन्स का प्रतिशत कम होता है । यह प्राथमिक संस्कृति वीवो पर्यावरण में जटिल की बेहतर नकल करती है, जबकि इसका स्टेम सेल व्युत्पन्न कोशिका वंश संवर्धन वांछित प्राप्त करने के लिए सरल जोड़तोड़ की अनुमति देता है।

सेल लाइनों या प्राथमिक OPCs की शुद्ध संस्कृतियों का उपयोग कर अन्य दवा स्क्रीनिंग रणनीतियों के विपरीत, यहां वर्णित विधि वांछित सेल प्रकार पर ध्यान केंद्रित किए बिना, एक जटिल वातावरण में पैथोलॉजिकल इंटरफेरेंट्स या चिकित्सीय अणुओं के प्रभाव के अध्ययन की अनुमति देती है। एचसीएस वर्कफ्लो ने सेल व्यवहार्यता और वंश विनिर्देश के विश्लेषण के साथ-साथ वंश-विशिष्ट कोशिका मृत्यु और रूपात्मक मापदंडों की अनुमति दी है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यहां वर्णित सभी पशु प्रोटोकॉल यूरोपीय समुदाय परिषद के निर्देशों (86/609/EEC) के अनुसार किए गए थे और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए NIH गाइडमें प्रकाशित दिशा निर्देशों का पालन करते हैं ।

1. समाधान और अभिकर् ता

  1. मानक माध्यम तैयार करें: DMEM/F12 ग्लूटामैक्स 1x; 8 mmol/L HEPES; 100 U/100 μg Penicillin/स्ट्रेप्टोमाइसिन (1% पी/एस); 1x B27; 1x एन-2।
  2. न्यूरोस्फीयर माध्यम तैयार करें: 10 एनजी/एमएल बीएमजीएफ जोड़ें; 10 एनजी/एमएल ईजीएफ से स्टैंडर्ड मीडियम तक ।
  3. ओलिगोस्फीयर/ओपीसी माध्यम तैयार करें: 10 एनजी/एमएल बीएमजीएफ जोड़ें; 10 एनजी/एमएल पीडीजीएफ-एए से स्टैंडर्ड मीडियम तक ।
  4. ओलिगोडेन्ड्रोक्टी विभेदन माध्यम तैयार करें: 50 एनएम T3 जोड़ें; 10 एनजी/एमएल सीएनटीएफ; 1x N-acetyl-L-cysteine (एनएसी) मानक माध्यम के लिए ।
  5. गैर-एंजाइमेटिक वियोजन बफर तैयार करें: गैर-एंजाइमेटिक वियोजन बफर में 1% पी/एस जोड़ें और बर्फ को ठंडा रखें।
  6. सुक्रोज समाधान तैयार करें: एचबीएसएस, 0.3 ग्राम/
  7. बीएसए वाशिंग सॉल्यूशन तैयार करें: ईबीएसएस, 40 मिलीग्राम/एमएल बीएसए, 0.02 एमएल/एल एचईपी।
  8. एंजाइमेटिक वियोजन बफर तैयार करें: एचबीबीएस, ५.४ मिलीग्राम/एमएल डी-ग्लूकोज, 15 mmol/L HEPES, १.३३ मिलीग्राम/एमएलए ट्रिप्सिन, ०.७ मिलीग्राम/एमएल Hyaluronidase, ८० यू/एमएल DNase ।
  9. साइटोकिन मिश्रण तैयार करें: टीजीएफ-ए1, टीएनएफ-α, आईएल-1, आईएल-6, आईएल-17, और आईएफएन-γ (20 एनजी/एमएल प्रत्येक)।
  10. साइटोकिन मिक्स व्हीकल तैयार करें: 0.04% स्टॉक (10% ग्लाइसरोल/100 एनएम ग्लाइसिन/25 एनएम ट्रिस, पीएच 7.3)।
  11. ऑक्सीजन-ग्लूकोज अभाव माध्यम तैयार करें: डीएमईएम डब्ल्यू/ओ ग्लूकोज का उपयोग करके मानक माध्यम। वांछित ग्लूकोज वंचन स्थिति की तंगी के आधार पर, ग्लूकोज से संबंधित यौगिकों (जैसे, बी 27 में डी-गैलेक्टोज) से बचने के लिए माध्यम से भी B27 और/या N2 को हटाना संभव है।

2. विच्छेदन और एनएससी अलगाव

नोट: भ्रूण और वयस्क एनएससी को संशोधनों के साथ अहलेनियस और कोकैया प्रोटोकॉल9 के बाद E13.5 भ्रूण पूर्वाभास या 2.5 महीने पुराने वयस्क उप-वेंट्रिकुलर जोन (एसवीजेड) से अलग किया गया था।

  1. भ्रूण एनएससी संस्कृतियों
    नोट: विच्छेदन शुरू करने से पहले, 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें जिसमें 150 माइक्रोन गैर-एंजाइमेटिक वियोजन बफर प्रत्येक शामिल हैं; पेट्री व्यंजन साफ करें और बर्फ ठंडे एचबीएसएस जोड़ें।
    1. E13.5 पर भ्रूण ले लीजिए - 14.5 समय पर गर्भवती चूहों से और ठंडे एचबीएसएस युक्त पेट्री डिश में जगह है।
    2. संदंश का उपयोग कर भ्रूण को काटना।
    3. भ्रूण के सिर को बर्फ के ठंडे पीबीएस युक्त एक साफ पेट्री डिश में रखें और मैग्नीफाइंग ग्लास या स्टीरियोस्कोप का उपयोग करके, संदंश के साथ खोपड़ी से त्वचा को हटा दें।
    4. एक बार जब मस्तिष्क दिखाई देता है और त्वचा को साफ कर देता है, तो इसे संदंश के साथ पक्षों पर दबाव लागू करके निचोड़ें।
    5. सेरिबैलम निकालें, केवल पूर्वाभास रखें और संदंश के साथ मेनिंग्स को हटा दें।
    6. अलग-अलग ऊतक को गैर-एंजाइमेटिक वियोजन बफर में रखें और अन्य भ्रूणों के साथ विच्छेदन चरणों को दोहराएं। बफर युक्त प्रत्येक ट्यूब में 2-3 जानवरों से ऊतक डालें।
    7. लगातार झटकों के तहत 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    8. इनक्यूबेशन के बाद, 850 μL मानक माध्यम जोड़ें और जब तक निलंबन झुरमुट से मुक्त न हो जाए तब तक पिपटिंग करके मिलाएं।
    9. यदि गैर-वियोजन ऊतक अभी भी दिखाई दे रहा है, तो आर टी में 2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें जब तक कि यह ट्यूब के नीचे जमा न हो जाए।
    10. जब वियोजन पूरा हो जाता है, तो कोशिकाओं की गणना करें और उन्हें निलंबन में 10-50 कोशिकाओं/माइक्रोन के घनत्व पर टी-25 या टी-45 फ्लास्क में प्लेट करें जिसमें न्यूरोस्फीयर माध्यम के 10-30 एमएल होते हैं, जिन्हें कोशिका आसंजन से बचने के लिए ऊर्ध्वाधर स्थिति में रखा जाता है।
  2. वयस्क एनएससी संस्कृतियां
    1. सर्वाइकल अपभ्रंश द्वारा जानवरों की बलि।
    2. बर्फ ठंडे एचबीएसएस युक्त 50 एमएल ट्यूब में 4-5 चूहों से दिमाग ले लीजिए।
    3. मस्तिष्क को ठंडे बाँझ सतह पर रखें। इस उद्देश्य के लिए, पानी से भरे टी-25 फ्लास्क का उपयोग करें और रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाए। प्रयोग के समय, बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी के साथ फ्लास्क को कवर करें।
    4. मस्तिष्क वेंट्रल साइड को नीचे की ओर रखें, रोस्ट्रो-कौडल दिशा में, और रेजर ब्लेड का उपयोग करके घ्राण बल्ब हटा दें।
    5. रेजर ब्लेड का उपयोग करके, कॉर्टेक्स से ऑप्टिकल चिअस्मा तक 1 मिमी मोटाई के 2-3 कोरोनल स्लाइस काटें।
    6. स्लाइस को ठंडी सतह पर एक वेंट्रो-पृष्ठीय स्थिति में रखें और कॉर्पस कैलोसम और दो पार्श्व वेंट्रिकल्स की पहचान करें।
    7. आवर्धक चश्मे या स्टीरियोस्कोप का उपयोग करके, पार्श्व वेंट्रिकल्स की दीवारों को अलग करें, इस बात का ध्यान रखें कि कॉर्पस कैलोसम के टुकड़े न ले जाएं।
    8. अलग ऊतक को एंजाइमैबद्ध वियोजन बफर (5-10 एमएल) में रखें और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    9. समाधान मिलाएं, कई बार पाइपिंग (कम से कम 50), और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर फिर से इनक्यूबेट करें।
    10. मानक संस्कृति माध्यम के 5 एमएल जोड़कर ट्राइप्सिन को बेअसर करें और 70 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके समाधान को फ़िल्टर करें।
    11. 400 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए फ़िल्टर किए गए समाधान को सेंट्रलाइज करें।
    12. सुक्रोज समाधान और सेंट्रलाइज में गोली को 500 x ग्रामपर 10 मिनट के लिए फिर से खर्च करें।
    13. बीएसए वाशिंग सॉल्यूशन में गोली को फिर से रीसुस्ल करें और 400 एक्स जीपर 7 मिनट के लिए सेंट्रलाइज करें।
    14. मानक संस्कृति माध्यम में गोली को फिर से रीसुस्ट करें, कोशिकाओं की गणना करें, और ऊपर वर्णित (चरण 2.1.10 में) के रूप में चढ़ाना करें।

3. प्राथमिक न्यूरोस्फीयर

  1. हर 2 दिन में ग्रोथ फैक्टर्स (आरएफजीएफ/ईजीएफ) जोड़ें ।
  2. हर 4-6 दिन (सेल घनत्व के आधार पर), माध्यम के आधे को इस प्रकार बदलें:
    1. पूरे सेल निलंबन को 15 या 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. 400 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
    3. मात्रा का आधा निकालें।
    4. ताजा माध्यम की एक ही राशि जोड़ें, धीरे से पाइपिंग द्वारा मिश्रण, और विकास कारकों को जोड़ें ।

4. ओलिगोस्फीयर

नोट: ओलिगोडेन्ड्रोसाइट भेदभाव संशोधनों के साथ चेन प्रोटोकॉल10 के बाद किया जाता है।

  1. जब न्यूरोस्फीयर 100-150 माइक्रोन के व्यास तक पहुंचते हैं, तो वे पारित होने के लिए तैयार होते हैं। ऐसा करने के लिए, पूरे सेल निलंबन को 15 या 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 400 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज करें।
    1. एक उल्टे संचारित प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके और इमेजजे सॉफ्टवेयर द्वारा उन्हें खोलकर क्षेत्रों की तस्वीरें लेकर व्यास का तेजी से मूल्यांकन करें।
    2. विश्लेषण मेनू पर क्लिक करें और उपकरण खिड़की से, स्केल बारका चयन करें ।
    3. माइक्रोन में चौड़ाई के रूप में 150 माइक्रोन सेट करें और गोले के साथ स्केल बार की तुलना करें।
  2. उलटा द्वारा पूरी मात्रा निकालें और ताजा मानक संस्कृति माध्यम के 180 माइक्रोन में गोली को फिर से खर्च करें। गोलों के विच्छेदन की अनुमति देने के लिए 50 बार पिपेट।
  3. ताजा मानक संस्कृति माध्यम के 810 माइक्रोन जोड़ें, कोशिकाओं की गिनती, और उन्हें फिर से प्लेट के रूप में न्यूरोस्फीयर के लिए वर्णित है।
  4. हर 2 दिन में बीएमजीएफ/पीडीजीएफ-एए 10 एनजी/एमएल जोड़ें ।
  5. हर 4-6 दिन (सेल घनत्व के आधार पर), माध्यम के आधे को इस प्रकार बदलें:
  6. पूरे सेल निलंबन को 15 या 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  7. 400 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
  8. मात्रा का आधा निकालें।
  9. ताजा माध्यम की एक ही राशि जोड़ें, धीरे से पाइपिंग द्वारा मिश्रण, और विकास कारकों को जोड़ें ।

5. प्लेट कोटिंग

  1. पॉली-डी, एल-ऑर्निथिन/लैमिनिन कोटिंग: ओपीसी को चढ़ाना से कम से 2 दिन पहले, पीबीएस में पतला ५० μg/ml पॉली-डी, एल-ऑर्निथिन समाधान, प्रत्येक कुएं में (४० μL/अच्छी तरह से ९६-अच्छी तरह से प्लेटों के लिए) और रात भर आरटी में इनक्यूबेट जोड़ें ।
  2. अगले दिन, तरल को हटा दें और तीन बार आसुत बाँझ पानी से धोएं।
  3. प्लेटों को रात भर आरटी में सूखने दें। अगले दिन, पीबीएस (5 माइक्रोग्राम/एमएल; 40 माइक्रोन/वेल फॉर 96-वेल प्लेट्स) में पतला एक लैमिनिन समाधान जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।

6. सेल सीडिंग

  1. जब ओलिगोस्फीयर 100-150 माइक्रोन के व्यास तक पहुंचते हैं, तो वे पॉली-डी, एल-ऑर्निथिन/लैमिनिन कोटेड प्लेटों पर अलग और वरीयता प्राप्त करने के लिए तैयार होते हैं। ऐसा करने के लिए, पूरे सेल निलंबन को 15 या 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 400 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज करें (जैसा कि चरण 4.1 में इंगित किया गया है)
  2. उलटा द्वारा पूरी मात्रा निकालें और ताजा मानक संस्कृति माध्यम के 180 माइक्रोन में गोली को फिर से खर्च करें। गोलों के विच्छेदन की अनुमति देने के लिए 50 बार पिपेट।
  3. ताजा मानक संस्कृति माध्यम के 810 माइक्रोन जोड़ें और कोशिकाओं की गिनती।
  4. कुओं से लेमिनिन समाधान निकालें और ३,००० सेल/सेमी2 घनत्व (१०० μL/well के लिए ९६-अच्छी प्लेटों के लिए) पर कोशिकाओं प्लेट ।

7. ओपीसी विभेदन प्रेरण

  1. 3 दिनों के बाद, पूरे माध्यम को हटा दें और ओलिगोडेन्ड्रोसाइट विभेदन माध्यम की एक ही मात्रा जोड़ें।
  2. हर 4 दिन में आधा माध्यम बदलें और हर 2 दिन में ताजा भेदभाव मिश्रण (T3/CNTF/एनएसी) जोड़ें ।

8. सूजन-मध्यस्थता भेदभाव ब्लॉक का शामिल करना

  1. न्यूरोस्फीयर वियोजन और अल्पामंडल उत्पादन (धारा 4) के बाद, साइटोकिन मिश्रण को संस्कृति माध्यम में जोड़ें और पूरे क्षेत्रों के गठन चरण के लिए साइटोकिन्स के संपर्क में ओलिगोस्फीयर रखें।
    नोट: मात्रा कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर करता है, क्योंकि कोशिकाओं के गठन के क्षेत्रों के लिए 10-50 कोशिकाओं/μL पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं ।
  2. अगर मीडियम को बदलने की जरूरत है तो पूरे वॉल्यूम को बदल दें और एक बार फिर साइटोकिन मिक्स डालें।

9. ऑक्सीजन-ग्लूकोज अभाव कोशिका मृत्यु का शामिल

  1. -1 DIV (मल्टीवेल प्लेटों में सेल सीडिंग के 2 दिन बाद), माध्यम को हटा दें और इसे एक नई मल्टीवेल प्लेट में संरक्षित करें।
  2. ओजीडी-मीडियम (ओजीडी ग्रुप) या फ्रेश मीडियम (कंट्रोल ग्रुप) की आधी वॉल्यूम (96-वेल प्लेट्स के लिए 50 माइक्रोन) जोड़ें। मात्रा की आधी मात्रा का उपयोग तरल और हवा के बीच ऑक्सीजन के आदान-प्रदान को कम करने के लिए किया जाता है।
  3. 95% एन 2 और 5%सीओ2 के साथ संतृप्त एक एयरटाइट हाइपोक्सिया कक्ष में ओजीडी समूह संस्कृतियों रखें। कक्ष के संतृप्ति को प्राप्त करने के लिए, चैंबर पाइप को बंद करने से पहले गैस मिश्रण को 25 एल/मिनट पर 6 मिनट के लिए प्रवाहित होने दें ।
  4. 3 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में हाइपोक्सिक कक्ष को इनक्यूबेट करें। मध्यम को हटाया और संरक्षित करने वाले नियंत्रण समूह और प्लेटों को भी इनक्यूबेटर में छोड़ दिया जाना चाहिए ।
  5. ग्लूकोज-मुक्त (ओजीडी समूह) या नए माध्यम (नियंत्रण समूह) को हटा दें और मध्यम को हटाया और चरण 9.1 पर संरक्षित जोड़ें।

10. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री

  1. वांछित समय बिंदु पर, आरटी में 20 मिनट के लिए ठंडे 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
  2. पीबीएस (आरटी में प्रत्येक धोने के लिए इनक्यूबेशन के 10 मिनट) के साथ दो बार धोएं ।
  3. अवरुद्ध समाधान के साथ आरटी में 1 एच इनक्यूबेट (पीबीएस ट्राइटन ०.३% जिसमें 1% बीएसए और 1% गधा/बकरी सामान्य सीरम) होता है ।
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण(टेबल 1)के साथ इनक्यूबेट, पीबीएस ट्राइटन 0.3% में पतला, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  5. पीबीएस (आरटी में प्रत्येक धोने के लिए इनक्यूबेशन के 10 मिनट) के साथ दो बार धोएं ।
  6. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट(टेबल 1)पीबीएस ट्राइटन में पतला समाधान 0.3% 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए Hoechst 33258 जोड़।
  7. पीबीएस (आरटी में प्रत्येक धोने के लिए इनक्यूबेशन के 10 मिनट) के साथ दो बार धोएं ।

11. सेल व्यवहार्यता, वंश संरचना, और वंश-विशिष्ट सेल मृत्यु का एचसीएस विश्लेषण

नोट: एचसीएस प्रतिनिधि छवियां और कार्यप्रवाह चित्र 2ए, बीमें दिखाए गए हैं ।

  1. सॉफ्टवेयर के मुख्य मेनू (एचसीएस स्टूडियो v 6.6.0) से कंपार्टमेंटल विश्लेषण एल्गोरिदम का चयन करें और मुख्य मेनू विकसित परख/स्कैन प्लेटसे स्कैन का चयन करें।
  2. iDev विंडो में, नए का चयन करें और फिर विकसित परख टेम्पलेट से सामान्य तीव्रता माप उपकरण का चयन करें।
  3. मेनू के दाईं ओर बनाएं पर क्लिक करें, 10x उद्देश्य का चयन ।
  4. इससे कॉन्फिडेंट एक्विजिशन मेन्यू खुलेगा। इस विंडो में, निम्नलिखित मापदंडों का चयन करें: (क) चैनलों की संख्या: Hoechst परमाणु धुंधला (BGRFR_386) के लिए पहला एक और प्रतिक्रिया में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक वंश-विशिष्ट मार्कर के लिए एक (ख) चैनल 1 पर सॉफ्टवेयर फोकस का चयन करें और 1 (ग) के रूप में ऑटोफोकस अंतराल सूची से प्लेट मॉडल का चयन करें।
  5. अधिग्रहण मेनू से, विभिन्न कुओं और विभिन्न क्षेत्रों में धुंधला की गुणवत्ता को देखें और मेनू में फिक्स्ड एक्सपोजर समय का चयन करके मैन्युअल रूप से एक्सपोजर समय का चयन करें।
  6. एक बार अधिग्रहण मापदंडों सेट कर रहे हैं, मेनू के शीर्ष पर मिनी स्कैन का चयन करें और प्रयोगात्मक हालत प्रति दो कुओं में अच्छी तरह से प्रति दस क्षेत्रों का चयन करें । यह पूरी प्लेट के लिए क्षेत्रों के सबसेट में सभी विश्लेषण पैरामीटर के सेट-अप की अनुमति देगा।
  7. जब मिनी स्कैन समाप्त हो जाता है, तो विश्लेषण के एल्गोरिदम को कॉन्फ़िगर करने के लिए कॉन्फ़िगर परख पैरामीटर पर क्लिक करें।
  8. खिड़की के दाईं ओर कॉन्फिगर समूहों पर क्लिक करें और मिनीस्कैन के कुओं को खींचें और छोड़ दें। विभिन्न समूहों को कॉन्फ़िगर करने के लिए समूह उप-अनुभाग में ऐड बटन पर क्लिक करें।
  9. पूरे एल्गोरिदम को विकसित करने के लिए कदम से कदम से खिड़की के बाईं ओर कार्यप्रवाह का पालन करें। सबसे पहले प्रत्येक चैनल के लिए प्रक्रिया छवि का चयन करें और पृष्ठभूमि हटाने और वांछित स्तर पर क्लिक करें।
  10. सबसे पहले न्यूक्लियर स्टेनिंग करके नाभिक की पहचान करें और उसका चयन करें। प्राथमिक वस्तु की पहचान करने पर क्लिक करें - चैनल 1 असली नाभिक का चयन करने के लिए और विरूपण साक्ष्य और मलबे का विश्लेषण करने से बचें। इस उद्देश्य के लिए, परमाणु धुंधला की एक प्रतिनिधि तस्वीर में ज़ूम करें और जांचें कि क्या नाभिक सॉफ्टवेयर द्वारा निर्मित परिधि से अच्छी तरह से घिरा हुआ है। एक नाभिक की बेहतर पहचान करने के लिए थ्रेसिंग मूल्य को बदलना और विभाजन एल्गोरिदम लागू करना संभव है।
  11. एक बार नाभिक को सही ढंग से परिभाषित किए जाने के बाद, निम्नलिखित चरण पर क्लिक करें: प्राथमिक वस्तु को मान्य करें। प्रत्येक क्षेत्र की छवि की सीमा पर नाभिक के विश्लेषण से बचने के लिए Object.BorderObject.Ch1 का चयन करें। Object.Area.Ch1 का चयन करें और, हिस्टोग्राम पर "कम" और "उच्च" सलाखों को स्थानांतरित करके, सभी पहचाने गए मलबे या बड़े-वस्तुओं को एकत्र या कलाकृतियों के अनुरूप हटा दें।
  12. यह सुनिश्चित करने के लिए सभी प्रयोगात्मक शर्तों के सभी मिनी स्कैन प्रतिनिधि छवियों की जांच करें कि चयनित पैरामीटर उन सभी के साथ फिट हैं।
  13. विशिष्ट वंश मार्कर के अनुरूप प्रत्येक चैनल के लिए पहचाने जाने वाले स्पॉट पर क्लिक करें, और रिंग मानों का चयन करें: चौड़ाई = 3 और दूरी = 0. इससे साइटोप्लाज्मिक फ्लोरेसेंस की पहचान हो सकेगी। सेल घनत्व के अनुसार, इन मूल्यों को अनुकूलित किया जा सकता है। सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से आसन्न छल्ले के बीच ओवरलैपिंग से बचना होगा।
  14. विश्लेषण बनाने के लिए कार्यप्रवाह में संदर्भ स्तर का चयन करें। संदर्भ स्तरों की स्थापना से नाभिकीय आकार और परमाणु धुंधला तीव्रता के आधार पर, और विशिष्ट मार्कर-सकारात्मक कोशिकाओं की स्वचालित गणना की अनुमति मिलेगी, जो रिंग द्वारा पहचाने गए साइटोप्लाजेटिक फ्लोरेसेंस के आधार पर है ।
  15. सबसे पहले Object.Area.Ch1पर क्लिक करें । मिनी स्कैन छवियों में, एक संघनित नाभिक का चयन करें और इस आकार के तहत सभी नाभिक के रूप में "गाढ़ा" के रूप में चयन करने के लिए हिस्टोग्राम पर "कम" बार ले जाएं।
  16. Object.AvgIntensity.Ch1पर क्लिक करें । मिनी स्कैन छवियों में, एक संघनित नाभिक का चयन करें और इस फ्लोरेसेंस तीव्रता के ऊपर सभी नाभिक के रूप में "गाढ़ा" के रूप में चयन करने के लिए हिस्टोग्राम पर "उच्च" बार ले जाएं।
  17. वंश विशिष्ट मार्कर के प्रत्येक चैनल के लिए Object.RingAvgIntensity पर क्लिक करें । अपने मिनी स्कैन छवियों में एक सकारात्मक कोशिका का चयन करें और इस फ्लोरेसेंस तीव्रता से ऊपर की सभी कोशिकाओं को "सकारात्मक" के रूप में चुनने के लिए हिस्टोग्राम पर "उच्च" बार को स्थानांतरित करें।
  18. यह सुनिश्चित करने के लिए सभी प्रयोगात्मक शर्तों के सभी मिनी स्कैन प्रतिनिधि छवियों की जांच करें कि चयनित पैरामीटर उन सभी के साथ फिट हैं।
  19. शीर्ष मेनू पर, जनसंख्या लक्षण वर्णन का चयन करें और इवेंट उपजनसंख्याका चयन करें।
  20. टाइप 1 इवेंट के रूप में, बायीं सूची में ऑब्जेक्टएएरियाच1 का चयन करें, फिर एंड > बटन पर क्लिक करें और अंत में ऑब्जेक्टवगिंटेंससीच1का चयन करें। यह कम क्षेत्र और उच्च तीव्रता के संयोजन के रूप में संघनित नाभिक की पहचान की अनुमति देगा।
  21. एक ही विंडो में, सभी स्कैन सीमाओं को डिमेक्ट करें।
  22. विश्लेषण में रखने के लिए मापदंडों का चयन करने के लिए शीर्ष मेनू में स्टोर करने के लिए चुनिंदा सुविधाओं पर क्लिक करें।
  23. अच्छी तरह से सुविधाओं का चयन करें और बाएं सूची से केवल वांछित मापदंडों पर जाएं: (क) चयनितObjectCountPErValidField (b) %EventType1ObjectCount (c) % High_RingAvgIntensity (विशिष्ट वंश मार्कर के प्रत्येक चैनल के लिए)।
    नोट: यह विश्लेषण कोशिकाओं की कुल संख्या, संघनित नाभिक का प्रतिशत, और कुल सेल संख्या पर प्रत्येक विश्लेषण मार्कर के लिए वंश-विशिष्ट सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत के रूप में readout के रूप में देगा । यदि विभिन्न वंशों का प्रतिशत केवल जीवित कोशिकाओं पर आवश्यक है, तो क्या चैनल (सकारात्मक कोशिकाओं की पूर्ण संख्या) के लिए मूल्य "High_RingAvgIntensity" रखना और मृत कोशिकाओं के प्रतिशत के घटाव के बाद कुल सेल नंबरों पर प्रतिशत की पुनर्गणना करना संभव है।
    1. वैकल्पिक रूप से, नाभिक सत्यापन (चरण 11.11) पर गाढ़ा नाभिक (चरण 11.14-11.15) की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले समान मापदंडों को स्थापित करने वाले विश्लेषण से मृत कोशिकाओं को हटाना संभव है।
  24. मुख्य शीर्ष मेनू से स्कैन प्लेट का चयन करें और विश्लेषण करने के लिए अच्छी तरह से पहचानने के लिए शीर्ष अनुभाग पर स्कैन सेटिंग उप-मेनू पर प्लेट प्रतीक पर क्लिक करें।
  25. प्रयोग और विवरण का नाम लिखें और एक बार सभी सेटिंग्स पूरी हो जाने के बाद, प्ले सिंबल दबाएं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

संस्कृति का पहला चरण अवधि में भिन्न हो सकता है, सीडिंग घनत्व के आधार पर और इस पर कि क्या क्षेत्र भ्रूण या वयस्क मूल के हैं। इसके अलावा, ओलिगोस्फीयर न्यूरोस्फीयर(चित्रा 1 बी)की तुलना में कम जनसंख्या दोगुनी प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, वयस्क ऊतक से क्षेत्रों का उत्पादन धीमा है और भ्रूण की तुलना में ओलिगोस्फीयर उत्पन्न करने में 2-3 सप्ताह लग सकते हैं, जो सीडिंग घनत्व के आधार पर 1-2 सप्ताह लग सकते हैं।

एक बार वरीयता प्राप्त होने के बाद, वंश-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके संस्कृतियों के पूरे भेदभाव चरण की निगरानी की जा सकती है। चूंकि इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य भेदभाव के अंतिम चरण का अध्ययन करना है, इसलिए 0 DIVs पर संस्कृति संरचना प्रस्तुत नहीं की जाती है। हालांकि, पहले संस्कृति चरण के दौरान, कोशिकाएं अभी भी नेस्टिन-पॉजिटिव होंगी, जो तंत्रिका अग्रदूतों का प्रतिनिधित्व करती हैं, और अधिकांश कोशिकाएं NG2-सकारात्मक (OPCs)11भी हैं। CNPase-सकारात्मक कोशिकाओं, preOL चरण के अनुरूप, T3-मध्यस्थता भेदभाव प्रेरण के बाद 3-6 दिन का पता लगाने योग्य हो जाएगा, जबकि MBP सकारात्मक कोशिकाओं 6 और 12 DIVs के बीच दिखाई देगा (परिपक्व OLs; भेदभाव चरण के अंत में संस्कृतियों संरचना के लिए चित्रा 2C देखें) ।

एचसीएस विश्लेषण परमाणु धुंधला और शेष चैनलों(चित्रा 2ए, बी)में फ्लोरेसेंस तीव्रता के विश्लेषण के माध्यम से संस्कृति में प्रत्येक एक कोशिका का पता लगाने की अनुमति देता है । भेदभाव चरण (12 DIVs) के अंत में संस्कृति की संरचना इस बात पर निर्भर करती है कि क्या संस्कृतियां भ्रूण या वयस्क मूल की हैं, भ्रूण संस्कृतियों के साथ T3-मध्यस्थता भेदभाव के लिए अधिक उत्तरदायी हैं और परिपक्व ओएलएस12के उच्च प्रतिशत तक पहुंचते हैं।

पूरी संस्कृति प्रक्रिया के दौरान, लगभग 40%-50% कोशिकाएं एस्ट्रोसाइट्स (जीएफएपी-पॉजिटिव कोशिकाएं) हैं, जबकि एक छोटा प्रतिशत (0%-10%) न्यूरॉन्स (बीटा-III-ट्यूबलिन-सकारात्मक कोशिकाएं) हैं; चित्रा 2C)। संस्कृति संरचना विभिन्न संस्कृति तैयारियों के बीच 10% भिन्न हो सकती है। वयस्क और भ्रूण संस्कृतियों भेदभाव चरण के अंत में परिपक्व OLs उत्पादन की उपज के लिए अलग है, भ्रूण कोशिकाओं परिपक्व OLs के उच्च प्रतिशत, अग्रदूत के कम प्रतिशत और एस्ट्रोसाइट्स के लगभग 30%-40% दिखा । दूसरी ओर, वयस्क संस्कृतियां विभेदन प्रेरण के 12 डीआईवी के बाद अधिक एस्ट्रोसाइट्स (लगभग 45%-55%) और कम विभेदित कोशिकाओं को प्रस्तुत करती हैं।

सॉफ्टवेयर को कोशिकाओं को पहचानने और संस्कृति संरचना का उचित निष्पक्ष विश्लेषण प्रदान करने की अनुमति देने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि सीडिंग घनत्व सही है, आसन्न कोशिकाओं के बीच ओवरलैपिंग से परहेज करना। जब एनएससी-व्युत्पन्न ओपीसी को उच्च घनत्व पर वरीयता प्राप्त किया जाता है, तो वे बहुत तेजी से एकत्र होते हैं, जिससे कुछ दिनों के बाद एस्ट्रोसाइट्स द्वारा अच्छी तरह से कब्जा कर लिया जाता है। इसके अलावा, सीमित स्थान(चित्रा 3ए, बी)के कारण उनकी विशेषता स्पाइडर-नेट आकार के साथ परिपक्व ओएलएस दिखाई नहीं देंगे।

सूजन-मध्यस्थता विट्रो परख में इस द्वारा प्रजनन योग्य है और भ्रूण और वयस्क दोनों संस्कृतियों में CNPase और एमबीपी धुंधला द्वारा पाए गए प्रीओएलएस और परिपक्व ओएलएस में एक मजबूत कमी उत्पन्न करता है। ओपीसी की संख्या में वृद्धि वयस्क संस्कृतियों(चित्रा 4ए, बी)में भी होती है। साइटोकिन मिश्रण संरचना को कई स्क्लेरोसिस13के चूहे मॉडल में वीवो प्रयोगों में से चुना गया था, और इस बीमारी में होने वाले सूजन-मध्यस्थता भेदभाव ब्लॉक के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में परीक्षण किया गया था।

जबकि भ्रूण और वयस्क ओपीसी भड़काऊ साइटोकिन एक्सपोजर के लिए एक ही भेद्यता दिखाते हैं, केवल भ्रूण-व्युत्पन्न संस्कृतियां ओजीडी विषाक्तता(चित्रा 5ए, बी)के प्रति संवेदनशील हैं, जो उनके विभिन्न मेटाबोलिक प्रोफाइल14के कारण सेल मृत्यु और भेदभाव हानि में वृद्धि दिखाते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: तंत्रिका स्टेम सेल-व्युत्पन्न ओलिगोडेन्ड्रोसाइट अग्रदूत सेल संस्कृति सेटअप और भेदभाव प्रोटोकॉल। {प्रायोगिकप्रक्रिया की योजना। (ख)2, 5 और 7 DIVs पर न्यूरोस्फीयर की प्रतिनिधि छवियां, और ग्राफ जिसमें न्यूरोस्फीयर और ओलिगोस्फीयर की आबादी दोगुनी होती है। स्केल बार: 100 माइक्रोन।(ग)विभेदन चरण (12 DIVs; परिपक्व OLs) के अंत में CNPase-सकारात्मक कोशिकाओं के माध्यम से, नेस्टिन और एनजी 2-पॉजिटिव कोशिकाओं से 0 DIV (तंत्रिका अग्रदूत/ओपीसी) में अंतर के विभिन्न चरणों को दिखाते हुए वरीयता प्राप्त अल्पामंडल-व्युत्पन्न ओपीसी की प्रतिनिधि छवियां । GFAP-सकारात्मक कोशिकाओं (एस्ट्रोसाइट्स) और बीटा-III-ट्यूबलिन सकारात्मक कोशिकाओं (न्यूरॉन्स) का एक छोटा सा प्रतिशत पूरी संस्कृति में मौजूद हैं। स्केल बार: 20 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सेल-आधारित उच्च सामग्री स्क्रीनिंग विश्लेषण कार्यप्रवाह और अपेक्षित भेदभाव रीडआउट। (ए)एनएससी-व्युत्पन्न ओपीसी की 12 डीआईवी संस्कृति के 10x उद्देश्य के साथ अधिग्रहीत एक संपूर्ण कुएं (96-वेल प्लेट) के एचसीएस अधिग्रहण की प्रतिनिधि छवियां और एक अलग एकल क्षेत्र। (ख)एचसीएस विश्लेषण साइटोप्लाज्मिक धुंधला और मार्कर पहचान की पहचान करने के लिए नाभिक (वस्तुओं) दृश्य, पहचान और नाभिक की अंगूठी के निर्माण सहित कार्यप्रवाह कदम । (ग)भेदभाव चरण (12 DIVs) के अंत में अपेक्षित संस्कृति संरचना दिखा ग्राफ । ओपीसी (पीडीजीएफαआर, एनजी 2), प्रीओएलएस (सीएनपीई, एपीसी), परिपक्व ओएलएस (एमबीपी), एस्ट्रोसाइट्स (जीएफएपी) और न्यूरॉन्स (β-III-ट्यूबलिन) के लिए मार्कर भ्रूण और वयस्क-व्युत्पन्न दोनों संस्कृतियों के लिए दिखाए जाते हैं। प्रत्येक सेल मार्कर के लिए गोल प्रतिशत ग्राफ में शामिल हैं, ध्यान दें कि यह एक प्रतिनिधि प्रयोग है और प्रतिशत के बारे में 5%-10% अलग हो सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: उच्च-घनत्व वाली संस्कृति की प्रतिनिधि उच्च सामग्री स्क्रीनिंग छवियां। (A)10x उद्देश्य द्वारा अधिग्रहीत एक कुएं (96-वेल प्लेट) छवि की प्रतिनिधि छवि और विभेदन चरण (12 डीआईवी) के अंत में एमबीपी अभिव्यक्ति के लिए चिह्नित। (ख)प्रतिनिधि निकाली गई फील्ड इमेज जिसमें एकत्रित कोशिकाओं की उपस्थिति और ओवरलैपिंग नाभिक की उपस्थिति को रेखांकित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: भ्रूण और वयस्क-व्युत्पन्न ओपीसी संस्कृतियों पर साइटोकिन उपचार का अपेक्षित प्रभाव। (ए)मानक संस्कृतियों की तुलना में भ्रूण और वयस्क-व्युत्पन्न ओपीसी संस्कृतियों की भिन्नता का प्रतिशत दिखा रहा है, जिसमें भेदभाव चरण (12 DIVs) के अंत में OPCs (NG2), preOLs (CNPase) और परिपक्व ओल्स (एमबीपी) का परिमाण शामिल है । (ख)वाहन या साइटोकिन मिश्रण के साथ इलाज किए गए विभेदन चरण (12 डीआईवी) के अंत में वयस्क संस्कृतियों की प्रतिनिधि छवियां और एनजी 2 या CNPase/MBP के लिए चिह्नित । स्केल बार: 20 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: भ्रूण-व्युत्पन्न ओपीसी संस्कृतियों पर ओजीडी एक्सपोजर का अपेक्षित प्रभाव। (ए)सेल आधारित एचसीएस इन कंट्रोल (सीटीआरएल) और ओजीडी-उजागर संस्कृतियों द्वारा निर्धारित संघनित नाभिक के प्रतिशत को दर्शाने वाला ग्राफ । (ख)एचसीएस-प्रसंस्कृत वस्तुओं की प्रतिनिधि छवियां पहचानी गई संघनित नाभिक (सफेद तीर) को उजागर करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

रोग-प्रतिकारक प्रजातियां तनूकरण
एंटी-β-III-ट्यूबलिन (आरएंडडी सिस्टम) चूहा 1:3000
एंटी-जीएफएपी (डाको) खरगोश 1:1000
एंटी-एनजी2 (मिलिपोर) खरगोश 1:350
एंटी-पीडीजीएफआर (सांता क्रूज़ बायोटेक्नोलॉजी) खरगोश 1:300
एंटी-सीएनपीई (मिलिपोर) चूहा 1:500
IgG2b विरोधी एपीसी, क्लोन CC1 (Calbiochem) चूहा 1:100
एंटी-एमबीपी (डाको) खरगोश 1:250
एंटी-नेस्टिन (मिलिपोर) चूहा 1:500
एलेक्सा फ्लोर 488-संयुग्मित एंटी माउस (थर्मोफिशर साइंटिफिक) गधा 1:500
एलेक्सा फ्लोर 647-संयुग्मित एंटी-माउस इग्जी2बी (थर्मोफिशर साइंटिफिक) बकरी 1:500
एलेक्सा 568-संयुग्मित विरोधी खरगोश (थर्मोफिशर वैज्ञानिक) गधा 1:500

तालिका 1: प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी की सूची।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

myelination/remyelination प्रक्रियाओं और demyelinating घटनाओं की जटिल प्रकृति इन विट्रो सिस्टम के विकास को बेहद चुनौतीपूर्ण बनाता है । विट्रो दवा स्क्रीनिंग सिस्टम में सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है ज्यादातर मानव सेल लाइनें या प्राथमिक शुद्ध राजभाषा संस्कृतियां, अधिक जटिल सह-संस्कृतियों या ऑर्गेनोटिपिक सिस्टम15के बढ़ते उपयोग के साथ। यहां तक कि अगर ऐसी प्रणालियों को उच्च सामग्री प्रौद्योगिकियों के साथ जोड़ा जाता है, तो स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म16विकसित करते समय शुद्ध राजभाषा संस्कृतियां पसंद की विधि बनी हुई हैं।

यहां वर्णित सहज मिश्रित संस्कृति एक उपयोगी इन विट्रो सिस्टम का प्रतिनिधित्व करती है, जो सभी मुख्य चरों को ध्यान में रखती है: शारीरिक T3-मध्यस्थता ओपीसी भेदभाव, प्रक्रिया के साथ पैथोलॉजिकल इंटरफेरेंट्स, अन्य सेलुलर घटक, और उम्र से संबंधित अंतर। प्रक्रिया में कोशिकाओं (जानवर की आयु) और गोलाकार गठन और हेरफेर की उत्पत्ति से प्राप्त कई चर होते हैं। वास्तव में, एक महत्वपूर्ण कदम ऊतक से अलगाव के बाद एनएससी सीडिंग का सेल घनत्व है, क्योंकि इष्टतम स्थिति में एक एकल क्षेत्र एक ही प्रसार कोशिका से प्राप्त होना चाहिए। चूंकि हमने देखा है कि अलग एनएससी कुल करने के लिए करते हैं और उन्हें अपने स्वयं के स्रावित पैराक्राइन कारकों की आवश्यकता होती है, उन्हें टी-25 या टी 75 फ्लास्क में 10-50 कोशिकाओं/μL की सीमा में सीडिंग करना, सेल एकत्रीकरण से बचने के लिए सबसे अच्छा समझौता है, लेकिन अभी भी कोशिकाओं को गुप्त कारकों द्वारा संवाद करने की अनुमति देता है।

तकनीक की मुख्य सीमाएं एक कार्यात्मक अक्षीय माइलियन की कमी और न्यूरॉन्स के साथ सीधी बातचीत है, क्योंकि विधि परिपक्व ओएलएस के चरण तक केवल ओपीसी भेदभाव को ध्यान में रखता है: CNPase/MBP-डबल सकारात्मक कोशिकाओं के साथ एक मकड़ी शुद्ध आकृति विज्ञान । इस उद्देश्य के लिए, अलग पृष्ठीय जड़ गंगलिया पर सुसंस्कृत प्राथमिक ओपीसी अभी भी मुख्य पद्धति17है । हालांकि, किसी भी उम्र में जानवरों से इन कोशिकाओं को अलग करने की संभावना ट्रांसलेशनल प्रक्रिया में एक मौलिक बिंदु है, क्योंकि यह ब्याज की उम्र से अलग कोशिकाओं पर यौगिकों और हानिकारक उत्तेजनाओं के परीक्षण की अनुमति देता है। जैसा कि यहां वर्णित है, वास्तव में, एनएससी को भ्रूण और वयस्क मस्तिष्क दोनों से अलग किया जा सकता है। चूंकि वयस्कता में विकासात्मक मायलिंजेशन और पुनर्जंमीकरण एक ही उद्देश्य को साझा करते हैं, यानी, नग्न अक्षों तक पहुंचने और मायलिन म्यान बनाने के लिए, यह मूल रूप से परिकल्पना की गई थी कि दोनों प्रक्रियाएं हर पहलू में समान थीं, तथाकथित पुनर्पूंजीकरण परिकल्पना18उत्पन्न करती हैं। हालांकि, अब यह स्पष्ट है कि दोनों प्रक्रियाओं को समान नहीं माना जा सकता है और सेल-आंतरिक आयु से संबंधित मतभेद मौजूद हैं और प्रायोगिक प्रश्न19के लिए सबसे उपयुक्त इन विट्रो मॉडल चुनते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए। वयस्क एनएससी-व्युत्पन्न ओपीसी, वास्तव में, शारीरिक टीएच-चालित भेदभाव और हानिकारक उत्तेजनाओं14, 20के साथ-साथ प्राथमिक ओपीसीएस21, 22के लिए जोखिम में मजबूत अंतर दिखाते हैं। वयस्क ऊतकों में ओपीसी और ओएलएस आबादी की विषमता भी है, रोग स्थितियों के लिए विशेष प्रासंगिकता23। वयस्क ऊतकों से प्राथमिक OPCs अलगाव के लिए प्रोटोकॉल24 उपलब्ध हैं और जब प्रायोगिक प्रश्न वयस्कता में पुनर्यीकरण पर अभिनय अणुओं को संबोधित किया जाता है पर विचार किया जाना चाहिए ।

एनएससी से ओपीसी का भेदभाव पूरी विभेदक प्रक्रिया के इन विट्रो प्रतिनिधित्व को अविभेदित अग्रदूत से परिपक्व राजभाषा तक की अनुमति देता है। यह प्रक्रिया वीवो स्थिति जैसा दिखता है, जहां टीएच प्रक्रिया का मुख्य चालक है, विशिष्ट परमाणु रिसेप्टर्स के माध्यम से कार्य करता है, और यह इस तंत्र के साथ प्रायोगिक हस्तक्षेप की अनुमति देता है ताकि एक ट्रांसलेशनल व्यू13में पैथोलॉजिकल स्थितियों की नकल की जा सके।

मॉडल की अंतिम मौलिक विशेषता पूरी संस्कृति में एस्ट्रोसाइट्स की निरंतर उपस्थिति है। हालांकि यह संस्कृति का विश्लेषण करने के लिए और अधिक कठिन बनाता है, इसकी जटिल कोशिका संरचना एक अलग लाभ का गठन करती है। जिस तरह से एस्ट्रोसाइट्स मिश्रित न्यूरोनल संस्कृतियों25 में हानिकारक घटनाओं की प्रतिक्रिया में योगदान करते हैं, वह व्यापक रूप से जाना जाता है, और सीएनएस के इस मुख्य घटक की अनुपस्थिति इन विट्रो सिस्टम को खराब उम्मीद के मुताबिक और अनुवादयोग्य बनाती है। दूसरी ओर, इस विशेषता के लिए, एनएससी-व्युत्पन्न संस्कृतियों को एकल-कोशिका प्रकार प्रणालियों की तुलना में कम समान होने का नुकसान होता है, और इससे पक्षपातपूर्ण विश्लेषण हो सकता है। हालांकि, सेल आधारित एचसीएस तकनीक पूरी संस्कृति और सभी सेल आबादी के विश्लेषण की अनुमति देती है, विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि क्षेत्रों के यादृच्छिकीकरण को भी हटा देती है। यह मानते हुए कि प्रयोग के लिए इस्तेमाल की जाने वाली सेल संस्कृति एक विश्वसनीय सीडिंग गुणवत्ता की है, एचसीएस प्रायोगिक स्थितियों की पूरी तस्वीर देगा, सांख्यिकीय रूप से मजबूत डेटा और कई स्वचालित फ्लोरेसेंस-आधारित विश्लेषण पैदा करेगा ।

अंत में, वर्तमान प्रोटोकॉल भ्रूण और वयस्क मस्तिष्क से एनएससी-व्युत्पन्न ओपीसी के अलगाव और भेदभाव के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है। पूरे प्रोटोकॉल में जानवरों की उम्र और प्रायोगिक लक्ष्यों के आधार पर लगभग 30 दिन लगते हैं। विशेष रूप से, वयस्क मूल से क्षेत्रों के गठन में भ्रूण वालों की तुलना में दोगुना समय लग सकता है, एक ही सीडिंग घनत्व पर। भेदभाव प्रेरण के लिए 2डी सतह पर सीडिंग के बाद 15 दिनों (-3 से 12 डीआईवी) का समय, हालांकि, सभी स्थितियों में एक निश्चित समय है। पूर्ण प्रोटोकॉल एक जटिल सेलुलर वातावरण में पूरे टीएच-मध्यस्थता भेदभाव प्रक्रिया के अध्ययन, विशिष्ट रोग तंत्र (यानी, भड़काऊ साइटोकिन्स और एचआई) के माध्यम से हस्तक्षेप और इन मुद्दों पर काबू पाने के उद्देश्य से नई रणनीतियों के परिणामस्वरूप परीक्षण की अनुमति देता है। एचसीएस तकनीक के साथ संस्कृति मॉडल की युग्मन एक मजबूत और अनुवादयोग्य स्क्रीनिंग मंच उत्पन्न करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

एमआईयूआर नेशनल टेक्नोलॉजी क्लस्टरप्रोजेक्ट आईआरएमआई (CTN01_00177_888744), और एरिटे एमिलिया-रोमाग्ना, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020 द्वारा समर्थित।

प्रयोगात्मक कार्य की मेजबानी के लिए आईआरईटी फाउंडेशन के लिए विशेष धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates - untreated NUNC 267313
B27 supplement (100x) GIBCO 17504-044
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) GIBCO PHG0024
BSA Sigma-Aldrich A2153
Ciliary Neurotropic Factor (CNTF) GIBCO PHC7015
DMEM w/o glucose GIBCO A14430-01
DMEM/F12 GlutaMAX GIBCO 31331-028
DNase Sigma-Aldrich D5025-150KU
EBSS GIBCO 14155-048
Epidermal Growth Factor (EGF) GIBCO PHG6045
HBSS GIBCO 14170-088
HEPES GIBCO 15630-056
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3884
IFN-γ Origene TP721239
IL-17A Origene TP723199
IL-1β Origene TP723210
IL-6 Origene TP723240
laminin GIBCO 23017-051
N-acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A9165
N2 supplement (50x) GIBCO 17502-048
Non-enzymatic dissociation buffer GIBCO 13150-016
PBS GIBCO 70011-036
Penicillin / Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA) GIBCO PHG0035
poly-D,L-ornitine Sigma-Aldrich P4957
TGF-β1 Origene TP720760
TNF-α Origene TP723451
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T2752-1G
Trypsin Sigma-Aldrich T1426

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Michalski, J. P., Kothary, R. Oligodendrocytes in a nutshell. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 340 (2015).
  2. Verden, D., Macklin, W. B. Neuroprotection by central nervous system remyelination: molecular, cellular, and functional considerations. Journal of Neuroscience Research. 94, 1411-1420 (2016).
  3. Raff, M. C., Lillien, L. E., Richardson, W. D., Burne, J. F., Noble, M. D. Platelet-derived growth factor from astrocytes drives the clock that times oligodendrocyte development in culture. Nature. 333, 562-565 (1988).
  4. Crawford, A. H., Chambers, C., Franklin, R. J. M. Remyelination: The true regeneration of the central nervous system. Journal of Comparative Pathology. 149, 242-254 (2013).
  5. Butt, A. M., Papanikolaou, M., Rivera, A. Physiology of oligodendroglia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 11175, 117-128 (2019).
  6. Baldassarro, V. A., Giardino, L., Calzà, L. Oligodendrocytes in a dish for the drug discovery pipeline: the risk of oversimplification. Neural Regeneration Research. 16, 291-293 (2021).
  7. Buchser, W. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. 1, Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. 1-80 (2014).
  8. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
  9. Ahlenius, H., Kokaia, Z. Isolation and generation of neurosphere cultures from embryonic and adult mouse brain. Methods in Molecular Biology. 633, Clifton, N.J. 241-252 (2010).
  10. Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse Oligodendrocyte Precursor Cells. Nature Protocols. 2 (5), 1044-1051 (2007).
  11. Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
  12. Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
  13. Fernández, M., Baldassarro, V. A., Sivilia, S., Giardino, L., Calzà, L. Inflammation severely alters thyroid hormone signaling in the central nervous system during experimental allergic encephalomyelitis in rat: direct impact on OPCs differentiation failure. Glia. 64, 1573-1589 (2016).
  14. Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. Differential effects of glucose deprivation on the survival of fetal versus adult neural stem cells-derived Oligodendrocyte Precursor Cells. Glia. , 23750 (2019).
  15. Merrill, J. E. In vitro and in vivo pharmacological models to assess demyelination and remyelination. Neuropsychopharmacology. 34, 55-73 (2009).
  16. Lariosa-Willingham, K. D., et al. A high throughput drug screening assay to identify compounds that promote oligodendrocyte differentiation using acutely dissociated and purified oligodendrocyte precursor cells. BMC Research Notes. 9, 419 (2016).
  17. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 209, 219-226 (2012).
  18. Fancy, S. P. J., Chan, J. R., Baranzini, S. E., Franklin, R. J. M., Rowitch, D. H. Myelin regeneration: a recapitulation of development. Annual Review of Neuroscience. 34, 21-43 (2011).
  19. Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS Myelin - from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews Neuroscience. 18, 753-769 (2017).
  20. Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. PARP activity and inhibition in fetal and adult Oligodendrocyte Precursor Cells: effect on cell survival and differentiation. Stem Cell Research. 22, 54-60 (2017).
  21. Leong, S. Y., et al. Oligodendrocyte Progenitor Cells (OPCs) from adult human brain expressed distinct microRNAs compared to OPCs in development. Neurology. 82, (2014).
  22. Bribián, A., et al. Functional heterogeneity of mouse and human brain OPCs: relevance for preclinical studies in multiple sclerosis. Journal of Clinical Medicine. 9, 1681 (2020).
  23. Jäkel, S., et al. Altered Human Oligodendrocyte Heterogeneity In Multiple Sclerosis. Nature. 566, 543-547 (2019).
  24. Medina-Rodríguez, E. M., Arenzana, F. J., Bribián, A., de Castro, F. Protocol to isolate a large amount of functional oligodendrocyte precursor cells from the cerebral cortex of adult mice and humans. PloS One. 8, 81620 (2013).
  25. Baldassarro, V. A., et al. Cell death in pure-neuronal and neuron-astrocyte mixed primary culture subjected to oxygen-glucose deprivation: the contribution of poly(ADP-Ribose) polymerases and caspases. Microchemical Journal. 136, 215-222 (2018).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 169 ओलिगोडेन्ड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाएं तंत्रिका स्टेम सेल ऑक्सीजन-ग्लूकोज अभाव सूजन उच्च सामग्री स्क्रीनिंग दवा स्क्रीनिंग
भ्रूण और वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल-व्युत्पन्न ओलिगोडेन्ड्रोसाइट अग्रदूत सेल संस्कृतियों की उच्च सामग्री स्क्रीनिंग भेदभाव और परिपक्वता विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baldassarro, V. A. High-Content… More

Baldassarro, V. A. High-Content Screening Differentiation and Maturation Analysis of Fetal and Adult Neural Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Precursor Cell Cultures. J. Vis. Exp. (169), e61988, doi:10.3791/61988 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter